Summary
Este protocolo proporciona un método para crear ratones humanizados (hu-NSG) vía intrahepática inyección de células madre hematopoyéticas humanas en ratones NSG neonatales radiación-condicionada. El ratón hu-NSG es susceptible a la infección por VIH y la terapia combinatoria antirretroviral (carro) y sirve como un modelo fisiopatológico adecuado para investigaciones de replicación y latencia del VIH.
Abstract
Normas éticas y desafíos técnicos para la investigación en patología humana, Inmunología y desarrollo terapéutico han colocado pequeños modelos animales en alta demanda. Con un genético y de comportamiento parecido a los seres humanos, pequeños animales como el ratón son buenos candidatos para los modelos de enfermedades humanas, a través del cual se recapitulan respuestas y humano-como síntomas. Además, el fondo genético del ratón puede modificarse para dar cabida a diversas demandas. El ratónnulo (NSG) NOD/SCID/IL2rγ es una de las cepas más ampliamente utilizado de ratón inmunocomprometidos; permite engraftment de células madre hematopoyéticas humanas o tejidos humanos y el desarrollo subsecuente de un sistema inmune humano funcional. Este es un hito fundamental en la comprensión del pronóstico y la fisiopatología de enfermedades humanos específicos como el VIH/SIDA y ayudar a la búsqueda de una cura. Adjunto, Divulgamos un protocolo detallado para generar un modelo de ratón humanizado de NSG (hu-NSG) por trasplante de células madre hematopoyéticas en un ratón NSG neonatal radiación-condicionada. El modelo de ratón de hu-NSG muestra desarrollo multilineal de trasplantado células madre humanas y susceptibilidad a la infección viral por VIH-1. También recoge características biológicas en respuesta a la terapia combinatoria antirretroviral (carro).
Introduction
Porque el establecimiento de adecuados modelos animales para enfermedades humanas, es clave para encontrar una cura, modelos animales apropiados durante mucho tiempo han sido perseguidos y mejorado con el tiempo. Se han desarrollado múltiples variedades de modelos murinos immunocompromised que permitan el engraftment de células humanas o de los tejidos y la posterior ejecución de funciones humanizado1,2. Estos modelos de ratón humanizado son críticos para la investigación de enfermedades específicas de humanos3,4,5.
Síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) resultando de la infección con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) es un ejemplo. Antes del establecimiento de modelos de ratón humanizado, limitaciones éticas y técnicas limitan estudios animales preclínicos de VIH/SIDA a primates no humanos3. Sin embargo, los altos gastos y requisitos para la atención especializada para tal animal dificultan estudios de VIH/SIDA en entornos académicos típicos. VIH principalmente infecta células humanas CD4 + T y afecta el desarrollo y la respuesta inmune de otras células humanas como células B, macrófagos y células dendríticas6; por lo tanto, pequeños modelos animales trasplantados con un sistema inmunológico humano funcional están en alta demanda.
Un avance se produjo en 1988, cuando CB17 -scid ratones con una mutación de Prkdcscid se desarrolló y demostró engraftment acertado del sistema inmunológico humano1. Los resultados de la mutación de Prkdcscid en funciones de las células T y B defectuosa y un sistema inmune adaptante seccionado en ratones, permitiendo el engraftment de humanos periféricos de la sangre las células mononucleares (PBMCs), las células madre hematopoyéticas (HSCs), y los tejidos hematopoyéticos fetales7,8. Sin embargo, niveles bajos del engraftment se observan con frecuencia en este modelo; las causas posibles son 1) residual actividad inmunológica innata modulada por natural killer (NK)-células y 2) el desarrollo de la etapa tardía de ratón (filtración) células T y B5. El desarrollo posterior de los diabéticos no obesos (cabeceo)-modelo de ratónscid logra dramático abajo-regulación de la actividad de células NK; así, es capaz de soportar un nivel más elevado y más sostenible engraftment del sistema inmunológico humano componentes9. Más suprimir o impedir el desarrollo de la inmunidad innata, modelos de ratón teniendo el truncamiento o el agujero ciego total de interleukin-2 receptor γ-cadena (Il2rg) en el (NOD) - Fondo descid fueron establecidos. Il2rg, también conocido como receptor del cytokine γ-cadena, es un componente indispensable de varios receptores de cytokine10,11,de12,13. Cepas como GUIÑO. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) y NODShi.Cg -PrkdcscidIl2rgtm1Sug (NOG) presentan robusta interrupción de ratón señalización de citoquinas y la ablación completa de desarrollo de la NK-célula, en Además de deterioro severo de la inmunidad adaptativa14,15,16.
