Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Assay ביוסנסור אנאירובית איתור כספית, קדמיום

Published: December 17, 2018 doi: 10.3791/58324
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, University of Ottawa

Summary

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול לשימוש ביוסנסור חיידקים אנאירוביים של תאים שלמים כדי להעריך כמה שונה משתנים סביבתיים משפיעים על הביולוגית של Hg ו- Cd חיידקים בסביבות אנאוקסיים.

Abstract

הזמינות הביולוגית כספית (Hg) כדי חיידקים נמצא צעד מפתח רעילים biomagnification Hg ב במארג המזון. הסכום יצטברו בגידולים מזון בסיסי המרות קדמיום (Cd) ובקרת הזמינות הביולוגית חיידקים. הביולוגית של מתכות אלה תלויה שלהם היווצרות המינים פתרון, אלא יותר במיוחד תחת תנאים אנאוקסיים Hg הוא מפוגל כדי רעילים monomethylmercury (MeHg) ואיפה Cd נמשכת ב rhizosphere. כל תאים ביולוגיים מיקרוביאלי לתת אות הניתנת לכימות כאשר מתכת מזין את ציטוזול, לפיכך הן כלים שימושיים כדי להעריך את הזמינות הביולוגית מתכת. למרבה הצער, רוב המאמצים biosensing יש עד כה היה מוגבל ל סביבות oxic בשל היכולת המוגבלת של חלבונים קיימים כתב לתפקד בהיעדר חמצן. במחקר זה, אנו מציגים שלנו מאמץ לפתח, לייעל assay ביוסנסור תאים שלמים מסוגל לתפקד anaerobically זה יכול לזהות מתכות בתנאי אנאוקסיים בזמן אמיתי ומעין, בתוך שעות. אנו מתארים איך החיישן יכולה לעזור להעריך את הרלוונטיות הסביבה רכיבה על אופניים של מתכות משפיעים על הזמינות הביולוגית שלהם איך כימי משתנים. להלן כללי התנהגות כולל שיטות (1) להכנת Hg, תקליטור תקני בתנאים אנאוקסיים, (2) להכין את החיישן בהעדר חמצן, (3) תכנון וביצוע ניסוי כדי לקבוע כיצד סדרה של משתנה משפיע על הזמינות הביולוגית כספית או תקליטור, ו- (4) כדי לכמת לפרש ביוסנסור נתונים. הצג טווחים ליניארי של ביולוגיים ואנו מספקים דוגמאות מראה של השיטה היכולת להבחין בין הזמינות הביולוגית מתכות רעילות על ידי ניצול מתכת-inducible והן מכוננת זנים.

Introduction

מרקורי (Hg) הוא גורם מזהם הכללית והוא הזמינות הביולוגית שלה כדי Hg methylating חיידקים הצעד הראשון לקראת שלה biomagnification דרך במארג המזון, תופעות אפשריות העצבים-אנוש והאטרקציות חיות בר1. כיום היא נחשבת מתילציה Hg מיקרוביאלי הזה הוא תהליך תאיים דורש: i) המינים של כספית להיות bioavailable2,3,4,5,6,7 ו- ii) עבור התא להיות מסוגל מבחינה פיזיולוגית methylating Hg8,9,10. קדמיום (Cd) bioaccumulates של אורגניזמים, אבל עושה לא biomagnifies ב foodwebs, נעשה שימוש נרחב בתהליכים תעשייתיים ומסחריים הגורמות בדרך כלל חשיפות חמור והאנשים סביבה11. למרות חיידקים לשחק בתפקידי מפתח במספר בגורלו של כספית בסביבה, רוב המחקרים על תקליטור גאוכימיה ו ecotoxicology מתמקדים פרוקריוטים מיקרוביאלי12. הצריכה של גידולים חקלאיים (למשל, אורז) היא המקור העיקרי של חשיפה ישירה קדמיום; במקרה זה, הביולוגית של תקליטור כדי חיידקים של rhizosphere משפיעה ישירות על הכמות הצמחים יכול להצטבר13.

Hg התעבורה מסלולים מורכבים, ייתכן כרוכים שלב14של הובלה פעילה. כאשר נהג מעורב עבודה הציע כי HgII משתמשת Znהשנייה או MnII טרנספורטר7,15,16,17. ואילו CdII המשוערות להיות מועבר בטעות לתוך ציטוזול דרך מסלולים כלט תחבורה מתכת (במיוחד MnII או ZnII), מנגנונים של תקליטורII תחבורה בתוך התאים נשארים מסלול התחבורה ספקולטיבי, לא ספציפיים Cd כבר מזוהה13,18. ללא קשר לאופי למעליות מעורב, שלושה גורמים מכניסטית ובסופו של דבר לקבוע את היכולת של מתכות להזין תא: i) היווצרות המינים מתכת פתרון2,6,15, 16 , 17 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23, ii) המאפיינים biophysiochemical של קרום התא17,24,25,26,27,28,29 30, ,31, ו- iii) היכולת של המתכת לגשת בגודל7,אתר התחבורה32. Cd / Hg סביר קיים יונים חופשיים בתנאים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית מיקרוביאלי בשל זיקתם גבוהה עבור מומס אורגני משנה (DOM), chelating מזהמים (למשל, EDTA), או מופחת גופרית moieties33, 34,35 (Cdהשנייה יכולה להתקיים חינם טופס או יון יון-זוגות בהיעדר אלה ליגנדים). יש חוסר השיטה היעילה בקביעת כמה מינים מתכת אלה הם bioavailable תחת תנאים רלוונטיים לגורלם בסביבה. למשל, כספית הוא מפוגל תחת תנאים אנאירוביים14, קדמיום והן Hg מתכות רכות (או קטיונים B class), המחייב את היווצרות המינים ייחקרו בתנאים לשמור על היושרה של קבוצות תכולה מופחתת של גופרית.

חיידקים ביולוגיים הם תאים חיידקיים הפולטות אות הניתנת לכימות בתגובה ריכוזי מתכת, התיק כספית או תקליטור זו תאיים. בתור שכזה, הם כלי אידיאלי כדי להבין כיצד מתכות להזין תא36, ובלבד חשיפה תנאים נשלטים בקפידה עבור... Hg ביולוגיים כוללים בדרך כלל ג'ין fusions בין המעגלים הרגולציה של מר-אופרון (כולל גנים קידוד עבור הרגולטורים שעתוק MerRas כמו האופרטור ועל יזם מחוזות אופרון) ודיווח על הגנים (למשל, . לאקס, ה-gfp, lac גנים). כאשר מרקורי קיים בציטופלסמה, זה יהיה לאגד עליזה משחק, וכתוצאה מכך שעתוק של גנים דיווח, האותות עוקבות-הייצור-19,-37. ביולוגיים תקליטורים מסוימים מיועדים בדרך כלל באמצעות את cadC, cadAC, zntA או zntR מקודד שעתוק regulators38, אך ראוי לציין כי עליזה משחק יש זיקה נמוכה יותר, עדיין לכימות תקליטור5. עקב מגבלת אירובי של רוב נפוץ כתב מאיר עיניים או פלורסנט חלבונים, עד לאחרונה מיקרוביאלי ביולוגיים נותרה אפשרות להציע תובנות ביואמסה של מתכות בתנאים אנאוקסיים. זה מאפשר אנאירובית איתור מתכות הזמינות הביולוגית קשה מאוד על טווח של תנאים רלוונטיים לגורלם סביבתיים, במיוחד בנוכחות חמצון-חיזור ליגנדים רגיש (למשל, סולפיד ו תיולים)4, 5 , 39.

