Summary
Burada, içinde bir yetişkin zebra balığı kendi doğal patojen Mycobacterium marinumkullanarak bir iletişim kuralı modeli insan tüberküloz için mevcut. Ayıklanan DNA ve RNA gelen virüslü zebra balığı iç organlarının balıklar ve ana bilgisayarın bağışıklık yanıtı qPCR ile toplam Mikobakteriyel yükler ortaya çıkarmak için kullanılabilir.
Abstract
Mycobacterium tüberküloz Şu anda en ölümcül insan patojen 1.7 milyon ölüm ve 10.4 milyon enfeksiyonları her yıl neden olduğunu. Maruz kalma bu bakteri steril bir enfeksiyondan aktif olarak devam eden bir ölümcül hastalık arasında değişen insanlarda geniş hastalığı spektrum neden olur. Asemptomatik, ama bir fulminan hastalık yeniden etkinleştirmek için potansiyele sahip latent tüberküloz, en yaygın biçimidir. Yetişkin zebra balığı ve onun doğal patojen Mycobacterium marinum son zamanlarda Tüberküloz hastalığı geniş spektrumu çalışmaya uygun bir model olduğu kanıtlanmıştır. Önemlisi, spontan gecikme süresi ve yeniden etkinleştirme gibi edinilmiş bağışıklık yanıtı Mikobakteriyel Enfeksiyon bağlamında bu modelde okudu. Bu makalede, biz yetişkin zebra balığı, nükleik asitler Mikobakteriyel yükler ve ana bilgisayar bağışıklık yanıtı kantitatif PCR ile ölçüm için çıkarım için iç organları koleksiyonu deneysel enfeksiyon için yöntemleri açıklanmaktadır. All-in-house-geliştirilmiş, M. marinum -belirli qPCR tahlil DNA olmayan bölme, Uyuyan veya son zamanlarda ölü mikobakteriler Ayrıca algılarken geleneksel kaplama yöntemleri daha duyarlıdır. DNA ve RNA aynı birey ayıklanır, hastalıklı devlet ve ev sahibi ve patojen gen ekspresyonu arasındaki ilişkileri incelemek mümkündür. Tüberküloz için yetişkin zebra balığı modeli böylece konak-patojen etkileşimleri çalışmaya son derece uygun, memeli vivo içinde sistemi olarak kendini göstermektedir.
Introduction
Zebra balığı (Danio rerio) yaygın olarak kullanılan bir hayvan model Biyomedikal araştırma ve ortak omurgalı biyoloji için kabul edilen bir modeldir. Zebra balığı birçok insan hastalıkları modelleme araştırma alanlarına uyarlanmış ve enfeksiyon ve birçok bakteriyel 3 ve viral enfeksiyonlar4 immünolojik araştırmalar kanser1 ve kalp hastalığı2 arasında değişen bozuklukları , 5. Ayrıca, zebra balığı embriyolar rahim gelişimi gelişim biyolojisi6 ve toksikoloji7,8' popüler bir model zebra balığı yaptı.
Araştırma, enfeksiyon biyolojisi, dahil olmak üzere birçok alanda optik şeffaf zebra balığı larva yaygın olarak kullanılır. İlkel makrofajlar algılanan9olduklarında ilk bağışıklık hücreleri 24 saat sonrası döllenme (hpf), içinde görüntülenir. Nötrofil yaklaşık 33 hpf10görünmesini sonraki bağışıklık hücreleri vardır. Zebra balığı larva böylece enfeksiyon erken dönemlerinde ve yokluğunda edinilmiş bağışıklık hücreleri11, doğuştan gelen bağışıklık rolü eğitim için uygulanabilir. Ancak, onun tamamen işlevsel edinilmiş bağışıklık sistemi ile yetişkin zebra balığı ek karmaşıklığı enfeksiyon deneyler için bir katmanı sağlar. T hücreleri çevresinde fertilizasyon123 gün sonrası ve B hücreleri fonksiyonel antikor üretmek mümkün 4 hafta sonrası döllenme13tarafından tespit edilebilir. Yetişkin zebra balığı memeli doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık sisteminin ana karşılıkları vardır. Balık immune systems ve insanlar arasındaki temel farklılıklar olduğu gibi lenfoid doku anatomisi antikor isotypes de bulunur. İnsanlar beş15var ise sadece üç antikor sınıflar14, zebra balığı vardır. Kemik iliği ve lenf düğümleri yokluğunda, Birincil lenfoid organlar olarak balık böbrek ve timus16 ve dalak, böbrek ve bağırsak ikincil lenfoid organlara17olarak hizmet vermektedir. Hücreleri, doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık tam onun cephanelik ile bu farklılıklara rağmen yetişkin zebra balığı bir son derece uygun, kullanımı kolay, memeli konak-patojen etkileşim çalışmaları için modeldir.
Zebra balığı son zamanlarda tüberküloz18,19,20,21,22çalışmaya uygun bir model olarak kurulmuştur. Tüberküloz Mycobacterium tüberküloztarafından neden olduğu hava bir hastalıktır. Dünya Sağlık Örgütü göre tüberküloz1.7 milyon ölümler 2016 yılında neden oldu ve bir tek patojen dünya çapında23tarafından ölüm önde gelen nedenidir. Fareler24,25, tavşan26 ve insan dışı primatlar27 sınırlamaları her yüz ama tüberküloz araştırmasında en iyi bilinen hayvan modelleri vardır. M. tuberculosis enfeksiyonu insan dışı primat modelin insan hastalık en çok benzeyen, ancak bu modeli kullanan ciddi Etik kaygılar nedeniyle sınırlıdır. Diğer hayvan modellerinde M. tüberküloz hastalığı patoloji etkileyen ana bilgisayar-özgüllük tarafından engel. Tüberküloz modelleme içinde en büyük sorunu insan hastalığında enfeksiyon ve hastalık sonuçları geniş yelpazede olmalı: tüberküloz dokunulmazlık gizli, aktif ve yeniden etkinleştirilen enfeksiyona28 sterilize arasında değişen çok heterojen bir hastalık olduğunu , hangi çoğaltmak ve deneysel model zor olabilir.
