Summary
Denne protokol beskriver implantation af et glas vindue på rygmarven af en mus for at lette visualisering ved intravital mikroskopi.
Abstract
Denne protokol beskriver en metode til rygmarven laminektomi og glas Vindues implantation for in vivo billeddannelse af muse rygmarven. En integreret digital vaporizer udnyttes til at opnå en stabil plan af anæstesi på en lav-flowhastighed af isofluran. En enkelt rygsøjle er fjernet, og et kommercielt tilgængeligt dækglas er overlagt på en tynd agopstået seng. En 3D-trykt plastik bagplade er derefter fastgjort til de tilstødende vertebrale spines ved hjælp af vævsklæber og dental cement. En stabiliserings platform bruges til at reducere bevægelses artefakt fra respiration og hjerteslag. Denne hurtige og clamp-fri metode er velegnet til akut multifoton Fluorescens mikroskopi. Repræsentative data er inkluderet for en anvendelse af denne teknik til to-foton mikroskopi af rygmarven Vaskulaturen i Transgene mus, der udtrykker egfp: claudin-5-et stramt samle protein.
Introduction
Transgene dyremodeller, der udtrykker fluorescerende proteiner, når de kombineres med intravital mikroskopi, giver en stærk platform til håndtering af biologi og patofysiologi. For at anvende disse teknikker til rygmarven, er specialiserede protokoller forpligtet til at forberede rygmarven til billeddannelse. En sådan strategi er at gennemføre en laminektomi og rygmarven vindue implantation. De vigtigste funktioner i en ideel laminektomi protokol til mikroskopi omfatter bevarelse af indfødte væv struktur og funktion, stabilitet af billedbehandlings feltet, hurtig behandlingstid, og reproducerbarhed af resultater. En særlig udfordring er at stabilisere billedfeltet mod bevægelsen induceret af respiration og hjerteslag. Flere ex vivo og in vivo strategier er blevet rapporteret til at nå disse mål1,2,3,4,5. De fleste in vivo metoder involverer fastspænding af siderne af rygsøjlen2,4 og er ofte efterfulgt af implantering af et stift metal apparat3,4 for stabilitet under kirurgi og downstream-billedbehandlings applikationer. Fastspænding rygsøjle kan potentielt kompromittere blodgennemstrømningen og inducere blod-hjerne barrieren (BBB) protein remodeling.
Formålet med denne metode er at gøre den intakte rygmarv til rådighed for optisk billeddannelse i levende mus samtidig minimere invasivitet af protokollen og forbedre resultaterne. Vi beskriver en enkelt laminektomi og Cover-Glass implantation procedure parret med en minimalt invasiv oval plast 3D-printet bagplade, der stadig opnår robust mekanisk stabilitet. Bagpladen overholdes direkte til de forreste og bageste vertebrale Spiner med Dental cement. Bagpladen er udstyret med laterale forlængerarme med skruehuller, der stift Fastgør til mikroskop scenen via en metalarm. Dette forankrer effektivt den intakte forreste og bageste hvirvlen til mikroskopet, hvilket giver mekanisk modstandsdygtighed over for bevægelses artefakt, der ellers ville blive introduceret ved respiration og hjerteslag. Metoden er blevet optimeret til laminektomi af en enkelt hvirvel på thorax niveau 12, udelade de klemmer, der anvendes i alternative strategier for stabilitet under in vivo Imaging. Proceduren er hurtig, tager ca 30 min per mus.
Denne protokol kan bruges til at studere sygdomsmekanismer af BBB. BBB er et dynamisk mikrovaskulære system bestående af endotelceller, vaskulære glatte muskler, pericytes, og astrocyt Foot processer, der giver et meget selektivt miljø for centralnervesystemet (CNS). Repræsentative data viser anvendelsen af denne protokol i Transgene mus konstrueret til at udtrykke forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP): Claudin-5, en BBB stramt Junction protein. De medfølgende bagplade udskrivnings filer kan også tilpasses til alternative applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter følge University of Illinois, Chicago institutionelle dyrepasning og brug udvalg protokoller. Dette er en Terminal procedure.
1. klargøring af reagens
- Forbered kunstig cerebral spinalvæske (aCSF) til at indeholde 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2· 6h2o, 2 mm CaCl2· 2H2o i DDH2o. sterilt filter og fryse i individuelle brug aliquoter. Varm aCSF i et vandbad til 39 °C før brug.
- Varm lav smeltepunkt agopstået (2%) i aCSF, indtil den er helt opløst i et vandbad, der er sat til 65 °C. Under laminektomi, afkøles smeltet agted alikvot til 39 °c i et vandbad, så det kan klar ved tæt på fysiologisk temperatur for trin 5,2.
