Summary
نقدم هنا دليلاً عمليا لبناء نظام متكامل الفحص المجهري، والذي يدمج التقليدية برنامج التحصين الموسع-فلوري التصوير، وتصوير فائقة جزيء واحد القرار القائم على الكشف، والكشف عن جزيء واحد متعدد الألوان، بما في ذلك نقل الطاقة صدى الأسفار جزيء واحد التصوير، إلى إنشاء واحدة بطريقة فعالة من حيث تكلفة.
Abstract
مجهر الأسفار أداة قوية للكشف عن الجزيئات البيولوجية في الموقع ورصد ديناميات والتفاعل في الوقت الحقيقي. بالإضافة إلى الفحص المجهري التقليدي برنامج التحصين الموسع-الأسفار، تطورت تقنيات التصوير المختلفة لتحقيق أهداف تجريبية محددة. بعض التقنيات المستخدمة على نطاق واسع وتشمل الأسفار جزيء واحد الرنين نقل الطاقة (سمفريت)، التي يمكن أن تبلغ conformational التغييرات والتفاعلات الجزيئية مع القرار انغستروم، والقائم على الكشف عن جزيء واحد فائقة القرار (SR) التصوير، والذي يمكن أن يعزز هذا القرار المكانية حوالي عشرة إلى توينتيفولد مقارنة بالفحص المجهري حيود محدودة. وهنا يقدم نظام متكامل تصميم العميل الذي يقوم بدمج عدة أساليب التصوير في المجهر واحد، بما في ذلك تصوير برنامج التحصين الموسع-الفلورسنت التقليدية، تصوير ريال على أساس الكشف عن جزيء واحد، والكشف عن جزيء واحد متعدد الألوان، بما في ذلك التصوير سمفريت. ويمكن تحقيق أساليب التصوير المختلفة بسهولة وتكاثر بتبديل العناصر البصرية. هذا التشكيل من السهل أن تعتمد أي مختبر البحوث في العلوم البيولوجية مع حاجة إلى روتين وتجارب التصوير المتنوعة في خفض التكلفة والمساحة بالنسبة إلى بناء المجاهر منفصلة لأغراض فردية.
Introduction
مجاهر الأسفار أدوات هامة لبحوث العلوم البيولوجية الحديثة والتصوير الفلورسنت تتم بشكل روتيني في الكثير من مختبرات البيولوجيا. بوضع علامات الجزيئات الحيوية ذات الاهتمام مع فلوروفوريس، ونحن مباشرة تصور لهم تحت المجهر وتسجيل التغييرات التي تعتمد على الوقت في الترجمة، والمطابقة، والتفاعل، والجمعية الدولة فيفو في أو في المختبر. مجاهر الفلورية التقليدية لدينا قرار حيود محدودة المكاني، الذي هو ~ 200-300 نانومتر في الاتجاه الأفقي، وشمال البحر الأبيض المتوسط ~ 500-700 في الاتجاه المحوري1،2، وهي، لذلك، تقتصر على التصوير في 100s من مقياس نانومتر إلى ميكرون. وقد وضعت بغية الكشف عن التفاصيل الدقيقة في الجمعية الجزيئية أو المنظمة، ميكروسكوبيس ريال المختلفة التي يمكن كسر الحد حيود. وتشمل الاستراتيجيات المستخدمة لتحقيق ريال التأثيرات البصرية غير الخطية، مثل الانبعاثات حفز استنفاد (STED) الفحص المجهري3،4 والمنظم الإضاءة مجهرية (SIM)5،6، 7، كشف العشوائية لجزيئات مفردة، مثل التعمير البصرية العشوائية مجهرية (العاصفة)8 وفوتواكتيفاتيد التعريب مجهرية (النخيل)9، ومزيج من الاثنين، مثل مينفلوكس10. بين هذه ميكروسكوبيس ريال، يمكن تعديل مجاهر ريال على أساس الكشف عن جزيء واحد بسهولة نسبيا من هيكل مجهر جزيء واحد. مع التنشيط المتكررة وتصوير فوتواكتيفاتابل البروتينات الفلورية (FPs) أو صور التحويل الأصباغ معلم على الجزيئات الحيوية ذات الاهتمام، القرار المكانية يمكن أن تصل إلى 10-20 نانومتر11. للحصول على معلومات بشأن التفاعلات الجزيئية و conformational مطلوب الديناميات في القرار في الوقت الحقيقي، انغستروم إلى نانومتر. سمفريت،من1213 نهج واحد لتحقيق هذا القرار. عموما، واعتماداً على الأسئلة البيولوجية للفائدة، يلزم أساليب التصوير مع القرارات المكانية المختلفة.
عادة، لكل نوع من التصوير، يلزم تكوين محدد الإثارة و/أو الانبعاثات الضوئية. على سبيل المثال، أحد أساليب الإضاءة الأكثر استخداماً للكشف عن جزيء واحد من خلال الانعكاس الداخلية مجموع (النقل البري)، التي تحتاج إلى تحقيقه من خلال موشور أو من خلال عدسة الهدف بزاوية معينة من إثارة. للكشف عن سمفريت، الانبعاثات من الأصباغ كل من المانحين ويقبلون بحاجة إلى فصل مكانياً والموجهة إلى أجزاء مختلفة من الإلكترون ضرب، جهاز (امككد)، الذي يمكن أن يتحقق مع مجموعة من المرايا وشق شعاع مزدوج اللون وضعت في طريق الانبعاث. ثلاثي الأبعاد (3-D) ريال التصوير، عنصرا بصرية، مثل عدسة أسطوانية14، تحتاج ليسبب تأثير الاستجماتيزم في مسار الانبعاثات. ولذلك، [هومبويلت] أو مجاهر المتكاملة المتاحة تجارياً، عادة، وظيفيا المتخصصة لكل نوع من التصوير أسلوب وليست مرنة للتبديل بين مختلف أساليب التصوير في إنشاء نفس. نقدم هنا هو نظام هجين فعالة من حيث التكلفة، يوفر قابل للتعديل واستنساخه للتبديل بين ثلاث طرق مختلفة التصوير: تصوير برنامج التحصين الموسع-الفلورسنت التقليدية مع القرار حيود محدودة، ريال على أساس الكشف عن جزيء واحد التصوير، والكشف عن جزيء واحد متعدد الألوان، بما في ذلك سمفريت التصوير (الشكل 1A). على وجه التحديد، يتضمن الإعداد المقدمة هنا إلى جانب ألياف الليزر الإدخال للإثارة متعدد الألوان وذراع إضاءة تجارية في مسار الإثارة، الذي يسمح المبرمجة تحكم زاوية الإثارة، للتبديل بين وضع النقل البري الدولي وفي وضع برنامج التحصين الموسع. في مسار الانبعاثات، كاسيت عدسة أسطوانية قابلة للإزالة [هومبويلت] يوضع داخل الجسم المجهر للتصوير ثلاثي الأبعاد بريال، ويوضع مقسم شعاع تجارية قبل كاميرا امككد التي يمكن تمكين بشكل انتقائي للكشف عن قنوات متعددة في الانبعاثات في نفس الوقت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-المجهر التصميم والجمعية
-
مسار الإثارة
ملاحظة: يتضمن مسار الإثارة أشعة الليزر ومكونات التباين (DIC) التدخل التفاضلية والجسم مجهر وذراعها الإضاءة.- إعداد جدول ضوئية عزل الاهتزازات. على سبيل المثال، يعطي جدولاً التخميد هيكلية من 48 × 96 x 12 '' مساحة كافية لكافة المكونات.
