Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Потенцирование эффективности противоопухолевой антитела, противоопухолевые препараты: обнаружение антител наркотиков синергизм с помощью комбинации индекс уравнения

Published: January 19, 2019 doi: 10.3791/58291
Automatic Translation
*1, *1, *1,2, *1, *1,3, *1,3
1Centre de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes Angers (CRCINA), Institut national de la santé et de la recherche médicale (INSERM), Université d'Angers, Université de Nantes, Nantes, France, 2Service de chirurgie pédiatrique, Centre hospitalier universitaire (CHU) de Nantes, Nantes, France, 3Unité de Formation et Recherche (UFR) des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques, Université de Nantes, Nantes, France
* These authors contributed equally

Summary

Этот протокол описывает как оценивать синергизм между противоопухолевой антитела и противоопухолевые препараты в доклинических моделях, используя сочетание индекс уравнение Чжоу и Талалай.

Abstract

Потенцирование враждебных моноклональных антител (МАБ), химиотерапевтические агенты представляет собой ценный стратегию для разработки эффективных и безопасных терапия против рака. Здесь мы предоставляем протокол для выявления рациональное сочетание на доклинических шаг. Во-первых мы расскажем на основе ячеек пробирного оценивать синергизм между противоопухолевой МАБ и цитостатическими препаратами, который использует сочетание индекс уравнение Чу и Талалай1. Это включает в себя измерение из опухолевых клеток наркотиков - и антитела чувствительность с помощью MTT assay, следуют анализ автоматизированной компьютерной для вычисления значения индекса (CI) сочетание. CI значений < 1 указывают синергизм между протестированных mAbs и цитотоксических агентов1. Для подтверждения в vitro выводы в естественных условиях, мы далее описания метода оценить эффективность режима комбинации в модели ксенотрансплантата опухоли. В этой модели комбинированные препараты значительно задерживает рост опухоли, что приводит к значительным расширенной выживания по сравнению с одного агента управления. Важно отметить, что эксперименты в естественных условиях показывает, что сочетание режим хорошо переносится. Этот протокол позволяет эффективной оценки комбинации противоопухолевых препаратов в доклинических моделях и выявление рациональное сочетание для оценки в клинических испытаниях.

Introduction

Обычный подход в лечении большого числа различных типов рака была основана на монотерапии. Даже если он по-прежнему используется во многих случаях, этот метод встретились несколько препятствий, ведущих к выбирают для комбинированной терапии-2. В частности раковые клетки более чувствительны к развивать устойчивость при обработке одного препарата, вызывая альтернативных выживания механизмы3, что приводит к терапевтической неудачи в больных4. Кроме того в монотерапии, препараты обычно управляются в высокой дозе. Эта ситуация часто приводит к возникновению сильного дозозависимый побочных эффектов, которые могут быть нетерпимым и силы врачей, чтобы остановить лечение2. По этим причинам, Ассоциация противораковые молекул является теперь предпочитают монотерапия.

Идеальные наркотики комбинации будут те, которые действуют в синергии против опухолевых клеток, без увеличения токсичности против нормальных клеток. Синергизм относится к взаимодействию двух или более препаратов, что терапевтический эффект больше, чем сумма каждого индивидуального наркотиков, действуя отдельно. Такое взаимодействие может привести к расширенной клинических терапевтическую эффективность2. Это ограничивает лечение сопротивления, увеличивает эффективность и может также уменьшить токсичность2. В самом деле дозировка каждого препарата может уменьшиться до снижения их побочные эффекты по ориентации различных путей. Кроме того один из молекул может также служить информирования агент против раковых клеток. Действие второго препарата может быть повышена на сенсибилизированных клеток и меньше дозах может быть использоваться5.

Комбинированная терапия может включать два или более химиотерапевтических препаратов и/или биопрепаратов, например моноклональные антитела6. Эти mAbs конкретно клетки, выражая клеток поверхностного антигена интереса и способны убить опухолевые клетки иммунологической путями, включая клеточный цитотоксичности антител зависимые (ADCC), с участием иммунных эффекторных клеток 7и дополнения зависимой цитотоксичности (CDC)6. Они также могут действовать через механизм-иммунологические, посредничестве апоптоз8,9,10,11. В этом случае индукции процесс запрограммированной смерти клетки могут информирования раковые клетки, ослабляют их функции и сделать более эффективным связанные химикотерапевтическое лекарство в нижней дозировке. Таким образом МАБ проапоптотических являются хорошими кандидатами для проектирования схемы комбинации с противоопухолевые препараты.

Были описаны различные математические модели для оценки синергизма наркотиков; один из них основан на комбинации индекс метод1. Этот метод основан на принципе медиана эффект, разработанная Чжоу1. Медиана эффект уравнение коррелирует дозу препарата и наркотический эффект следующим образом.

Equation 1

D здесь, доза препарата; DM -медиана эффекта доза; Фа — часть пострадавших от дозы; m является экспонента, что означает форму доза эффект участок1. Медиана эффекта дозу используется для расчета дозы Dx препарат, который подавляет или убивает «x» % клеток. Значение CI затем вычисляется для оценки аддитивный эффект препарата комбинации, следующим1.

Equation 2

Значение CI 1 указывает аддитивный эффект и CI значение < 1 указывает синергетический эффект, в то время как значение CI > 1 указывает антагонизм1. Применение этого метода также способствует наличие компьютерной программы, CompuSyn, который определяет синергизм и антагонизм при всех дозах или уровни воздействия имитируемых автоматически12.

