Summary

Una estrategia eficiente para la generación de sistemas de transcripción binario tejidos específicos en Drosophila genoma editando

Published: September 19, 2018
doi:

Summary

Aquí, presentamos un método para generar sistemas de transcripción binario tejidos específicos en Drosophila sustituyendo el primer exón de la codificación de los genes con los conductores de la transcripción. El método basado en el CRISPR/Cas9 coloca una secuencia de transactivator bajo la regulación endógena de un gen sustituyó y en consecuencia facilita la expresión de transctivator exclusivamente en los patrones espacio-temporales de gene-específico.

Abstract

Sistemas de transcripción binario son poderosas herramientas genéticas utilizadas para visualizar y manipular el celular destino y expresión genética en grupos específicos de células o tejidos en organismos modelo. Estos sistemas contienen dos componentes como líneas transgénicas. Una línea de conductor expresa un activador transcripcional bajo el control de promotores específicos de tejido/potenciadores y un puertos de línea de reportero/efector un gene de la blanco se coloca aguas abajo para el sitio de unión del activador de transcripción. Animales que ambos componentes inducen la transactivación específica de tejido de una expresión del gen objetivo. Precisa expresión espaciotemporal del gen en tejidos específicos es fundamental para la interpretación objetiva de la actividad del gene de la célula. Por lo tanto, es esencial el desarrollo de un método para generar líneas exclusivo controlador de células/tejidos específicos. Aquí presentamos un método para generar sistema de expresión específicos altamente específica de tejido mediante el empleo de un “cluster regularmente Interspaced corto palindrómico Repeat/CRISPR-asociados” (CRISPR/Cas)-basado en genoma edición técnica. En este método, la endonucleasa Cas9 está dirigido por dos quimérica guía RNAs (gRNA) a sitios específicos en el primer exón de la codificación de un gen en el genoma de Drosophila para crear roturas de doble cadena (DSB). Posteriormente, usando un plásmido donante exógeno que contenga la secuencia del transactivator, la maquinaria de reparación celular autónoma permite reparación dirigida de homología (HDR) del OSD, dando por resultado la eliminación precisa y reemplazo del exón con el transactivator secuencia. El transactivator noqueó en se expresa exclusivamente en las células donde el cis-elementos regulatorios del gen sustituyó son funcionales. El protocolo paso a paso detallado presentado aquí para generar un controlador transcripcional binario expresado en Drosophila fgf/servicios-produciendo células epiteliales/neuronales puede adoptarse para cualquier expresión del gene o tejido específico.

Introduction

La caja de herramientas genética para genes específicos se ha desarrollado bien en Drosophila, convirtiéndolo en uno de los mejores sistemas de modelo para investigar la función de genes implicados en una amplia variedad de procesos celulares. Sistemas de expresión binaria, como levadura Gal4/UAS (secuencia de activación upstream), primero fue adoptada para regiones reventado y gen potenciador de tejidos específicos en el modelo genético de Drosophila 1 (figura 1). Este sistema facilita el desarrollo de un gran número de técnicas tales como la regulación espacio-temporal de sobreexpresión de genes, regiones, golpe de gracia en determinados grupos de células, así como en la ablación de la célula, marca de celular, en rastreo de celulares y moleculares procesos en el embrión y los tejidos, rastreo de linaje y mosaico análisis durante el desarrollo. Un número del sistema binario de la transcripción, como la bacteriana LexALexAop (figura 1) y Q-sistema de Neurospora , son poderosas herramientas genéticas que son ampliamente utilizados en Drosophila, además el original sistema de Gal4/UAS dirigida gene expresión1,2,3.