כדי להקל המשוכה מתודולוגי של לחיות הדמיה, בהעדר חמצן, Drepper. et al. (2007) יש שפותחה חלבון פלואורסצנטי מבוסס פלווין (FbFp), המבוססת על תחום מתח החמצן אור של חלבון SB2 מ- putida פ. המשפחה חלבון הוא מסוגל לזרוח בהיעדר חמצן40. בונים על עבודתו של. Drepper et al., המעבדה שלנו תוכנן של ביוסנסור אנאירובית המאפשר לימוד Hg הזמינות הביולוגית בתנאים oxic, אנאוקסיים, מגוון רחב של מליחות 17. בעיתון הנוכחי, אנו נתאר כיצד להכין ולהשתמש את החיישן לבחון את ההשפעה של משתנים סביבתיים על הזמינות הביולוגית כספית או תקליטור. למרות שפיתחנו את החיישן עבור HgII, בחרנו לבצע ניסויים עם הדיסקהשני כאמצעי למשוך תשומת לב הקורא לעובדה כי ביולוגיים עשויים להגיב גם במספר לחצים שעלולים להתרחש פעולה סביבתית מטריצות; במקרה זה בתקליטורהשני נחקר כי זה ידוע כדי לאגד הרגולטור תעתיק עליזה משחק5. כאן, אנו מראים כיול נציג וטווחים ליניארי פונקציונלי ביחס או מתכת. אנחנו גם נותנים דוגמא כאשר תוצאות החיישן חותכות (מ גII ו- MnII ב- Hg הזמינות הביולוגית) ולא חד משמעיות (ZnII ב- Hg הזמינות הביולוגית).

Protocol

1. צמיחה מדיה והכנות מדיה חשיפה

  1. כדי לבצע 250 מ של מדיום הגידול:
    הערה: אם פתרון ויסודות #1 ויסודות קורט #2 פתרון כבר מוכנים, דלג לשלב 1.1.5.
    1. היכונו להכיל את molarities הסופית של 1.5 x 10-3 מ' נה2MoO4, 6.5 x 10-4 M נה2SeO4, 5 x 10-3 M H3בו יסודות קורט #1 פתרון בבקבוקון נקי נפחי (200 מ) 3, NaOH 0.1 M.
      התראה: בסיסים חזקים (NaOH) הן מאכל. להפוך בטוח מתי שקילה של ריאגנטים כדי להבטיח כי molarity הסופי מייצג מפתח בדולח; מו, Se ו- B.
    2. תחת שדה סטרילי, מסנן לחטא באמצעות מסנן 0.22 של מזרק polyethersulfone מיקרומטר בבקבוק פלסטיק סטרילית/לנקות/טפלון (PTFE).
    3. להכין ויסודות #2 פתרון בבקבוקון נקי נפחי (200 מ"ל) כדי להכיל את molarities הסופית של 0.01 M MnSO4, 5 x 10-4 מ' ZnSO4, 3.25 x 10-3 מ' CoCl2, 6.25 x 10-3 מ' NiCl 2, ו- 0.1 M H2אז4.
      התראה: חומצות חזקות (H2אז4) הן מאכל. להפוך בטוח מתי שקילה של ריאגנטים כדי להבטיח כי molarity הסופי מייצג מפתח בדולח; Mn, Zn, Co, וני.
    4. תחת שדה סטרילי, מסנן לחטא באמצעות מסנן 0.22 של מזרק polyethersulfone מיקרומטר בבקבוק זכוכית נקי.
    5. תחת שדה סטרילי, בבקבוק זכוכית סטריליים/לנקות (מינימום 250 מ ל); להוסיף 200 מ ל מים הנדסה גנטית, 42.5 מ ל M9 (5 x; ראה טבלה של חומרים) של מלחי מינימלי, 2.5 מ של 2 מ' גלוקוז, µL 125 של 2 מ' MgSO4, µL 1200 של 0.6 מ' תיאמין HCl aliquot (הלעפה תרוטרפמט-20) קפוא, mL 1.25 ננו ארבעה מ'3 , µL 770 של 0.075 ק ז ללאוסין / L-איזו-לאוסין / פתרון ולין, µL 250 ויסודות #1, 250 µL של יסוד קורט #2ושל 250 µL של נתרן EDTA 0.01 M מלח.
      הערה: ריאגנטים כל שלב 1.1.5 צריך להיות מוכן מראש ומסנן עיקור באמצעות מסנן מזרק polyethersulfone 0.22 מיקרומטר. הנדסה גנטית מים עשוי להיות מעוקר באמצעות החיטוי.
    6. קח בקבוק הזכוכית עכשיו המכיל הפתרון משלב 1.1.5., מכסה אותה באופן רופף, מחזור זה דרך קאמרית אנאירוביים האויר.
    7. תא אנארובי, להוסיף µL 15 מ' 0.225 מכל4 0.2 מ' H2כדי4, שווי הבקבוק בחוזקה, ומנערים עד פוחת משקעים לבן כל להיעלם.
      הערה: ריאגנטים כל שלב 1.1.7 צריך להיות מוכן מראש ומסנן עיקור באמצעות מסנן מזרק polyethersulfone 0.22 מיקרומטר. לאחסן את מכל 0.225 מ4 0.2 M H2אז4 תא אנארובי.
    8. להסיר את הכובע של בקבוק, המתינו למשך דקה אוויר להחליף, להחליף את הפקק מהבקבוק, אז תלחצו נמרצות. חזור על שלב זה פעם אחת.
    9. הדקו את הכובע בחוזקה לתוך הבקבוק, להסיר תא אנארוביואחסן בקבוק במקרר (4 הלעפה תרוטרפמט) עד השימוש.
    10. מדיום הגידול צריך להיות הניקל פעם בשבוע על ידי וחזור על שלבים 1.1.5 כדי 1.1.9.
  2. כדי להפוך 100 מ של חשיפה בינונית 2 x 50 מ"ל חרוט סטרילי פוליפרופילן צנטריפוגה צינורות:
    הערה: מומלץ אותה חשיפה בינונית להיות מוכן ביום של חשיפה assay כדי למזער את הסיכון של זיהום, אולם זה יכול להתבצע מראש והם מאוחסנים במקרר.
    1. תא אנארובי, כדי כל 50 מ ל להוסיף צנטריפוגה צינור 42 מ ל מים הנדסה גנטית אנאירובית, 350 µL של 1 מ' נתרן בטא-Gylcerophosphate מ aliquot קפוא (-20 הלעפה תרוטרפמט), 2 מ של 1 מ' מגבים, מכשירי ללא חומצה, μL 50 של 1 מ' (NH4)2אז4 , ΜL 125 של גלוקוז 2 מ', μL 300 של 2.5 מטר קו ו μL 200 של NaOH 2.5 מטר.
      הערה: ריאגנטים כל שלב 1.2.1 צריך להיות מוכן מראש ומסנן עיקור באמצעות מסנן מזרק polyethersulfone 0.22 מיקרומטר. הנדסה גנטית מים עשוי להיות חום עיקור באמצעות החיטוי. 2.5 M NaOH ו- 2.5 M NaOH יש לאחסן בקבוקי פלסטיק/PTFE. ריאגנטים כל המפורטים החייב להיות מאוחסן קאמרית אנאירובית חוץ נתרן בטא-Gylcerophosphate, שבו ניתן לאחסן במקפיא (הלעפה תרוטרפמט-20). באופן כללי, זה תרגול טוב כדי להשאיר כל חלקי פלסטיק או זכוכית, מיכלי למשך מספר ימים בבית הבליעה אנאירובית כדי להבטיח כי לא עקבות של חמצן יישארו.
    2. קאפ הצינורות צנטריפוגה 50 מ ל, לנער היטב, ולהסיר aliquot 10 מ"ל כדי למדוד את רמת ה-pH. ה-pH שנמדד של מדיה זו חשיפה חייב תמיד למדוד 7.00 ± 0.02-25 הלעפה תרוטרפמט. אם ה-pH לא למדוד בטווח הזה, להתאים מחדש את עוצמת הקול של הוסיף 2.5 מטר קו לתיקון זה.
      הערה: מעולם לא titrate את הפתרון לתיקון ה-pH עם מכשיר בדיקה pH. pH הגששים מייצגות מקור זיהום עבור חשיפה בינונית. ה-pH חייב תמיד להיות תוצר ריאגנטים נוספה בשלב 1.2.1.
  3. להכין פתרון מניות 5-10 מ מ NaNO3 ולהשאיר בתוך תא אנארובי לשמש במהלך הזמן של חשיפה וזמינותו.
    הערה: קל לדלל מרוכז יותר ראשי NaNO3 תקן לעומת ביצוע של 5-10 מ מ NaNO3 ראשוני.