Наша группа разработала конкретные 8B6 МАБ для O-ацетил GD2 Ганглиозиды (OAcGD2) нейробластома антигена13 и далее показал, что этот МАБ способны вызвать смерть клетки с атрибутами апоптоз11. Чтобы проверить ли МАБ 8B6 может информировать нейробластома клетки Топотекан противоопухолевого агента, мы адаптировали вышеупомянутый метод, разработанный Чжоу1. Во-первых мы определить значения эффективной дозы 50 (50Эд) МАБ 8B6 и Топотекан. Далее нейробластома клетки с равномощного соотношением двух соединений, основанной на ценностях50 Эд подвергаются для определения CI значений с помощью вышеупомянутых моделирования программного обеспечения. Этот метод позволяет нам продемонстрировать синергизм между 8B6 и Топотекан МАБ в пробирке. Далее мы опишем протокол для дальнейшей оценки потенции и безопасность этой комбинации режим в естественных условиях. Этот протокол может легко применяться для выбора комбинации химиотерапевтического агента и мощным и безопасным противораковые МАБ в доклинических исследованиях. Схематическое представление этого исследования приводится на рисунке 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Животных и экспериментальной процедуры были утверждены правительством Франции (соглашений #C44-278 и #APAFIS 03479.01). Уход за животными и процедуры были проведены согласно директиве ЕС 2010/63/ЕС и французский закон #2013-118 по защите животных, используемых для научных целей.

1. Оценка наркотиков взаимодействие между 8B6 МАБ и Топотекан In Vitro

  1. 96-луночных пробоподготовки
    Предупреждение: Консультации Комитета института охраны здоровья и безопасности и следовать правилам местные правила, связанные с безопасностью лаборатории. Просмотрите сведения о материала и лист данным по безопасности перед началом работы с СМИ, клеточных линий или реагенты. Используя стерильную методику и работать в Ламинарный шкаф. Все решения/оборудование, которые используются для манипулирования клетки должны быть стерильными.
    Примечание: Следующий протокол был разработан для использования с адэрентных клеток. Изменения требуется применить этот метод к nonadherent клеткам, растущих в подвески; Этот протокол использует составленном для каждого экспериментальные условия.
    1. Растут IMR5 клетки в колбе T75.
    2. В первый день (день 0) соблюдайте культуру клеток под микроскопом, чтобы проверить confluency клеток. Аспирационная средой клеток из колбы, промойте его с 5 мл физиологического раствора фосфатного буфера (PBS) и добавить 3 мл 0,05% Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) / PBS решения. Возвращение колбу в инкубатор для 3 мин (37 ° C, 5% CO2).
    3. Изучение культуры клеток под микроскопом для ячейки отряда.
      Примечание: В случае необходимости, вернуть настой инкубатора для дополнительных 3-5 мин, в зависимости от типа клеток опухоли.
    4. Добавить 10 мл среднего полного клеток в колбу и передать стерильные 15 мл конические суспензию клеток. Центрифуга клетки для 5 мин на 300 x g. Подсчет количества ячеек с помощью Горяева.
    5. Снимите и выбросьте супернатант. Ресуспензируйте Пелле клеток в полный рост среднего. Средняя громкость для получения конечной концентрации 1 х 105 клеток/мл.
    6. Уэллс семян 84 96-луночных культуры плиты с 104 ячейки, которая является 100 мкл суспензии клеток. Следуйте экспериментальной макета показан на рисунке 2.
    7. Инкубируйте клетки для 18 h в инкубаторе клеток (37 ° C, 5% CO2).
  2. Подготовка раствора препарата
    Примечание: Для исследования наркотиков/МАБ сенсибилизации, изменения сроков, продолжительности и лечения концентрация для удовлетворения конкретных наркотиков/МАБ в вопросе. Обратите внимание, что начальной концентрации 3 x конечной концентрации.
    1. На следующее утро (день 1), подготовить следующие решения наркотиков, используя полный рост среднего.
      1. МАБ приготовления раствора
        1. Разбавьте МАБ в 500 мкл полный рост средних для получения антител рабочего раствора с концентрацией МАБ по 240 мкг/мл.
        2. Выполните пять серийных разведений два раза, как указано на рисунке 2.
      2. Топотекан приготовления раствора
        1. Разбавить, как выше, препарата в 500 мкл полный рост средних для получения рабочего раствора препарата с конечной концентрации 120 Нм.
        2. Выполните пять серийных разведений два раза, как указано на рисунке 2.
      3. Антитела и наркотиков приготовления раствора
        1. Развести препарат и МАБ решения в 500 мкл полный рост средних и получить решение в 120 Нм наркотиков и МАБ 240 мкг/мл (рабочий раствор).
        2. Выполните пять серийных разведений два раза, как указано на рисунке 2.
    2. Приехать в конечной концентрации, передачи 50 мкл раствора каждого препарата в соответствующие ячейки, как указано в экспериментальной макет ( рис. 2).
      Примечание: Передачи 50 мкл среднего полного роста в необработанной ячейки скважины, как указано на рисунке 2.
    3. Инкубируйте клетки для 72 h в инкубатор (37 ° C, 5% CO2).
  3. MTT пробирного
    1. Добавьте 10 мкл раствора реагента МТТ в каждой скважине.
    2. Инкубируйте при 37 ° C в течение 4 ч.
    3. Добавить 100 мкл раствора (10% SDS в 0,01 М HCl) лизиса в каждой скважине, используя многоканальные пипетки и тщательно перемешать, закупорить.
    4. Инкубируйте при 37 ° C для 4 h в камере увлажненные (95% влажность).
    5. Читайте поглощения в 570 Нм (570) и 620 Нм (620) с помощью спектрофотометра.
      Примечание: Mix каждый образец снова закупорить перед чтением поглощения; поглощения в 620 Нм позволяет коррекции неспецифических фоновых значений.
    6. Рассчитать исправленные поглощения: исправлены поглощения =570-620.
    7. Рассчитать следующим образом жизнеспособность клеток: клетки жизнеспособность = 100 x (образец означает исправленный поглощения / управления означает исправленный поглощения).
    8. Рассчитать часть пострадавших значения (ФА), используя следующее уравнение: 1 - (образец означает исправленный поглощения / управления означает исправленный поглощения).
  4. Наркотиков взаимодействия аналитического моделирования программного обеспечения для сингла и наркотиков сочетание исследования
    1. Запустите программное обеспечение моделирования, чтобы открыть окно начать.
    2. Нажмите на кнопку Новый эксперимент , чтобы открыть главное окно.
    3. В окне имя введите имя эксперимента.
      Примечание: Может быть добавлено в окне даты .
    4. Нажмите на кнопку Новый одного препарата .
    5. Введите имя в поле Полное имя .
    6. Введите сокращение в окне Abbrev .
    7. Введите единица концентрации препарата в окне единицы .
    8. Введите Данные точки 1 доза и Fa значение, нажмите клавишу Enter.
    9. Повторите этот шаг для всех точек данных вводятся.
    10. Нажмите на кнопку Готово .
    11. Выполните те же шаги для ввода точки данных МАБ.
      Примечание: Используйте тот же блок концентрации как используется наркотиков.
    12. Нажмите на кнопку Новый препарат комбо .
    13. Выбор препарата и МАБ.
    14. Постоянный коэффициент и нажать на кнопку ОК.
    15. Введите имя в поле Полное имя .
    16. Введите сокращение в окне Abbrev .
    17. Введите коэффициент наркотиков/МАБ в окне отношение .
    18. Введите Данные точки 1 доза и нажмите Enter.
      Примечание: Программа будет автоматически вычислять дозы МАБ и комбо.
    19. Введите значение Данных точки 1 фа и нажмите клавишу Enter.
    20. Повторите этот шаг для всех точек данных вводятся.
    21. Нажмите на кнопку Готово , а затем нажмите на кнопку Создать отчет .
    22. Выберите наркотиков и МАБ и затем нажмите кнопку ОК.
    23. Выберите комбо и затем нажмите кнопку ОК.
    24. Выберите заголовок, CI таблицаи Сводная таблица. Затем нажмите кнопку ОК.
    25. Введите имя файла, анализ файла и нажмите кнопку сохранить для создания отчета.
      Примечание: После нажатия кнопки OK, отчет автоматически откроется в веб-браузере на компьютере по умолчанию.
    26. Чтобы напечатать отчет, выберите Печать из меню файл веб-браузера. В докладе содержится резюме раздел таблицы, которая включает в себя название, Дата, имя файла, к сведению описание, параметры (m, Dm и r), Эд50 для агента либо в монотерапии или в комбинации и в таблице CI для каждой комбинации Эд50, Эд 75, Эд90и95Эд.
      Примечание: CI значение < 1 указывает синергизм, значение CI = 1 указывает аддитивности и значение CI > 1 означает антагонизм.