Mycobacterium marinum M. tuberculosis ile % 85 amino asit kimlik29~ 3.000 orthologous proteinler ile yakın akrabası olduğunu. M. marinum doğal olarak granülom, tüberküloz, kendi iç organları19,30işaretlerinden üreten zebra balığı bozar. Tüberküloz araştırmalarında kullanılan hayvan modellerin aksine zebra balığı birçok yavrular üretir, yalnızca sınırlı bir alan için ve önemlisi, neurophysiologically az gelişmiş omurgalı tüberküloz modelin kullanılabilir olduğunu. Ayrıca, M. marinum enfeksiyon latent enfeksiyon, aktif hastalık veya hatta sterilizasyon Mikobakteriyel Enfeksiyon yakından spektrum hastalığı sonucu insan tüberküloz19, taklit eden yetişkin zebra balığı neden olur 31 , 32. burada, M. marinum karın boşluğuna enjekte ve Mikobakteriyel yükler ve zebra balığı bağışıklık yanıtlarını ölçmek için kantitatif PCR kullanarak yetişkin zebra balığı deneysel tüberküloz modeli için yöntemleri tarif doku örnekleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm zebra balığı deneylerin hayvan deney kurulu Finlandiya (ESAVI/8245/04.10.07/2015) tarafından onaylanmıştır. Yöntemleri Yasası (497/2013) ve Finlandiya bilimsel veya eğitim amacıyla kullanılan hayvanların korunması hükümet Kararnamesi (564/2013) göre gerçekleştirilir.
1. kültür, Mycobacterium marinum
Not: Mycobacterium marinum bir patojen yüzeysel enfeksiyon insanlarda neden yeteneğine olduğundan, bu bakteri ile çalışmaya başlamadan önce biohazard atık bertaraf ve kişisel güvenliği yerel yönergeleri öğrenin.
- Kültür M. marinum 7 H 10 üzerinde plaka en az 5 gün için OADC (oleik asit, albümin, dekstroz, katalaz) zenginleştirme ve % 0,5 v/v gliserol 29 ° c, % 10 ile desteklenmiştir. M. marinum kültürler taze bakteri dondurucudan alarak her iki hafta ve her hafta yeni bir tabağa aktarma korumak.
Not: M. marinum sucul türler bulaşmasını doğal balık patojen ve zebra balığı stokları bakteri ile kontamine değil için önlemler almak önemlidir. Virüslü zebra balığı ve bakteri ile kontamine öğeleri yetiştirme tesislerinden ayrı tutulması gerek. - Steril 1 µL aşılama döngü aseptik bir loopful M. marinum bakteri kütlesinin 7 H 9 10 mL içeren bir hücre kültür şişesi aktarmak için kullanmak % 10 ADC (albumin, dekstroz, katalaz) zenginleştirme, %0,2 v/v polysorbate 80 ve %0,2 v/v ile orta gliserol. Kültür yaklaşık bir OD600 (optik yoğunluk) 0.7 sallayarak olmadan karanlıkta 29 ° C'de 3-4 gündür. Kap gevşek bırakın veya bir filtre kapağı gazlar yeterli alışverişi için izin vermek için kullanın.
Not: Polysorbate 80 toplama bakterilerin önlemek için orta olarak eklenir. Buna ek olarak, ışığa maruz kalma fenotipik değişiklikler bakteri kolonileri (Örneğin, beyaz sarı renk değişiklikleri) yol açar. Bunu önlemek için kültürler karanlıkta bırakın. - OD600değeri ile spektrofotometre ölçmek. 0,07 – 0,09, OD600 sıvı kültür sulandırmak ve sallayarak olmadan karanlıkta 29 ° C'de 2 gün boyunca kültür devam edin. Kap gevşek bırakın.
Not: Bu iki gün boyunca, yaklaşık 0,5 karşılık gelen erken bir log fazı için bir OD600bakteriyel süspansiyon ulaşacak.
2. yetişkin zebra balığı bulaşmasını için hazırlanması bakteriyel çözüm
- Bakteriyel süspansiyon büyük bir steril küvet veya bir 15 mL tüp aktarmak ve en büyük kümeleri yerleşmek izin vermek 15 dakika oda sıcaklığında karanlıkta yerleştirin.
- En iyi 5 – 7 mL süspansiyon temiz bir tüp veya bir küvet aktarmak ve OD600ölçmek. Bu üst aşama süspansiyon enfeksiyonlar için kullanın.
- M. marinum kültürünün 1 mL taze tüp ve 10.000 x gde 3 dk santrifüj içine toplamak. Süpernatant kaldırmak ve pelet 1 mL steril 1 x PBS resuspend.
- Seyreltik steril 1 kullanarak istenen bakteriyel toplama ulaşmak için PBS 0.3 mg/mL fenol kırmızı bir izleyici olarak x. Seyreltilmiş süspansiyon üç aliquots bölün.
Not: CFU (koloni oluşturan birimler) vs önceden belirlenmiş bir OD600 kullanın / µL eğrisi seyreltme tahmin etmek için gerekli içinde 5 µL enjeksiyon cilt34aranan bakteri sayısını bulmak için. OD600 ve bakteriyel süspansiyon konsantrasyon arasındaki ilişkiyi gerçek enfeksiyon deneyler başlamadan önce doğrulanması gerekiyor. Bu doğrulama veri toplamak için iki hafta saklıdır. - 1 mL şırınga kullanarak, yavaş yavaş çekme yoluyla 27 G süspansiyon iğne 3 x. Her aliquot için kullanmadan önce bu adımı gerçekleştirin.
Not: aynı bakteriyel çözüm daha 2 h için kullanmayın.
3. deneysel mayi enjeksiyon ile M. marinum enfeksiyon
- Parafilm film bir parça üzerine bakteriyel seyreltilmiş çözeltinin 5 µL damlacık pipette ve damlacık 30 G insülin iğne çek.
- 5-8 ay kullanın-eski vahşi tipli balık ve deney için rag1−/−hu1999 mutant balık. Tank su %0.02 3-aminobenzoic asit etil ester (pH 7,0) ile yetişkin zebra balığı anestezi. Balık ventral tarafta bir yarık nemli bir köpük plastik üzerinde içine konumlandırın.
Not: bez-/- mutant balık somatik rekombinasyon geçmesi ve fonksiyonel T ve B hücreleri üretmek mümkün değildir. - İğne pelvik yüzgeçleri arasında enjekte bir yaklaşık 45 derecelik açıyla. Yukarı doğru tüm açılış karın boşluğu içinde gözlemlemek için iğne açılış tutun. Yavaş yavaş bakteriyel süspansiyon enjekte ve iğne dikkatli bir şekilde çıkarın.