ملاحظة: بناء الهيكل في غرفة مع التحكم في درجة الحرارة (مثل، 21.4 ± 0.55 درجة مئوية). استقرار درجة الحرارة أمر حاسم للحفاظ على محاذاة البصري. - تثبيت جهاز مجهر مجهز بذراع إضاءة للاتصال بالألياف الضوئية، 100 × النفط-الغمر TIRF الهدف العدسة، ومكونات DIC.
- ضع أربعة رؤساء الليزر (647 نانومتر، 561 نانومتر، 488 نانومتر، و 405 نانومتر، مطوقة الشكل 1B) الحرارة المصارف على الطاولة الضوئية، وتأكد من أشعة الليزر المنبعثة لها نفس الارتفاع وهي قصيرة قدر الإمكان لضمان استقرار جيدة (مثل ، 3 '').
ملاحظة: إذا كان رأس ليزر يجلس على ارتفاع أقل من غيرها الليزر، وضع صفيحة ألومنيوم بسماكة كافية تحته. دائماً ضمان الحد الأقصى من الاتصال بين المصارف الحرارة والجدول البصرية لتبديد الحرارة أفضل (الشكل 1B). الليزر بحاجة إلى أن تكون قوية بما يكفي لتصوير ريال. انظر الجدول للمواد. من المستحسن أن يكون الليزر تنظيف المرشحات أمام ليزر صمام ثنائي. - تثبيت بطاقة الحصول على بيانات من خلال واجهة interconnect (PCI) مكون طرفية في محطة عمل والاتصال أشعة الليزر باستخدام هذه البطاقة. التحكم في السلوكيات ON/OFF الليزر الترانزستور الترانزستور منطق (TTL) إخراج وتكيفهم السلطة بإخراج تمثيلية لهذه البطاقة (الشكل 1). تثبيت الفحص المجهري سليم التصوير البرمجيات (تجارية أو [هومبويلت]) للتحكم في بطاقة حيازة البيانات، فضلا عن الجسم المجهر.
- جبل المرايا وشق شعاع مزدوج اللون (590 و 525 و 470 طويلة تمرير مرشحات) لما يتصاعد منها. استخدام يتصاعد مرآة مستقرة جداً للمرايا. استخدام شق دائري مع الاحتفاظ بحلقات لتجنب ثني أي من شق شعاع مزدوج اللون (الشكل 1).
- وضع المرايا وشق شعاع مزدوج اللون على الطاولة الضوئية الجمع بين أشعة الليزر (الشكل 1B). لتحقيق المحاذاة الأكثر استقرارا، تجعل هذا الترتيب كله حسب الاتفاق قدر الإمكان، واستخدام الوظائف البصرية 1 ''-سمك. ترتيب الليزر حيث أن الليزر الطول الموجي أقصر أقرب إلى اقتران الألياف البصرية (الشكل 1B) نظراً للطول الموجي القصير الأضواء تتبدد أكثر في الهواء.
- الجمع بين أشعة الليزر في ألياف الضوئية طريقة واحدة. للقيام بذلك، بناء مقرنة ألياف في قفص نظام من خلال الخطوات التالية:
- تحميل لوحة محول ألياف في جبل محور ع ترجمة (الشكل 1E، الفريق الموجود في أقصى اليمين).
- جبل عدسة يبنوا متعامي (البعد البؤري = 7.5 ملم) في لوحة قفص (الشكل 1E، الفريق الثاني من اليسار).
- اتصال أجزاء اثنين أعلاه بمد قضبان شكل قفص. جبل القفص على الطاولة الضوئية مع تصاعد بين قوسين على الوظائف 1 '' سميكة ضوئية (الشكل 1E، الفريق الأوسط).
- محاذاة 647-نانومتر الليزر أولاً مع ألياف الضوئية طريقة واحدة (نهاية FC/آسيا والمحيط الهادئ إلى المقرنة).
ملاحظة: استخدام ألياف البصرية وضع متعددة من قبل استخدام الألياف الضوئية طريقة واحدة قد تساعد عملية المحاذاة محاذاة الخام. ضبط زوايا المرايا وشق شعاع مزدوج اللون (الشكل 1، بالمقابض التكيف)، فضلا عن المسافة بين العدسة يبنوا متعامي ولوحة محول الألياف (الشكل 1E، عن طريق ضبط محور ع الترجمة جبل) للحصول على الليزر أقصى إنتاج الطاقة عن طريق الألياف. - حالما يتم محاذاة أول ليزر، مؤقتاً تثبيت زوج من القزحيات ومحاذاة بقية الليزر واحداً تلو الآخر (الشكل 1F). التحقق من كفاءة المحاذاة مع مقياس طاقة.
- ترك واحدة القزحية الجزء الأمامي من لوحة محول للحد من انعكاسات الليزر.
ملاحظة: قوي الظهر انعكاسات يمكن أن تقلل من عمر مصادر الليزر. بشكل اختياري، يمكن تثبيت عازل بصري أمام كل رئيس الليزر لإزالة الأفكار تماما.
- توصيل الطرف الآخر من الألياف الضوئية للذراع إضاءة المجهر (الشكل 1 ح).
- تصميم وتثبيت "التكبير عدسة (ماج)" من خلال الخطوات التالية:
ملاحظة: يمكن استخدام الليزر لتصوير برنامج التحصين الموسع-الأسفار من العينة، ولكن حجم الضيق شعاع الليزر كل حدود المنطقة المضاءة من العينة إلى منطقة عدة مرات أصغر من الحجم الفعلي للاستشعار الكاميرا المقابلة، لا سيما بالنسبة أحدث كاميرات (مع 18.8 مم في طول قطري مقارنة بطول 11.6 ملم التقليدية). وهكذا، من المستحسن توسيع شعاع لتحقيق إضاءة أكبر وتملق للعينة.- تصميم ماج العدسة، والتي يمكن أن تندرج في ذراع الإضاءة (الشكل 1 ح).