2. поколение человеческой нейробластомы ксенотрасплантатов Nonobese Диабетическая NOD Scid гамма мышей (ГЯП мышей)

Примечание: Исключите любое загрязнение клеточной культуры. Поскольку матрица базальной мембраны образует гель выше 5 ° C, все cultureware или СМИ, контактирующих базальной мембраны матрица Реагент должен быть prechilled /-ледяной. Держите базальной мембраны матрицы на льду во время всего процесса.

  1. Приготовление суспензии клеток IMR5
    1. Оттепель на ночь реагент матрица базальной мембраны, погрузив флакона в лед в холодильнике 4 ° C перед использованием.
    2. В день 0 урожай культивировали IMR5 клетки как описано выше.
    3. Передать клетки 15 мл Конические трубки и центрифуги на 300 x g за 5 мин.
    4. Выбросите супернатант. Вымыть клетки 2 x 15 мл ледяной PBS и готовят суспензию клеток 5 x 107 клеток/мл в ледяной PBS.
      Примечание: При необходимости, передавать суспензию клеток пробки microcentrifuge 1,5 мл.
    5. Вихрем флакона матрица базальной мембраны.
      Примечание: Реагент матрица базальной мембраны следует разморозить и разошлись.
    6. Добавить один объем реагента матрица базальной мембраны и смешайте его закупорить для получения суспензии клеток 2,5 x 107 клеток/мл.
    7. Держите суспензию клеток на льду.
  2. Подготовка мышей
    Примечание: Мышей должно быть шесть-семь недель.
    1. Сохранить мыши под условие конкретного возбудителя бесплатно.
    2. Разрешить период акклиматизации три - пять дней после того, как прибыли мышей.
    3. В день прививки, брить фланге, где будет инъекции (см. шаг 2.3.6).
  3. Подготовка инъекции клеток опухоли
    Примечание: Держите суспензию клеток матрицы ледяной базальной мембраны асептики во всей процедуре.
    1. Сочетание клетки и аккуратно нарисуйте суспензию клеток в 1 мл шприц с иглой 21 G.
    2. Проверьте, чтобы убедиться, что есть нет пузырьков воздуха в шприц.
    3. Лечить области прививка мыши с антисептическим раствором.
    4. Осторожно выжмите мыши кожи на фланге между пальцами, в месте инъекции.
    5. Вставьте иглу точно в складке кожи. Не устанавливайте иглы глубоко в ткани, чтобы обеспечить подкожных инъекций.
    6. Inject 100 мкл суспензии клеток IMR5 (т.е., 2,5 х 106 клеток), подкожно в нижнем правом фланге мышей.
    7. Вращайте для предотвращения утечки и снять иглу шприца.
  4. Мониторинг изменения веса тела и роста опухоли
    1. Измерьте длину (A) и (B) Ширина опухоли с суппортом.
    2. Рассчитайте объем опухоли, по формуле (A x B2) x 0.5.
    3. Начало терапии при опухоли достигли средний объем3~ 50-60 мм.