Tres modelos de ratón humanizado teniendo un scid mutación y Il2rg nocaut con frecuencia se emplean en la investigación del VIH/SIDA: el modelo BLT (médula ósea/hígado/timo), el modelo de ABP (leucocitos de sangre periférica) y el modelo de la fuente (SCID repoblación celular) 3. BLT el modelo se crea vía quirúrgico trasplante de hígado fetal humano y timo bajo la cápsula del riñón de ratón acompañada con la inyección intravenosa del hígado fetal HSCs3,17,18. El modelo de ratón de BLT ofrece eficacia alta engraftment, desarrollo de las células hematopoyéticas humanas en todos los linajes y el establecimiento de un fuerte sistema inmune humano; Además, las células T son educadas en un timo humano autólogo y exhiben respuestas inmunitarias restricción HLA4,5,17,19. Sin embargo, la necesidad de procedimientos quirúrgicos sigue siendo el mayor inconveniente del modelo BLT. El modelo de ratón PBL se establece por la inyección intravenosa con linfocitos periféricos humanos. El modelo ABP ofrece comodidad y rendimientos engraftment acertado de la célula de T, pero su aplicación es limitada debido a la insuficiente de la célula de B y engraftment de células mieloides, engraftment bajo niveles general y el inicio de la severa injerto - versus - host disease (GVHD)3 ,20. El modelo de ratón de fuente se establece mediante inyección de HSCs humanas en ratones SCID de adultos jóvenes o recién nacidos. Exhibe el engraftment promedio eficiencia por encima del 25% (evaluado como sangre periférica CD45 porcentaje) y apoya el desarrollo de múltiple-linaje de HSCs inyectados y la elaboración de un sistema inmune humano innato. Sin embargo, la limitación del modelo de fuente es que la respuesta de células T es ratón H2-restringido en lugar de humanos HLA restringida14,21.
El modelo de ratón de la fuente se considera un modelo fácil y confiable para el VIH/SIDA pequeño animal estudios preclínicos, ejemplificado por el engraftment consistente de un sistema inmunológico humano y acertado desarrollo hematopoyético. Previamente informó de la creación de un modelo de ratón de NSG Hu-fuente-SCID (hu-NSG) y se describe su aplicación en la replicación del VIH y latencia estudios22,23,24. Este modelo de ratón de hu-NSG exhibe altos niveles de la médula ósea autoguiado hacia el blanco, susceptibilidad a la infección por el VIH y recapitulación de la infección por VIH y la patogénesis. Además, el modelo de ratón de hu-GSN responde adecuadamente a la terapia combinatoria antirretroviral (carro) y recapitula rebote viral del plasma sobre el retiro del carro, confirmando el establecimiento de un VIH latencia depósito25,26 ,27. Este embalse de latencia del VIH es más justificada por la producción de virus VIH réplica-competente ex vivo inducida por humanos CD4 + células T aisladas de ratones infectados y tratados con carro hu-NSG de descanso.
Adjunto, describimos el protocolo detallado para el establecimiento del modelo de ratón de hu-NSG de ratones neonatales de NSG, incluyendo procedimientos relacionados con el tratamiento del VIH infección y carro para el desarrollo de la latencia. Esperamos que este protocolo para ofrecer un nuevo conjunto de enfoques en los estudios animales sobre Virología VIH, latencia y tratamiento VIH.
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Protocol
Todos los procedimientos y cuidado de los animales se han realizado según protocolos revisado y aprobado por la ciudad de esperanza Animal atención institucional y Comité de uso (IACUC) llevó a cabo por el investigador principal de este estudio (Dr. John Rossi, IACUC #12034). Tejido hepático fetal humano se obtuvo de recursos avanzados de biociencias (Alameda, CA), una organización sin fines de lucro, conforme a las regulaciones federales y estatales. El vendedor tiene su propia Junta de revisión institucional (IRB) y cumple con los requisitos de protección del sujeto humano. PBMCs humanos están aisladas de las muestras de sangre periférica desechados de anónimos donantes sanos de esperanza sangre donantes del centro de ciudad (Duarte, CA), con la no identificación con respecto a edad, raza, género u origen étnico. IRB #/ REF #: 97071/075546
1. general práctica aséptica
- Realizar experimentos de cultivo de tejidos en gabinetes de flujo laminar designado.
- Mantener el medio de cultivo de tejidos y complementos bajo condiciones estériles y filtrar utilizando a un previo de 0.22 μm filtración unidad a utilizar.
- HSCs humanas preparadas en tubos estériles de preservar y mantener en hielo hasta inyección.
- Como resultado de la deficiencia inmune severa, manejar ratones NSG asépticamente. Usar una bata de cirugía desechable, tapa de la pelo, mascarilla, cubiertas del zapato y guantes para evitar la contaminación. Desinfecte la superficie del Banco, titular de la irradiación y cámara de inducción de anestesia con esterilizante de base dióxido de cloro (p. ej., Clidox) antes y después de los experimentos.