ملاحظة: يعتمد تصميم عدسة ماج على حيث يتم تثبيته. ويبين الشكل 1 ح مثال للتثبيت في الذراع الإضاءة، ولكن يمكن تثبيته في أي بقعة بعد أشعة الليزر وتحديدالمنطقه (انظر المناقشة). التصميم مع التصميم بمساعدة الكمبيوتر وصياغة البرامج. - ضع اثنين achromatic عدسات مقعرة واحدة (البعد البؤري = و1)، والآخر محدب (البعد البؤري = و2) في حامل العدسة ماج الصنع (الشكل 2 ألف و 2 (ج))، مع المسافة يساوي مجموع أطوال بهم، و1 + و2 = (-25) + 50 = 25 مم (الشكل 2).
ملاحظة: مع هذا الاختيار لأطوال، عدسة ماج يوسع الشعاع و2/| إف1| = طيات 2. توفر العدسة ماج براعة. ويمكن إزالتها باستئناف الإضاءة العادية دون توسيع الحزم (الشكل 2D) أو إدراجها في الاتجاه المعاكس لتركيز شعاع الليزر لتحقيق شدة إثارة أقوى.
- تصميم ماج العدسة، والتي يمكن أن تندرج في ذراع الإضاءة (الشكل 1 ح).
- إعداد جدول ضوئية عزل الاهتزازات. على سبيل المثال، يعطي جدولاً التخميد هيكلية من 48 × 96 x 12 '' مساحة كافية لكافة المكونات.
2-انبعاث المسار
ملاحظة: مسار الانبعاثات تتكون من عدسة أسطوانية قابلة للإزالة وعجلة تصفية حاجز الفاصل انبعاثات كاميرا امككد (الشكل 1). لتحقيق أفضل نقطة انتشار الدالة (PSF) من جزيئات مفردة، يتم وضع منظور DIC بعيداً عن العدسة والهدف.
- إدراج مخصص-تصميم كاسيت أسطواني (عدسة ثلاثية الأبعاد)، التي يمكن أن تندرج في محلل DIC اليدوي فتحه في جسم المجهر (الشكل 3).
ملاحظة: هذا التصميم لا يضر محلل DIC حيث يمكن إدراج كتلة محلل في البرج عامل التصفية. - وضع العدسة ثلاثية الأبعاد من 10 أمتار من البعد البؤري في الكاسيت وأدخله في مسار شعاع انبعاث لخلق تأثير الاستجماتيزم اللازمة لاستخراج إحداثي z كل جزيء واحد14.
ملاحظة: بشكل اختياري، يمكن وضع كاسيت عدسة ثلاثية الأبعاد أو الخروج من مسار الانبعاثات (الشكل 3). - تثبيت تقسيم شعاع مزدوج اللون متعدد فرقة في برج التصفية داخل الجسم المجهر.
- تثبيت عوامل الانبعاثات.
ملاحظة: يتم اختيار عوامل الانبعاثات حسب فلوروفوريس المفضل. اعتماداً على وحدة التصوير، تستخدم عوامل الانبعاثات وضعت في مواقع مختلفة كما هو موضح أدناه:- لتصوير متسلسل متعدد الألوان برنامج التحصين الموسع-الأسفار أو تصوير ريال، استخدام مرشحات الانبعاثات توضع في عجلة تصفية حاجز متصل بجانب الجسم المجهر للتقليل من الاهتزاز في الجسم المجهر أثناء تبديل القناة (الشكل 1).
- لكشف متعدد الألوان المتزامنة (مثلاً، تجارب سمفريت)، وضع عامل تصفية آخر في الخائن انبعاثات (الاختيار الخطوة 4 للحصول على التفاصيل).
ملاحظة: عادة، مقسم انبعاث تجارية وضعين للتحويل (أي، "المشاركة" أو "تجاوز" وسائط). لفصل الأضواء الانبعاثات لونياً للتصوير بالألوان متعددة متزامنة (وضع "المشاركة")، يتم استخدام مكعب تصفية عقد شق شعاع مزدوج اللون اثنين وثلاثة عوامل الانبعاثات ("ثلاثية المكعب،" الرقم 4 و 4 د). ويستخدم في تركيبة مع المكعب الثلاثي فتحه فارغة في عجلة تصفية الحاجز. للتصوير بالألوان متعددة متسلسلة، من ناحية أخرى، يتم استبدال المكعب الثلاثي مكعب يحتوي فقط على مرآة داخل ("تجاوز المكعب،" الشكل 4A و 4 د).
- قم بتثبيت الكاميرا امككد كالجزء الأخير من مسار الانبعاثات. استخدام اتصال USB PCI بتحقيق معدل إطار بسرعة.
ملاحظة: من المستحسن كاميرا امككد للكشف عن جزيء واحد الأكثر حساسية، ولكن كاميرا سكموس متقدمة يمكن أن تكون بديلاً.
3-حيود محدودة التصوير مع برنامج التحصين الموسع-الإثارة
- ضبط زاوية عرضية الليزر الإثارة إلى وضع برنامج التحصين الموسع في الذراع الإضاءة.
- فك الارتباط مع العدسة ثلاثية الأبعاد إذا شارك (الشكل 3، اللوحة اليمنى).
- إدراج المكعب الالتفافية في التقسيم الانبعاثات (الشكل 4A و 4E، اللوحة السفلية).
- (اختياري) إدراج العدسة ماج لمنطقة إضاءة موسعة (الشكل 2D، اللوحة اليمنى).
ملاحظة: مع استخدام عدسة ماج و 100 × النفط-غمر عدسة الهدف، حوالي 91 × 91 ميكرومتر2 يمكن أن تكون مضيئة بالتساوي، مما يلغي الحاجة استخدام مصدر ضوء أبيض ومكعبات تصفية متعددة. - استخدام الفحص المجهري التصوير البرمجيات اتخاذ متعدد القنوات، و/أو Z-مكدس، والوقت الفاصل بين الصور.
ملاحظة: هناك العديد من البرامج المتاحة للتصوير المجهري، وليس فقط من الشركات المصنعة للمجهر، بل أيضا من شركات الطرف الثالث أو مفتوحة المصدر للمطورين.
4-متعدد القنوات تصوير جزيء واحد بما في ذلك سمفريت
ملاحظة: نقل إلى موضع "فارغ" في عجلة تصفية الحاجز، حيث أنه يمكن أن تصل إلى جميع الانبعاثات مع أي الطول الموجي للمجموعة الثانية من مرشحات/مزدوج اللون شق شعاع في المقسم والانبعاثات.