2. הכנת כספית, קדמיום סטנדרטים.

  1. הכנת פתרון Mercuric (HgII) 4-8 מיקרומטר 0.2 מ' H2אז4.
    1. הכן Hg2 + תקן על ידי millimolar (1-10 מ מ) HgCl2, HgNO3 או4 HgSO פתרון של 0.2 מ' H2אז4.
      התראה: מרקורי הוא רעיל מאוד ו- H2כדי4 הוא מאכל. פועלים ציטוטוקסיקה עם כל ציוד מגן אישי.
    2. בבקבוק PTFE, לדלל הרגילה של 2.1.1. לתוך 0.2 M H2אז4 בריכוז בטווח של מיקרומטר Hg 4-82 +.
      הערה: החומצה משמש חייב להיות אנליטית כיתה ח2אז4.
    3. ריכוז Hg מ 2.1.2 לאמת באמצעות מנתח כספית (ראה טבלה של חומרים).
      הערה: שיטות אחרות עבור אימות הריכוז Hg עשוי לשמש.
  2. הכנת של 10 מיקרומטר Cd הפתרוןהשני ב 10 מ מ H2אז4.
    1. להכין תקן העיקרי של CdCl2 (10-50 מ מ טווח עבור שקילה מדויקת של אבקת) 0.1 M H2אז4.
    2. בסדרה של דילולים סדרתי ב- mL 20 שטופים נקי חומצה צלוחיות זכוכית בורוסיליקט עם שחור בעל תאים פנוליים מזרקי עם PTFE בפני ליינרים גומי, לדלל את התקן מ- 2.2.1 ל 10 מיקרומטר Cd2 +. להבטיח את הריכוז של H2כדי4 כל דילול טורי עוקבות נשאר 10 מ מ.

3. הכנה של החיישן Assay חשיפה אנאירובית

  1. צלחת את החיישן inducible כספית (החיידק NEB5α מחסה PUC57merR-PpFbFp), את החיישן צורונים ביטוי (החיידק NEB5α מחסה PUC19Balch-PpFbFp) מ-80 cryostock הלעפה תרוטרפמט על גבי צלחות מרק Lysogeny המכיל אמפיצילין ug/mL 120. לראות את העבודה שפורסמו בעבר שלנו לפרטים על הייצור של אלה ביולוגיים17.
  2. ב- 4:30-5 PM, לחסן תרבות ב 10 מ"ל של ליברות (+ מגבר) ולגדול בן לילה.
    הערה: החל מצלחת זה לוקח יומיים להתכונן התרבות אנארובי. חשיפה assay (קרי, תרבות התחיל ביום שני (4:30-5 PM) יהיה מוכן לקבל החשיפה assay בבית בצהריים ביום רביעי). השלבים הבאים הן טכניקות מיקרוביולוגית הנדרשים הדרושים להכין את התרבויות ביום של חשיפה וזמינותו.
    1. קח אחד המושבה מתרבות צלחת ולהוסיף 10 מ ל מרק Lysogeny (ליברות) עם 21 µL של פתרון מניות 100 מ"ג/מ"ל של אמפיצילין סודיום מלח (הריכוז הסופי הוא המגבר ug/mL 210) צינור תרבות סטרילי.
    2. למקם את התרבות חממה/שייקר ולגדול בן לילה-+37 הלעפה תרוטרפמט ברעידות-220 סל"ד.
  3. למחרת בבוקר בשעה 9-10, resuspend התרבות ולגדול anaerobically לאורך כל היום (20% inoculum).
    1. מביאים את התרבות מן החממה (שלב 3.2.1) את מדיום הגידול (שלב 1.1.9) לתוך תא אנארובי.
    2. הוסף 8 מ של טרי מדיום הגידול , אמפיצילין (210 μg/mL) לתוך צינור Balch סטרילי.
    3. לאסוף 2 מ"ל של תרבות מבוגר בן לילה, העברת לתוך 2 מ ל צינור Microcentrifuge. צנטריפוגה בשלב RCF 10,000 למשך 90 שניות, לזרוק את תגובת שיקוע, resuspend ב 2 מ"ל של טרי מדיום הגידול. הוסף את התרבות resuspended הצינור Balch המכיל 8 מ של טרי מדיום הגידול , אמפיצילין.
    4. שימוש סטרילי טכניקה, בזהירות המקום פקק גומי על המרקע Balch. להסיר מן תא אנארובי למקם שייקר / חממה, לגדול anaerobically עד 3-5 בצהריים +37 הלעפה תרוטרפמט ברעידות-220 סל"ד.
  4. בין 3 ל 5 PM, לבצע inoculum אנאירובית של 1% לתוך טריים מדיום הגידול ולגדול בן לילה.
    1. תביא את הצינור Balch (שלב 3.3.4) לתוך תא אנארובי יחד עם מדיום הגידול. להוסיף 100 µL של התרבות 10 מ"ל של טרי מדיום הגידול (1% inoculum) עם המגבר (210 המגבר ug/mL) צינור Balch סטרילי.
    2. שימוש סטרילי טכניקה, בזהירות המקום פקק גומי על המרקע Balch. להסיר מן קאמרית אנאירובית, מקום חממה/שייקר, לגדול בין לילה ב +37 הלעפה תרוטרפמט ברעידות-220 סל"ד.
  5. בין 9-10 בבוקר, resuspend התרבות לגדול anaerobically לאורך כל היום (20% inoculum).
    1. מביאים את התרבות מן החממה (שלב 3.4.1) את מדיום הגידול (שלב 1.1.9) לתוך תא אנארובי.
    2. הוסף 8 מ של הצמיחה בינונית , אמפיצילין (210 המגבר ug/mL) לתוך צינור Balch סטרילי.
    3. לאסוף 2 מ' של תרבות מבוגר בן לילה, העברת לתוך 2 מ ל צינור Microcentrifuge. צנטריפוגה ב 10,000 x g למשך 90 שניות, לזרוק את תגובת שיקוע, ו resuspend ב 2 מ"ל של טרי מדיום הגידול. הוסף את התרבות resuspended הצינור Balch המכיל 8 מ של טרי מדיום הגידול , אמפיצילין.
    4. שימוש סטרילי טכניקה, בזהירות המקום פקק גומי על המרקע Balch. הסר קאמרית למקם שייקר / חממה, לגדול anaerobically ב +37 הלעפה תרוטרפמט ברעידות-220 סל"ד.
  6. לפקח על הגידול של התרבות באמצעות ספקטרופוטומטרים (שלב 3.5.4) עד יתר600 של 0.6 . הקפד מערבולת תרבות לפני כל יתר קריאה.
    הערה: שלב זה לוקח 3-4 שעות, ו חשיפה בינונית (שלב 1.2) צריך להיות מוכן במהלך הזמן הזה, כמו גם חשיפה assay (שלב 4.1).
  7. לעצור את הצמיחה כשאחוז התרבות של יתר600 של 0.6 (±0.1) (3-4 שעות צפויה צמיחה).
    1. להכניס 2 x 2 מ"ל Microcentrifuge צינורות צינור קאמרית אנאירובית (שלב 3.6) ותרבות העברה. צנטריפוגה ב 10,000 x g למשך 90 שניות, לזרוק את תגובת שיקוע, ו resuspend ב 2 x 2 מ"ל של טרי חשיפה בינונית.
    2. חזור על שלב כביסה 3.7.1. פעם אחת כדי להסיר את עקבות של מדיום הגידול.
  8. לשלב שני צינורות microcentrifuge של תרבית תאים (שלב 3.7) 7 mL PTFE סטנדרטי בקבוקון להשיג ביוסנסור מניות כדי לשמש חשיפה Assay (שלב 4).
    הערה: יש להקפיד לערבב ביוסנסור מניות על ידי ביסודיות ובעדינות pipetting הלוך לפני השימוש. השיטה עשוי להיות עצר כאן עבור עד לשעה.