3. наркотиков и администрации антитела у мышей

  1. Внутривенное МАБ 8B6
    1. Внимательно заполните 1 мл шприц, монтируется с 25 G иглой с МАБ решения.
    2. Поместите курсор мыши под лампой тепла за 10 мин до расширяются вены хвост.
    3. Останови мыши в грызунов фиксатор.
    4. Лечить области прививка мыши с антисептическим раствором.
    5. Вставьте иглу параллельно хвост вен, проникая 2-4 мм в просвет при сохранении скос иглы лицом вверх (рис. 3A).
    6. Придать 100 мкл антител раствора внутривенно (и.в.).
    7. По завершении инъекции нежно давление инъекции для предотвращения кровотечения.
  2. Внутрибрюшинное администрация топотекан
    1. Нарисуйте раствор препарата в 1 мл шприц, монтируется с помощью иглы, 25 G.
    2. Удерживайте кнопку мыши в лежачем положении, с ее задний конец слегка повышен.
    3. Лечить области прививка мыши с антисептическим раствором.
    4. Найдите средней линии живота мыши и мысленно разделить квадрантов брюшной полости. Найдите место инъекции в правом или левом нижнем квадранте (рис. 3B).
    5. Вставьте иглу в брюшную полость (5 мм в глубину) на ~ 10° угол, в правом или левом нижнем квадранте.
    6. Придать внутрибрюшинно 100 мкл раствора препарата (и.п.).
    7. Лечить сайт прививка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Представитель результаты и показатели приспособлены с разрешения из ранее опубликованных работ14.

Анти-OAcGD2 МАБ 8B6 синергически повышает ингибирующее воздействие Топотекан на нейробластома рост клеток линии:

Создание препарата и концентрации антител которые будут использоваться для оценки синергизма между топотекан и МАБ 8B6, препарат и антитела чувствительности человеческого IMR5, нейробластома клетки были измерены во-первых, используя assay МТТ. Воздействие МАБ 8B6 или Топотекан только за 72 ч привели к концентрации зависимых ингибитирование IMR5 жизнеспособность клеток (рис. 4A). Доза реакция кривых позволило расчет Эд50 значения для каждого соединения. С этой целью ОС ценностей были рассчитаны с использованием программного обеспечения для моделирования анализа. Рассчитанные значения50 Эд были найдены 10 ± 1 Нм для Топотекан (рис. 4B) и 18 мкг/мл ± 3 для 8B6 МАБ (данные не показаны).

Основываясь на этих значениях50 Эд, далее, потенция шести комбинационный равномощного, коэффициенты 8B6 МАБ и Топотекан были протестированы (рис. 2). Сдвиг кривой доза реакция комбинации к чувствительной стороне графа показывает, что сочетание режим является более мощным, чем каждый монотерапии (рис. 4A). Для получения соответствующего Эд50 и CI значения, вычисленные ОС ценностей. Эд50 значения Топотекан были значительно ниже в присутствии 8B6 МАБ (p < 0,05, рис. 4B), указывающее что МАБ 8B6 знакомит опухолевых клеток в Топотекан. Важно отметить, что значения CI были значительно меньше, чем 1.0 (p < 0,05), демонстрируя синергетического взаимодействия (рис. 5). Таким образом МАБ 8B6 имеет потенциал как терапевтического агент адъювантной химиотерапии Топотекан.

Анти-OAcGD2 МАБ 8B6 повышает противоопухолевую активность Топотекан In Vivo

Потому что в vitro модели не принимать во внимание период полувыведения препарата ни метаболизма препарата, необходимо подтвердить в vitro выводы в естественных условиях. Кроме того в естественных условиях модели являются весьма полезным оценить сочетание режима безопасности. Чтобы подтвердить, что синергизм между топотекан и МАБ 8B6, характерных для раковых клеток, antineuroblastoma эффекты комбинированной терапии в модели ксенотрансплантата опухоли были оценены. Для этого был выбран тяжелой иммунодефицитных штамм мыши ГЯП. Эти мыши не хватает как врожденный, так и адаптивной иммунной системы15и таким образом, сделать это возможным для исследователей, чтобы исключить любой иммуномодулирующих эффектов, вызванных Топотекан терапии, которые могут повлиять на МАБ потенции. Лечение было начато после того, как опухоли отображается средний объем 50 ± 2,5 мм3 (рис. 6A). Лечения состоял из 8B6 либо МАБ (150 мкг и.в., день 7 и 11 день), топотекан (0,36 мг/кг и.п., 7-11 дней), или сочетание МАБ 8B6 и Топотекан. Опухоль томов осуществлялся в ходе экспериментов. Все терапии привело к замедления роста опухоли, по сравнению с контрольными группами (рис. 6A). Сочетание режима, однако, индуцированной сильнейший эффект (рис. 6A).

Рост опухоли могут быть далее проанализированы для изучения выживаемости после лечения. С этой целью событий, что приводит к эвтаназии мыши был определен как опухоль объем ≥ 1 см3 по этическим соображениям. Это позволило нам провести анализ Каплана-Мейера выживания и рассчитать время медиана выживаемости без событий для каждой экспериментальной группы. Как показано на рисунке 6B, обе монотерапии существенно улучшились событие свободных выживания (EFS) по сравнению с контрольными группами (медиана EFS транспортное средство лечение группы был 21 дня группы топотекан, 26 дней; группы управления антитела, 22 дней ; МАБ 8B6 группы, 29 дней [Рисунок 6B]). Тем не менее комбинированной терапии был сильнейший эффект на выживание мышей, при этом средний показатель EFS, продлен до 39,5 дней (p < 0,05, МАБ 8B6 vs. комбинации; p < 0.01, топотекан против сочетание [Рисунок 6B]).

Потому что синергетического взаимодействия может привести к увеличению токсичности, сочетание режима безопасности необходимо оценивать. Таким образом потеря веса часто используется как маркер чувствительным для наблюдения за работоспособностью в грызунов16. Таким образом, вес потеря измеряется как снижение в процентах от первоначального веса-была сохранена как показатель системных переносимость каждого режима испытания. Было отмечено отсутствие потери веса тела, предполагая, что лечение было хорошо переносится (рис. 7). Эти данные показывают, что сочетание Топотекан плюс МАБ 8B6 представляет более мощным противоопухолевая эффективность в естественных условиях чем либо агент самостоятельно, без обнаружению токсичности.