- لإعداد الكشف عن جزيء واحد متعدد الألوان المعطل تداولها سطح الجزيئات15 استخدام الإثارة TIRF، بما في ذلك قياس سمفريت، وضبط زاوية الليزر الإثارة عرضية إلى الزاوية TIRF. فض الاشتباك ماج العدسة والعدسة ثلاثية الأبعاد.
- المشاركة في وضع ثلاث قنوات في التقسيم الانبعاثات (الشكل 1) من خلال الخطوات التالية:
- استبدال المكعب الالتفافية مع مكعب "معايرة" الذي يسمح للضوء للذهاب من خلال جميع القنوات (الشكل 4 باء و 4E).
- قم بتشغيل الكاميرا تحت DIC (أي، لا يوجد عامل تصفية الانبعاثات في عجلة تصفية الحاجز) وضبط الفتحة المقسم الانبعاثات حتى ثلاث قنوات منفصلة تماما تظهر على الشاشة.
ملاحظة: إجراء هذه الخطوة مع ضوء غرفة مضاءة، لتصور كل القنوات. - تشغيل مقابض التحكم ضبط رأسية وأفقية في المقسم والانبعاثات ومحاذاة القنوات الثلاث (الشكل 4E و 4F) تقريبا.
- إيقاف الكاميرا واستبدال المكعب المعايرة مع مكعب ثلاثية (الشكل 4 و 4E).
- ضع عينة مع الخرز متعدد القنوات 100 نانومتر على رأس 100 × عدسة الهدف والتركيز على العينة.
- قم بتشغيل الكاميرا والليزر 488 نانومتر والتكبير والتصغير في واحدة من الخرز مشرق وناعما محاذاة القنوات الثلاث التي تحول التكيف التحكم المقابض مرة أخرى (الشكل 4E وز 4).
ملاحظة: حبات 100 نانومتر الأقنية ينبعث أطوال موجية مختلفة من الضوء على الإثارة 488 نانومتر، تمكين المحاذاة ثلاث قنوات.
- قم بتشغيل الكاميرا وأشعة الليزر، التركيز، وإيجاد موقف جيد مع كثافة بقعة معقولة. ضبط الوقت الليزر السلطة والتعرض لتحقيق مستويات مقبولة من الإشارات إلى الضجيج وفوتوبليتشينج. استخدام الفحص المجهري برامج التصوير لتأخذ صوراً بمرور الزمن.
5-ريال تصوير
ملاحظة: هذا هو جزيء واحد المستندة إلى الكشف المجهري ريال.
- لإعداد تصوير ريال، إدراج العدسة ثلاثية الأبعاد وإزالة العدسة ماج. تعيين وقت التعرض للكاميرا في قنوات الليزر المناسبة (مثل، مرض التصلب العصبي المتعدد 5-60). تحديد وتعيين يدوياً زاوية عرضية الليزر الإثارة الأمثل أن تكون الزاوية TIRF.
- ضع العينة في التصوير المخزن المؤقت16ريال. تسمح المخزن المؤقت لحجته لمدة 10 دقيقة على الأقل قبل التصوير.
ملاحظة: تنتهي ريال التصوير المخزن المؤقت بعد 1 ساعة تقريبا، لذا يجب ريال جديد التصوير المخزن المؤقت تبعاً لذلك. - تأخذ صورة DIC قبل تصوير ريال. بغية إيجاد ارتفاع الهدف الصحيح لريال، الذي يحسن تأثير الاستجماتيزم، استخدم DIC التصوير للعثور على الطائرة المتوسطة للخلايا. تعريف الطائرة بالارتفاع الذي الخلايا الانتقال من "الخفيفة" بالصور "الظلام" ويبدو أن تصبح شفافة (الشكل 5Aو 5B وج 5). حالما يتم تحديد المستوى البؤري المطلوب، إشراك نظام تصحيح z-الانجراف (الشكل 1A).
- إجراء تصوير ريال. تغيير قوة 405 نانومتر الليزر للحفاظ على كثافة معقولة 'وامض على' البقع.
ملاحظة: في حين أنه من الممكن لتغيير الليزر 405 نانومتر يدوياً، أكثر ملاءمة لتشغيل رمز اقتناء بيانات مبرمجة للحفاظ على كثافة البقع "امض على". هنا مثال عن كيف تتم تلقائياً. شفرة المصدر متاح عند الطلب (الشكل 6).- بدء الحصول على التصوير مع 0 واط/سم2 الليزر البنفسجي السلطة.
- عد الوميض على البقع في فترة زمنية معينة.
- تعدل قوة الليزر البنفسجي حيث أن يتم الإبقاء على عدد البقع وامض على عتبة المعرفة من قبل المستخدم "عد" في مجال الرؤية. زيادة قوة الليزر البنفسجي عندما ينخفض عدد البقع وامض على عتبة عد الأصوات.
- إنهاء اقتناء عندما ينخفض عدد البقع وامض على عتبة العد باستخدام قوة الليزر البنفسجي الأقصى.
ملاحظة: يمكن أن يكون الحد الأقصى لتعيين بشكل مختلف اعتماداً على سطوع عينة، ولكن لا يزيد عن 130 واط/سم2. اعتماداً على الهدف الفعلي لتصوير ريال، يمكن إنهاء هذه التعليمات البرمجية الحصول التلقائي يدوياً في أي وقت تريده.
- تحقق من سلوك وامض وبسفس البقع قريبا بعد بداية اقتناء.
ملاحظة: إذا كان سلوك وامض ليست مثالية، تغيير زاوية عرضية الليزر الإثارة أو استبدالها في المخزن المؤقت للتصوير. تتوقع أخذ عينات "عمودي"، "الأفقي" والأشكال "الماس" من PSF، تمثل فلوروفوريس من أسفل، أعلاه، وضمن المستوى البؤري، على التوالي (الشكل 5). إذا كان إظهار معظم البقع بسفس الأفقي أو العمودي، ثم المستوى البؤري إيقاف من مركز الخلايا وحتى إنهاء التجربة وضبط المستوى البؤري مرة أخرى. وجود فقاعة هواء في النفط الغمر أو غيرها من العوامل المحلية يمكن أن تؤثر على نوعية بسفس، ولذلك قد يكون من الضروري لاستبدال النفط أو تغيير إلى منطقة تصوير مختلفة للعينة. - لتحليل البيانات، استخدام المصدر المفتوح (في الإضافات إيماجيج المعاهد الوطنية للصحة) أو الرموز المتاحة تجارياً للكشف عن سينترويدس لكل نقطة في كل إطار التصوير واستخراج قيم z لكل نقطة من عرض x و y14.