Bemærk: agrose-opløsningen kan opbevares ved-20 °C i engangs-aliquoter. - Forbered steril 50 mg/mL carprofen i bakteriostatisk vand. Opbevares ved 4 °C.
- Rengør dækslet-briller med 70% ethanol, tre skyller af Hedeselskabet2O, og opbevar det tørt i en støvfri beholder.
2. backplate 3D-udskrivning
- Brug 3D CAD-software bruges til at oprette en model til de dimensioner, der er vist i figur 1. Interiøret er en ellipse bredeste på den nederste overflade med hensyn til printeren og skæres med en lofted skåret til en mindre ellipse danner en lumen på den modsatte overflade. To projekterings arme med huller til at acceptere skruer strækker sideværts, for fastgørelse til bagpladen holder gaffel. Fra denne 3D-struktur, oprette en trianguleret 3D mesh-fil (. STL fil).
Bemærk: Se figur 1b\U2012D og supplerende filer 1 og 2. - Overfør den triangulerede 3D-mesh-fil til en 3D-printer.
- Print Bagplader ved hjælp af en 0,4 mm hot-end dyse og en 0,2 mm laghøjde. Vælg dysetemperatur på 205 °C, senge temperatur på 45 °C og udskrivningshastighed på 45 mm/s.
- Vurdere de resulterende 3D trykte Bagplader visuelt for strukturel integritet (figur 1E); grov strukturel fiasko (manglende lumen, skjult væg) indikerer udskrivnings defekter (figur 1f).
3. kirurgisk forberedelse
- Forvarmning af varmepuden.
- Ilæg isofluran i leverings sprøjten, mens du arbejder i en kemisk stinkhætte. Fastgør leverings sprøjten til isofluran-enheden.
- Vælg en 8 \ u201212-ugers-gammel mus. Veje dyret. Inducerer anæstesi med 2% isofluran i et induktions kammer. Injicér carprofen ved 5 mg/kg subkutant.
- Anbring næse keglen og Levér isofluran 2% med en strømningshastighed på 150 mL/min til vedligeholdelse af et kirurgisk plan for anæstesi (figur 2a\U2012E). Wrap varmepuden med en engangs absorberende pad for nem oprydning.
- Placer et dyr på varmepuden på Operations stationen og Installer næse keglen. Smør termometeret med vaseline og sæt det 5 mm ind i endetarmen. Tape termometer sonden til halen for stabilitet. Påfør oftalmisk salve i øjnene af musen.
- For at opretholde hydrering, anvende 200 μL lactat Ringer's opløsning ved subkutan injektion hver 30 min indtil afslutning af forsøget.
- Spray dorsum med 70% ethanol, Fjern pels med Clippers, og rengør stedet med povidon-jod.
4. laminektomi
- Placer dyret mellem ørepuderne; disse bevarer hoved positionen af musen med hensyn til næse-kegle.
- Bekræft, at dyret er dybt bedøvet som vurderet af manglende interdigitale kniv refleks og stabilt åndedrætsmønster.
- Lav en 1,5 cm rostral-caudal indsnit på midterlinjen over den nedre Thoracic/Upper lænde region ved hjælp af #11 klinge (figur 2). Adskil huden ved at gribe den med sløv tandede tang og/eller dykkede fingre. Brug pincet til at adskille og skrælle tilbage resterende gennemsigtige bindevæv under huden. Den overfladiske muskulatur bør nu eksponeres; fortrænge dette med en skum kirurgisk spyd.
- Brug skum kirurgiske Spears (eller en curette) til at fjerne den resterende, dybere muskulatur af målet hvirvler (Thoracic 12). For at skabe en plads til bagpladen, også rydde væk muskler fra det bageste aspekt af thorax 11, og den forreste aspekt af thorax 13. Kontrollere enhver blødning ved at anvende forsigtigt tryk med et kirurgisk spyd eller bruge en minimal puls med en Cautery pistol. Fortsæt med at fjerne den resterende muskel væk fra sener ved hjælp af tang
- Når musklerne er fjernet, forsigtigt løsne sener ved at skære med tang. Der bør være masser af plads til at visualisere og manipulere ledningen, når dette trin er fuldført. Kontroller, at Dura-sagen af det Inter-vertebrale rum, den semi-gennemsigtige laminar knogle, det centrale overfladiske blodkar under knoglen, og forreste udstrålende arterie er nu klart synlige.
- Våd regionen med varm aCSF. Brug mikroboret til at fortynde laminar knoglen gentagne med lige streger parallelt med rygmarvs lange akse (figur 2, figur 3). Hvis det ønskes, kan du bruge et glidende stadie til at rotere Operations platformen for at forbedre den ergonomiske komfort (for eksempel, en højrehåndet operatør må rotere Operations platformen mod uret for bore trinnet).