Figure 1
Рисунок 1 : Схематическое представление исследования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Макет комбинацию эксперимента на 96-луночных тарелку с соотношением Топотекан МАБ 8B6, подготовленных как шесть решений. Решения были подготовлены как описано в протоколе. Уэллс, помечены 1-4 служат МАБ 8B6 решения, колодцы, помечены 5-8 служат Топотекан решения, и скважины, помечены 9-12 служить МАБ 8B6 и Топотекан (комбинация) решения. Уэллс, помечены A и H служить как элементы управления; Уэллс, помечены B служат 0,125 x Эд50 концентрации наркотиков решения; Уэллс, помечена буквой C служить 0.25 x Эд50 концентрации наркотиков решения; Уэллс, помечены D служат 0.5 x Эд50 концентрации наркотиков решения; Уэллс, помечены E служить как Эд50 концентрации наркотиков решений; Уэллс, помечены F служат 2 x Эд50 концентрации наркотиков решения; Уэллс, помечена буквой G служат 4 x Эд50 концентрации наркотиков решений, как указано. Терапевтических агентов с двумя различными подразделениями (например, мкг/мл для mAb 8B6 и Нм для Топотекан) анализируются в фиксированный коэффициент комбинации (0,075, топотекан/8B6). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Инъекции. (A) внутривенные инъекции в Вену хвост сдержанной мыши, с помощью шприца инсулин 27 G x 1/2 дюйма, 1 мл. (B) внутрибрюшинного введения в нижнем правом квадранте живота мыши, используя 1 мл шприц, монтируется с помощью иглы, 25 G. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Доза эффект отношения топотекан, МАБ 8B6 и их сочетанием воздействия на торможение роста жизнеспособность клеток нейробластомы IMR5 после 72 ч. MTT assay была выполнена, как описано в протоколе. (A) доза реакция кривых показано представитель трех независимых реплицирует, каждый запустить в quadruplicates. Данные представлены как среднее ± SD; p < 0,001. (B) Эд50 Топотекан используется как одного агента или в сочетании с 8B6 МАБ. Данные представлены как среднее ± SEM. Эта цифра была изменена от Фарадж и др. 14. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Figure 5
Рисунок 5 : Сочетание значений индекса. Процент выживания значения были преобразованы в пострадавших от фракции (ФА) значения и используется для вычисления индекса комбинации (мера взаимодействия, аддитивности и антагонизм) с использованием компьютерного программного обеспечения, как указано в тексте. В комбинации индекс участков данные представлены как означает ± SD для трех независимых реплицирует. Результаты показывают, что 8B6 МАБ был синергетический эффект с Топотекан (CI < 1). Эта цифра была изменена от Фарадж и др. 14. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6 : Сочетание лечения IMR5 ксенотрасплантатов ГЯП мышей с МАБ 8B6 плюс Топотекан. (A) мышах с учетом человеческой нейробластомы IMR5 ксенотрасплантатов лечили транспортного средства (PBS, и.п.), топотекан только (0,36 мг/кг, и.п.), управление только IgG (150 мкг, и.в.), МАБ только 8B6 (и.в.) или топотекан и МАБ 8B6 комбинированные, как указано. Администрация лечения антитела mAb 8B6 или управления начал на 7 день после прививки IMR5 клеток и повторяется один раз на 11 день. Топотекан или PBS лечения был запущен на 7 день и за пять дней подряд. Контроль роста опухоли и опухоли томов были рассчитаны. Средняя опухоли объем ± SEM каждой группе лечения (PBS группы, 9 мышей; все другие группы, 10 мышей) изображены (* p < 0,05 для mAb 8B6 против 8B6 МАБ и вместе, топотекан ** p < 0.01 Топотекан против МАБ 8B6 и Топотекан вместе), как указал. Для mAb 8B6/Топотекан комбинации, по сравнению с наркотиками только элементы управления, как указано (p < 0,05) наблюдалось значительное снижение объема ксенотрансплантата. (B) событий бесплатно показываются выживания Каплана-Мейера кривых различных групп относились. Эта цифра была изменена от Фарадж и др. 14. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7 : Средний вес для каждой группе лечения, как указано. Средний вес мышей на день 0 был определен как 100% вес. Вес в каждой группе оставалась стабильной в период лечения. Данные представлены как среднее ± SEM. Эта цифра была изменена от Фарадж и др. 14. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Для прогнозирования эффекта лекарственных взаимодействий, могут использоваться три метода: методология isobologram17, модель нелинейной смесь18и сочетание индекса1. Сочетание индекс анализ наиболее часто используется потому, что его применение является упрощенной, наличие удобной компьютерной программы. Для этой цели мы сначала характеризуется доза эффект ответ каждого агента используется самостоятельно или в комбинации, выполняя МТТ пробирного19. Эта методология основывается на способности жизнеспособных клеток для уменьшения tetrazolium соли в продукте фиолетового цвета Формазаны с максимумом поглощения 570 Нм19. В момент смерти клетки теряют способность преобразовать МТТ в Формазаны. Таким образом количество цветных Формазаны товара пропорциональна количество жизнеспособных клеток в культуре19. Действительно мы выбрали эту методологию как нерадиоактивных альтернативой включению тимидина третируют в ДНК для измерения распространения клеток19. Таким образом МТТ анализы были широко приняты и остаются популярными в научных лабораториях, о чем свидетельствуют тысячи опубликованных статей. В то время как количество Формазаны измеряется путем записи поглощения в 570 Нм, используя спектрофотометр плита чтение, ссылка волны 620 Нм иногда используется, но не обязательно для большинства пробирного условий. Учитывая критический шаг, описанные здесь мы обнаружили, что условия культуры, используются для выращивания клеток может повлиять на результаты анализов МТТ. Мы обнаружили, что количество жизнеспособных клеток, метаболической активности клеток, возраст культур и количество проходов и детали среднего роста могут быть важными факторами. Таким образом, они должны быть приняты во внимание при повторяющихся assay и анализа данных. Кроме того клетки культуры условия отличаются для каждой ячейки строки. Это, таким образом, сложно представить что четкого указания о ячейке, плотность посева. Как правило среднее количество ячеек между 2 000-10 000 ячеек на хорошо рекомендуется для достижения оптимального клеток плотности в течение 72 ч. Главное, МТТ сокращение отражает жизнеспособных клеточный метаболизм и не, ячейки в частности, распространения или смерти клетки. Таким образом, МТТ анализов не должна быть описана как измерения мобильных распространения, ни мобильных цитотоксичность20,11. Обнаружении смерти клетки зависит от конкретных анализов на основе ячеек. Например в предыдущих исследованиях, мы использовали Западный анализ помаркой обнаружить активацию caspase 3 и/или cytometry анализ для выявления Фосфатидилсерин в листовке внешней мембраны плазмы, для подтверждения активности проапоптотических МАБ 8B613потока.