ملاحظة: في هذا التقرير، رمز مصدر وضعت أصلاً في واحدة من أقرب جزيء واحد على أساس الكشف عن ريال8 تعديل للكشف عن ثلاثي الأبعاد16 وتم استخدامه. - وفي حالة التصوير باللونين، صورة فلوروفوري مع الطول الموجي الإثارة وقتاً أطول، تليها واحدة مع الطول الموجي أقصر الإثارة. تشغيل التعليمات البرمجية اقتناء الآلي وبالمثل إلى الموضحة في الخطوة 5، 4، ولكن مع ليزر تصوير مختلفة.
ملاحظة: يجب تصحيح لوني بين الصور مع فلوروفوريس مختلفة (مثلاً، والصبغ الأحمر والصبغ الأصفر والأخضر). هنا هي الخطوات.- شل عدة حبات الأقنية 100 نانومتر على ساترة زجاجية، تجنب تكوين مجموعات.
- التقاط صور منها في قنوات مختلفة من الإثارة.
- استخراج (X, Y, Z) بتنسيق من البرمجيات (الخطوة 5، 6).
- ارسم ΔXأنا = X-1i X 2طاء والمادة ΔYi = Y1i -ص2i (لحبات مختلفة و 1 و 2 قنوات الألوان المختلفة) كل على حدة ويصلح لهم مع الوظائف المناسبة. حفظ المهام.
ملاحظة: الوظائف الخطية كافية في معظم الحالات. حالما يتم تحديد هذه المهام، ليس لديه هذا القياس بأن يتكرر في كل مرة للتصوير. - في تصوير ريال اللونين الفعلية عينة من الفائدة، تطبيق الوظائف إلى زيغ الصحيحة (X, Y). للاتجاه z زيغ، القيام بالحصول على ΔZ = ض1 -ض2 حبات الأقنية أو عينات مرجعية معروفة الأقنية المصنف جنبا إلى جنب مع عينة الفائدة.
ملاحظة: عكس (س، ص) زيغ، الاتجاه z زيغ ليس جيدا استنساخه في كل تجربة، ويرجع ذلك أساسا إلى صيانة غير كاملة الاتجاه z التركيز عند التبديل القناة. ومن ثم، يوصي بإجراء التصحيح في كل مرة. ΔZ = ض1 -ض2 في الغالب مستقلة (X, Y)، حتى مجرد عدد قليل من حبات أو العينات المرجعية سيكون كافياً كل منطقة عينة كل الاهتمام. ارسم الصور ريال اللونين النهائية شيدت في برمجيات تصور ثلاثي الأبعاد وتحقق ΔZ يدوياً.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويسمح هذا المجهر مرنة واستنساخه بالتبديل بين مختلف أساليب التصوير. هنا نعرض عينة من الصور التي تم جمعها مع كل وحدة التصوير.
يوضح الشكل 5 PSF جزيء وامض في أثناء اقتناء ريال. يتم بناؤها الآلاف من مثل هذه الصور لإنشاء الصورة النهائية ريال (الشكل 5E). ويبين الشكل 5E الكشف التنظيمي البكتيرية نفس كما هو موضح في الصورة برنامج التحصين الموسع-الأسفار في الشكل 7 ألف. يبين الشكل 7 صور ممثل برنامج التحصين الموسع-الأسفار الحمض النووي الريبي تنظيمية صغيرة في خلايا الإشريكيّة القولونية ومرناً في خلايا الثدييات U2OS. تتم تسمية كل الكشف مع معلم fluorophore اليغو الحمض النووي عن طريق التهجين في الموقع 17. يبين الشكل 8 قياس سمفريت الممثل من جزيئات الحمض النووي الريبي مطوية المسمى مع المانحين صبغة (الصبغة الخضراء) ويقبلون صبغة (الصبغة الحمراء). المجمعات معطلة على الشريحة المجهر، ومتحمس بالإضاءة TIRF. يمكن استخراج مسارات كثافة الأسفار من جزيئات مفردة الفردية، توليد الكفاءة الحنق كدالة للزمن.
رقم 1: تصميم تركيب المجهر. (أ) هذا الفريق يظهر الرسم التخطيطي لإعداد. م = مرآة، DBS = شعاع مزدوج اللون الفاصل، LCF = الليزر تنظيف فلتر، أنا = آيريس، L = العدسة، AP = لوحة محول، زتم = z-محور متعدية الجنسيات جبل، من = الألياف الضوئية، أوقيانوسيا = الألياف الضوئية اقتران, CL = أسطواني العدسة، TL = أنبوب العدسة، الإنكليزية والفرنسية = تريد الانبعاث، Obj = الهدف العدسة، وخ = موتور الخطوة. ينتقل نظام تصحيح z-الانجراف موتور الخطوة نوسيبيسي للعدسة الهدف لعكس اتجاه z الانجراف، التي يتم حسابها بواسطة إشارة الأشعة تحت الحمراء (IR) إنشاؤها بواسطة LED الخاصة بها والكشف عنها بواسطة كاشف الخاصة به. (ب) هذا الفريق يظهر الجمعية الإثارة الليزر. هي مجتمعة عن طريق المرايا وشق مزدوج اللون شعاع الليزر أربع وثم توجه إلى ألياف الضوئية من خلال عدسة تركيز وصفيحة محول يجلس على جبل متعدية الجنسيات (أسفل الصورة). (ج) هذا الفريق يظهر التحوير الليزر. اثنين حربه نيل-Concelman (BNC) الكابلات موصولة إلى كل من الليزر (الرأس أو المراقب المالي، حسب الشركة المصنعة) TTL والتحوير التناظرية (الفريق الموجود في أقصى اليمين). يتم دمج BNC الكابلات في كبل واحد (الفريق الأوسط) متصل ببطاقة اكتساب بيانات في محطة عمل (الفريق الموجود في أقصى اليمين) للتحكم بكمبيوتر. (د) هذا الفريق يظهر في مرآة والخائن شعاع مزدوج اللون يتصاعد. (ﻫ) بناء مقرنة ألياف في نظام قفص. لوحة محول ألياف (أ فب) شنت في جبل محور ع ترجمة (زتم) حيث أنه يمكن أن يكون التضمين المسافة إلى متعامي مزدوجة العدسة (L1، عرض الجانب تظهر). AP وزتم تحتوي على مطابقة المواضيع ونفس المستوى 1 ولوحة القفص. (و) زوج من قزحيات (يطوق) يتم تثبيتها أثناء إجراء محاذاة لأشعة الليزر متعددة. يتم استخدامها للتأكد من أن الليزر 647-شمال البحر الأبيض المتوسط (اللوحة اليمنى) والليزر 561-شمال البحر الأبيض المتوسط (اللوحة اليمنى) تذهب من خلال نفس المسار. (ز) جزء الجزئي من مسار الانبعاثات يرد. خارج الجسم، ومجهر مثبتة عجلة تصفية الانبعاثات والمقسم والانبعاثات، والكاميرا امككد بالترتيب. (ح) هذا الفريق يظهر الجمعية ذراع الإضاءة. ويتم إدراج العدسة ماج ذراع الإضاءة. يتم إرسال أشعة الليزر الإثارة في الذراع الإضاءة من خلال الألياف الضوئية، والألياف الضوئية اقتران (في الجانب الأيسر من الصورة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: العدسة ماج. (أ) هذا الفريق تبين الإسقاطات العامودي صاحب السكن العدسات المكبرة أشعة الليزر (الوحدة: مم). ويعتزم هذا التصميم