Bemærk: det anvendte glide trin er konstrueret af en øvre aluminiumsplade, der glider ± 15 mm med hensyn til den faste bundplade. - Tag forsigtigt fat i den overfladiske spinale proces med pincet og løft hvirvlen; knoglen skal løfte væk nemt. Hvis der er modstand, gentages knogle udtynding med boret og om nødvendigt bruge iris saks, at være omhyggelig med at sigte Scissor spidser opad for at undgå at beskadige vævet.
Bemærk: for at opretholde Dura intakt, er det vigtigt ikke at slæbebåd på knoglen. - Brug #4 pincet til at fjerne eventuelle knogle skår væk. Brug et kirurgisk spyd til at anvende forsigtigt konstant tryk for at kontrollere enhver blødning. Skyl vævet med varm aCSF. Lad ikke vævet tørre ud.
5. implantation af Cover glas
- Påfør forsigtigt et 3 mm borosilikat Cover-glas til den udsatte ledning.
- Sørg for, at agrose afkøles til 39 °C. Brug en lille spatel, anvende varm 2% agopstået/aCSF til kanten af dækslet-glas og tillade kapillar handling at trække det under overfladen.
Bemærk: ved temperaturer under 39 °C kan den agopstået begynde at gel. Hvis dette sker, blive ved hjælp af et vandbad eller mikroovn. Nogle operatører foretrækker først at anvende en dråbe agopstået og lægge dækslet-glas på toppen. - Påfør vævet klæbemiddel til de udsatte knogle artikulære processer af den intakte tilstødende hvirvel på thorax niveau 11 vertebrale rygsøjlen og thorax niveau 13 vertebrale rygsøjlen. Påfør yderligere vævs klæbemiddel i en ring omkring laminektomi stedet, over den tilstødende sene og tværgående proces.
Bemærk: vævsklæber er påkrævet for korrekt overholdelse af tand cementen i de efterfølgende trin. De artikulære processer danner et naturligt sæde, hvor bagpladen kan hvile stabilt (figur 3). Adhæsion til artikulære processer vil danne de stærkeste fastgørelsespunkter. - Bland dental cement med brændte i en porcelæn blande bakke. Udnyt en lille spatel til at overføre dental cement på vævet klæbende lag. Brug dental cement til at klæbe bagpladen til det kirurgiske felt, centreret over vinduet. Lad 10 minutter for dental cement til at helbrede.
Bemærk: den faste vedhæftning af bagpladen til de forreste og bageste artikulære processer giver den fundamentale strukturelle stabilitet af implantatet. - Brug ekstra dental cement til at udfylde den indvendige base af bagpladen, og undersiden af bagpladen: vævs interface.
Bemærk: den ekstra anvendelse af dental cement forbedrer tilslutningen og reducerer risikoen for lækage af mikroskopisk objektiv nedsænknings væske (saltvand) ud i bunden af bagpladen. - Forked bagplade holderen til den rette position over vinduet. Fastgør bagpladen i bagplade holderen med skruer.
Bemærk: denne protokol udnyttede en Special bearbejdet bagplade holder (figur 2g\U2012H). - Påfør saltvand til bagpladen for at teste for lækage. Hvis nogen væske lækker, tørre området og anvende mere dental cement.
6. klargøring af billedbehandling
- Overfør dyret på Operations platformen til det optiske bord.
Bemærk: vores kirurgiske platform, bagplade holder og isofluran næse kegle holder kan transporteres mellem kirurgiske og to-foton billed stationer som én enhed, samtidig med at der anvendes kontinuerlig isofluran anæstesi (figur 2D,H). Lignende enheder kan samles fra at holde gafler, bjælker og støttende søjle stillinger, der fås fra kommercielle kilder (f. eks. ThorLabs). For intravital mikroskopi, bør der være mindst 11 inches af clearance mellem mikroskopet mål og det optiske bord til at rumme højden af den kirurgiske platform. - Fastgør Operations platformen til det optiske bord ved hjælp af et monterings indlæg i rustfrit stål og en opspændings gaffel.
- Påfør frisk saltvand i brønden af bagpladen. Sænk en vand Sænknings linse ind i brønden.