Not: kırmızı izleyici enjeksiyon üzerine balık dışarı sızması durumunda, deneyden balık hariç. - Hemen sonra enjeksiyon, balık taze tank su ile bir kurtarma tankı içine aktarın.
- 7H 10 bakteriyel uzaklaştırılmış örnekleri almak her 15dk kullanımda aliquot bakteriyel üzerinden tabaklar ve bakteri 29 ° C'de 5 gün kuluçkaya ve enfeksiyon doz plakaları kolonileri sayarak doğrulayın.
- Balık iyi olmak düzenli olarak kontrol edin ve herhangi bir balık üzerinde %0,02 ile enfeksiyon belirtileri olan ötenazi 3-aminobenzoic asit etil ester (pH 7,0) konsantrasyon.
Not: Yaklaşık olarak, Yetişkin zebra balığı % 7'si ile 34 ± 15 CFU enfekte ve zebra balığı % 30'u 709 CFU 2029 ± ile enfekte belirtiler tarafından 8 hafta19sahip olmuş olacak. Semptomlar anormal yüzme, dokunmatik, nefes nefese, ödem veya gözlemlenebilir boşa yanıt eksikliği yer alabilir. - Zebra balığı ortak standartlar35göre korumak.
4. iç organları topluluğu
- 3-aminobenzoic asit etil ester (üzerinde %0,02 konsantrasyon, pH 7,0) su tankı içinde aşırı dozda ile zebra balığı ötenazi.
- Bir PIN posterior branchiostegal ışınları ve başka kuyruk platformu üzerine balık çakmak için aracılığıyla ekleyin.
- Bütün karın boşluğu neşterle açmak ve iç organların küçük kaşık ve keskin uçlu cımbız kullanarak toplama. Yürekten başlayıp kuyruk bir blok tüm iç organlar ayırmak için doğru omurga boyunca çalışın.
Not: tüm böbrek doku sırt boyunca kaşıkla kazıma toplamak emin olun. - Son olarak, cımbız gut lağım yanındaki bağlantısını kesin ve organları altı 2.8 mm seramik boncuklar ile 1,5 mL homojenizasyon tüp içine aktarmak için kullanın. Hemen kuru-örnek dondurmak için buza koyun. Örnek-80 ° homojenize oluncaya kadar C saklanır.
- % 70 etanol bireyler arasındaki aletlerimle durulayın.
5. homojenizasyon ve RNA bir organ blok çıkarma.
Not: Yöntem Stanford Üniversitesi iletişim kuralları36değiştirilir.
- Guanidin thiocyanate-fenol çözüm nükleik asit çıkarma (Tablo reçetesi) için kullanılan bir toplam hacmi 1500 µL. için üst kısmında örnek eklemek örnek en fazla toplam hacminin % 10 kapsar emin olun.
Dikkat: Beklenen hasat doku 100 µL. guanidin thiocyanate-fenol çözüm toksik içerir ve rahatsız edici maddeler ve birleşimler ve koruyucu giysiler, nitril eldiven ve bir duman mahallede çalışma gerektirir birimdir. Bu zehirli gazlar oluşumuna neden olur gibi çamaşır suyu ile birleştirmek değil. Malzeme güvenlik veri sayfaları (MSDS) kullanmadan önce okuyun. - Boncuk atan homogenizer 3 kez 40 için kullanarak örnekleri homojenize 3200 devirde s. Serin buz 30 s döngüleri arasında. Homojenize örnekleri 9 min için bir su banyosunda solüsyon içeren temizleyicide.
- 12.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de örnekler santrifüj kapasitesi ve temizlenen homogenate 1000 µL taze microcentrifuge tüp içine taşıyın.
- Kloroform 200 µL eklemek, hemen 15 vortexing tarafından mix s ve oda sıcaklığında 2 min için kuluçkaya.
Dikkat: Kloroform bir toksik ve tahriş edici bileşik Eğer inhale, yuttu ya da cilt veya gözlerle temas. Bir duman mahallede iş ve kişisel koruma için gerekli güvenlik donanımları kullanabilirsiniz. Malzeme güvenlik veri sayfaları (MSDS) kullanmadan önce okuyun. - 12.000 x g 4 ° C'de sulu ve organik aşamaları ayırmak için 15 dakika, santrifüj kapasitesi.
- Dikkatle, üst aşaması 500 µL RNA kirletici önlemek için taze bir tüp aktarın. Çıkarın ve sulu faz (~ 100 µL) geri kalanını atmak ve interfaz ve Organik faz 4 ° C'de DNA ekstraksiyon için saklayın.
Not: Üst aşama RNA içerir. - 2-propanol 500 µL ve hemen vortexing tarafından RNA çökelti 15 s. Incubate için oda sıcaklığında 10 dakika karıştırın.
- 12.000 x g 4 ° C'de RNA cips için 10 dk de santrifüj kapasitesi. Süpernatant pipetting tarafından kaldırın.
- % 75 etanol ve girdap 10 için 1 mL ekleyin s.
Not: Burada protokol duraklatılmış ve örnekleri gecede 4 ° C'de muhafaza - 4 ° C'de 5 min için 7.500 x g , santrifüj Süpernatant pipetting tarafından kaldırın.
- 5.9-5.10 yıkama adımları yineleyin. Süpernatant dikkatli bir şekilde çıkarın pipetting tarafından ve izin Pelet kuruması duman mahallede.
- RNA Pelet 500 µL nükleaz ücretsiz su içinde dağıtılması ve buz üzerinde örnekleri tutmak. Konsantrasyonları microvolume Spektrofotometre ile veya eşdeğer ekipman ile ölçmek. RNA-80 ° C'de depolayın
6. ortak ayıklanan zebra balığı ve Mikobakteriyel DNA saflaştırılması
- Guanidin thiocyanate (son konsantrasyonu 4 M), 118.2 g sodyum sitrat 3.68 g çözülerek tekrar ayıklama arabellek (Larabida) hazırlamak (son konsantrasyonu 50 mM) ve 30.29 g Tris ücretsiz Bankası (son konsantrasyonu 1 M) 120 mL su (Bu Mayıs nükleaz ücretsiz'çalışma gecede karıştırma gerektirir). Su nükleaz içermeyen bir son toplam hacmi 250 mL ve filtre çözümü sterilize etmek için ekleyin.