يكون لائقاً في الذراع الإضاءة. (ب) يظهر هذا الفريق رسم داخلية من الثقب في حامل فيها الحصول على اثنين من العدسات في. L1 عدسة مقعرة و L2 عدسة محدبة، والمسافة بينهما هو مجموع أطوال الاتصال بهم. (ج) هذه صورة من العدسة ماج. (د) العدسة ماج يمكن إدراجها في الذراع الإضاءة لتوسيع أو تركيز أشعة الليزر (يسار) أو يمكن إزالتها للاحتفاظ بأشعة الليزر (يمين) بدون تغيير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: العدسة ثلاثية الأبعاد- (أ) هذا الفريق تبين الإسقاطات العامودي صاحب وجود حفرة دائرية فارغة لوضع الالتفافية وحفرة مستطيلة لعقد العدسة الاسطوانية (الوحدة: مم). ويعتزم هذا التصميم يكون لائقاً للمنزلق محلل DIC في هيئة مجهر. (ب) هذه صورة من العدسة ثلاثية الأبعاد. (ج) أسطواني العدسة يمكن أن تشارك في مسار الشعاع الانبعاثات تسبب بسفس مع الاستجماتيزم (يسار) أو يمكن فض الاشتباك لتجاوز الوضع، إبقاء بسفس سليمة (اليمين). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: محاذاة متعدد القنوات للتقسيم الانبعاثات. تظهر مخططات لمسار الضوء والبصريات في التقسيم الانبعاثات مع (أ) مكعب التفافية، (ب) المكعب المعايرة، والمكعب (ج) ثلاثية. M = مرآة. مكعب تجاوز مرآة داخل (M5) ومن المفترض أن يتم استخدامها مع عامل تصفية انبعاثات (الإنكليزية والفرنسية) في عجلة تصفية الحاجز. مكعب المعايرة قد شق شعاع (درجة البكالوريوس) التي تسمح للأضواء للذهاب من خلال جميع القنوات. وقد المكعب الثلاثي هما شعاع مزدوج اللون شق (DBS)، فضلا عن ثلاثة عوامل الانبعاثات. (د) هذه صور من ثلاثة مكعبات. (ﻫ) الداخلية للتقسيم الانبعاثات يرد دون مكعب (اللوحة العلوية) ومع مكعب (أسفل اللوحة) انزلاق في. هو وراء M4 M3 وعدم القبض عليه في الصورة. مقابض التحكم للمرايا على رأس الخائن الانبعاثات (اللوحة العلوية). (و) هذا الفريق يوضح المحاذاة قناة باستخدام المكعب المعايرة تحت DIC. (ز) هذا الفريق يظهر محاذاة الجميلة الخضراء (اللوحة العلوية) وقنوات الأحمر (الفريق الأوسط) باستخدام الخرز متعدد القنوات 100 نانومتر ومكعب ثلاثي. أيضا يظهر صورة مدمجة للقناتين (أسفل اللوحة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: الحصول على الصور الممثل ريال- إظهار هذه اللوحات تمثيلية DIC صورة (أ) أدناه، (ب) عند، أو (ج) أعلاه أن الطائرة وسط الخلايا. (د) هذا الفريق يبين مثال PSF fluorophores وامض على. دائرة أورانج يحيط PSF. "عمودي" دائرة خضراء تحيط PSF. "أفقي" دائرة زرقاء يحيط PSF على شكل الماس، الذي يمثل فلوروفوريس في طائرة مركزة. (ه) هذا الفريق يوضح ممثل بناؤها صورة ريال. هو المسمى الجيش الملكي النيبالي تنظيمية صغيرة مع الأسفار في الموقع التهجين مع صبغة حمراء. علامة الحدود الأبيض حواف الخلايا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: مدونة اقتناء بيانات مبرمجة لتصوير ريال- في هذه الوحدة النمطية لاقتناء القابلة للبرمجة، تنفيذ الأوامر ومجهر مراقبة وظائف مختلفة مذكورة في اللوحة اليسرى ويمكن تحديدها لإنشاء تعليمات برمجية لاقتناء المبرمجة. يتم تنفيذ الأوامر تسلسلياً من الأعلى إلى الأسفل. هذه الصورة يظهر مثال حيث المعرفة مسبقاً إجراء عدد معين من المقتنيات التصوير تكريرها حتى تطرح اقتناء ويحسب عدد البقع في ثلاثة إطارات الصور متسلسلة. إذا كان متوسط عدد هذه البقع فوق العتبة (ويعرف 50% عدد الخلايا في تصوير البكتيرية)، ما زال الحصول على الصورة في نفس الحلقة. إذا كان دون العتبة، ثم يستمر الحصول على الصور في الحلقة القادمة حيث يتم استخدام طاقة الليزر البنفسجي أقوى (قطع في الجزء السفلي من الشاشة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 7: صور ممثل برنامج التحصين الموسع-الأسفار- (أ) هذا الفريق يظهر الحمض النووي الريبي تنظيمية صغيرة في خلايا كولاي . (ب) هذا الفريق يظهر مرناً في خلايا الثدييات U2OS. تتم تسمية الكشف مع الصبغ الأحمر والصبغ الأزرق من خلال الأسفار في الموقع التهجين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 8: مثال لتصوير سمفريت. كانت متحمس عينات (A) مع الليزر 561-شمال البحر الأبيض المتوسط. (ب) الانبعاثات من الأصباغ الخضراء والحمراء التي تم جمعها في وقت واحد وسيظهر كالأخضر (يمين) والبقع الحمراء (يسار)، على التوالي. (ج) هذا الفريق يظهر الأسفار الممثل كثافة مقابل الوقت مسارات للصبغة الخضراء (الأخضر) وصبغ أحمر (أحمر) من جزيء واحد. (د) يظهر هذا الفريق الحنق الكفاءة مقابل حساب مسار الوقت (الخط الأزرق الصلبة) كمايقبلون/(أناالمانحة + IAcceptor) من جزيء واحد من العينة. تتبع الحنق مزودة بنموذج ماركوف الخفي (خط أحمر متقطع). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نظام المجهر الهجين هذا يلغي الحاجة إلى شراء مجاهر متعددة. التكلفة الإجمالية لجميع أجزاء، بما في ذلك الجدول البصرية، والبرمجيات والجدول التثبيت العمالة ومحطة العمل، هو حوالي 230,000 دولار. أجزاء آلة مخصصة، بما في ذلك ماج العدسة والعدسة ثلاثية الأبعاد، ويتكلف حوالي مبلغ 700 (التكلفة تعتمد على الرسوم الفعلية في معاهد مختلفة). النموذجية المتاحة تجارياً النظم المتكاملة لجزيء واحد المستندة إلى الكشف المجهري ريال تكلف أكثر من 300,000 دولار ~ 000 400 وهي غير متاحة لقياس سمفريت، أو برنامج التحصين الموسع-تصوير لمجال رؤية معقولة، دون الضوء الأبيض المصدر. وهكذا، يمكن تحقيق النهج الذي قدم هنا يعادل مجاهر متعددة بتكلفة مخفضة إلى حد كبير قدرات التصوير.