- Aplique ungüento oftálmico basados en petróleo después de hemorragia retro orbitario para evitar la resequedad en los ojos.
- Cambiar a antibiótico que contiene dieta para prevenir la infección debido a hemorragia retro orbital.
2. manejo VIH, infectadas por roedores y las muestras de sangre y tejidos que contienen el Virus
PRECAUCIÓN: El VIH es un patógeno humano de clase 3; las normas de manejo deben seguirse exactamente.
- Manejar muestras que contienen el virus de VIH en un BSL2 designado + espacio de laboratorio 3. Cerradura de reactivos que contiene el virus de forma segura en un contenedor secundario durante el transporte. Desinfectar la superficie exterior de los recipientes de fondo limpiando con lejía del 10% y el isopropanol antes del transporte.
- Mantenga todos los desperdicios que contienen virus en contenedores designados con 2-3 capas de bolsas de residuos biosanitarios hospitalarios. Antes de la eliminación de residuos, desinfectar rociando generosamente los residuos con solución de nonilfenol etoxilado/yodo (por ejemplo, Wescodyne) y autoclave.
- Usar equipo de protección personal: tapa de la pelo, tapa frontal, pantalla facial contra salpicaduras, cubiertas del zapato, bata de cirugía desechable y guantes de doble capa.
- Manejar roedores infectados con extrema precaución. Realizar colecciones de sangre y las inyecciones, mientras que los ratones son bajo anestesia (pasos 5.1-5.2, 6.3-6.5, 7.3 y 8.1-8.2).
3. aislamiento de células madre hematopoyéticas
- Preparar solución de colagenasa/dispase para la digestión del tejido.
- Disolver el polvo para preparar solución stock a una concentración de 100 mg/mL de colagenasa/dispase y almacene la solución stock de colagenasa/dispase en 150 alícuotas μl a-20 ° C.
- Para trabajar la solución de colagenasa, diluir 150 μL del stock de colagenasa/dispase con 15 mL de RPMI 1640 suplementado con 10% FCS y 1% de penicilina/estreptomicina.
Nota: La concentración final de colagenasa/dispase para la digestión del tejido es 1 mg/mL.
- Con una hoja de afeitar estéril, cortar tejido hepático fetal (16-24 semanas de gestación) en trozos pequeños (aproximadamente 2-3 mm3 en tamaño) seguido de digestión con colagenasa/dispase solución 1 mg/mL durante 30 minutos a temperatura ambiente. Ajustar el volumen de solución de digestión para que todos los pedazos de tejido son totalmente sumergidos. Utilice el extremo posterior del émbolo de la jeringa suavemente moler la muestra de tejido para facilitar la digestión.
- Pasar la mezcla de digestión a través de un filtro de malla de nylon estéril de 70 μm para adquirir una suspensión unicelular.
- Enriquecer para CD34 + HSCs utilizando un sistema de MACS por instrucciones del fabricante.
- Cuenta el porcentaje viable de enriquecido CD34 + HSCs utilizando un hemacitómetro28 y proceder a la inyección intrahepática en ratones neonatales de NSG.
- Congelar los restantes enriquecido CD34 + HSCs de congelación los medios de comunicación (p. ej., CryoStor CS2) y preservar las células en un tanque de nitrógeno líquido. Uso futuro, narran el porcentaje viable de descongelado CD34 + HSCs antes de la inyección. Con el uso de los medios de congelación, descongelación posterior viabilidad es entre 80 a 90%.
4. intrahepática inyección de HSCs humano CD34 + en ratones neonatales NSG
Nota: Los ratones NSG Neonatal 2-3 días desde el nacimiento son más adecuados para este procedimiento, ya que son lo suficientemente fuertes como para soportar la irradiación en dosis media letal, mientras que los jóvenes bastante a totalmente han deteriorado sistemas inmunes. Anestesia no es necesaria para la inyección de HSC.
- Coloque la camada entera de ratones NSG neonatales (típicamente 5-10 ratones, ambos sexos) en una jaula estéril irradiación en forma de empanada y exponga a una dosis total de 200-250 cGy rayos gamma radiación de una fuente de la radiación de Cesio-137. Asegúrese de que la dosis de radiación está dentro de la gama, como pérdida de peso significativa o incluso la muerte puede observarse cuando se exponen ratones NSG a altas dosis de irradiación. 12
Nota: La radiación es un peligro para la salud, se debe protección personal contra la radiación. - Después de la irradiación, inyectar cada ratón NSG neonatal con 5 x 105 viable humano CD34 + HSCs utilizando una configuración de la aguja de la jeringuilla (figura 1). Directamente inyectar las células en el hígado.