- Brug transmitterede eller epifluorescens lys til at identificere det område af interesse og fokus. Skift til Laserscanning tilstand og udføre in vivo Imaging i henhold til de relevante to-photon laser excitation bølgelængde, dichroics og båndpas filtre for fluorophores til stede i vævet6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Implanterede glasruder og intravital to-foton mikroskopi giver et nyttigt værktøj til vurdering af dynamiske ændringer i CNS-proteiner. Den funktionelle integritet af BBB er påvirket af udtrykket, subcellulære lokalisering, og omsætningen satser på stramme Junction proteiner7. Tidligere undersøgelser har vist, at tætte samlings proteiner gennemgår en hurtig og dynamisk remodeling ved Steady State8. Den aktuelt beskrevne laminektomi og glas Vindues forberedelse er blevet anvendt i transgene egfp: claudin-5 mus9, som bærer fluorescerende stramme samlings proteiner, for at vurdere BBB Tight Junction remodeling i den eksperimentelle autoimmun hesteencephalitis (EAE) model af multipel sklerose10. I de repræsentative data blev billeddannelse af eGFP: Claudin-5 opnået med et to-foton mikroskop med 920 nm excitation, et 40 × infrarødt mål (0,8 NA) og et grønt fluorescens emissions filter (figur 4). Optiske stakke blev udtaget ved 2 μm aksiale trin til 100 μm under den durale overflade. Data skildrer visualisering af fluorescently mærkede kryds i hele en vaskulær plexus. Enkelte optiske skiver og Z-projektion billeder er inkluderet (figur 4). Den klare afgrænsning af snævre samlings strukturer i Z-projektion (figur 4b) indikerer, at minimal X-Y-billedforskydning produceres efter vellykket laminektomi, vinduesplacering og bagplade implantation.
Figur 1. Brugerdefinerede trykte bagplade stabilisering enhed. A) orthogonal bagplade visninger. B-D) triangulerede mesh modeller af dorsale og ventrale overflader af bagpladen. E) korrekt trykt bagplade. F) forkert trykt bagplade. Se supplerende filer 1 og 2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Kirurgiske trin for laminektomi. A) isoflurane anæstesi Delivery System udnytte en integreret digital vaporizer herunder (i) en touch screen display til styring af anæstesi, (II) kontrol ringer, (III) indgange til valgfri add-on fysiologi moduler, (IV) anæstesi koncentration justeringsknap, (v) sprøjtepumpe pusher Block, (vi) sprøjte med isofluran, (VII) integreret digital vaporizer, (VIII) Inspirations slange, (IX) Inspirations slange til induktions kammer, (x) induktions kammer, (XI) Inspirations slange til næse-kegle, (XII) Udløbsslange til næse kegle, (XIII) Udløbsslange til induktions kammeret. B) instrumenter, der anvendes i laminektomi omfatter (i) feedback kontrolleret varme enhed, (II) K-koblede rektal termometer sonde, (III) fleksibel silikone varmepude, (iv) #11 klinge, (v) #5 tang, (vi) tandet titanium pincet, (VII) titanium iris saks, (VIII) knoglemikrobor, (IX) Cautery Gun, (x) 3D trykt bagplade, (XI) sugende skum kirurgiske Spears, (XII) keramisk blande bakke til akryl harpiks, (XIII) akryl harpiks og Accelerant, (XIII) vævsklæber, (XIV) oftalmisk smøremiddel, (XV) 3 mm Cover-glas. C) stereomicroskop og kirurgisk platform. Under operationen sidder Operations platformen på en glide Stage (sølv og sort rund base på mikroskop scenen). D) mus beliggende på den brugerdefinerede kirurgiske platform med opvarmet seng, efter overfladisk mellemlinie incision. Isofluran til-holderen er justerbar i Y-og Z-aksen for at rumme små og store mus. Ørepude stabiliserer hovedet med hensyn til nosecone. Rektalthermoprobe måler kernetemperaturen. E) kirurgisk felt på trinnet af muskel fjernelse. F) kirurgisk felt efter fjernelse af muskler. G) kirurgisk felt under udtynding af vertebrale knoglen. H) kirurgisk felt efter fjernelse af vertebrale knoglen. I) kirurgisk felt under placering af dækglas. J) kirurgisk felt efter placering af dækglas. K) kirurgisk felt under indledende belægning med akryl. L) kirurgisk felt efter afslutning af bagpladens implantering. M-N) Mus placeret i Operations stationen efter afsluttet laminektomi. Messing forgaflen er justerbar i X-, Y-og Z-akser til positionering over rygmarvs laminektomi site. Gaflen er mekanisk forankret til Operations platformen for at give optimal stabilisering af billedfeltet under kirurgi og downstream-applikationer, herunder to-foton intravital mikroskopi. Under operationen er den kirurgiske platform monteret på et glide trin. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Skematisk skildring af anatomisk placering af rygmarven vindue. A) skematisk skildring af den overlegne visning af en nedre thorax vertebrale krop, spinøs proces, og rygmarv (SC) segment. En punkteret cirkel skildrer sædet for artikulær proces, det vigtigste støtte punkt for bagplade vedhæftning. B) skematisk skildring af den overlegne visning af rygmarven vindue. Målet vertebrale rygsøjlen (her, T12) er blevet fjernet. Et tyndt lag af agopstået overlejrer rygmarven. Et dækglas hviler oven på den agopstået. Vævsklæber påføres over de tværgående processer (og ikke vist her, på den eksponerede artikulære proces af de tilstødende, intakte vertebrale Spiner). Dental cement overlejrer vævs klæberen. Bagpladen klæder til vævs cementen, der hviler på de tværgående processer (vist) og artikulær processen af de tilstødende, intakte