يمكن أن يستند هذا النظام مجهر التضمين مجهر الهيئات من شركات مصنعة مختلفة. يمكن تثبيت العدسة ثلاثية الأبعاد المحتملة في أي موضع في المسار الانبعاثات، بما في ذلك داخل التقسيم الانبعاثات، داخل الجسم المجهر، أو في المساحة المتوفرة بين عجلة تصفية ونوسيبيسي موضوعية. ومع ذلك، سيحدد الموقع الفعلي للعدسة ثلاثية الأبعاد، البعد البؤري لتحقيق أفضل أثر الاستجماتيزم للتصوير ثلاثي الأبعاد بريال. ونحن نوصي بدءاً بطول بؤري 10 أمتار. عدسة ماج هو أساسا المتوسع الحزم المثبتة في مسار الإثارة. إذا كان الليزر الإثارة إلى جانب الهواء (أي.، دون الألياف الضوئية)، أنها تافهة لتثبيت هذه المنافذ في أي بقعة بعد أشعة الليزر هي وتحديدالمنطقه. إذا كان الليزر الإثارة إلى جانب الألياف، ثم ابحث عن فتحات إضافية لتثبيت العدسات اثنين (واحد محدب والآخر محدب). على سبيل المثال، لديها الكثير من الإضاءة التجارية الأسلحة فتحات لمرشحات الكثافة محايدة. العثور على اثنين من العدسات بمجموع أطوال بهم مساوية للمسافة بين فتحات اثنين. وبعد ذلك، يمكن إدراجها لتعمل كعدسة ماج. بدلاً من ذلك، يمكن جبل لميدان الحجاب الحاجز المنزلق مكان آخر، إذا كانت متوفرة. وقد ميزة إضافية لتمكين أحد تركيز الليزر الإثارة لتحقيق السلطة العليا، التي قد تكون ضرورية لتصوير ريال، ببساطة عن طريق عكس اتجاه العدسة ماج بناء العدسة ماج في كاسيت القابلة للإزالة.
في هذا التقرير، أظهرنا مرونة التبديل بين ثلاث تقنيات التصوير المختلفة باستخدام مجهر التضمين. يمكن استخدام هذا الإعداد لتطبيقات أوسع وأكثر تقدما. على سبيل المثال، يمكن استخدام التكوين SR للجسيمات واحدة تتبع في الخلايا الحية، على صورة التحويل أو الجزيئات معلم بروتين فلوري الحيوية فوتواكتيفاتابل لمصلحة18،19. يمكن استخدام التكوين سمفريت لدراسة التفاعلات الجزيئية في فيفو نظم20. يمكن الجمع بين الكشف الانبعاثات على أساس التقسيم متعدد القنوات مع التكوين SR القيام بتصوير ريال اللونين أو الجسيمات واحدة تتبع في الوقت نفسه21.
ويمكن توسيع هذا التشكيل كذلك تمكين أكثر من التضمين المكونات. على سبيل المثال، يمكن إضافة طبقة أخرى من تصفية حجرة البرج والإضاءة، حيث أنه يمكن إنشاء مسارات إضافية للإثارة/الانبعاثات لقنوات إضافية، مثل واحد مع ليزر (IR) الأشعة تحت حمراء للتصوير عينات المسمى بصبغات الأشعة تحت الحمراء. بالإضافة إلى السماح للقناة التصوير المضافة، يمكن استخدام الأشعة تحت الحمراء أشعة الليزر لتصحيح الانحراف المرحلة في تصوير ريال أثناء التصوير اقتناء أو أثناء تحليل وظيفة. لتصحيح الانحراف خلال اقتناء التصوير، إذا لم يتوفر نظام تصحيح z-الانجراف من الشركة المصنعة للمجهر، نظام بديل مع ليزر الأشعة تحت الحمراء يمكن أن يكون أما [هومبويلت]14 أو تم الحصول عليها من شركات الطرف الثالث. لتصحيح اقتناء بعد الانجراف، ويمكن استخدامها ليزر الأشعة تحت الحمراء لتتبع علامات الاعتماد. 22
جزيء واحد ريال على أساس الكشف عن الفحص المجهري يتطلب مجموعتين من البرنامج وواحدة للحصول على البيانات وواحد لتحليل البيانات. للحصول على البيانات، بل برمجيات بسيطة [هومبويلت] أن يأخذ الصور من خلال الكاميرا بينما يسيطر على الليزر/إيقاف السلوكيات يمكن أن تعمل على توليد صور ريال، بينما من الممكن أن تعدل يدوياً قوة الليزر 405 نانومتر، مثلاً، عن طريق تناوب تثبيت أمام الليزر تصفية الكثافة المحايدة التدرج. ومع ذلك، هذه الطريقة لإجراء التجربة مرهون بحكم المجرب ذاتي من كثافة الوميض على بقع. وهكذا، هذه الطريقة ليست موضوعية، وقد لا تكون مناسبة لاستخدامها للتحديد الكمي لريال تصوير البيانات. رمز اقتناء البيانات المستخدمة هنا تشمل الكشف الموضعي/خوارزمية الفرز بينما يتم الحصول على البيانات الجارية، مما يتيح التعديل التلقائي لقوة الليزر 405 نانومتر استناداً إلى كثافة الوميض على بقع (الشكل 6). في الوقت الحاضر، توفر بعض الشركات المصنعة مجهر وحدات التصوير القابلة للبرمجة، حتى يمكن الاستفادة من هذه، أو البحث عن الإضافات من مصادر مفتوحة مثل مايكرو--مدير. لتحليل البيانات، فمن الممكن استخدام وحدات التحليل المتاحة تجارياً من مصنعي مجهر أو البحث عن الإضافات من المصادر المفتوحة مثل إيماجيج.