4. חשיפה Assay

  1. תכנון פריסה בצלחת.
    הערה: הקפידו שיהיו כל pipetting ערכים מחושבים, מניות מוכן לפני הפעלת assay חשיפה. איך כראוי עיצוב ניסוי, מה ששולט לכלול מפורט בטקסט. בנוסף, לא צריך אפשרות להפעיל את הניסוי אם יש חמצן בבית הבליעה אנאירובית הצביע על המסך אנאירובית.
    1. לעצב את הפריסה צלחת לפי תבנית טוב 96. לרוץ ניסויים משכפל טכני של 3, זה יאפשר עבור טיפולים שונים 32, המיוצגת בצורה הטובה ביותר על ידי רשת 4 x 8 כדי להגדיר את הבקבוקונים (ראה איור 1).

Figure 1
איור 1: 96 צלחת טוב (משמאל), רשת 4 x 8 המתאימים המכיל PTFE שבקבוקי (מימין) להעביר לצלחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

הערה: כאשר בדיקות עבור התפקיד של המשתנה על ספיגת כספית עם הטיפולים ביוסנסור inducible מרקורי; שני נדרשים עבור כל משתנה: טיפול (ביוסנסור + Hg + משתנה + חנקתי), בה טיפול ריק (ביוסנסור + משתנה + חנקתי). כאשר בודקים התפקיד של המשתנה על הפיזיולוגיה של התא באמצעות את ביוסנסור מכוננת, שני טיפולי נדרשים עבור כל משתנה: הטיפול (ביוסנסור + Hg + משתנה + חנקתי) ואת הטיפול ( ריק ביוסנסור + משתנה + Hg). מרקורי עשויה להיות מוחלף עם קדמיום. כספית או תקליטור יהפוך המשתנה בעת ביצוע עקומת כיול. מכוננת , inducible ביולוגיים לא צריך להתנהל באותו הזמן (בפריסה צלחת אותו). דוגמה תבנית עבור הפריסה צלחת והרשת המתאימים 4 x 8 בעת בדיקת טווח הריכוז של מגנזיום (משתנה) ניתנת טבלה 1).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
. Hg המושרה ביוסנסור + Hg + חנקתי + מ מ 0 מ"ג Hg המושרה ביוסנסור + ניטראט 0 מ מ מ ג ביוסנסור מכוננת + Hg + חנקתי + מ מ 0 מ"ג ביוסנסור מכוננת + Hg + מ מ 0 מ"ג
b Hg המושרה ביוסנסור + Hg + חנקתי + 0.1 מ מ מ ג Hg המושרה ביוסנסור + חנקתי + 0.1 מ מ מ ג ביוסנסור מכוננת + Hg + חנקתי + 0.1 מ מ מ ג ביוסנסור מכוננת + Hg + 0.1 מ מ מ ג
c Hg המושרה ביוסנסור + Hg + חנקתי + 1 מ מ ג Hg המושרה ביוסנסור + חנקתי + 1 מ מ ג ביוסנסור מכוננת + Hg + חנקתי + 1 מ מ ג ביוסנסור מכוננת + Hg + 1 מ מ ג
d Hg המושרה ביוסנסור + Hg + חנקתי + 10 מ מ ג Hg המושרה ביוסנסור + חנקתי + 10 מ מ ג ביוסנסור מכוננת + Hg + חנקתי + 10 מ מ ג ביוסנסור מכוננת + Hg + 10 מ מ ג
e

טבלה 1: למשל צלחת פריסה של שימוש את החיישן כדי לבדוק את הזמינות הביולוגית Hg (5 ננומטר) מעבר הדרגתי של מגנזיום (0-10 מ מ)

  1. להגדיר את הרשת 4 x 8 לפי התוכנית צלחת וזמינותו.
    1. מקום 7 מ ל PTFE בקבוקונים רגיל במגש.
      הערה: בקבוקונים PTFE צריך להיות חומצה שטף החום לעקר לפני השימוש. בקבוקונים. צריך רק להיות מטופלים על ידי מניפולציה החיצוני של המבחנה.
    2. כדי כל מבחנה, הוסף אמצעי האחסון חשיפה בינונית המתאימה כל טיפול.
      הערה: חשיפה עם הנפח הכולל של 2,000 µL (2 מ"ל), נוספה חשיפה בינונית יהיה: חשיפה בינונית µL = µL 2,000 – טיפול (ריק) µL. (למשל, חשיפה µL בינוני = 2,000 – 100 µL (ביוסנסור) – 40 µL (חנקת) – 100 µL (Hg ) – 100 µL (משתנה (למשל, MgSO4)) = 1660 µL). ודא כי אמצעי האחסון הוסיף המשתנה שנבדקו אינו עולה על 5% (100 µL) נפח סופי.
    3. כדי כל מבחנה, להוסיף נפח המתאימים של הפתרון של המשתנה כימי להיבדק לפי התוכנית צלחת.
    4. מהשלב 1.3, להוסיף ניטראט המבחנה כל כך הריכוז הסופי הוא 200 מיקרומטר (40-80 µL). הכללת צעד זה עבור ביוסנסור מכוננת טיפול סרק.
    5. משלב 2.1 או 2.2, להוסיף Hg (5 nM כאשר בודקים משתנה) או תקליטור (300 ננומטר כאשר בודקים משתנה) כדי הבקבוקונים לפי התוכנית צלחת. הכללת צעד זה עבור מרקורי ביוסנסור inducible טיפול סרק.
      1. בעת שימוש Hg, קח את המניה 4-8 מיקרומטר , לנער היטב. לדלל את הפתרון ב חשיפה בינונית בקבוקון PTFE 7 mL ל 100-250 ננומטר כדי להפוך את העבודה עם פתרון Hg. מזה הפתרון עובד להוסיף Hg הבקבוקונים הנדרש. במקרה זה עקומת כיול של כספית הנע בין 0 ל- 12.5 ננומטר.
        הערה: כאשר בודקים ההשפעה של משתנה על הזמינות הביולוגית כספית או תקליטור, לוודא [Hg] או [תקליטור] נשאר קבוע לאורך כל הטיפולים. בעת הוספת כספית או תקליטור, הקפד להשתמש עצה פיפטה אחת אבל לא לגעת המדיום חשיפה ב הבקבוקונים.
  2. לנער בתנועה-מסלולית באופן ידני.
    הערה: הניסוי אולי ניתן להשהות עכשיו בהתאם הזמן הנדרש עבור כספית או Cd כדי speciate בתמיסה. אם נשאר במשך יותר משעה, במקום PTFE כמוסות על הבקבוקונים PTFE כדי למנוע אידוי/זיהום.
  3. בעדינות פיפטה ביוסנסור מניות הלוך ושוב כדי להבטיח הומוגניות. להוסיף µL 100 מניות ביוסנסור כל מבחנה. לנער orbitally באופן ידני.
  4. להכין את הקורא צלחת להתחמם לקרוא עם הקריטריונים הבאים: טמפרטורת 37˚C, קינטי לרוץ במשך 10 שעות עם קריאות כל 2.5-5 דקות ברעידות מסלולית בין קורא, ומדידות קרינה פלואורסצנטית עם קרינה פלואורסצנטית עירור של 440 ננומטר ומסעדת פליטה של 500 nm.
  5. פיפטה 200 µL מ כל הבקבוקונים PTFE ברשת 4 x 8 לתוך הבארות המקביל של צלחת טוב 96 (שחור, 96-ובכן להתרחק-התחתון Nonbinding Microplates פני השטח). פיפטה הלוך 5 פעמים לפני העברת כל µL 200.
    הערה: במקום השמטת קצה פיפטה, להשאיר את הטיפ פיפטה בבקבוקון PTFE כדי לעקוב אחר ההתקדמות pipetting.
  6. למקם את הצלחת היטב 96 המגש של הקורא צלחת, ולאחר מכן למקם את המכסה על הצלחת היטב 96 ולהתחיל וזמינותו.