5. engraftment validación mediante sangrado retro-orbital y análisis de citometría de flujo
- En la inyección de 10-12 semanas post-HSC, anestesiar ratones utilizando un aparato de inhalación isoflurano/oxígeno. Ajustar el flujo de oxígeno para mantener el porcentaje de isoflurano en 4-5%. La anestesia tarda 3-5 minutos, dependiendo de cada ratón. Adecuadamente anestesiados ratones muestran un lento y patrón de respiración profunda y ninguna reacción al estímulo del pellizco del dedo del pie.
- Recoger 50-100 μl de sangre periférica de cada ratón por muestreo retro-orbitales28. Almacenar las muestras de sangre en K2EDTA o tubos para recogida de sangre heparinizada para evitar la coagulación.
Nota: Tubos sangre están obligados a tener capa de anticoagulante para poder PBMCs de ratón aislados de sangre para análisis de citometría de flujo. EDTA se sabe para inhibir reacciones enzimáticas tales como PCR y qRT-PCR; así, si se requieren reacciones enzimáticas posteriores, utilice un aparato de colección de sangre heparinizada. - Centrifugar las muestras de sangre a 2.000 x g durante 20 minutos a 4 ° C para que sedimenten los glóbulos.
- Transferir el sobrenadante de plasma a nuevos tubos de microcentrífuga después de centrifugación y conservar a-80 ° C si se requiere el análisis del cytokine.
- Lisar los glóbulos rojos (gr) en el sedimento de células de la sangre a temperatura ambiente durante 10 minutos con tampón de lisis de glóbulos rojos (Tabla de materiales).
Nota: Si no tienen muestras de plasma, lisar directamente la sangre con solución de lisis sin centrifugación.
- Pelotilla células sanguíneas restantes después de lisis de RBC a 300 x g durante 5 minutos a 4 ° C; aspirar el sobrenadante. Lavar el pellet celular con 0,01% de BSA con DPBS, centrifugar a 300 x g durante 5 minutos a 4 ° C y aspirar el sobrenadante. Repetir el lavado una vez más.
- Bloquear celdas con 100 μl de 1 x bloqueo cóctel (tabla 3 de la receta) durante 20 minutos a 4 ° C.
- Después de bloquear, directamente agregar cada solución de anticuerpo en la suspensión celular a una concentración de 2 μl/106 células e incube a 4 ° C durante 30 minutos. Anticuerpos para la validación del engraftment: anti-humanos CD45 (leucocitos, RRID: AB_2732068), humana CD3 (T-cells, RRID: AB_396896), humana CD4 (linfocitos T, RRID: AB_397037), anti humano CD8 (células T citotóxicas, RRID: AB_2722501), anti humano CD14 (monocitos, RRID: AB_10373536) y anti-humanos CD19 (linfocitos B, RRID: AB_10373382). Para el panel de flujo sugerido, ver tabla 4 y Tabla de materiales para números de catálogo, RRIDs y números de lote.
Nota: Tinción de anticuerpo en solución de bloqueo elimina la fijación no específica de los anticuerpos anti-humanos hacia los marcadores de la superficie del ratón, como varios marcadores de la superficie comparten homología entre humanos y de ratón. - Aislar PBMCs humanos de donantes sanos y preparar solo manchado flujo cytometry controles de compensación mediante PBMCs humano purificado. alternativamente, utilizar microesferas marcados con fluorescencia como compensación controla29.
- Analizar las muestras de sangre periférica utilizando un citómetro de flujo y cuantificar el porcentaje de células CD45 + humanas, humanas células CD3 +, células CD14 + humanas y humanas células CD19 + de las células de sangre periféricas total.
- Estudios de latencia y posterior infección por el VIH, calcular el porcentaje de CD8 + T-células dentro de las células CD3 + y CD4 + células de T.
Nota: Por lo general, se observa una relación CD4:CD8 entre 1.5 y 2.5 antes de VIH infección30.
- Estudios de latencia y posterior infección por el VIH, calcular el porcentaje de CD8 + T-células dentro de las células CD3 + y CD4 + células de T.
6. Análisis de la infección de ratones hu-NSG y la carga Viral en Plasma mediante qRT-PCR
- Propagar material viral VIH BaL en PBMCs humanos de donantes sanos, cosecha en infección posterior al día 10 y valorar uso de p24 ELISA kit31.
- Ratones de hu-grupo selecto con más de 20% humano CD45 + células en la sangre periférica para la infección por VIH.
- Anestesiar ratones hu-NSG utilizando un aparato de inhalación de oxígeno isoflurano (paso 5.1).
- Después de confirmar el animal está anestesiado, inyectar virus VIH BaL a dosis de 200 ng de p24 por ratón por vía intraperitoneal.