Not: Bu arabellek oda sıcaklığında 6 aya kadar muhafaza edilebilir. Hidroklorik asit ve hidrojen siyanür gibi zehirli gazlar üretmek için tepki olarak Larabida çamaşır suyu ile birleştirmek değil. - Interphase ve örnek Organik faz Mikobakteriyel DNA ayıklamak için kullanın. Larabida 500 μL her tüp için ekleyin. Oda sıcaklığında INVERSION tarafından kapsamlı bir şekilde 10 dakika karıştırın.
- 12.000 x g için oda sıcaklığında 30 dk de tüpler santrifüj kapasitesi ve dikkatli bir şekilde yeni bir tüp için DNA içeren üst sulu faz 500 µL aktarın.
- 2-propanol 400 μL ekleyin. Ters çevirme tarafından mix ve oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.
- Örnekleri, 12.000 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi DNA içeren bir Pelet bu noktada görünür olmalıdır. Dikkatli bir şekilde süpernatant pipetting tarafından çıkarın.
- % 70 etanol 800 μL ekleyin. Pelet INVERSION tarafından yıkayın. Genomik DNA kolayca yıkar değil girdap örnekleri bu noktada, yap.
- Örnekleri, 12.000 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi ve süpernatant pipetting tarafından kaldırın. Etanol yıkama (adım 6,6 ve 6.7) yineleyin.
- Etanol pipetting tarafından dikkatli bir şekilde çıkarın. 5-10 dk. dağıtılması için 200 μL nükleaz ücretsiz su Pelet örnekleri kurumasına izin verin.
- DNA konsantrasyonları microvolume Spektrofotometre ile veya eşdeğer ekipman ile ölçmek. DNA 4 ° C'de veya uzun süreli depolama için-20 ° C'de muhafaza edilebilir.
7. kantitatif PCR Mikobakteriyel yükler ölçmek için
- QPCR reaksiyon karışımları ile no-ROX (carboxy-X-rodamine) M. marinum iç kopya etmek rondela (ITS) arasında 16S-23S ITS MMITS1 astar (Tablo 1) ile üretici yönergelerine göre karşı hazırlamak. Reaksiyon mix pipette ve çoğaltmaları 96-şey tabakta qPCR için uygun olarak dilutions örnek. Bilinen bir miktar bakterilerin DNA Standart seyreltme dizi her vadede içerir.
Not: Beklenen M. marinum yük balık başına 1.000.000 CFU 4 TEFE, 0 CFU aralığı. QPCR tahlil da diğer qPCR kitleri ile gerçekleştirilir ama tavlama sıcaklığı astar için yeniden en iyi duruma getirilmiş olmalı. - Optik şeffaf bir film ile plaka mühür ve 2.000 x g 4 ° C'de 2 min için plaka santrifüj kapasitesi
- Tablo 2' de gösterilen qPCR programını çalıştırın.
- Standart eğri kullanarak, tüm balık bakteriler sayısını hesaplayın.
8. DNaz tedavi RNA örnekleri
- Herhangi bir olası kalan iz genomik DNA RNA kaldırmak için yürütmek DNaz ben tedavi. RNA örnekleri buz çözme.
Not: yalnızca RNase free ekipman ve çözümleri kullanın ve çalışma yüzeyi ve Pipetler ile çalışmaya başlamadan önce RNases (Malzeme tablo) ortadan kaldırarak bir dekontaminasyon reaktif emin olun. Uzun kollu önlük ve örneklerini korumak için eldiven giymek. - 10 μL hazırlamak DNaz ben buz üretici yönergelerine göre reaksiyon karışımları. En fazla 1 μg RNA'ın da dahil olmak üzere, 10 DNaz arabellek x 1 μL ve RNA'ın 8 μL örnek DNaz karışım 1 μL.
- Yavaşça reaksiyonlar (vortexing) mix ve 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya
- Isı-inactivation önce 50 mm EDTA 1 µL 10 µL örnekleri ekleyin. EDTA eklenmezse, RNA ısıtıldığında kimyasal bozulması geçirecek.
- 10 dk 65 ° c ısı-ı. DNaz devam doğrudan cDNA sentezi için devre dışı bırakın veya-80 ° C'de DNaz tedavi RNA saklamak için kuluçkaya
9. cDNA sentezi
- Tüm reaktifler ve buz üzerinde örnekleri tutmak ve üreticinin yönergelerine göre reaksiyon karışımları hazırlamak. 5 μL tepki karışımı için Ters transkripsiyon Master Mix 1 μL dahil, 3 μL nükleaz ücretsiz su ve 1 μL DNaz tedavi RNA.
- Karışımı yavaşça ters transkripsiyon reaksiyonlar ve kısaca Tüp, gerekirse spin.
- Örnekleri bir PCR makine ve Tablo 3' te gösterilen programı kullanın.
- CDNA nükleaz ücretsiz su qPCR 2.5 ng/μL, maksimum konsantrasyon için gerekirse sulandırmak. cDNA-20 ° C'de depolanan
10. ölçüm zebra balığı gen ekspresyonu kantitatif PCR ile
- QPCR ana karışımı buz üreticinin yönergelerine uygun olarak hazırlamak ve ışıktan korumak. Tablo 1' de tanıtılan astar kullanın.
Not: kapaðý indüksiyon her gen için hesaplamak için Ayrıca bir havuza alınan temel örnek 6 sağlıklı zebra balığı çıkarılan ifadeden ölçün. - Her örnek çoğaltır hazırlamak ve qPCR plaka üzerine reaksiyon karışımları pipette. Optik şeffaf bir film ile plaka mühür ve plaka 2000 x g 4 ° C'de 2 min için de çalışma başlamadan önce santrifüj kapasitesi.
- QPCR çalıştırmak kullanılan astar çift bağlı olarak tavlama sıcaklığı ile Tablo 4 gösterilen program (Tablo 1).