5. לכימות הנתונים

  1. חייב להיות מתוקנות על כל רעש טוב בודדים ולא יכולתם זריחה של כל טיפול בכל נקודה בזמן טיפול ריק.
    1. יש לתרגם את פלורסצנטיות עבור כל נקודת הזמן (t) של כל טיפול (T) לחשבון עבור זריחה הראשונית (t0) של הפעם הראשונה נקודה של כל טוב, אז בממוצע על פני 3 טיפולים משכפל (r1- r3 ). ואז חייב להיות חסמה ממוצע טיפול זה הממוצע טיפול ריק (TB) תורגם באופן זהה (משוואה 1).

קרינה פלואורסצנטית (t) = ממוצע(Tr1(t) – Tr1(t0), Tr2(t) – Tr2 (t0), Tr3(t) – Tr3(t0)) – ממוצע(טרה-בתים r1 (t) – טרה-בתיםr1(t0), טרה-בתיםr2(t)– טרה-בתיםr2( t0 ), טרה-בתיםr3(t) – טרה-בתיםr3(t0)) (1)

הערה: זה צריך להיעשות כפונקציה של גיליון אלקטרוני. הפצה נאותה של שגיאה צריך לחשב גם עבור כל נקודת זמן.

  1. גרף זריחה המתוקן של כל טיפול כפונקציה של הזמן

Figure 2
איור 2: תוקנו נתוני קרינה פלואורסצנטית כפונקציה של הזמן. קרינה פלואורסצנטית הנמדדת יחידות קרינה פלואורסצנטית היחסי (RFU) הנפלטים על ידי e. coli NEB5α מחסה pUC57merR-Pp (Inducible זן) לאורך זמן עם התוספת של כספיתII (0-12.5 ננומטר) בתנאים אנאירוביים. קרינה פלואורסצנטית היה שהממוצע של 3 טכני משכפל-הלעפה תרוטרפמט 37. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

הערה: יש ערך Hg nM 0 בגרף, כל ריכוזי כספית אחרים יש כבר נמחק את 0 nM Hg טיפול ריק. לכן, 0 מייצג Hg nM ציר x וכל זריחה חיובית מייצגת פלורסצנטיות מ- Hg בהתחשב כל משתנה. זה אופציונלי לא ריקות של זריחה באופן זה, אבל עקומות פלורסנט ייתן הקימורים קרינה פלואורסצנטית מטעה אם המשתנה נבדק יש רקע זריחה (קרי, התפרקה חומר אורגני עצמו לזרוח, ואם יש אין טיפול ריקים המכילים חומר אורגני מומס, הגדלת ריכוז חומר אורגני מומס והתאים רק יגביר את האות פלורסנט).

  1. לכמת הפסגה זריחה. לשיא פלורסצנטיות לכימות תתרחש בדרך כלל אחרי 2.5-4 שעות, המייצג את האנרגיה שהושקעו מצריכת חנקתי מיקרומטר 200 כל כמו מקבל אלקטרון מסוף. השיא הזה צריך ניתן לכמת ומייצג את הערך פלורסצנטיות הסופי של טיפולספציפי.
    הערה: במקרה לא שיא פלורסצנטיות נצפית (קרי, הזמינות הביולוגית לא כספית), זריחה של טיפול בנקודת הזמן של הפסגה זריחה של הפקד (קרי, לא משתנה נוסף או 5nM Hg) צריך ניתן לכמת. לחלופין, אם יש קרינה פלואורסצנטית אינדוקציה לטיפול, אבל קרינה פלואורסצנטית אינו מייצר לשיא מוגדרת היטב, יש זיהום סביר של מקבל אלקטרון זיקה גבוהה יותר כגון O2 , צעדים יש לנקוט כדי להסיר שאריות חמצן מן כל הפתרונות ועל הניסוי יש לבצע שוב.

Representative Results

ברגע יש כבר לכמת את הפסגות זריחה על פי שלב 5.3, התוצאה של הפסגות פלורסצנטיות יכול להיות בגרף לפי הריכוז משתנה הממחישות כיצד אותו משתנה משפיע הביולוגית היחסי של כספית או תקליטור. לדוגמה, עקומת כיול של זריחה מעל [HgII] איור 2 תניב מהנתונים inducible המוצגים באיור 3 א. עבור HgII כיול, הרצון עקומת תמיד מכילים 3 מרכיבי המתח Hg-inducible; תגובה הסף של 1-2 ננומטר Hgהשני לפני זריחה אות ייצור הוא יחסי בצורה לינארית [HgII], הטווח. ליניארית איפה 5 nM HgII יהיה אמין תמיד במרכז הטווח, מישור לאן הגדלת [HgII] כבר לא יגדל פלורסצנטיות אות. אין שינוי בייצור אות על המתח מכוננת מראה כי רעילות מתרופות [HgII] אינה משפיעה על ייצור אות. עבור תקליטורII ב- 3B איור, תמיד יש 2 מרכיבי המתח inducible; מגוון ליניארי שבו בצורה אמינה תמיד יהיה 200-300 ננומטר CdII במרכז הטווח. ליניארית, מישור. ירידה ברמת קרינה פלואורסצנטית האות עם הגדלת [תקליטורII] מראים כי ריכוז גבוה של תקליטור רעילים לתאים יכול להסביר ירידה בייצור פלורסצנטיות inducible לאחר הרמה ב- nM 1000 CdII. לכן, בעת בדיקת הזמינות הביולוגית כספית או תקליטור ביחס משתנה הסביבה, אנו ממליצים להשתמש 5 nM עבור HgII , 300 ננומטר עבור תקליטורII.

במקרים מסוימים, האות הייצור ניתן כראוי לייחס הזמינות הביולוגית כספית או תקליטור, אך במקרים אחרים, אות הייצור עשויה להיות מושפעת וריאציה במצב פיזיולוגי של המארח תא ביוסנסור (למשל, המתכת של ריבית או תנאים סביבתיים נבדק רעילים). ב- איור 4A, 5 nM Hg הזמינות הביולוגית נבדקה על שיפוע של Zn (0-10 מיקרומטר). Hg-inducible והן זנים מכוננת, יש ירידה דומה האות עם הגדלת Zn ריכוזים. לכן, אחד לא יכול להפלות בין אם האות נובעת הזמינות הביולוגית הוריד או היא תוצאה של Zn רעילות. איור 4B ו- 4 C, 5nM Hg הזמינות הביולוגית נבדקה על מעבר הדרגתי של מ גII (0-10 מ מ) ו- MnII (0-10 מיקרומטר). הגדלת מ גII ו- Mn ריכוזיםהשני ירד האות זריחה של המתח inducible. מצד שני, המתח המכונן לא הראה ירידה זריחה עם הגדלת Mg ריכוזיםII II ו- Mn (מ גII ו- MnII מועילים עבור התאים בייצור של FbFp, כפי שמתואר על ידי גידול בתוך האות קרינה פלואורסצנטית). מדגים כי התאים הם קיימא, הירידה זריחה של המתח Hg-inducible נובעת ירידה Hg הזמינות הביולוגית. נתונים אלה מדגישה עד כמה חשוב עבור כל מבחני ביוסנסור גם לספק מדידות המכונן של כושר תא.