Когда комбинация тестирование препаратов, они доставляются вместе или последовательно во времени. Учитывая разнообразие механизма действий, трудно обеспечить четкие руководящие принципы для соответствующих экспериментальной установки. Тем не менее большинство исследователей использовать прямое тестирование комбинации препаратов. Кроме того широко используются концентрации, которые производят определенные одного агента эффект ингибирования роста клеток 50%. Концентрации наркотиков, отражающие концентрации в плазме, достижимые в больных обычно считаются соответствующими клинически. Таким образом, сочетание доза эффект анализ выполняется для нескольких доз, сохраняя соотношение сочетание постоянн с последовательным разрежения (50Эд)МАБ/коэффициентнаркотиков (50Эд), хотя это не является обязательным требованием 1. следует отметить, CI значения следует также рассчитывать на различных Эд испытания (например, Эд50, Эд75и90Эд), потому что они могут меняться с Fa в нелинейных способом1. После выполнения автоматического анализа значения CI, линейный коэффициент корреляции r-значение оценкам алгоритмами должно быть > 0.9, чтобы отразить добра аппроксимации экспериментальных данных. CI значений < 1 свидетельствуют о синергии, CI значения = 1 указывают аддитивности и значения CI > 1 обозначают антагонизм1. Вследствие изменчивости в экспериментальные методы и биологической системы рассчитанные CI следует далее подвергаться статистической рассмотрения. Таким образом простой метод заключается в том, чтобы повторить эксперимент комбинации препарата, несколько раз, после чего вычисления результирующего значения CI перед определением статистика среднее ± SD1. Также рекомендуется протестировать комбинацию в панели крупнейших возможных клеточных линий, чтобы учесть изменчивость, которая существует между ними.

Важно отметить, что несколько параметров в исследовании в vitro не принимаются во внимание для экстраполяции в естественных условиях . Например в пробирке жизнеспособности анализов, ни принимать во внимание в естественных условиях период полувыведения препарата, ни в vivo наркотиков метаболизм, что может привести к инактивации препарата. Таким образом экстраполяция в пробирке в vivo остается отдельный вопрос, и выгодно наркотиков взаимодействия свидетельствует в vitro следует дополнительно подтверждено в естественных условиях. Таким образом явное проявление синергии в мышей, принимая опухоли ксенотрасплантатов, используя метод index сочетание был опубликованный21. Тем не менее в vivo исследования требуют большое количество животных точно определить синергизма и более дорогих и более длительным. Альтернативные эффективную модель F-тест по-прежнему требует значительных ресурсов22. Как другой подход к ограничению использования большого числа животных состоит в демонстрации наркотиков синергии в ячейку культуры моделей следуют свидетельства увеличения противоопухолевый ответ комбинации в ограниченной ксенотрансплантата исследования14, мы использовали человеческой нейробластомы IMR5 клетки как опухоль мишенью для изучения в естественных условиях . Мы сохранили IMR5 клетки, потому что они опухолеобразования у мышей23. В то время как человека опухоли ксенотрансплантата модели обеспечивают ценные модели для тестирования наркотиков комбинаций в vivo24, он может быть трудно установить такие модели из различных клеток линии25. Для увеличения масштабов образования опухоли в мышей, клетки могут быть введены в мышей с матрицей подвал мембрана как автомобиль25. Важно отметить, что поскольку матрица подвал мембрана polymerizes и затвердевает при температуре выше 5 ° C, все cultureware или СМИ, контактирующих матрица подвал мембрана должна быть prechilled и льда холодной, и решения подвал мембрана должны храниться на мороженое в течение всего процесса25. С использованием матрицы подвал мембрана, мы наблюдали 100% принять курс с IMR5 клетками, в то время как в отсутствии матрицы подвал мембрана, эта линия клетки продемонстрировали < 80% взять курс (данные не показаны). Кроме того для увеличения распространенности опухоли трансплантата, матрица подвал мембрана может также увеличить темпы роста опухоли25. Мы отметили, что все ксенотрасплантатов появился на 11 день. Однако в течение первых семи дней после вызов клеток опухоли, наличие комков могут наблюдаться, которое может быть вызвано наличием первоначального посевным материалом (данные не показаны). Таким образом мы не рассматривали измерения размера опухоли значимого до этого времени. С помощью матрицы подвал мембрана позволило сократить количество мышей в условиях экспериментальной и выполнить эксперимент в естественных условиях в течение трех месяцев.