Nota: Ser extremadamente cautelosos con la aguja, no reutilizar las agujas y desechar inmediatamente después del uso en envase agudo designado. Desinfectar la zona de la inyección después de la administración de virus. - Infección después de tres semanas, anestesiar ratones hu-NSG y recolección de sangre periférica mediante retro-orbital sangrado con heparina tubos capilares y tubos de recogida.
- Plasma separado y células de la sangre por centrifugación a 2.000 x g durante 20 minutos.
- Lisar los glóbulos rojos. Block y manchas restantes células de la sangre con anticuerpos para los análisis de citometría de flujo (sección 5.3-5.8).
Nota: Análisis de citometría de flujo debe centrarse en comparar la relación de CD4:CD8 antes y después de la infección. Se espera que la disminución significativa en el recuento de células CD4 +, como el CD4 antígeno sirve como un co-receptor para la entrada viral. - Las muestras de plasma de uso analizar el viral del VIH la carga mediante qRT-PCR. Aislar el RNA viral de muestras de plasma usando un kit de mini RNA viral. Realizar qRT-PCR con primers específicos de LTR de HIV-1 y sonda fija (detalles de la secuencia en la tabla 5), usando el protocolo del fabricante.
7. oral Administración de carro y validación de supresión Viral (opcional)
Nota: Este paso es opcional para las investigaciones sobre el pronóstico del VIH, la virología o la fisiopatología relacionada con la infección durante la fase de infección aguda. Carro de tratamiento del VIH hu-NSG se utiliza para recapitular la latencia del VIH entre pacientes humanos recibiendo carro. Ratones con éxito VIH hu-NSG reciben carro durante 4 semanas. El régimen de carro consta de tenofovir disoproxil fumarato (TDF; 300 mg/cápsula), emtricitabina (FTC; 200 mg/cápsula) y raltegravir (RAL; 400 mg/cápsula). La dosis de carro para el tratamiento de ratones infectados por el VIH hu-NSG se ajusta según el cuerpo de superficie (tabla 1, ecuación 1, tabla 2)32.
- Calcular la cantidad de cada medicamento necesario para cada jaula durante una semana de tratamiento, teniendo en cuenta el volumen de la botella de agua, el número de ratones en cada jaula y un consumo promedio de agua diaria de 4 mL por ratón.
Nota: El punto clave en este paso es asegurar que cada ratón adquiere su dosis diaria de 4 mL de agua potable. - Moler todos los tres medicamentos con dosis ajustadas en polvo fino y disolver la mezcla en polvo en agua azucarada (por ejemplo, Medidrop Suralose). Cambiar la botella de agua cada semana con cóctel de carro recién disuelto en agua azucarada.
Nota: El polvo de la droga no puede disolver inmediatamente, agite vigorosamente para lograr una suspensión homogénea antes de regresar la botella a la jaula de tenencia. - Obtener muestras de sangre periférica mediante retro-orbital sangría cada dos semanas y analizar tanto la relación CD4:CD8 mediante citometría de flujo (sección 5.3-5.8) y la carga viral en plasma mediante qRT-PCR (sección 6.6).
Nota: Por lo general después de 4 semanas de tratamiento, la carga viral en plasma disminuye a por debajo del límite de detección y se restablece una relación típica CD4:CD8.
8. validación del rebote Viral sobre carro de retiro (opcional)
Nota: Este paso es fundamental para validar el modelo de estado latente, como rebote viral sobre el retiro del carro proporciona evidencia directa de un depósito de latencia. Se recomienda también para servir como un experimento de control para investigaciones terapéuticas sobre VIH rebote supresores.
- Plan para la retirada del carro después de cargas virales del plasma de las muestras de sangre periférica por debajo del límite de detección y la relación CD4:CD8 se restaura en un rango entre 1.5 y 2.5.
- Recoger muestras de sangre periférica mediante retro-orbital sangrado cada 2 semanas después de la retirada del carro. Vigilar de cerca el cambio en las cargas virales del plasma (sección 6.6) así como la relación de CD4:CD8 (sección 5.3-5.8).
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Representative Results
Análisis de citometría de flujo se realiza con frecuencia para validar la pureza de HSCs aisladas, evaluar niveles de engraftment, perfil respuestas inmunes a la infección viral y encuesta sobre eficacia del carro. Un panel de anticuerpos típica contiene anticuerpos fluorescente etiquetados cada 4-6; así, un citómetro de flujo con láser múltiples y una amplia selección de filtros es fundamental para lograr resultados precisos.