- Bir ev tutma gene (loopern437) ile karşılaştırıldığında gen ifade oranı denklemi kullanarak ΔCt yöntemi ile analiz:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Doğal balık patojen Mycobacterium marinum zebra balığı iç organların bozar ve histolojik olarak görünür granülomlar19ile sistemik enfeksiyon oluşturur. Yetişkin zebra balığı mayi bir iğne ile M. marinum ile enfekte. DNA ve RNA ayıklanır ve Mikobakteriyel yük nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) DNA'yı kullanarak şablon olarak ölçülür. Yöntemin Şekil 1' de gösterilen.
İlk balık hastalık için kullanılan mikobakteriler için enfeksiyon sonucu önemli bir belirleyici sayısıdır. M. marinum (~ 2.000 CFU) yüksek enfeksiyon doz Mikobakteriyel yükler ortalama bakteri yükü yaklaşık beş milyon bakteri (Şekil 2A) sonuçta balık öldürme ulaşıncaya kadar artmaya devam ilerici bir hastalığa yol açar. Düşük doz (~ 20-90 CFU) insan tüberküloz (2B rakam) içinde görülen benzer bir hastalık spektrum gelişimi M. marinum yol açar. Bakteriyel yük yaklaşık 4 – 7 hangi balık çoğunluğu sonra hastalık kararlı bir duruma ulaşıncaya kadar hafta (Şekil 2A ve Şekil 3A), artmaya devam ediyor. Şekil 2B gösterir bir örnek ile düşük doz enfeksiyon hastalığı sonuçları dağılımı: virüslü zebra balığı yaklaşık % 7'si bakteriyel büyüme sınırlamak yapamaz. Bu kişilerin bir birincil progresif hastalık geliştirilen ve enfeksiyon sonra iki ay içinde öldüler. Civarında bireylerin yüzde 10'u Mikobakteriyel Enfeksiyon 4 hafta tarafından temizlenir. Balık nüfusun geri kalan % 65 sürekli bakteriyel yükleri ile gizli bir Mikobakteriyel Enfeksiyon geliştirilmiştir. Ancak, enfeksiyon, % 18, 8 ve 32 hafta arasında gizli enfeksiyon kendiliğinden hastalığın ilerlemesi için önde gelen yeniden.
Kullanarak bez-/- mutant balık, adaptif bağışıklık yanıtı yetişkin balık rolü eğitim mümkündür. Bez-/- mutant balık yeterince yüksek bakteri yükler (Şekil 3A) önde gelen mikobakteriler büyüme sınırlamak değil ve artan morbidite (Şekil 3B), açıkça edinilmiş bağışıklığın önemini gösteren Mikobakteriyel Enfeksiyon kontrol. Ayrıca, belirli Mikobakteriyel Enfeksiyon sitokin yanıtları çağrıştıran içinde adaptif yanıt önemi bu modelde okudu. İşte, adaptif yanıt interlökin 4 (IL4) verimli indüksiyon için gerekli olduğunu göstermektedir (Şekil 3 c) ama interferon-γ (IFNγ) 4 TEFE (3D şekil), indüksiyon için gereksiz. İnterferon γ interlökin 4 ekstraselüler patojenler karşı adaptif immün yanıt ortak bir arabulucu ise hücre içi patojenlere karşı yanıt sürüş bir sitokin var. İl4 göre yaban-türü grubunda anlamlı olarak daha yüksek ifade düzeyde bez-/- mutant balık Mikobakteriyel Enfeksiyon (Şekil 3 c) önemli adaptif humoral yanıt anlamına gelir.
Şekil 1: iş akışı yetişkin zebra balığı Mikobakteriyel yüklerin geliştirme eğitimi. Yetişkin zebra balığı mayi iğne M. marinumile enfekte. DNA ve RNA balıkların iç organları ayıklanır ve M. marinum yük ve ana bilgisayarın bağışıklık yanıtı nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ile incelenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: M. marinum enjeksiyon yetişkin zebra balığı içine hastalık durumlarında bir spektrum neden olur. (A)zebra balığı bir düşük (34 ±15 CFU) veya M. marinumyüksek bir doz (2029 ±709 CFU) ile enjekte. Ortalama yükler 5 balık için (hariç 32 haftalık yüksek doz, n = 2) SD düşük doz istatistikleri ile gösterilir: * p < 1 hafta ile karşılaştırıldığında 0,05 ** p < 0,05 1 ile karşılaştırıldığında ve 2 hafta. Yüksek doz İstatistikleri: *** p < 0,05 karşılaştırıldığında ile 1, 2, 8, 11 ve 20 wk. ¤ yüksek doz p vs düşük doz < 0,05. Parikka ve ark. güncelleme 201219. (B) tipik dağıtım hastalığı sonuçlar bir düşük doz ile M. marinumbulaşmış bir vahşi tipi zebra balığı nüfus içinde. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: edinilmiş bağışıklığın yetişkin zebra balığı Mikobakteriyel Enfeksiyon elbette etkiler. Yetişkin yaban tipi (wt) ve rag1 (−/−) zebra balığı düşük doz ile enfekte (n = 30), M. marinum. (A) ortalama Mikobakteriyel yükler qPCR 2, 4 ve 7 hafta sonrası enfeksiyon (TEFE) tarafından ölçülen (n = 10) * P < 0,05. (B) balık hastalığın belirtileri geliştirme euthanized ve hayatta kalma araziler oluşturuldu. (C). il4 ifade düzeyleri 4 TEFE ölçüldü. IFNγ (D) ifade düzeyleri 4 TEFE ölçüldü. (A ve B) değiştiren Parikka vd 201219. (C ve D) Hammarén ve ark. 201438değiştiren. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Gen | Astar sıra | Tavlama sıcaklığı |
| MMITS1 | F: CACCACGAGAAACACTCCAA | 65 |
| 16s-23SITS Locus AB548718 M. marinum miktar için | BİLGİ: ACATCCCGAAACCAACAGAG | |
| loopern4 | F: TGAGCTGAAACTTTACAGACACAT | 61 |
| Tekrarlayan öğeleri ifade | BİLGİ: AGACTTTGGTGTCTCCAGAATG | |
| il4 | GCAGGAATGGCTTTGAAGGG | 59.5 |
| ZDB-GEN-100204-1 | GCAGTTTCCAGTCCCGGTAT | |
| ifnγ1-2 | F: GGGCGATCAAGGAAAACGACCC, | 61 |
| ZDB-GEN-040629-1 | BİLGİ: TAGCCTGCCGTCTCTTGCGT |
Tablo 1: astar dizileri ve tavlama sıcaklıkları. Kullanılan astar dizileri ve onların en iyi duruma getirilmiş tavlama sıcaklıkları. M. marinum 16S-23S rRNA transkript için astar bir No-ROX qPCR kit ve diğer astarlar için qPCR kiti de dahil olmak üzere bir ROX için optimize edilmiştir.