Наркотиков/антителом дозировках могут отличаться в зависимости от штамма линии и мыши ячейки. Из-за ограничения в vitro жизнеспособности assay для экстраполяции в vivo дозировка препарата/антитела описанных выше клинически значимые дозы были сохранены для топотекан и МАБ 8B6 в в естественных условиях экспериментальных условиях, на основе данных, опубликованных другими26,27. Экстраполировать параметр человека дозировка для мышей, были проведены ранее опубликованные рекомендации28 . По сути, мы вводят 150 мкг и.в. 8B6 антител в день 7, после второй инъекции пять дней спустя (общая доза/мыши = 300 мкг). Топотекан лечение начал тот же день в качестве первой инъекции 8B6 МАБ путем инъекций Топотекан 0,36 мг/кг или PBS управления и.п. пять дней подряд. Учитывая критический шаг, описанные здесь мы рекомендуем, начиная вливания антител, когда опухоль ксенотрасплантатов достигают3~ 50 мм. Более высокие объемы ксенотрансплантата опухоли приведет к более низкой ставке ответ потому что опухоль бремя явно обратно коррелирует с концентрации антитела, антитела экспозиции и антитела эффективность29. Мы также сохранили потери веса как индикатор системных переносимость каждого испытания режим16. Однако, интерпретации собранных весов не может быть полезным с опухолью большой массы. В этом случае тело условие скоринга, как описано в других разделах16, рекомендуется.

Опухоли могут быть собраны в разное время точек для анализа Иммунохимия, для предоставления дальнейшей информации о механизме действия вызвали в естественных условиях. В предыдущей работе индекс apoptotic опухоли оценивали после МАБ 8B6 вливания13. С этой целью были обнаружены apoptotic клетки тумора, используя assay TUNEL13. Кроме того процент ядер клеток опухоли был забит с Ki67 антиген положительный пятнать для анализа индекс распространения опухоли13.

Тяжелые иммунодефицитных мышей отсутствует врожденная и адаптивного иммунитета с потерей Т-клетки, клетки B и природных убийца (НК) клетки с сокращением макрофагов и антиген представляющих клеток функции и отсутствие циркулирующих дополнением30. Таким образом этот протокол не позволяет исследователям сделать никаких выводов относительно предполагаемых последствий химиотерапии в потенцирования МАБ терапии, изменяя микроокружения опухоли в vivo31. Однако, как предполагаемый иммуномодулирующие эффекты химиотерапевтического агента, так и роль региона фрагмент кристаллизующихся (Fc) МАБ в повышении потенции противоопухолевый препарат заслуживают рассмотрения, но эти вопросы требуют наличия сингенных модель с неповрежденной иммунной системы и физиологических опухоли микроокружения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

S.Fa., J.F. и с.б. обозначаются как изобретатели ожидании патентов, охватывающих клиническое применение терапевтических антител анти O-ацетил GD2.

Acknowledgments

Предоставить поддержку: Фондасьон де Projet де L 'Université de Nantes, les Bagouz» меню Манон, Кубка французской лиги против le рак comité de Loire-Atlantique, Комитет дю Morbihan и Комитет де Вандея, une Роза залить S.A.R.A.H, Мартин де л ' Этуаль и la Société Française de Lutte contre les Раки et les leucémies de L'Enfant et de просвещение (SFCE). М.б. и J.F. поддерживаются Ла Лига Contre Le рака. Авторы благодарят ют объекта структуры Fédérative де Recherche Bonamy Франсуа. Авторы также поблагодарить д-р S. Сузин (Inserm, Париж) для обеспечения IMR5 клеток и г-жа H. Estéphan за ее технической помощи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Proliferation kit (MTT) Roche 11-465-007-001
CompuSyn software ComboSyn Combosyn can be downloaded for free at http://www.combosyn.com
Electric shaver Bioseb BIO-1556
Fetal calf serum Eurobio CVFSVFF00-01 10% heat-inactivated fetal calf serum in RPMI 1640
Firefox  Mozilla Corporation Firefox can be downloaded for free at http://www.mozilla.org/en-US/firefox/
Heat lamp Verre&Quartz 4003/1R
Human neuroblastoma IMR-5 cell line Accegen Biotechnology ABC-TC0450 IMR-5 is a clone of the human neuroblastoma cell line IMR32 5459762. IMR-5 cells were generously provided by Dr. Santos Susin (U.872, Paris, France)
L-glutamine Gibco 25030-024 2 mM in RPMI 1640
Lysis solution  Roche  11-465-007-001
mAb 8B6 University of Nantes N/A
Matrigel Corning 354248
Multiskan FC Thermofischer Scientific  N08625
Needle 21G 1 ½  BD Microlance 304432
Needle 25G 1 Terumo NN-2525R
NSG mice Charles River Laboratories 5557
Nunc MicroWell 96-well microplates Thermofisher 167008
PBS VWR L182-10
PBS, 0,05% EDTA Sigma-Aldrich E9884
PC that runs windows 7 Microsoft Windows 7 can be purchased at http://www.microsoft.com/en-gb/software-download/windows7
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122 100 units/mL penicillin and 100 mg/mL streptomycin in RPMI 1640
Reagent reservoir Thermofischer Scientific 8094
Rodent restrainer Bioseb TV-150-SM
RPMI 1640 Gibco 31870-025
Syringe 1 mL Henke Sass Wolf 5010.200V0
Topotecan Sigma-Aldrich T2705