Validación de engraftment inicial, el recuento de células CD45 + humano puede variar desde 20% a 80%, y subconjuntos de los leucocitos humanos deben aparecer como poblaciones discretas en el flujo dot-plot (figura 2). La relación de CD4:CD8 estancias entre 1.5 y 2.5 para un individuo sano; CD4 + el agotamiento significativo se observa típicamente sobre la infección viral, produciendo un cociente más bajo de CD4:CD8; y restauración de la relación sana se observa sobre el tratamiento de carro (figura 3).
qRT-PCR da un límite de detección de 40 copias RNA/mL de plasma; diluciones adecuadas se requieren antes del experimento. Cargas virales del plasma detectadas mediante qRT-PCR en el curso de la infección y carro de régimen pueden ser trazadas y utilizadas para evaluar la eficiencia de la infección y carro (figura 4).
Figura 1. Jeringa/aguja setup utilizado para inyección intrahepática.
La configuración a medida de aguja de la jeringuilla Hamilton 80508 incluye una aguja calibre 30, de 51 mm de longitud con un borde biselado y una jeringa de cristal de 50-μl conectado. Volumen de inyección máxima de este procedimiento es 25 μl. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Datos de citometría de flujo representan engraftment acertado y la evolución de las células linfoides y mieloides en la sangre periférica.
Muestras de sangre periférica con éxito preparado deben tener separaciones discretas de la población, y un ratón bien implantada hu-NSG debe tener células T, células B y monocito positivo las poblaciones se presentaron en la sangre periférica. Un gráfico de CD4:CD8 se recomienda para el cálculo de tasas. un) engraftment acertado mostró leucocitos humanos de más de 25% CD45 + en la sangre periférica; discreta población de b) de células B, c) monocitos, d) las células de T entre CD45 + leucocito humano; e) CD4 + linfocitos T y f) CD8 + células de T citotóxicas están bien separadas, y g) produce un cociente entre 1,5 a 2,5 en este hu-NSG no infectada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Cambios cuenta CD4 + de la célula a través del curso de la infección viral, el carro y el carro se retiran.
Medida que progresa la infección, la relación CD4:CD8 disminuye de 1.5-2.5 a > 1.0, relación CD4:CD8 ha servido como un parámetro clínico en la evaluación del pronóstico del VIH así como el tratamiento eficacias. un) representante de flujo de datos que indica el cambio en las tasas de CD4:CD8 en el curso experimental; b) restaurado de cuadro de comparación de la tendencia que indica la efectividad del carro, que puede ser identificado como porcentaje de células T CD4 +. Detección de recuento de células T CD4 + mediante citometría de flujo. N: número de ratones probados = 6; Barras de error: medios ± SEM. * p < 0.05, ** p < 0.01, ***p < 0.001, *** p < 0,0001, ns: no significativo diferente. Se emplean el análisis de ANOVA de dos vías. Figura es reimpreso con permiso de22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Cambios del ARN viral del suero copiar números durante el curso de la infección viral, retiran el carro y carro
Detección de viremia de plasma en los ratones infectados por el VIH hu-NSG por qRT-PCR. El área sombreada indica el período de tiempo durante el cual los ratones recibieron carro (del día 28 al día 70 tal como se muestra). Es el límite de detección (indicado por la línea discontinua) del ensayo PCR (~ 110-160 copias de RNA/mL) en 50 a 80 μl de plasma obtenido a través de la vena de la cola. Estrella (*) indica que el ARN viral no detectado en animales carro tratado en el día 56. Número de copias de RNA viral suero había analizado de muestras de sangre periférica sirve como evidencia directa sobre el grado de infección viral. Debe estar en el acuerdo con el análisis de flujo de CD4. N: número de ratones probados = 6; Barras de error: medios ± SEM. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, *** p < 0,0001, ns: no significativo diferente. Se emplean el análisis de ANOVA de dos vías. Figura es reimpreso con permiso de22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Ecuación 1. Traducción de dosis basado en el área de superficie corporal (BSA).
Ecuación para convertir la dosis humana con la dosis contra pequeños animales experimentales. El factorm de K se puede encontrar en la tabla 2.