Aquí, presentamos un método para generar sistema fiable expresión binaria de tejidos específicos mediante el empleo de una técnica de edición del genoma. Los recientes avances en la tecnología de edición CRISPR/Cas9 genoma han permitido oportunidades sin precedentes hacer cambios de genoma dirigido en una amplia gama de organismos. En comparación con las otras técnicas de edición de genoma disponible, el sistema CRISPR/Cas9 es barato, eficiente y confiable. Esta tecnología utiliza componentes del sistema inmune adaptativo bacteriano: una endonucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes que crea una rotura de doble cadena (DSB) y un ARN quimérico guía (gRNA), que guía la Cas9 a un sitio particular del genoma para específicas OSD4. Las células contienen la maquinaria para reparar el OSD mediante diferentes vías. No homólogos se terminan uniendo (NHEJ) lleva a pequeñas inserciones o eliminaciones interrumpir funciones de los genes, mientras que la reparación dirigida de homología (HDR) presenta un definida dirigida/deseable genómico knock-en/knock-out mediante un donador exógeno de HDR como una plantilla. La estrategia de reemplazo basada en HDR puede utilizarse eficientemente para generar un sistema altamente confiable expresión binaria de tejidos específicos, que puede superar todas las limitaciones de los métodos de trampa tradicional potenciador. Describimos un procedimiento paso a paso para la utilización de reparación HDR CRISPR/Cas9-basado en la generación de una línea de controlador binario de transcripción que se expresa bajo el control de la regulación transcripcional y postranscripcional endógena de un Drosophila gen. En este protocolo, se demuestra la generación de una línea de controlador específica para servicios (bnl) gen codificando una proteína familia FGF que regula la morfogénesis ramificación de la vía aérea traqueal epitelio5. En este ejemplo, el primer exón de la codificación del gene del bnl fue substituido por la secuencia de una secuencia de transactivator bacteriana LexA sin alterar cualquier endógeno cis-secuencias reguladoras del gene del bnl . Nos muestran que la estrategia genera una línea de conductor de bnl-LexA que spatiotemporally controla la expresión de un gen reportero colocado aguas abajo de LexAoperator (LexAop o LexO) exclusivamente en bnl- expresando las células epiteliales/mesenquimales/neuronal.

Protocol

1. diseñar y construir el gRNA Vector de expresión Para sustituir precisamente una región larga definida de un exón, utilice un gRNA doble enfoque6, en el cual cada gRNA puede apuntar específicamente a dos extremos de la región seleccionada de interés. Para obtener la precisa expresión espaciotemporal gene-específica del controlador, seleccione dos sitios de destino de gRNA dentro del primer exón de la codificación del gene. Para Drosophila melanogaster<…

Representative Results

Este protocolo fue utilizado con éxito para generar una expresión binaria específica reportero sistema específica para bnl expresando células5. El cis-elementos reguladores (CREs) que controlan la expresión espaciotemporal complejo bnl no caracterizan. Por lo tanto, para lograr expresión espacio-temporal bajo el control de la secuencia de regulación endógena bnl , solamente el primer exón codificación de bnl f…

Discussion

Tradicionalmente, las trampas de potenciador de Drosophila fueron generadas por dos métodos diferentes. Una de las formas incluye inserción al azar de un conductor (ej., Gal4) secuencia en el genoma por transposición (e.g., transposición de elemento P)1 . Por otra parte, las secuencias de controlador pueden colocarse bajo el control transcripcional de una región enhancer putativos/promotor en una construcción del plásmido, que luego se integrarían en un sitio ect…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos Dr. F. Port, Dr. K. o ‘ Connor-Giles y el Dr. S. Feng debates sobre estrategia CRISPR; Dr. T.B. Kornberg y el centro de Stock de Bloomington de reactivos; Instalaciones de centrales de UMD; y el financiamiento de NIH: R00HL114867 y R35GM124878 al SR.