vertebrale Spiner (ikke vist i dette panel). Et ekstra tyndt lag af dental cement påføres på det indvendige af bagpladen fælg. Bagpladen er afbildet i en cutaway visning for at visualisere Cover-Glass. C) skematisk skildring af den laterale visning af rygmarven vindue. Målet vertebrale rygsøjlen (her, T12) er blevet fjernet. Et tyndt lag af agopstået overlejrer rygmarven. Et cover-glas hviler oven på agopstået. Vævsklæber påføres over den eksponerede artikulære proces af de tilstødende, intakte T11 og T13 vertebrale Spiner. Dental cement overlejrer vævs klæberen. Bagpladen klæder til vævs cementen, hvilende på tværgående processer og artikulær proces af tilstødende, intakt vertebrale spines (vist). Bagpladen er afbildet i en cutaway visning; i en ægte lateral opfattelse af agerede og Cover-glas ville blive tilsløret af den laterale væg af bagpladen. Anatomiske strukturer er baseret på detaljeret magnetisk resonans billeddannelse af C57Bl/6 spinal kolonne udført af Harrison og kolleger 11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Tight Junction mikrostruktur visualiseret af eGFP: Claudin-5 i musens rygmarv ved intravital to-foton mikroskopi. A) enkelt optisk sektion taget ved 30 μm under den durale overflade i en sund egfp: claudin-5 mus. Rød pil skildrer en eGFP: Claudin-5 Tight Junction segment, som strækker sig vinkelret på den langsgående stramme samlings akse. Scale bar repræsenterer 5 μm. inset: Scale bar repræsenterer 10 μm. B) Z-projektion af det vaskulære netværk, der strækker sig 100 μm under den durale overflade af den sunde muse rygmarv. Den optiske stak blev udtaget ved 2 μm aksial trin størrelse og omfatter skive fra panel A. Der er ikke udført nogen Billedjustering. Skarp afgrænsning af de supplerende strukturer i Z-projektion demonstrerer minimal billedforskydning mellem på hinanden følgende rammer. C) repræsentativt udsnit af optiske skiver taget med 10 μm intervaller fra den resulterende Z-stak. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende fil 1. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metode, der er beskrevet her, giver mulighed for stabil billeddannelse af rygmarven i mus gennem et glas vindue. Denne metode er blevet anvendt til at vurdere BBB remodeling i transgene eGFP: Claudin5 +/-mus, der udtrykker en fluorescerende BBB stramt Junction protein, men det kunne anvendes lige så godt for undersøgelser af eventuelle fluorescerende proteiner eller celler i rygmarven.
Flere metoder til laminektomi og rygmarvs stabilisering er blevet udviklet. Alle protokoller adresse stabiliserer rygmarven under billeddannelse og vindues gennemførelse for visuel adgang til strukturen af interesse. Antallet af hvirvler fjernet og graden af invasivitet af de tilgængelige protokoller varierer (f. eks komponenter limet på overfladen af overfladisk knogle, som i denne protokol, versus indlejret dybere). Davalos og akassoglou2 udviklet en laminektomi metode ved hjælp af flytbare klemmer på hver side af rygsøjlen og en klemme i bunden af halen af musen for at stabilisere rygmarven. Denne innovative strategi for at suspendere dyret lettet nogle af de thorax forskydning forårsaget af bevægelsen af lungerne udvide mod operationsbordet. For at skabe et godt for indeholdende nedsænkning væske til en vand-nedsænkning mikroskopisk linse, en rand af gelatine segl (f. eks GELseal) blev lavet omkring rygmarven og fyldt med acsf. Forseglings fælgen kunne blive forstyrret under billeddannelse, men kunne også let tørres af ved slutningen af sessionen for at muliggøre sårlukning og efterfølgende genbehandling. Denne metode er blevet bredt vedtaget12,13. Andre grupper har udviklet alternative stabiliseringsmetoder. Fenrich et al. 4 håndlavede modificerede papirclips som en måde at sikre rygsøjle. Disse modificerede papirclips blev sikret i laterale vertebrale pediles med cyanoacrylat lim og vedligeholdt som permanent implanterede håndtag til en aftagelig ekstern clips og ekstern holder gaffel for fremragende bevægelses stabilitet. Cupido og kolleger har præsenteret variationer over de førnævnte metoder med inkorporering af agopstået overlejret på ledningen2,4,12. Farrar og Schaffer3 udviklede en firsidede metal stabilisator, der kunne gøre det muligt at gennemføre et glas vindue på tre ryghvirvler i stedet for kun én. Denne metode tillod også rygmarven at være fastgjort med skruer til en større bro stabilisator under billeddannelse for at reducere potentielle bevægelse. En miniaturiseret et-foton mikroskop implanteret direkte på laminektomi Imaging kammer er også blevet udviklet til in vivo optagelse i frit bevægende mus på en-foton niveau, men er endnu ikke let tilgængelige for de fleste laboratorier13 . I en anden tilgang, Weinger et al. 1 dissekeret en hel rygmarv og indlejret det i agopstået for ex vivo Imaging, som giver mulighed for ugennemtrængelig bevægelses stabilitet og adgang til ventrale rygmarven, men ophæver blodgennemstrømningen. Nogle begrænsninger af disse udviklinger omfatter langvarig kirurgisk tid4, mulig afbrydelse af gelatine tætning RIM2, behovet for at tilpasse dækslet-glas dimensioner til at passe det ønskede område af rygmarven4, manual ændring af papirclips4,12, relativt invasive kirurgiske teknikker12,14og luftbobler, der dannes ved brug af silicium elastomer3,4.