| Medicamento | Dosis diaria (mg) |
| Tenofovir disoproxil fumarato | 300 |
| Emtricitabina | 200 |
| Raltegravir | 800 |
Tabla 1. Dosis diaria de medicamentos individuales en régimen de carro
| Especies | Peso (kg) | BSA (m2) | Km factor |
| Humano | |||
| Adulto | 60 | 1.6 | 37 |
| Niño | 20 | 0,8 | 25 |
| Ratón | 0.02 | 0.0007 | 3 |
Tabla 2. Peso, BSA y Km tabla de factor de conversión de dosis
| Reactivo de | Volumen (μl) * | Concentración final |
| 0.01% de BSA en PBS | 98 | |
| humanos de 10 mg/ml de IgG | 1 | 100 μg/ml |
| 10 mg/ml IgG de ratón | 1 | 100 μg/ml |
| 100 | ||
| * La receta es para una muestra de células en 100 μl de bloqueo de cóctel. Ajustar el volumen en consecuencia con los números de muestra. | ||
Tabla 3. Bloqueo de coctel para células aisladas de sangre
| Anticuerpo | Fluoróforo | Máximo ej. | Em. Max |
| CD45 | BB515 | 490 nm | 515 nm |
| CD3 | PE-Cy7 | 496 nm | 785 nm |
| CD4 | Azul Pacífico | 401 nm | 452 nm |
| CD8 | BUV395 | 348 nm | 395 nm |
| CD14 | APC-Alexa 750 | 650 nm | 774 nm |
| CD19 | PE | 496 nm | 578 nm |
Tabla 4. Panel de flujo sugerido de varios colores
| Primer avance | 5'-GCCTCAATAAAGCTTGCCTTG-3 ' | |||
| Primer revés | 5'-GGCGCCACTGCTAGAGATTTT-3 ' | |||
| Punta de prueba * | 5'-AAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTAGTGTTGACT-3 ' | |||
| * 5'-FAM, agujero negro 3' Quenche 1 | ||||
Tabla 5. VIH-1 LTR iniciadores y sonda
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Discussion
Immunocompromised ratones engrafted con células y tejidos humanos presentan características fisiológicas humanas y son un enorme valor para los estudios de patología, Fisiopatología e Inmunología sobre enfermedades específicas de humanos. Entre las múltiples cepas de ratones immunocompromised, el visto bueno. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) el modelo es el más inmunodeficientes debido a su falta de inmunidad innata y adaptativa, así como del cytokine de ratón específicos seccionado señalización3,12,19 . Por lo tanto, ratones NSG se han utilizado extensivamente en el proceso de humanización, y está bien establecido que repoblación de células humanas en la sangre periférica de ratón, linfoide y tejidos mieloides y que los ratones exhiben caso humano respuesta inmune a estímulos infecciosos como el VIH27,33.
Debido a la restricción del host del VIH, estudios animales preclínicos de pronóstico de Virología y de la infección de VIH fueron previamente limitados a los primates no humanos infectados con la inmunodeficiencia de simian virus (SIV, la versión de primates no humanos del VIH)3. Los avances científicos en la investigación con células madre y la generación de ratones NSG han abierto la posibilidad de llevar a cabo la investigación del VIH en pequeños animales murinos con menor costo y más rápido experimental facturación. En la actualidad, humanización de NSG puede lograrse mediante el trasplante de tejidos 1) fetales humanas HSCs (modelo BLT), PBMCs 2) humanos (modelo PBL) y 3) humanas HSCs (modelo de la fuente). El modelo BLT ofrece la más alta eficiencia de engraftment como desarrollo integral de ambas funciones linfoides y mieloides34,35, pero técnicamente es exigente. El modelo PBL es el más conveniente establecer pero tiene una corta ventana experimental al engraftment resultantes de EICH; Además sólo ofrece respuestas de células T periféricas decentes y carece de desarrollo linfoide y mieloide. Por estas razones, se empleó el modelo de la fuente en el presente Protocolo, con las adaptaciones para cumplir con los requisitos para las investigaciones de VIH. El modelo hu-NSG está totalmente desprovisto de función inmune y eficiente en la médula ósea autoguiado hacia el blanco a la radiación y el trasplante; Además, permite desafío viral y las investigaciones posteriores a una edad más temprana, evitando el desarrollo de problemas patológicos relacionados con la edad sabido que el fondo de la cepa de cabeceo. Aunque las células de T en el modelo hu-NSG son educadas en un ambiente de timo de ratón y sólo están restringidos de H2, múltiples, si no todos los subconjuntos de células inmunes humanas pueden convertirse en y colonizan los órganos linfoides y mieloides ratón. Perceptiblemente, tejido linfoide asociado a intestino del modelo hu-NSG también es reconstituido con células inmunes humanas; así, este modelo podría soportar potencialmente mucosa la transmisión del VIH, similar a la de22,modelo BLT23.
Uno de los mayores obstáculos para la erradicación del VIH es la existencia de un reservorio de latencia entre los pacientes tratados con supresores carro33,36,37,38,39. Células latente infectadas permanecen quietas y contribuyan a rebote viral del VIH sobre el retiro del carro. Reservorios de latencia se encuentran anatómicamente en el hígado, bazo, cerebro y otros tejidos linfoides y se compone principalmente de memoria CD4 + células de T36,40,41. Según nuestro grupo, el modelo hu-NSG apoya plenamente el desarrollo del linaje de células T, lo que es adecuado para el modelo patológico de la latencia del VIH. Mostramos que este modelo es altamente susceptible a la infección viral y posteriormente al régimen de carro a través de la administración oral. Espectacular rebote viral ocurre inmediatamente sobre el retiro del carro, que es totalmente compatible con la existencia de un reservorio de latencia. Infección latente memoria CD4 + células de T puede ser aislado de los órganos linfoides del VIH hu-NSG en carro y ensayos consecuencia viral recapitulan rebote viral ex vivo41. El modelo hu-GSN y el régimen de carro de la infección VIH que se describe en este protocolo así tienen amplias aplicaciones en campos relacionados con la virología VIH, pronóstico de la infección, Fisiopatología de la latencia y desarrollo de la terapéutica antirretroviral.
El modelo de ratón de hu-NSG en este protocolo requiere irradiación e inyección intrahepática de HSCs en día nacimiento después de 2-3; por lo tanto, se requiere mejoramiento interno y condiciones específicas. Aunque el trasplante de HSC neonatal generalmente produce eficiencias engraftment alta, en algunos casos GVHD severo puede ocurrir. En algunos casos, puede observarse una disminución significativa en periférico recuento de células CD45 + en la infección, y en condiciones extremas, puede observarse sangre periférica CD45 + agotamiento; por lo tanto, los análisis de citometría de colección y del flujo de sangre puede ser difícil. Una de las principales limitaciones de este modelo de ratón de hu-NSG se encuentra dentro de la naturaleza quimérica de sus T-células. Las células T en el modelo de ratón de hu-NSG son educadas dentro del entorno de timo de ratón y son restringidos de H2 en lugar de estar restringidos a HLA; por lo tanto, la recapitulación completa de los cambios dinámicos de subconjuntos de células T en la infección es menos probable. Además, aunque el modelo de ratón de hu-NSG exhibe buena susceptibilidad a la infección por VIH-1, la carga viral del plasma observadas puede ser varias veces menor que en el modelo de BLT, posiblemente debido a la reconstitución en funciones linfoides y mieloides humanas.
En Resumen, el ratón de hu-NSG en este protocolo ofrece una metodología sencilla y eficaz para generar un modelo de ratón humanizado estudios Virología y la latencia del VIH, como una alternativa al modelo BLT. A pesar de sus limitaciones en el desarrollo integral de linfoide y mieloide, se ha demostrado el modelo hu-NSG susceptibles a la infección y en respuesta a carro de tratamiento u otras terapias22,23,24. El modelo de patología de la latencia establecida según este protocolo recoge VIH rebote viral in vivo y latente infectado memoria que CD4 + células de T pueden ser más aislado para investigación adicional.
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Disclosures
Los autores no divulgar conflictos de interés.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud [otorgar números R01AI29329, R01AI42552 y R01HL07470 a J.J.R.] y el Instituto Nacional del cáncer de los institutos nacionales de salud [número de licencia P30CA033572 para la ciudad de esperanza genómica Integrativa Farmacología analítica y núcleos de citometría analítica]. El siguiente reactivo se obtuvo a través de los NIH NIH SIDA programa de investigación y referencia reactivo, División de SIDA del NIAID,: virus VIH BaL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD34 MicroBead Kit, human | MiltenyiBiotec | 130-046-703 | |
| CryoStor CS2 | Stemcell Technologies | 07932 | |
| NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji | The Jackson Laboratory | 005557 | Order breeders instead of experimental mice |
| IsoFlo | Patterson Veterinary | 07-806-3204 | Order through animal facility, restricted item |
| Clidox disinfectant | Fisher Sicentific | NC9189926 | |
| Wescodyne | Fisher Sicentific | 19-818-419 | |
| Hamilton 80508 syringe/needle | Hamilton | 80508 | Custom made |
| Blood collection tube (K2EDTA) | BD Bioscience | 367843 | |
| Blood collection tube (Heparin) | BD Bioscience | 365965 | |
| Capillary tube (Heparinized) | Fisher Sicentific | 22-362574 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Sigma Aldrich | 11814389001 | |
| QIAamp Viral RNA mini kit | Qiagen | 52906 | |
| TaqMan Fast VIrus 1-step Master Mix | Thermofisher | 4444434 | |
| HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit) | PerkinElmer | NEK050B001KT | |
| IgG from human serum | Sigma Aldrich | I4506-100MG | |
| IgG from mouse serum | Sigma Aldrich | I5381-10MG | |
| BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30) | BD Biosciences | 564586 | RRID: AB_2732068, LOT 6347696 |
| PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7) | BD Biosciences | 557851 | RRID: AB_396896, LOT 6021877 |
| Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4) | BD Biosciences | 558116 | RRID: AB_397037, LOT 6224744 |
| BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8) | BD Biosciences | 563795 | RRID: AB_2722501, LOT 6210668 |
| APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4) | ThermoFisher | MHCD1427 | RRID: AB_10373536, LOT 1684947A |
| PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1) | ThermoFisher | MHCD1904 | RRID: AB_10373382, LOT 1725304B |
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