Materials

X-Gal/IPTG Gentrox (Genesee Scientific) 18-218 cloning
LB-Agar BD Difco BD 244520 cloning
Tris-HCl Sigma Aldrich T3253 Molecular Biology
EDTA Sigma Aldrich E1161 Molecular Biology
NaCl Sigma Aldrich S7653 Molecular Biology
UltraPure DNase/RNase-Free Water ThermoFisher Scientific 10977-023 Molecular Biology
10%SDS Sigma Aldrich 71736 Molecular Biology
KOAc Fisher-Scientific P1190 Molecular Biology
EtOH Fisher-Scientific 04-355-451 Molecular Biology
GeneJET Miniprep ThermoFisher Scientific K0503 Miniprep
PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits ThermoFisher Scientific K210006 Maxiprep
BbsI NEB R0539S Restriction enzyme
Primers IDT-DNA PCR
pCFD4 Kornberg Lab DNA template and vector for gRNA
KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems) Kapa biosystems KK2601 PCR
Q5-high fidelity Taq NEB NEB #M0491 PCR
Gibson Assembly Master Mix NEB NEB #E2611 DNA assembly
pBPnlsLexA:p65Uw Addgene DNA template for LexA amplification
Proteinase K ThermoFisher Scientific 25530049 Molecular Biology
2x PCR PreMix, with dye (red) Sydlab MB067-EQ2R Molecular Biology
Gel elution kit Zymo Research (Genesee Scientific) 11-300 Molecular Biology
TRI reagent Sigma-Aldrich Molecular Biology
Direct-zol RNA purification kits Zymo Research (Genesee Scientific) 11-330 Molecular Biology
OneTaq One-Step RT-PCR Kit NEB E5315S Molecular Biology
lexO-CherryCAAX Kornberg Lab Fly line
UAS-CD8:GFP Kornberg lab Fly line
btl-Gal4 Kornberg lab Fly line
MKRS/TB6B Kornberg lab Fly line
Confocal Microscope SP5X Leica Imaging expression pattern
CO2 station Genesee Scientific 59-122WCU fly pushing
Stereo microscope Olympus SZ-61 fly pushing
Microtube homogenizing pestles Fisher-Scientific 03-421-217 genomic DNA isolation
NanoDrop spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-1000 DNA quantification

References

  1. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  2. Lai, S. -. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nature Neuroscience. 9 (5), 703-709 (2006).
  3. Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
  4. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  5. Du, L., Zhou, A., Patel, A., Rao, M., Anderson, K., Roy, S. Generation of a targeted expression system for branchless and characterization of novel cellular expression patterns of the gene in Drosophila. Developmental Biology. 427 (1), 35-48 (2017).
  6. Port, F., Chen, H. -. M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), E2967-E2976 (2014).
  7. Gratz, S. J., Rubinstein, C. D., Harrison, M. M., Wildonger, J., O’Connor-Giles, K. M. CRISPR-Cas9 Genome Editing in Drosophila. Current Protocols in Molecular Biology. 111 (1), (2015).
  8. Doench, J. G., Hartenian, E., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  9. Port, F., Bullock, S. L. Augmenting CRISPR applications in Drosophila with tRNA-flanked sgRNAs. Nature Methods. 13 (10), 852-854 (2016).
  10. Beumer, K. J., Trautman, J. K., Mukherjee, K., Carroll, D. Donor DNA Utilization During Gene Targeting with Zinc-Finger Nucleases. G3. 3 (4), 657-664 (2013).
  11. Pfeiffer, B. D., Ngo, T. -. T. B., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).
  12. Lin, C. -. C., Potter, C. J. Editing Transgenic DNA Components by Inducible Gene Replacement in Drosophila melanogaster. Genetics. 203 (4), 1613-1628 (2016).
  13. Li, W., Köster, J., et al. Quality control, modeling, and visualization of CRISPR screens with MAGeCK-VISPR. Genome Biology. 16 (1), 281 (2015).

Play Video

Cite This Article
Du, L., Zhou, A., Sohr, A., Roy, S. An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing. J. Vis. Exp. (139), e58268, doi:10.3791/58268 (2018).

View Video