Vi har udviklet en alternativ metode, der giver flere fordele. Denne protokol er blevet optimeret til at reducere mængden af tid brugt under operationen. Der henviser til, at nogle kirurgiske protokoller kræver længere procedure tider fra en time til en halv4 til en time3; Når mestrer, denne laminektomi metode kan udføres i ca. 30 min. at reducere den tid, der bruges i kirurgi kan mindske fysiologisk stress til musen, og lette højere gennemløb eksperimenter. Denne protokol fjerner en enkelt hvirvel, og inkorporerer overfladisk vedhæftning af stabiliserings anordningen gør det mindre invasive end nogle sammenlignelige protokoller4,5,12,14. Ligesom metoden til Figley et al., ved at udnytte et plastik implantat denne protokol giver kompatibilitet med akustisk Imaging5.
For at undgå lysspredning (under intravital mikroskopi), der kan være forårsaget af forskellene mellem brydnings indeksene af luft, vand og væv, overlejrer de fleste protokoller et optisk gennemsigtigt substrat i forhold til den udsatte rygmarv. Fælles substrater omfatter høj renhed, lav-smeltetemperatur agopstået10,12 eller silikone polymerer3,4,5. Agopstået tilbyder fordelen ved brugervenlighed, med minimal bobledannelse, og er passende for akut billeddannelse sessioner. For at beskytte vævet mod varme skader, er det bekvemt at opvarme den agopstået til ud over smeltepunktet og derefter tillade det at køle til ~ 39 °C i et vandbad under laminektomi, så det kan være klar på det rette tidspunkt for anvendelse til den udsatte rygmarv. For kronisk billeddannelse er silikone polymerer mere modstandsdygtige over for dehydrering. Pilot forsøg under udviklingen af den nuværende protokol udelod enten det aganserede lag eller det overliggende dækglas, og fandt ud af, at den deraf følgende lysspredning reducerede den tilgængelige dybde af billeddannelse.
En differentierende funktion i denne protokol er inkorporering af en 3D trykt bagplade og støttende bagplade gaffel holder. Efter laminektomi og vindues implantation, er præparatet stabiliseret ved tilsætning af en 3D-trykt oval bagplade, der er fastgjort på plads med Dental cement. Bagpladen tjener to funktioner: for det første, det giver strukturel støtte og stabilisering af rygmarven, og for det andet, det skaber en læbe til at holde væske til fordybelse mål for mikroskopi. I prototyper af dette setup blev der anvendt kommercielt tilgængelige stolpe stolper, adaptere og holde gafler. Vi har for nylig skiftet til specialfremstillede dele som afbildet her. I begge tilfælde er det væsentlige træk at give strukturel stringens for at stabilisere billedfeltet mod forstyrrelser i rum og tid induceret af hjerteslag og respiration. Selv om dyrets krop hviler løst på varmepuden, er rygmarven og dens billedbehandlings felt lidt suspenderet fra holdegaflen, hvilket også mindsker respiratorisk forskydning. Plastik substratet giver let fleksibilitet til at rumme spændinger fra at skrue ind i plade holderen. Den sorte plastik farve, der bruges til udskrivning, afspejler minimal lys i fluorescens feltet. Gennem disse metoder, vi med succes generere billedstakke, der kan bruges uden post hoc justering justering. Desuden er 3D bagplade beskrevet heri er billig at producere, koster kun øre i materiale for hver udskrift, når printeren er købt. Desuden er udgifterne til 3D-printere faldet i de seneste år. 3D trykte bagplade strukturelle filer (Se supplerende filer 1 og 2) offentliggjort med denne protokol kan let ændres for at imødekomme individuelle laboratorie behov. Vi har designet den lange dimension af bagpladen for at imødekomme det intervertebrale rum skabt ved fjernelse af thorax 12 vertebrale rygsøjlen, som over ligger lænde 2/3 rygmarven segmenter11. For at anvende denne teknik til en anden vertebrale sektion, kan de ledsagende CAD-filer ændres.
Denne protokol udnytter en kommercielt tilgængelig low-flow anæstesi system, der udsender en digital integreret direkte injektion vaporizer som et alternativ til den traditionelle passive vaporizer. Det vigtigste element i low-flow-enheden er den reducerede operatør eksponering for isoflurane, en betydelig sundhedsmæssige fordel. Low-flow anæstesi enheden tilbyder også omkostningsbesparelser på grund af det reducerede forbrug af isofluran og udnyttelse af rum luft i stedet for komprimeret gas. I nærværende undersøgelse, 2% isofluran leveret af integreret digital vaporizer på 150 mL/min, sammen med feedback-kontrollerede termisk støtte, opnået en stabil plan for anæstesi og passende vedligeholdelse af kroppens kernetemperatur. I overensstemmelse med denne, offentliggjorte sammenligninger af digitale integrerede fordampnings og traditionelle fordampnings har også konkluderet, at den digitale integrerede vaporizer giver en stabil plan for anæstesi og god bevaring af kernetemperatur, puls, respiratorisk hastighed, og nyttiggørelse, mens udnytter mindre isofluran15,16.
Et non-steroidt antiinflammatorisk lægemiddel (NSAID) såsom carprofen kan administreres præoperativt som et supplerende analgetikum. I løbet af få timer hæmmer NSAID'er inflammatorisk cytokintransskription og interstitiel ødem; flerdages administration dæmper sværhedsgraden af Neuro inflammatoriske sygdomme, herunder eksperimentel autoimmun encephalomyelitis, en dyremodel af multipel sklerose17,18. Især i studiet af Neuro inflammatorisk sygdom skal de gavnlige virkninger af carprofen analgesi nøje afvejes mod sygdomsmodificerende virkninger ved bestemmelse af analgesi og anæstesi for et eksperiment i tæt koordination med passende regulerings nævn.
En begrænsning af denne metode er, at det ikke er umiddelbart modtagelig for gentagne billedbehandling sessioner på tværs af flere dage. Den væsentligste årsag er, at bagpladen struktur er for stor til at lukke huden over. Derfor, der er en risiko for, at en mus ville fjerne bagpladen ved at vågne fra anæstesi. Hvis gentagen billeddannelse var afgørende, er der flere strategier, der kunne implementeres, herunder at reducere størrelsen af bagpladen, eller ændre mount. Som med enhver kirurgisk procedure, der er en indlæringskurve for operatørerne. Der er behov for tæt koordination med de institutionelle dyreværns kontorer og revisions bestyrelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
S.E. Lutz er støttet af det nationale center for fremme translational Sciences, nationale institutter for sundhed, under Grant KL2TR002002 og University of Illinois Chicago College of Medicine start-up midler. Simon Alford understøttes af RO1 MH084874. Indholdet er udelukkende ansvaret for forfatterne og ikke nødvendigvis repræsenterer de officielle synspunkter af NIH. Forfatterne tak Dritan Agalliu i Department of Neurology på Columbia University Medical Center for TG eGFP: Claudin-5 mus, videnskabelige diskussioner, og indsigt i udviklingen af den kirurgiske protokol og Imaging applikationer. Forfatterne tak Sunil P. Gandhi i Department of Neurobiology og Behavior på University of California, Irvine for at designe den første prototype af stereoanlæg og dyre temperatur controller, diskussion af den kirurgiske protokol, og træning i to-foton mikroskopi. Forfatterne takker også Steve Pickens (W. Nuhsbaum, Inc.) for at hjælpe med at tilpasse det kirurgiske stereomicroskop og Ron Lipinski (hval fremstilling) til bearbejdning af stereotaktiske dele.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Raise3D | Pro2 | For printing backplates |
| PLA 3D printing filament | Inland | PLA+-175-B | Black plastic 3D printing material |
| 3D CAD software | Dassault Systemes | Solidworks software | used to design 3D shapes |
| 3D printer software | Raise3D | Ideamaker software | software used to interface with the 3D printer |
| 3D printed oval backplate | custom | Stabilizing imaging field | |
| Surgical dissecting microscope | Leica | M205 C | Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage |
| Microscope camera | Leica | MC170 | HD color camera for visualizing surgical field |
| Gliding stage | Leica | 10446301 | The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement. |
| Surgical station and stabilization fork | Whale Manufactoring | custom | Laminectomy |
| SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit | Kent Scientific | SS-01 | Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer |
| Stainless steel 1.5 inch mounting post | ThorLabs | P50/M | For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging |
| Counterbored Clamping Fork for 1.5" mounting Post | ThorLabs | PF175 | For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging |
| Ideal bone microdrill | Harvard apparatus | 72-6065 | Thinning bone for laminectomy |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | Warming saline |
| Cautery gun | FST | 18010-00 | Cauterizing minor bleeds |
| Heating pad | Benchmark | BF11222 | 1.9” x 4.5” silicone heater with 20” Teflon leads, 10W, 5V |
| K type thermocoupled rectal probe | Physitemp | RET3 | Measuring mouse body temperature |
| petroleum jelly | Sigma | 8009-03-8 | Lubricating rectal probe |
| Feedback-regulated thermal controller | custom | NA | Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series |
| PVA Surgical eye spears | Beaver-visitec international | 40400-8 | Absorbing blood |
| Electric trimmer | Wahl | 41590-0438 | Trimming mouse fur |
| Blade, #11 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Forceps, #5 | FST | 11254-20 | Surgical tool |
| Forceps, #4 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Titatnium toothed forceps | WPI | 555047FT | Surgical tool |
| Titanium Iris scissors | WPI | 555562S | Surgical tool |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 084-1469SB | Preparing tissue surface for dental acrylic |
| Ceramic mixing tray | Jack Richeson | 420716 | Mixing dental acrylic agent with accelerant |
| Orthojet dental acrylic | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | Permanently bonding backplate to tissue |
| Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm | Harvard apparatus | 64-0720 | optical window |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | For aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | For aCSF |
| Glucose | Fisher Scientific | 50-99-7 | For aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | For aCSF |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | For aCSF |
| CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | For aCSF |
| Carprofen | Rimadyl | QM01AE91 | Analgesia |
| Bacteriostatic water | Henry Schein | 2587428 | Diluent for carprofen |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-6776-2 | Anesthesia |
| Lactated ringer solution | Baxter | 0338-0117-04 | Hydration for mouse |
| Agarose High EEO | Sigma | A9793 | gel point 34-37 degrees C |
| Opthalmic lubricating ointment | Akwa Tears | 68788-0697 | Prevent corneal drying |
| MOM Two-Photon Microscope | Sutter |
References
- Weinger, J. G., et al. Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).
- Farrar, M. J., Schaffer, C. B. A procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. (82), e50826 (2013).
- Figley, S. A., et al. A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model. PLOS ONE. 8 (3), e58081 (2013).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135 (3), 311-336 (2018).
- Shen, L., Weber, C. R., Turner, J. R. The tight junction protein complex undergoes rapid and continuous molecular remodeling at steady state. Journal of Cell Biology. 181 (4), 683-695 (2008).
- Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82, 1-15 (2014).
- Lutz, S. E., et al. Caveolin1 Is Required for Th1 Cell Infiltration, but Not Tight Junction Remodeling, at the Blood-Brain Barrier in Autoimmune Neuroinflammation. Cell Reports. 21 (8), 2104-2117 (2017).
- Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. Neuroimage. 68, 22-29 (2013).
- Cupido, A., Catalin, B., Steffens, H., Kirchhoff, F. Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue. Bakota, L., Brandt, R. , Springer. New York. 37-50 (2014).
- Sekiguchi, K. J., et al. Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice. Nature Communications. 7, 11450 (2016).
- Nadrigny, F., Le Meur, K., Schomburg, E. D., Safavi-Abbasi, S., Dibaj, P. Two-photon laser-scanning microscopy for single and repetitive imaging of dorsal and lateral spinal white matter in vivo. Physiological Research. 66 (3), 531-537 (2017).
- Adelsperger, A. R., Bigiarelli-Nogas, K. J., Toore, I., Goergen, C. J. Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Damen, F. W., Adelsperger, A. R., Wilson, K. E., Goergen, C. J. Comparison of Traditional and Integrated Digital Anesthetic Vaporizers. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 756-762 (2015).
- Miyamoto, K., et al. Selective COX-2 inhibitor celecoxib prevents experimental autoimmune encephalomyelitis through COX-2-independent pathway. Brain. 129 (Pt 8), 1984-1992 (2006).
- Muthian, G., et al. COX-2 inhibitors modulate IL-12 signaling through JAK-STAT pathway leading to Th1 response in experimental allergic encephalomyelitis. Journal of Clinical Immunology. 26 (1), 73-85 (2006).