وباختصار، يوفر الإعداد المعروضة هنا براعة عالية وسهولة التحويل بين مختلف تكوينات التصوير بتكلفة مخفضة والفضاء. هذا التشكيل من السهل نسبيا على اعتماد أي مختبر البحوث في العلوم البيولوجية مع حاجة إلى روتين وتجارب التصوير المتنوعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وتسلم J.F. الدعم من برنامج العلماء سيرل وجائزة ابتكار جديدة لمدير المعاهد الوطنية للصحة. الكتاب تقر اقتراحات مفيدة من مختبر بول Selvin (جامعة إلينوي، اوربانا-شامبين) لتحديد المواقع العدسة ثلاثية الأبعاد.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nikon Ti-E microscope stand | Nikon | Ti-E | |
| Objective lens | Nikon | 100X NA 1.49 CFI HP TIRF | |
| Microscopy imaging software | Nikon | NIS-Elements Advanced Research/HC | HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging. |
| The illumination arm | Nikon | Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M | This arm has a slot for a magnification lens |
| Analyze block | Nikon | Ti-A | This is installed in the filter turret. |
| Z-drift correction system | Nikon | PFS | This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector. |
| Optical table top | TMC | 783-655-02R | |
| Optical table bases | TMC | 14-426-35 | |
| 647 nm laser | Cobolt | 90346 (0647-06-01-0120-100) | Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 561 nm laser | Coherent | 1280721 | OBIS 561nm LS 150mW Laser System |
| 488 nm laser | Cobolt | 90308 (0488-06-01-0060-100) | Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 405 nm laser | Crystalaser | DL405-025-O | 405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust |
| Heat sink | Cobolt | 11658 (HS-03) | Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers |
| Heat sink | Coherent | 1193289 | Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser |
| CAB-USB-miniUSB | Cobolt | 10908 | Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 9146T35 | Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 8975K248 | Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser |
| BNC cable | L-com | CC58C-6 | RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft |
| BNC adapter | L-com | BA1087 | Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded |
| SMA to BNC Adapter | HOD | SMA-870 | Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection. |
| SMB to BNC Adapter | Fairview Microwave | FMC1638316-12 | SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers |
| Data Acquisition Card | National Instruments | PCI-6723 | 13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc |
| Barrier Filter Wheel controller | Sutter Instrument | Lambda 10-B | Optical Filter Changer |
| Emission Splitter | Cairn | OptoSplit III | |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T640LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T565LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III |
| Emission filter | Chroma | ET700/75M | Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET595/50M | Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET525/50M | Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Semrock | FF02-447/60-25 | Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/647/752rpc-UF3 | Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body |
| DAPI Filter set | Chroma | 49000 | installed in the microscope body |
| Nikon laser/TIRF filtercube | Chroma | 91032 | |
| 590 long pass filter | Chroma | T590LPXR-UF1 | for combining 647 nm laser and 561 nm laser |
| 525 long pass filter | Chroma | T525LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser |
| 470 long pass filter | Chroma | T470LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser |
| Laser clean-up filter (647) | Chroma | zet640/20x | for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser |
| Laser clean up filter (488) | Semrock | LL01-488-25 | for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser |
| LED light source | Excelitas | X-Cite120LED | used only for DAPI imaging |
| Mirror mount | Newport | SU100-F3K | |
| Optical posts | Newport | PS-2 | |
| Clamping fork | Newport | PS-F | |
| Power Meter | Newport | PMKIT | For measuring laser power |
| Dichroic beamcombiner mount | Edmund Optics | 58-872 | C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly |
| Retaining ring | Thorlabs | CMRR | used for dichroic beamcombiner mounts |
| Fiber Adapter Plate | Thorlabs | SM1FC | FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread |
| Z-axis translational mount | Thorlabs | SM1Z | Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible |
| Achromatic Doublet lens | Thorlabs | AC050-008-A-ML | Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 - 700 nm |
| Cage Plate | Thorlabs | CP1TM09 | 30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap |
| Cage Assembly Rod | Thorlabs | ER4 | Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm |
| Cage Mounting Bracket | Thorlabs | CP02B | 30 mm Cage Mounting Bracket |
| Single mode optical fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m |
| Multi mode optical fiber | Thorlabs | M42L01 | Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | ACN127-025-A | ACN127-025-A - f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens" |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | AC127-050-A | f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens" |
| Retaining ring | Thorlabs | SM05PRR | SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens" |
| Nylon-tipped screw | Thorlabs | SS3MN6 | M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens" |
| 3D lens | CVI Laser Optics | RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700 | f=10 m, rectangular cylindrical lens |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
| 100 nm multichannel beads | Thermo | T7279, TetraSpeck microspheres | |
| red dye | Thermo | Alexa Fluor 647 | |
| yellow-green dye | GE Healthcare | Cy3 | |
| green dye | GE Healthcare | Cy3B | |
| blue dye | Thermo | Alexa Fluor 488 |
References
- Lipson, S. G., Lipson, H., Tannhauser, D. S. Optical physics. , Cambridge University Press. Cambridge, UK; New York, NY. (1995).
- Török, P., Wilson, T. Rigorous theory for axial resolution in confocal microscopes. Optics Communications. 137 (1-3), 127-135 (1997).
- Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Optics Letters. 24 (14), 954-956 (1999).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780-782 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Balzarotti, F., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606-612 (2017).
- Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nature Methods. 9 (12), 1181-1184 (2012).
- Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Hua, B., et al. An improved surface passivation method for single-molecule studies. Nature Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).
- Fei, J., et al. RNA biochemistry. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Stracy, M., Kapanidis, A. N. Single-molecule and super-resolution imaging of transcription in living bacteria. Methods. 120, 103-114 (2017).
- Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8452-8457 (2014).
- Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. The Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
- Shi, X., et al. Super-resolution microscopy reveals that disruption of ciliary transition-zone architecture causes Joubert syndrome. Nature Cell Biology. 19 (10), 1178-1188 (2017).
- Youn, Y., Ishitsuka, Y., Jin, C., Selvin, P. R. Thermal nanoimprint lithography for drift correction in super-resolution fluorescence microscopy. Optics Express. 26 (2), 1670-1680 (2018).