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chou, T. C. Theoretical basis, experimental design, and computerized simulation of synergism and antagonism in drug combination studies. Pharmacological Reviews. 58 (3), 621-681 (2006).
  2. Bayat Mokhtari, R., et al. Combination therapy in combating cancer. Oncotarget. 8 (23), 38022-38043 (2017).
  3. Zahreddine, H., Borden, K. L. Mechanisms and insights into drug resistance in cancer. Frontiers in Pharmacology. 4, 28 (2013).
  4. Martin, T. P., Baguley, D., et al. Re: "Postoperative validation of bone-anchored implants in the single-sided deafness population." Snapp et al. Otol Neurotol 2012: 33;291-6. Otol Neurotol. 34 (4), 777-778 (2013).
  5. Choi, B., et al. Sensitization of lung cancer cells by altered dimerization of HSP27. Oncotarget. 8 (62), 105372-105382 (2017).
  6. Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nature Reviews Immunology. 10 (5), 317-327 (2010).
  7. Mellor, J. D., Brown, M. P., Irving, H. R., Zalcberg, J. R., Dobrovic, A. A critical review of the role of Fc gamma receptor polymorphisms in the response to monoclonal antibodies in cancer. Journal of Hematology & Oncology. 6, 1 (2013).
  8. Kowalczyk, A., et al. The GD2-specific 14G2a monoclonal antibody induces apoptosis and enhances cytotoxicity of chemotherapeutic drugs in IMR-32 human neuroblastoma cells. Cancer Letters. 281 (2), 171-182 (2009).
  9. Retter, M. W., et al. Characterization of a proapoptotic antiganglioside GM2 monoclonal antibody and evaluation of its therapeutic effect on melanoma and small cell lung carcinoma xenografts. Cancer Research. 65 (14), 6425-6434 (2005).
  10. Nakamura, K., et al. Apoptosis induction of human lung cancer cell line in multicellular heterospheroids with humanized antiganglioside GM2 monoclonal antibody. Cancer Research. 59 (20), 5323-5330 (1999).
  11. Cochonneau, D., et al. Cell cycle arrest and apoptosis induced by O-acetyl-GD2-specific monoclonal antibody 8B6 inhibits tumor growth in vitro and in vivo. Cancer Letters. 333 (2), 194-204 (2013).
  12. Chou, T. C., Martin, N. CompuSyn for drug combinations: PC software and user’s guide: a computer program for quantitation of synergism and antagonism in drug combinations, and the determination of IC50 and ED50 and LD50 values. , ComboSyn Inc. Paramus, NJ. (2005).
  13. Alvarez-Rueda, N., et al. A monoclonal antibody to O-acetyl-GD2 ganglioside and not to GD2 shows potent anti-tumor activity without peripheral nervous system cross-reactivity. PLoS One. 6 (9), e25220 (2011).
  14. Faraj, S., et al. Neuroblastoma chemotherapy can be augmented by immunotargeting O-acetyl-GD2 tumor-associated ganglioside. Oncoimmunology. 7 (1), e1373232 (2017).
  15. Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
  16. Ullman-Cullere, M. H., Foltz, C. J. Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice. Laboratory Animal Science. 49 (3), 319-323 (1999).
  17. Teicher, B. A. Assays for in vitro and in vivo synergy. Methods in Molecular Medicine. 85, 297-321 (2003).
  18. White, D. B., Slocum, H. K., Brun, Y., Wrzosek, C., Greco, W. R. A new nonlinear mixture response surface paradigm for the study of synergism: a three drug example. Current Drug Metabolism. 4 (5), 399-409 (2003).
  19. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  20. Huyck, L., Ampe, C., Van Troys, M. The XTT cell proliferation assay applied to cell layers embedded in three-dimensional matrix. Assay and Drug Development Technologies. 10 (4), 382-392 (2012).
  21. Thompson, J., et al. Synergy of topotecan in combination with vincristine for treatment of pediatric solid tumor xenografts. Clinical Cancer Research. 5 (11), 3617-3631 (1999).
  22. Tan, M., Fang, H. B., Tian, G. L., Houghton, P. J. Experimental design and sample size determination for testing synergism in drug combination studies based on uniform measures. Statistic in Medicine. 22 (13), 2091-2100 (2003).
  23. Tang, X. X., et al. Implications of EPHB6, EFNB2, and EFNB3 expressions in human neuroblastoma. Proceding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10936-10941 (2000).
  24. Mehta, R. R., Graves, J. M., Hart, G. D., Shilkaitis, A., Das Gupta, T. K. Growth and metastasis of human breast carcinomas with Matrigel in athymic mice. Breast Cancer Research and Treatment. 25 (1), 65-71 (1993).
  25. Mullen, P., Ritchie, A., Langdon, S. P., Miller, W. R. Effect of Matrigel on the tumorigenicity of human breast and ovarian carcinoma cell lines. International Journal of Cancer. 67 (6), 816-820 (1996).
  26. Feng, C., Tang, S., Wang, J., Liu, Y., Yang, G. Topotecan plus cyclophosphamide as maintenance chemotherapy for children with high-risk neuroblastoma in complete remission: short-term curative effects and toxicity. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 33 (8), 1107-1110 (2013).
  27. Cheung, N. K., et al. Ganglioside GD2 specific monoclonal antibody 3F8: a phase I study in patients with neuroblastoma and malignant melanoma. Journal of Clininical Oncology. 5 (9), 1430-1440 (1987).
  28. Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
  29. Dayde, D., et al. Tumor burden influences exposure and response to rituximab: pharmacokinetic-pharmacodynamic modeling using a syngeneic bioluminescent murine model expressing human CD20. Blood. 113 (16), 3765-3772 (2009).
  30. Racki, W. J., et al. NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection. Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).
  31. Sherif, A., Winerdal, M., Winqvist, O. Immune Responses to Neoadjuvant Chemotherapy in Muscle Invasive Bladder Cancer. Bladder Cancer. 4 (1), 1-7 (2018).

Tags

Исследования рака выпуск 143 раковых исследований разработки лекарственных средств комбинации антител наркотиков взаимодействие антитело препарата МТТ пробирного антитела наркотиков синергии сочетание индекс уравнение в пробирке клеток линии модели опухоли ксенотрансплантата модель
Потенцирование эффективности противоопухолевой антитела, противоопухолевые препараты: обнаружение антител наркотиков синергизм с помощью комбинации индекс уравнения
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bahri, M., Fleurence, J., Faraj, S., … More

Bahri, M., Fleurence, J., Faraj, S., Ben Mostefa Daho, M., Fougeray, S., Birklé, S. Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation. J. Vis. Exp. (143), e58291, doi:10.3791/58291 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter