여기서, 우리는 생물학적 나노기공 기반 전자 플랫폼을 사용하여 단일 분자 한계에서 이산 금속 산소 클러스터, 폴리옥소메탈레이트(POMs)를 검출하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 이러한 분자의 연구에 사용되는 전통적인 분석 화학 도구에 대한 보완적인 접근법을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
개별 분자는 단일 나노미터 규모의 기공을 통해 흐르는 이온 전류를 감소시키는 정도를 측정하여 검출및 특징화될 수 있다. 신호는 분자의 물리 화학적 특성과 기공과의 상호 작용의 특징입니다. 우리는 세균성 단백질 외독신 황색포도상 황색포도상 혈우병 알파 헤몰리신(αHL)에 의해 형성된 나노기공이 단일 분자 한계에서 폴리옥소금속류(POMs, 음이온 금속 산소 클러스터)를 검출할 수 있음을 입증한다. 또한, 용액내 12-인산화산 POM(PTA, H3 PW12O40)의다중 분해 제품을 동시에 측정한다. 나노 기공 방법의 단일 분자 감도는 POMs가 핵 자기 공명 (NMR) 분광학에 필요한 것보다 훨씬 낮은 농도로 특징 지어질 수 있게 합니다. 이 기술은 화학자가 polyoxometalates 또는 다른 금속 클러스터의 분자 특성을 연구하고 POM 합성 공정을 더 잘 이해하고 수율을 향상시키는 새로운 도구역할을 할 수 있습니다. 가설적으로, 주어진 원자의 위치, 또는 분자 내의 단편의 회전, 및 금속 산화 상태는 이 방법으로 조사될 수 있었다. 또한, 이 새로운 기술은 용액내의 분자의 실시간 모니터링을 허용하는 장점이 있다.
서론
단일 분자 수준에서 생체 분자 분석을 검출하는 것은 나노 기공을 사용하고 이온 전류 변조를 측정하여 수행 할 수 있습니다. 전형적으로, 나노 기공은 그들의 제조에 따라 2개의 종류로 나뉩니다:생물학 (단백질 또는 DNA 종이접기에서 각자 조립된) 1,2,3,또는 고체 상태 (예를들어,제조된 반도체 처리도구) 4,5. 고체 나노 기공은 잠재적으로 물리적으로 더 견고하고 다양한 솔루션 조건에서 사용될 수 있지만, 지금까지 단백질 나노 기공은 더 큰 감도, 더 큰 대역폭, 더 나은 화학 물질을 제공합니다. 선택성, 그리고 더 큰 신호 대 잡음 비.
황색포도상구균α-헤몰리신(αHL)에 의해 형성된 것과 같은 다양한 단백질 이온 채널은 이온(예를들어,H+및 D+)을 포함한단일 분자를 검출하는데 사용될 수 있으며,2,3,폴리뉴클레오티....
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프로토콜
참고: 아래 프로토콜은 전자 생명 과학 (EBS) 나노 패치 DC 시스템에 특정합니다. 그러나, 평면 지질 이중층 멤브레인(표준 지질 이중층 막 챔버, U-튜브 기하학, 당겨진 미세 모세소 등)을 통해 전류를 측정하는 데 사용되는 다른 전기생리학 장치에 쉽게 적응할 수 있다. 상업적 물질및 그 출처의 식별은 실험 결과를 설명하기 위해 주어진다. 이 식별은 국립 표준 기술 연구소의 권고를 의미하지 않으며, 재료가 가장 이용 가능한 것이라는 것을 의미하지도 않습니다.
1. 솔루션 및 뉴스란슈트 준비
- Type-1 정수 시스템에서 18MΩ-cm 의 물로 모든 전해질 용액을 준비하여 미량 유기 종을 제거한 다음 이온 채널 녹화 직전에 0.22 μm 진공 필터를 통해 모든 전해질 용액을 필터링합니다.
참고: 수질은 멤브레인 나노기공 시스템의 안정성과 수명을 위한 중요한 요소입니다. - 와일드 타입 αHL.
- αHL 독소 단백질을 취급할 때 MSDS 예방 조치를 따르십시오.
- 1 mg/mL에서 18 MΩ-cm 물과 18 MΩ-cm 물과 동포화된 야생형 단조체 S. 아우레우스α-헤몰리신(α HL)....
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결과
지난 2년 동안 멤브레인 결합 단백질 나노미터 규모의 기공은 다재다능한 단일 분자 센서로 입증되었습니다. 나노기공 기반 측정은 실행하기가 비교적 간단합니다. 전해질 용액으로 채워진 2개의 챔버는 전기적으로 절연된 지질 막에 내장된 나노기공에 의해 분리됩니다. 패치 클램프 증폭기 또는 외부 전원 공급 장치는 전해질 저장소에 침지된 Ag/AgCl 전극을 통해 나노 기공 전체에 정전전위를 제공합니다. 전기장은 개별 하전된 입자를 기공안으로 유도하여 입자의 크기, 모양 및 전하에 따라 이온 전류가 일시적으로 감소합니다. 컴퓨터 프로그램은 적용된 전압을 제어하고 실시간으로 분자가 모공으로 가역적으로 분할하여 발생하는 이온 전류 봉쇄를 모니터링합니다. 저잡음, 고임피던스 전계 효과 트랜지스터를 사용하여 전류를 증폭및 전압으로 변환하고 데이터 수집 카드를 사용하여 디지털화됩니다.
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토론
음이온 전하로 인해 POM은 정전기 상호 작용을 통해 유기 카운터 양이온과 관련이 있습니다. 따라서 POM을 사용하여 복잡한 형성을 피하기 위해 적절한 용액 조건과 올바른 전해질 환경(특히 용액의 양이온)을 식별하는 것이 중요합니다. 버퍼 선택에서 특별한 주의가 필요합니다. 예를 들어, 트리스(hydroxymethyl)아미노메탄 및 구연산 완충액을 함유한 POM의 포획률은 인산 완충액의 경우보다 현저히 낮으며, 이는 처음 두 버퍼 중 하나가 POM을 사용하여 복합체를 형성하기 때문일 수 있습니다. 나노 기공과 강하게 상호 작용합니다. 더욱이, NaCl 전해질은 KCl(다른 알칼리 금속뿐만 아니라) 대신에 의도적으로 [PW11O39]7-by K+의 강수량을 피하기 위해 사용되었다.
체류 시간 분포의 정확한 측정에 중요한 것은 충분히 높은 대역폭에서 전류를 측정하는 능력입니다. 예를 들어, 기하급수적으로 .......
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감사의 글
우리는 박사 후 펠로우십 (J.E.)에 대한 유럽 분자 생물학 기구의 재정 적 지원과 NIH NHGRI (J.J.K.)의 보조금에 감사드립니다. 우리는 교수 진규 주와 세르게이 칼라치코프 (컬럼비아 대학) heptameric αHL을 제공하고, 교수 조셉 레이너 (버지니아 커먼 웰스 대학)와 영감을 토론에 대한 도움을 주셔서 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 나노패치 DC 시스템 | Electronic Biosciences, Inc., EBS | ||
| 밀리포어 LC-PAK | 밀리포어 진공 필터 | ||
| 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPhPC) | Avanti 극성 지질, 알라바스터, AL | 850356P | |
| Decane, ReagentPlus, ≥ 99%, | 시그마-알드리치 | D901 | |
| &알파; HL | 목록 생물학 연구소, 캠벨, 캘리포니아 | ||
| Ag 와이어 | Alfa Aesar | ||
| 2mm Ag/AgCl 디스크 전극 | 생체 내 메트릭 | E202 | |
| 고임피던스 증폭기 시스템 | Electronic Biosciences, 샌디에이고, 캘리포니아 | ||
| 석영 모세관 | |||
| 맞춤형 폴리카보네이트 테스트 셀 | |||
| 데이터 처리 및 분석 MOSAIC | https://pages.nist.gov/mosaic/ | ||
| 포스포텅스텐 산 수화물 | Sigma-Aldrich | 455970 | |
| 염화나트륨 | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| 인산나트륨 일염기성 일수화물 | Sigma-Aldrich | 71507 |
참고문헌
- Ettedgui, J., Kasianowicz, J. J., Balijepalli, A. Single molecule discrimination of heteropolytungstates and their Isomers in solution with a nanometer-scale pore. Journal of the American Chemical Society. 138 (23), 7228-7231 (2016).
- Bezrukov, S., Kasianowicz, J.
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재인쇄 및 허가