Figure 3
איור 3: ליניארי טווחי החיישן עם כספית וקדמיום. קרינה פלואורסצנטית המרבי הנמדדת פלורסצנטיות יחסית יחידות (RFU) ± סטיית תקן 1 הנפלטים על ידי e. coli NEB5α מסתירים את pUC57merR-Pp (Hg-Inducible) ו- pUC19Balch-Pp (Constitutive) עם התוספת של א) HgII (0-15 ננומטר) ו B) CdII (0-1, 000 ננומטר) בתנאים אנאירוביים. קרינה פלואורסצנטית היה שהממוצע של 3 טכני משכפל-הלעפה תרוטרפמט 37. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: דוגמה של תוצאה חד משמעיות עם אבץ, תוצאה חד משמעי עם מגנזיום והן מנגן. קרינה פלואורסצנטית המרבי הנמדדת פלורסצנטיות יחסית יחידות (RFU) ± סטיית תקן 1 הנפלטים על ידי e. coli NEB5α מסתירים את pUC57merR-Pp (Hg-Inducible) ו- pUC19Balch-Pp (Constitutive) עם התוספת של א) ZnII (0-10 מיקרומטר), B) מ"גII (0-10 מ מ), ו- C) MnII (0-10 מיקרומטר) בתנאים אנאירוביים. [HgII] נקבע ל-5 ננומטר על כל טיפולי קרינה פלואורסצנטית היה הממוצע של משכפל טכני 3-37 הלעפה תרוטרפמט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

חיידקים ביולוגיים הם כלים שימושיים לזיהוי המנגנונים שבאמצעותו מתכות אינטראקציה עם החיידקים. כאן, אנו מתארים שיטה שבה ניתן לכמת anaerobically Hg הזמינות הביולוגיתII II ו- Cd התא המארח גראם שליליים (e. coli), לתת תוצאה הניתנת לכימות תוך מספר שעות. אחד היתרונות הגדולים של פרוטוקול זה הוא שזה מאפשר שליטה מקיף על היווצרות המינים מתכת במדיום חשיפה על ידי הימנעות ליגנדים הנחשב חזק או רכיבים שעלולות להוביל משקעים מתכת. היווצרות המינים מתכת יש כבר וניסו ונבדק במדיום הזה חשיפה באמצעות PHREEQC17, אולם ניתן לפרוס תוכנה היווצרות המינים מתכת אחרת. במקרה של אין ליגנדים הוסיף, Hg היווצרות המינים צפוי להיות נוכח כ 97% Hg(OH)2 ו- 3% Hg (NH3)22 +, בעוד Cd היווצרות המינים יהיה להציג בתור 59% Cd-β-Glycerophosphate, 25% Cd2 +ו- 16% CdSO4. באמצעות תוכנה פשוטה הדוגמנות תרמודינמי, המשתמש יכול לעצב חשיפה בתקשורת, לבדוק הזמינות הביולוגית של המתכת של עניין. בנוסף, התא המארח ביוסנסור (e. coli NEB5α) הוא בר קיימא על מגוון רחב של pH (5-8.5) וריכוז NaCl (0-0.55 מ')17.

Hg מתילציה היא תהליך אנארובי, פרוטוקול המתוארים במחקר זה אין דרישה עבור חמצן, המאפשרות תיאור מדויק יותר של מטבוליזם אנארובי על הזמינות הביולוגית מתכת. זה חשוב כי הנוכחות של חמצן משתנה ג'ין ביטוי פרופילים48,49 , לפיכך, פוטנציאל הובלה מסלולים; לכן שיטה זו מציגה יתרון על פני כעת exising חלופות אירובי. הבונה biosensing המובאת כאן פוטנציאל ניתן להשתמש עם מארחים אנאירובית אחרים שעשויים להיות רלוונטיים יותר עבור מתילציה כספית (למשל, Geobacter, Desulfovibrio), אבל אולי פחות צייתן יותר e. coli. מגבלה אחת הנוכחי של הגישה המובאת כאן היא כי הגבול שלנו של זיהוי לא הגיע עדיין pM רמות, בניגוד קיימות מערכות אירובית4,19,37. . זה חשוב עם זאת לציין כי כדי להשיג את מגבלות אלה נמוך זיהוי מספר שלבים צריכים להילקח44: אני) תוספת ליגנד נדרש כדי להבטיח Hg נשאר בפתרון לא לספוח על גבי קיר התא מיקרוביאלית (Hg יהיה בלתי הפיך מאוגד לתא השטח תיולים מניעת שלה25,הזמינות הביולוגית27; ראה סף התגובה Hg ב איור 3A), ii) שינויים צפיפות התאים, או השלישי) לשנות הבונה גנטית כדי לכלול חלבונים התחבורה של מר-אופרון (כלומר עופר יעקב ו- merP), הגדלת Hg השטף בתוך50,התא51. שינויים אלה יהיה מועיל באיתור ריכוזים נמוכים של כספית, אך לא בהכרח אידיאלי בעת הערכת מצבים הרלוונטיים לסביבה. ואילו הקודם קדמיום ביולוגיים קיימים בעיקר בתור "הוכחה על עקרון", הם תוכננו בתקשורת מורכבות שאינן מאפשרות את החוקר להעריך את התפקיד של היווצרות המינים על הזמינות הביולוגית41,42, 43 , 44.

החיישן הוא כלי שימושי ביותר בקביעת מנגנון שבו הם מינים מתכת bioavailable. מכיוון האורגניזם המארח אינה Hg-methylator, אותו ניתן להשתמש רק לפתח מודל איך Hg עשוי להכניס חיידקים גראם שליליים ואת לא תירוץ סופית איך Hg-methylators לרכוש Hg. שיטות אחרות קיימות עבור קביעת הזמינות הביולוגית כספית, כגון מתילציה, תוצאה של ספיגת או השימוש מאזן מסה הגישה10,15,20,45,46. זאת, השיטה המובאת כאן מציע את היתרון של נתונים בזמן אמת בדאנטה הזמינות הביולוגית התאים קיימא. אנו ממליצים כי בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לכמת את רמות כספית או תקליטור הכולל במטריצה הסביבה. למרות השימוש המוצע ביולוגיים לקביעת ריכוזים מתכת ב סביבה36, רבים בשיטות הרגילות זמינים יותר זמינים כגון ICP-MS, FAAS (לניתוח Cd) או גבס ספקטרוסקופיית בליעה אטומית (עבור Hg ניתוח). עם זאת ניתן החיישן משמש כדי לקבוע אם נתונה מטריצה סביבתיים יש הפוטנציאל לשיפור או ה"בלתי הזמינות הביולוגית; זו מושגת על ידי ביצוע תוספות סטנדרטי.

ה-pH של התקשורת חשיפה עשויה להשתנות כדי בכל מקום בטווח של 5 ו- 8.5, בתנאי החומצה חינם מגבים (מאגר) מוחלף עם חומצה חינם חלופי של מאגר עם pKa המתאים (ראה רשימת מאגרים המתאים (פרירה. et al. (2015) 47), מותאם עם קו ה-pH מתאים בעת ביצוע החשיפה לתקשורת. בנוסף, השיטה אינה מוגבלת Hg ו- Cd, אך יכול להרחיב עליו מתכות אחרות באמצעות אחרים שעתוק regulators.