| Adım | Zaman | Sıcaklık |
| 1 | 3 dk. | 95 ° C |
| 2 | 5 s | 95 ° C |
| 3 | 10 s | 65 ° C |
| 4 | 5 s | 72 ° C (floresan algılama) |
| 5 | 2. adıma geçin. 39 kez | |
| 6 | Eğrisi Analizi 55-95 ° C erime 0.5° C aralıklarla | |
| 7 | Sonsuza dek | 4 ° C |
Tablo 2: M. marinum DNA ölçmek için qPCR programı. Bir qPCR protokol üreticinin yönergelerine göre tasarlanmış ve M. marinum DNA zebra balığı örnekleri ölçmek için en iyi duruma getirilmiş.
| Zaman | Sıcaklık |
| 5 dk | 25 ° C |
| 30 dk | 42 ° C |
| 5 dk | 85 ° C |
| sonsuza dek | 4 ° C |
Tablo 3: cDNA sentez programın. CDNA üretici yönergelerine göre virüslü bir zebra balığı ayıklanan RNA üzerinden sentezleme protokolü.
| Adım | Zaman | Sıcaklık |
| 1 | 30 s | 95 ° C |
| 2 | 12 s | 95 ° C |
| 3 | 30 s | Tavlama ° C |
| 4 | 2. adıma geçin. 39 kez | |
| 5 | Eğrisi Analizi 65-95 ° C erime 0.5 ° C aralıklarla | |
| 6 | Sonsuza dek | 4 ° C |
Tablo 4: ana bilgisayarın gen ekspresyonu ölçmek için qPCR programı. Bir qPCR protokol üreticinin yönergelerine göre tasarlanmış ve farklı zebra balığı genlerin ifade ölçmek için en iyi duruma getirilmiş.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada deneysel olarak enfekte yetişkin zebra balığı dokulardan çıkarılan DNA Mikobakteriyel yükler ölçmek için qPCR tabanlı bir uygulama açıklar. Bu uygulama astar 16S-23S rRNA iç kopya etmek spacer sıra40tasarlanmış temel alır. Toplam Mikobakteriyel yükü bir balık örnek olarak kültürlü mikobakteriler bilinen bir dizi arasından çıkarılan ve o bir bakteri genomunu bir kopyasını herhangi bir zamanda sayarsak DNA hazırlanan standart bir eğri kullanarak tahmin edilmektedir. Yaklaşık 100 M. marinum -qPCR algılama sınırıdır birimleri18oluşturan colony. Geleneksel kaplama için karşılaştırıldığında Yöntem açık bir avantaj hem aktif hem de sigara bölen uyuyan bakteri tespit edilebilir olduğunu. Ayrıca, zebra balığı dokulara gelen kültür tabaklarda bulaşıcı büyüme ortak bir sorun bu yaklaşım tarafından atlatılabilirdi. Ancak, DNA şablon olarak kullanılır gibi bazı ölçülen kopya çok yakın zamanda ölen bakteri DNA'sı türetilebilir mümkün olduğu. Hem DNA ve RNA (aynı zamanda proteinler, burada açıklanmayan)-ebilmek var olmak hulâsa--dan aynı birey gibi bireyin Mikobakteriyel yük her iki gen ifadesi verileri ile birleştirilebilir nükleik asit tabanlı protokol önemli bir avantaj olduğunu ev sahibi ve bakteri.
M. marinum dozaj enfeksiyon sonucu önemli bir belirleyici olduğunu. Düşük M. marinum (~ 20-90 CFU) enfeksiyon doz ile gecikmesi olarak en sık görülen hastalık durumlarında bir spektrum üretir. Enfeksiyon doz binlerce sırasına göre ise, daha ilerici bir hastalık bireylerin çoğunda gelişir. Doğal bulaşıcı doz insan tüberküloz41yılında düşük olarak bilindiği gibi M. marinum düşük dozda zebra balığı modeli kullanarak üretmek daha doğal bir enfeksiyon olasılığı düşüktür. Doğru doz ulaşmak için OD600 ve herhangi bir deney başlamadan önce koloni oluşturan birimler arasındaki ilişkiyi doğrulamak emin olun. Kaplama enfeksiyon dozlarda normal varyasyonu yaklaşık % 30'dur ve bir sorun olarak kabul edilmez. Ancak, bakteriyel süspansiyon tüm 5 µL hacmi balık içinde kalmasını doğrulamak önemlidir. Enjeksiyon çözümü sızıntı ilave varyasyon enfeksiyon doz neden olur. Enfeksiyon doz yanı sıra zorlanma bakteri hastalık ilerleme etkileyebilir. Çok oldu bu virülans gösterildiği M. marinum farklı suşları suşları arasında değiştirebilirsiniz. İki en yaygın olarak kullanılan suşların ATCC927 vardır (izole zorlanma bu deneylerde kullanılan balık) ve M süzün. Ancak, bu suşlar büyük ölçüde onların virülans farklı. Balık izole zorlanma daha hafif hastalık iyi uygun Mikobakteriyel Enfeksiyon33gizli şeklinde eğitim için üretir, ancak insan izole M zorlanma daha ilerici bir hastalık gelişir. Bakteri transfer seri olarak Eğer bir kültürden diğerine, bir dondurucudan taze mikobakteriler alarak engelledi virülans bir yük içinde bakterilerin de değiştirebilir yeterince sık stok.
Yavaş yavaş M. marinum antibiyotikler bölme vitro kültür contaminations için eğilimli. Bu nedenle, işleme bakteri laminar akış mahallede yapılan sıkı aseptik yaklaşım gerektirir. Kültür olası bulaşma çok yüksek bir doz600 değer olarak algılanan garip görünüşlü bakteriyel askıya alınması veya koloniler. M. marinum kolonileri normalde bulanık kenarlı, düz ve mat beyaz renkli vardır. M. marinum kültürler ışığa duyarlı ve ışığa maruz zaman sarı pigment üreten başladılar. Bu sarı pigment M. marinum kolonileri--dan diğer bakteri enfeksiyonları sonra ayırt etmek için kullanılabilir. Kirletici yakında enfeksiyon sonra ölmek balık neden olabilir. Genellikle, bir düşük doz enfeksiyon ilk belirtileri önce 3 hafta enfeksiyon sonrası ve bu zaman noktasından önceki herhangi bir Scotlan bakteriyel yada enjeksiyon sırasında bağlı travma nedeniyle kirlenme olasılığı görünmez.
Yetişkin zebra balığı 3-aminobenzoic asit etil ester için çok hassas ve pozlama süresi çok uzun veya anestezik konsantrasyonu çok yüksek olduğunda sağ çıkamayız. Bu nedenle, ne zaman hastalık, zebra balığı sadece iyi anestezi ulaşmak için zaman en az için anestezi maruz (~ 1-2 dk). Enfeksiyon sonra yetişkin zebra balığı su sıcaklığı 26-28 ° c gruplar halinde tutulur Sıcaklık daha yüksek veya daha düşük ise, M. marinum büyüme hızı ve kinetik enfeksiyon etkileyebilir. Ayrıca, tank su kalitesi (mikrobiyolojik kalite, tuz konsantrasyonu, pH, oksijen doygunluk) başarılı bir deneme sağlanması önemli bir parçasıdır. Balık sağlık izleme günlük ve enfeksiyonu gruptan kaldırılacak ve ötenazi gerek gösteren balık taşınması gerekiyor. Balık içinde belgili tanımlık tank ölürsen, diğer balık enfeksiyon ilerleme etkiler bağırsak yeniden enfekte olabilir.
Yaygın olarak kullanılan zebra balığı larva modeli tüberküloz deneyleri sınırlı bir alt kümesine ana bilgisayar-mikrop etkileşimleri yönlendirir çalışma doğuştan gelen bağışıklık için geçerlidir. Yetişkin zebra balığı kullanımı, doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık yanıtı çok yönlü modeli18,32,39' çalışma olanak verir. Yetişkin zebra balığı tüberküloz tüm spektrumu çalışmaya uygun omurgalı model olarak kendini göstermektedir. M. marinumbir düşük doz pozlama ile balık nüfusun % 7 birincil progresif hastalık geliştirmek, % 10 enfeksiyon sterilize edebiliyoruz, % 65 gizli hastalık geliştirmek ve % 18 kendiliğinden yeniden etkinleştirme (Şekil 2) oluşur. Hastalık spektrum görüntüleyen büyük çoğunluğu gizli bir hastalığı, yaklaşık % 4-14 geliştirmek insan tüberküloz, birincil aktif enfeksiyon enfeksiyon42, % 10 – 20 sonra ilk beş yıl içinde ağır üretmek çok benzeyen maruz kalan kişi43 enfeksiyon sterilize etmek mümkün görünüyor ve gizli enfeksiyonlar % 5-10'u yeniden44. Ana bilgisayarlarının genetik farklılıkları tüberküloz ve hastalık ilerleme45duyarlılık etkiler. Bu da genetik olarak birçok diğer laboratuvar hayvanları46,47çok heterojen zebra balığı nüfus görülmektedir. Doğal genetik varyasyon bu aramanın en uygun bağışıklık yanıtı multifaktöriyel bu hastalık için son derece uygun bir model sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser Fin Kültür Vakfı (H.L. tarafından), Tampere tüberküloz Vakfı (H.L., L.-M.V., M.M.H., milletvekili), Finlandiyalı Anti-tüberküloz Derneği (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L., temeli desteklenen M.M.H., milletvekili), Sigrid Jusélius Vakfı (milletvekili), Emil Aaltonen Vakfı (M.M.H.), Jane ve fotograf Erkko Vakfı (milletvekili) ve Finlandiya Akademisi (milletvekili). Leena Mäkinen, Hanna-Leena Piippo ve Jenna Ilomäki teknik yardım kabul vardır. Yazarlar Tampere zebra balığı Laboratuvar Hizmetleri için kabul.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mycobacterium marinum | American Type Culture Collection | ATCC 927 | |
| Middlebrock 7H10 agar | BD, Thermo Fisher Scientific | 11799042 | |
| Middlebrock OADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Middlebrock 7H9 medium | BD, Thermo Fisher Scientific | 11753473 | |
| Middlebrock ADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| GENESYS20 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Phosphate buffered saline tablets (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| 27 G needle | Henke Sass Wolf | 4710004020 | |
| 1 mL syringe | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Omnican 100 30 G insulin needle | Braun | 9151133 | |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| 1.5 mL homogenization tube | Qiagen | 13119-1000 | |
| 2.8 mm ceramic beads | Qiagen | 13114-325 | |
| Ethanol, ETAX Aa | Altia | ||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475 | |
| Chloroform | VWR | 22711.290 | |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277 | FW 118.2 g/mol |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 1613859 | FW 294.1 g/mol |
| Tris (free base) | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | FW 121.14 g/mol |
| TRI reagent | Molecular Research Center | TR118 | Guanidine thiocyanate-phenol solution |
| PowerLyzer24 homogenizator | Qiagen | ||
| Sonicator m08 | Finnsonic | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix | Bioline | BIO-98005 | |
| qPCR 96-well plate | BioRad | HSP9601 | |
| Optically transparent film | BioRad | MSB1001 | |
| C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system | BioRad | ||
| RNase AWAY | Thermo Fisher Scientific | 10666421 | decontamination reagent eliminating RNases |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0525 | |
| Reverse Transcription Master Mix | Fluidigm | 100-6298 | |
| SsoFast Eva Green master mix | BioRad | 172-5211 |
References
- Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 34, 80 (2015).
- Bournele, D., Beis, D. Zebrafish models of cardiovascular disease. Heart failure reviews. 21 (6), 803-813 (2016).
- Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish Infection: From Pathogenesis to Cell Biology. Trends in cell biology. 28 (2), 143-156 (2018).
- Varela, M., Figueras, A., Novoa, B. Modelling viral infections using zebrafish: Innate immune response and antiviral research. Antiviral Research. 139, 59-68 (2017).
- Goody, M. F., Sullivan, C., Kim, C. H. Studying the immune response to human viral infections using zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 84-95 (2014).
- Thisse, C., Zon, L. I. Organogenesis--heart and blood formation from the zebrafish point of view. Science. 295 (5554), 457-462 (2002).
- Eimon, P. M., Rubinstein, A. L. The use of in vivo zebrafish assays in drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 5 (4), 393-401 (2009).
- Sukardi, H., Chng, H. T., Chan, E. C. Y., Gong, Z., Lam, S. H. Zebrafish for drug toxicity screening: bridging the in vitro cell-based models and in vivo mammalian models. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 7 (5), 579-589 (2011).
- Wittamer, V., Bertrand, J. Y., Gutschow, P. W., Traver, D. Characterization of the mononuclear phagocyte system in zebrafish. Blood. 117 (26), 7126-7135 (2011).
- Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of leukocyte biology. 98 (4), 523-537 (2015).
- Yoshida, N., Frickel, E., Mostowy, S. Macrophage-Microbe interactions: Lessons from the Zebrafish Model. Frontiers in Immunology. 8, 1703 (2017).
- Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7369-7374 (2004).
- Lewis, K. L., Del Cid, N., Traver, D. Perspectives on antigen presenting cells in zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 63-73 (2014).
- Hu, Y., Xiang, L., Shao, J. Identification and characterization of a novel immunoglobulin Z isotype in zebrafish: Implications for a distinct B cell receptor in lower vertebrates. Molecular immunology. 47 (4), 738-746 (2010).
- Danilova, N., Bussmann, J., Jekosch, K., Steiner, L. A. The immunoglobulin heavy-chain locus in zebrafish: identification and expression of a previously unknown isotype, immunoglobulin Z. Nature immunology. 6 (3), 295-302 (2005).
- Zapata, A., Diez, B., Cejalvo, T., Frias, C. G., Cortes, A.
- Traver, D., Paw, B. H., Poss, K. D., Penberthy, W. T., Lin, S., Zon, L. I. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).
- Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
- Parikka, M., et al. Mycobacterium marinum Causes a Latent Infection that Can Be Reactivated by Gamma Irradiation in Adult Zebrafish. PLoS Pathog. 8 (9), 1-14 (2012).
- Tobin, D. M., et al. Host Genotype-Specific Therapies Can Optimize the Inflammatory Response to Mycobacterial Infections. Cell. 148 (3), 434-446 (2012).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current opinion in microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
- Berg, R. D., Ramakrishnan, L. Insights into tuberculosis from the zebrafish model. Trends in molecular medicine. 18 (12), 689-690 (2012).
- World Health Organization. WHO Global tuberculosis report 2017. , Available from: http://www.who.int/tb/publications/global_report/en/ (2017).
- Ordonez, A. A., et al. Mouse model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9. Disease Models & Mechanisms. 9 (7), 779-788 (2016).
- Kramnik, I., Beamer, G. Mouse models of human TB pathology: roles in the analysis of necrosis and the development of host-directed therapies. Seminars in Immunopathology. 38 (2), 221-237 (2016).
- Manabe, Y. C., et al. The aerosol rabbit model of TB latency, reactivation and immune reconstitution inflammatory syndrome. Tuberculosis. 88 (3), 187-196 (2008).
- Pena, J. C., Ho, W. Monkey Models of Tuberculosis: Lessons Learned. Infection and immunity. 83 (3), 852-862 (2015).
- Cadena, A. M., Fortune, S. M., Flynn, J. L.
- Stinear, T. P., et al. Insights from the complete genome sequence of Mycobacterium marinum on the evolution of Mycobacterium tuberculosis. Genome research. 18 (5), 729-741 (2008).
- Swaim, L. E., Connolly, L. E., Volkman, H. E., Humbert, O., Born, D. E., Ramakrishnan, L. Mycobacterium marinum infection of adult zebrafish causes caseating granulomatous tuberculosis and is moderated by adaptive immunity. Infection and immunity. 74 (11), 6108-6117 (2006).
- Myllymaki, H., Bauerlein, C. A., Ramet, M. The Zebrafish Breathes new Life into the Study of Tuberculosis. Frontiers in Immunology. 7, 196 (2016).
- Luukinen, H., et al. Priming of Innate Antimycobacterial Immunity by Heat-killed Listeria monocytogenes Induces Sterilizing Response in Adult Zebrafish Tuberculosis Model. Disease Models and Mechanisms. 11, (2018).
- Sar, A. M., Abdallah, A. M., Sparrius, M., Reinders, E., Vandenbroucke-Grauls, C., Bitter, W. Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence. Infection and immunity. 72 (11), 6306-6312 (2004).
- Madigan, M., Martinko, J. Brock Biology of Microorganisms. , (2016).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish:a practical approach. , Oxford University Press. Oxford. (2002).
- Anonymous Stanford University Protocols. , Available from: http://med.stanford.edu/labs/vanderijn-west/Protocols.html (2018).
- Vanhauwaert, S., et al. Expressed Repeat Elements Improve RT-qPCR Normalization across a Wide Range of Zebrafish Gene Expression Studies. Plos One. 9 (10), e109091 (2014).
- Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
- Oksanen, K. E., et al. An adult zebrafish model for preclinical tuberculosis vaccine development. Vaccine. 31 (45), 5202-5209 (2013).
- Roth, A., Fischer, M., Hamid, M. E., Michalke, S., Ludwig, W., Mauch, H. Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences. Journal of clinical microbiology. 36 (1), 139-147 (1998).
- Rajararna, M. V. S., Ni, B., Dodd, C. E., Schlesinger, L. S.
- Vynnycky, E., Fine, P. The natural history of tuberculosis: the implications of age-dependent risks of disease and the role of reinfection. Epidemiology and infection. 119 (2), 183-201 (1997).
- Cobat, A., et al. Two loci control tuberculin skin test reactivity in an area hyperendemic for tuberculosis. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2583-2591 (2009).
- Delogu, G., Goletti, D. The Spectrum of Tuberculosis Infection: New Perspectives in the Era of Biologics. Journal of Rheumatology. 41, 11-16 (2014).
- Abel, L., et al. Genetics of human susceptibility to active and latent tuberculosis: present knowledge and future perspectives. Lancet Infectious Diseases. 18 (3), E75 (2018).
- Guryev, V., et al.
- Brown, K. H., et al. Extensive genetic diversity and substructuring among zebrafish strains revealed through copy number variant analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 529-534 (2012).