ניתן לשנות את הבדיקה חשיפה לחקור את ההשפעה של אחרים acceptors אלקטרונים כגון O2 ו- fumarate הזמינות הביולוגית כספית או תקליטור. שינויים מזעריים השיטה לנצל O2 והן fumarate כמו אלקטרונים acceptors הינם זמינים על פי בקשה.

לסיכום, ברצוננו להדגיש את הנקודות הבאות: אני) זה הכרחי כי הריכוזים של מניות תקליטור או כספית ידועים בשלב 2, כמו אלה ישמש כדי לכייל את החיישן. II) ביום חשיפה, חייבים לעצור את הצמיחה של תאים-OD600 של 0.6 (± 0.1), כי הטיפול נלקח בעת resuspending של תרביות תאים, כמו החיישן מכויל לדחיסות התא הזה. III) לבסוף, חשוב כי המדיום חשיפה מורכב בקפידה יום חשיפה. כדי להבטיח ההצלחה של הפרוטוקול, צריך לגדול תרבויות רבות בעת ובעונה אחת (כדי לעקוף את האפשרות של כשל הצמיחה), מדיום הגידול צריך להיות הניקל שבועי (כדי לעקוף את metastability של התקשורת ושל זיהום אפשרי). יש גם לציין כי ביולוגי משכפל (תרביות תאים מרובים) מביעים השתנות כשמדובר אות הייצור. למרות התגובות פלורסנט עשויים להשתנות מתרבות לתרבות, המגמות פלורסנט בתגובה נתון משתנה צריכים להישאר דומה בכל משכפל ביולוגיים רבים.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

ברצוננו להודות הערות מסוקרים בעילום שם שני חברים טוב של המעבדה פולן לדיון תובנה על התפתחות החיישן אנאירובית. פרס חוקר מוקדם לבין מחוז אונטריו מענק גילוי, תוספת מאיץ מדעי הטבע, הנדסה מחקר המועצה של קנדה כדי A.J.P. מימנה את המחקר הזה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7 ml standard vial, rounded interior Delta Scientific 200-007-20 34 recommended
Vial tray, 21 mm openings Delta Scientific 730-2001 4 for (4 x 8 grid)
24 mm Closure Delta Scientific 600-024-01 32 recommended
LID CORNER NOTCH BLK STR CS/50 Corning Corning 3931
Corning 96- well clear-bottom nonbinding surface microplate Corning Corning 3651
Anaerobic Chamber (glovebox) The air in the anaerobic chamber should be (97 % N2 ± 2 % and 3 % H2 ± 2 %)
Palladium catalyst Converts O2 to H2O in the anaerobic chamber. Not required but recommended.
Microplate reader
450 (±10) nM filter for the microplate reader
500 (±10) nM filter for the microplate reader
Anaerobic culture vial (balch tubes) + rubber stoppers
Spectrophotometer Modified for anaerobic culture tubes
MA-3000 (mercury analyzer)
pH probe Any pH probe will work
50 mL conical sterile polypropylene centrifuge tubes.
0.22 µm polyethersulfone syringe filter + syringe
Sterile/clean glass bottles For growth media and standards
Sterile/clean plastic or PTFE bottles For alkali solutions (NaOH/KOH)
Reagents powders: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, ampicillin sodium salt, Difco M9 Minimal Salts, Glucose, MgSO4, Thiamine HCl, NaNO3, l-leucine, l-isoleucine valine, EDTA sodium salt, FeSO4, Sodium Beta-Gylcerophosphate, Mops free acid, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2
Sterile Milli-Q water Autoclaved or filter sterilized is fine.
Lysogeny Broth
Analytical grade H2SO4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Futsaeter, G., Wilson, S. The UNEP Global Mercury Assessment: Sources, Emissions and Transport. E3S Web of Conferences. 1, 36001 (2013).
  2. Barkay, T., Gillman, M., Turner, R. R. Effects of dissolved organic carbon and salinity on bioavailability of mercury. Applied and Environmental Microbiology. 63 (11), 4267-4271 (1997).
  3. Ndu, U., Mason, R. P., Zhang, H., Lin, S., Visscher, P. T. Effect of inorganic and organic ligands on the bioavailability of methylmercury as determined by using a mer-lux bioreporter. Applied and Environmental Microbiology. 78 (20), 7276-7282 (2012).
  4. Golding, G. R., et al. Evidence for facilitated uptake of Hg(II) by Vibrio anguillarum and Escherichia coli under anaerobic and aerobic conditions. Limnology and Oceanography. 47 (4), 967-975 (2002).
  5. Golding, G. R., Sparling, R., Kelly, C. A. Effect of pH on intracellular accumulation of trace concentrations of Hg(II) in Escherichia coli under anaerobic conditions, as measured using a mer-lux bioreporter. Applied and Environmental Microbiology. 74 (3), 667-675 (2008).
  6. Chiasson-Gould, S. A., Blais, J. M., Poulain, A. J. Dissolved Organic Matter Kinetically Controls Mercury Bioavailability to Bacteria. Environmental Science & Technology. 48 (6), 3153-3161 (2014).
  7. Schaefer, J. K., Szczuka, A., Morel, F. M. M. Effect of Divalent Metals on Hg(II) Uptake and Methylation by Bacteria. Environmental Science & Technology. 48 (5), 3007-3013 (2014).
  8. Compeau, G., Bartha, R. Sulfate-reducing bacteria: principal methylators of mercury in anoxic estuarine sediment. Applied and Environmental Microbiology. 50 (2), 498-502 (1985).
  9. Compeau, G. C., Bartha, R. Effect of salinity on mercury-methylating activity of sulfate-reducing bacteria in estuarine sediments. Applied and Environmental Microbiology. 53 (2), 261-265 (1987).
  10. Gilmour, C. C., Henry, E. A., Mitchell, R. Sulfate stimulation of mercury methylation in freshwater sediments. Environmental Science & Technology. 26 (11), 2281-2287 (1992).
  11. Rani, A., Kumar, A., Lal, A., Pant, M. Cellular mechanisms of cadmium-induced toxicity: a review. International Journal of Environmental Health Research. 24 (4), 378-399 (2014).
  12. Liu, F., Fortin, C., Campbell, P. G. C. Can freshwater phytoplankton access cadmium bound to low-molecular-weight thiols? Limnology and Oceanography. 62 (6), 2604-2615 (2017).
  13. Shahid, M., Dumat, C., Khalid, S., Niazi, N. K., Antunes, P. M. C. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. de Voogt, P. 241, Springer International Publishing. 73-137 (2017).
  14. Hsu-Kim, H., Kucharzyk, K. H., Zhang, T., Deshusses, M. A. Mechanisms regulating mercury bioavailability for methylating microorganisms in the aquatic environment: a critical review. Environmental Science and Technology. 47 (6), 2441-2456 (2013).
  15. Szczuka, A., Morel, F. M. M., Schaefer, J. K. Effect of Thiols, Zinc, and Redox Conditions on Hg Uptake in Shewanella oneidensis. Environmental Science and Technology. 49 (12), 7432-7438 (2015).
  16. Schaefer, J. K., et al. Active transport, substrate specificity, and methylation of Hg(II) in anaerobic bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (21), 8714-8719 (2011).
  17. Stenzler, B. R., Hinz, A., Ruuskanen, M. O., Poulain, A. J. Ionic strength differentially affects the bioavailability of neutral and negatively charged inorganic Hg complexes. Environmental Science and Technology. , (2017).
  18. Sigel, A. Cadmium: From Toxicity to Essentiality. , Dordrecht : Springer Netherlands : Imprint: Springer (2013).
  19. Barkay, T., Turner, R. R., Rasmussen, L. D., Kelly, C. A., Rudd, J. W. Luminescence facilitated detection of bioavailable mercury in natural waters. Methods in Molecular Biology. 102, Clifton, N.J. 231-246 (1998).
  20. Zhang, T., et al. Methylation of mercury by bacteria exposed to dissolved, nanoparticulate, and microparticulate mercuric sulfides. Environmental Science and Technology. 46 (13), 6950-6958 (2012).
  21. Ndu, U., Mason, R. P., Zhang, H., Lin, S., Visscher, P. T. Effect of inorganic and organic ligands on the bioavailability of methylmercury as determined by using a mer-lux bioreporter. Applied and Environmental Microbiology. 78 (20), 7276-7282 (2012).
  22. Moreau, J. W., et al. The Effect of Natural Organic Matter on Mercury Methylation by Desulfobulbus propionicus 1pr3. Frontiers in Microbiology. 6 (1389), (2015).
  23. Schaefer, J. K., Morel, F. M. M. High methylation rates of mercury bound to cysteine by Geobacter sulfurreducens. Nature Geoscience. 2 (2), 123-126 (2009).
  24. Dunham-Cheatham, S., Farrell, B., Mishra, B., Myneni, S., Fein, J. B. The effect of chloride on the adsorption of Hg onto three bacterial species. Chemical Geology. 373, 106-114 (2014).
  25. Dunham-Cheatham, S., Mishra, B., Myneni, S., Fein, J. B. The effect of natural organic matter on the adsorption of mercury to bacterial cells. Geochimica et Cosmochimica Acta. 150, 1-10 (2015).
  26. Mishra, B., Shoenfelt, E., Yu, Q., et al. Stoichiometry of mercury-thiol complexes on bacterial cell envelopes. Chemical Geology. 464, 137-146 (2017).
  27. Sara Anne, T., Qing, M., Jean-François, G. Probing changes in Hg(II) coordination during its bacterial uptake. Journal of Physics: Conference. 712 (1), 012078 (2016).
  28. Macek, T. Microbial Biosorption of Metals. , Springer. Netherlands. (2011).
  29. Ledin, M., Pedersen, K., Allard, B. Effects of pH and Ionic Strength on the Adsorption of Cs, Sr, Eu, Zn, Cd and Hg by Pseudomonas Putida. Water, Air, and Soil Pollution. 93 (1-4), 367-381 (1997).
  30. Daughney, C. J., Fein, J. B. The effect of ionic strength on the adsorption of H+, Cd2+, Pb2+ and Cu2+ by Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis: A surface complexation model. Journal of Colloid and Interface Science. 198 (1), 53-77 (1998).
  31. Borrok, D. M., Fein, J. B. The impact of ionic strength on the adsorption of protons, Pb, Cd, and Sr onto the surfaces of Gram negative bacteria: testing non-electrostatic, diffuse, and triple-layer models. Journal of Colloid and Interface Science. 286 (1), 110-126 (2005).
  32. Daguené, V., et al. Divalent Base Cations Hamper HgII Uptake. Environmental Science & Technology. 46 (12), 6645-6653 (2012).
  33. Turner, D. R. Speciation and cycling of arsenic, cadmium, lead and mercury in natural waters. Lead, Mercury, Cadmium and Arsenic in the Environment. , 175-186 (1987).
  34. Liu, G., Cai, Y., O'Driscoll, N. Environmental Chemistry and Toxicology of Mercury. , John Wiley & Sons. (2011).
  35. North, A. E., Sarpong-Kumankomah, S., Bellavie, A. R., White, W. M., Gailer, J. Environmentally relevant concentrations of aminopolycarboxylate chelating agents mobilize Cd from humic acid. Journal of Environmental Sciences. 57, 249-257 (2017).
  36. Van Der Meer, J. R., Belkin, S. Where microbiology meets microengineering: design and applications of reporter bacteria. Nature Reviews Microbiology. 8 (7), 511-522 (2010).
  37. Rasmussen, L. D., Turner, R. R., Barkay, T. Cell-density-dependent sensitivity of a mer-lux bioassay. Applied and Environmental Microbiology. 63 (8), 3291-3293 (1997).
  38. Magrisso, S., Erel, Y., Belkin, S. Microbial reporters of metal bioavailability. Microbial Biotechnology. 1 (4), 320-330 (2008).
  39. Golding, G. R., Kelly, C. A., Sparling, R., Loewen, P. C., Barkay, T. Evaluation of mercury toxicity as a predictor of mercury bioavailability. Environmental Science and Technology. 41 (16), 5685-5692 (2007).
  40. Drepper, T., et al. Reporter proteins for in vivo fluorescence without oxygen. Nature biotechnology. 25 (4), 443-445 (2007).
  41. Kumar, S., Verma, N., Singh, A. K. Development of cadmium specific recombinant biosensor and its application in milk samples. Sensors and Actuators B: Chemical. 240, 248-254 (2017).
  42. Yoon, Y., et al. Simultaneous detection of bioavailable arsenic and cadmium in contaminated soils using dual-sensing bioreporters. Applied and Environmental Microbiology. 100 (8), 3713-3722 (2016).
  43. Kang, Y., Lee, W., Jang, G., Kim, B. G., Yoon, Y. Modulating the sensing properties of Escherichia coli-based bioreporters for cadmium and mercury. Applied and Environmental Microbiology. 102 (11), 4863-4872 (2018).
  44. Hynninen, A., Tõnismann, K., Virta, M. Improving the sensitivity of bacterial bioreporters for heavy metals. Bioengineered Bugs. 1 (2), 132-138 (2010).
  45. Graham, A. M., Bullock, A. L., Maizel, A. C., Elias, D. A., Gilmour, C. C. Detailed assessment of the kinetics of Hg-cell association, Hg methylation, and methylmercury degradation in several Desulfovibrio species. Applied and Environmental Microbiology. 78 (20), 7337-7346 (2012).
  46. Graham, A. M., Aiken, G. R., Gilmour, C. C. Dissolved Organic Matter Enhances Microbial Mercury Methylation Under Sulfidic Conditions. Environmental Science & Technology. 46 (5), 2715-2723 (2012).
  47. Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. (Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions-a review. RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).
  48. Salmon, K., Hung, S. P., Mekjian, K., Baldi, P., Hatfield, G. W., Gunsalus, R. P. Global gene expression profiling in Escherichia coli K12: the effects of oxygen availability and FNR. Journal of Biological Chemistry. 278 (32), 29837-29855 (2003).
  49. Salmon, K. A., Hung, S. P., Steffen, N. R., Krupp, R., Baldi, P., Hatfield, G. W., Gunsalus, R. P. Global Gene Expression Profiling in Escherichia coli K12 effects of oxygen availability and ArcA. Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 15084-15096 (2005).
  50. Larose, C., Dommergue, A., Marusczak, N., Coves, J., Ferrari, C. P., Schneider, D. Bioavailable mercury cycling in polar snowpacks. Environmental Science & Technology. 45 (6), 2150-2156 (2011).
  51. Omura, T., Kiyono, M., Pan-Hou, H. Development of a specific and sensitive bacteria sensor for detection of mercury at picomolar levels in environment. Journal of Health Science. 50 (4), 379-383 (2004).

Tags

מדעי הסביבה גיליון 142 ביוסנסור כספית קדמיום אנאירובי הזמינות הביולוגית מתכת היווצרות המינים
Assay ביוסנסור אנאירובית איתור כספית, קדמיום
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stenzler, B. R., Gaudet, J.,… More

Stenzler, B. R., Gaudet, J., Poulain, A. J. An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium. J. Vis. Exp. (142), e58324, doi:10.3791/58324 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter