Summary
פרוטוקול זה מתאר השרשה של חלון זכוכית אל חוט השדרה של העכבר כדי להקל על ההדמיה על ידי המיקרוסקופיה.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר שיטה לניתוח חוט השדרה והשרשה חלון זכוכית עבור vivo הדמיה של חוט השדרה של העכבר. מאדה דיגיטלית משולבת מנוצל כדי להשיג מישור יציב של הרדמה בקצב נמוך בזרימה של isofלוריאן. עמוד שדרה אחד בחוליות מוסר, וזכוכית כיסוי מסחרית זמינה מצופה על מיטה דקה. הרקע פלסטיק 3D מודפס לאחר מכן מודבקת את השדרה השדרה הסמוכה באמצעות דבק רקמה ושיניים מלט. פלטפורמת ייצוב משמש כדי להפחית את התנועה מתוך נשימה ודופק. שיטה מהירה ונטולת מלחציים זו מתאימה היטב למיקרוסקופיה חריפה מרובת פוטון. נתונים מייצגים כלולים עבור יישום של טכניקה זו לשני פוטון המיקרוסקופיה של חוט השדרה ומיקרולטורה בעכברים טרנסגניים המבטא eGFP: קלאודין-5 – חלבון הצומת צר.
Introduction
דגמי החיות הטרנסגניים מבטאים חלבונים פלורסצנט, כאשר הם משולבים עם מיקרוסקופ אינטרטל, מספקים פלטפורמה רבת עוצמה לטיפול בביולוגיה ופתופסולוגיה. כדי להחיל טכניקות אלה על חוט השדרה, פרוטוקולים מיוחדים נדרשים להכין את חוט השדרה עבור הדמיה. אסטרטגיה אחת כזו היא לבצע כריתת למינציה והשתלת חלון חוט השדרה. התכונות המרכזיות של פרוטוקול כריתת למינציה אידיאלית למיקרוסקופיה כוללות שימור מבנה ותפקוד של רקמות מקוריות, יציבות של שדה ההדמיה, זמן עיבוד מהיר ושלילת תוצאות. אתגר מסוים הוא לייצב את שדה ההדמיה נגד התנועה הנגרמת על ידי נשימה ודופק. מספר vivo ex ואסטרטגיות vivo דווחו כדי להשיג את המטרות הללו1,2,3,4,5. רוב בשיטות vivo כרוכות לאורך הדרך בעמוד השדרה2,4 ולעתים קרובות לאחר מכן על ידי השתלת מנגנון מתכת נוקשה3,4 עבור יציבות במהלך הניתוח ו יישומי דימות במורד הזרם. לחיץ את עמוד השדרה יכול להתפשר על זרימת הדם ולגרום דם-מוח מחסום (BBB) שיפוץ חלבון.
מטרת שיטה זו היא להפוך את חוט השדרה שלמים זמין לדימות אופטי בעכבר החי תוך מזעור הפלישה של הפרוטוקול ושיפור התוצאות. אנו מתארים כריתת למינציה אחת וכיסוי השתלת זכוכית הליך לזווג עם מינימלית פולשנית האליפסה 3d מודפס מתכתי שעדיין משיגה יציבות מכנית חזקה. לוחית הגיבוי היא דבקה ישירה השדרה הקדמית והאחורי החוליות עם מלט שיניים. הלוחית האחורית מצוידת בזרועות הארכה לרוחב עם חורי בורג שמתחברים באופן נוקשה לשלב המיקרוסקופ דרך זרוע מתכת. זה מעגן ביעילות את החוליה הקדמית והאחורי ללא שינוי לשלב המיקרוסקופ, מתן עמידות מכנית לחפץ התנועה שאחרת הוכנסו על ידי נשימה ודופק. השיטה ממוטבת עבור כריתת למינציה של חוליה אחת ברמת בית החזה 12, השמטת את התפסים מנוצל אסטרטגיות חלופיות ליציבות במהלך הדמיה vivo . ההליך הוא מהיר, לוקח כ 30 דקות לכל עכבר.
פרוטוקול זה יכול לשמש לחקר מנגנוני המחלות של BBB. Bbb הוא מערכת דינמית מיקרוסקולרית מורכבת של תאים אנדותל, שריר חלק כלי הדם, קרום הלב, ו אסטרוציט ברגל תהליכים המספקים סביבה סלקטיבית מאוד עבור מערכת העצבים המרכזית (cn). נתונים מייצגים מתארים את היישום של פרוטוקול זה בעכברים טרנסגניים הנדסה לבטא חלבון פלורסנט ירוק משופר (eGFP): קלאודין 5, חלבון BBB צר הצומת. ניתן גם להתאים אישית את קבצי ההדפסה מלוח הרקע עבור יישומים חלופיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים הולכים בעקבות האוניברסיטה של אילינוי, שיקגו מוסדית לטיפול בבעלי חיים ופרוטוקולי הוועדה. . זהו תהליך סופני
1. הכנה מגיב
- הכנת נוזל השדרה מלאכותי מוחין (aCSF) כדי להכיל 125 mM הנאקל, 5 מ"מ KCl, 10 מ"מ גלוקוז, 10 מ"מ HEPES, 2 מ"מ MgCl2 ·6h 2 o, 2 מ"מ cacl2· 2H2o ב Ddh2 o.מסנן סטרילי ו להקפיא בשימוש בודדים השתמש ali,. חמה aCSF באמבט מים 39 ° c לפני השימוש.
- חום נמוך התכה הנקודה (2%) ב-aCSF עד התפרקה לחלוטין באמבט מים ל65 ° c. במהלך כריתת למינציה, מגניב את agarose מומסת עד 39 ° צ' באמבט מים, כך שהוא יכול להיות מוכן קרוב לטמפרטורה הפיזיולוגית עבור שלב 5.2.
הערה: ניתן לאחסן את הפתרון האגקם ב-20 ° c בעלי שימוש יחיד. - הכן סטרילי 50 mg/mL carprofen במים בקטיוסטטיים. חנות ב -4 ° c.
- נקי כיסוי-משקפיים עם 70% אתנול, 3 שוטף של ddH2O, ולאחסן יבש במיכל ללא אבק.
2. לוח הדפסה תלת-ממדי
- השתמש בתוכנת 3D CAD משמש ליצירת מודל לממדים המוצגים באיור 1. הפנים הוא אליפסה הרחב ביותר במשטח התחתון ביחס למדפסת לחתוך עם לונופה לחתוך לאליפסה קטנה יותר להרכיב לומן על פני השטח הנגדי. שתי זרועות מקרינים עם חורים כדי לקבל ברגים להאריך באופן משני, עבור המצורפים המזלג החזקת לוחית. ממבנה תלת-ממד זה, צרו קובץ שינוי משולש תלת-ממד (. קובץ STL).
הערה: ראה איור 1B\u2012 2012D וקבצים משלימים 1 ו-2. - העלה את הקובץ התלת-ממדי של רשת השינוי למדפסת תלת-ממדית.
- הדפס לוחות רקע באמצעות זרבובית 0.4 mm לקצה חם וגובה שכבה 0.2 מ"מ. בחר טמפרטורת חרירים של 205 ° צ', טמפרטורת המיטה של 45 ° c, ומהירות ההדפסה של 45 mm/s.
- העריכו את הרקע המודפס של הדפסת תלת-ממד התוצאות באופן חזותי עבור תקינות מבנית (איור 1E); כישלון מבנית גולמי (נעדר לומן, קיר מכווץ) מציין פגמים בהדפסה (איור 1F).
3. הכנה כירורגית
- מחממים את משטח החימום.
- בזמן שאתה עובד. בתוך מכסה כימי חברו את מזרק המשלוח. ליחידת האספקה
- בחר עכבר בן 8 \ u201212 בשבוע. . שוקלים את החיה לגרום להרדמה באמצעות 2%. בחדר האינדוקציה הכנס carprofen ב 5 מ"ג/ק"ג תת-עורי.
- הצב את האף-חרוט ולספק isofלאנה ב 2% עם שיעור הזרימה של 150 mL/min עבור תחזוקה של מישור כירורגי של הרדמה (איור 2A= =E). עוטפים את משטח החימום עם משטח סופג חד פעמי בשביל להקל על ניקוי.
- מיקום חיה על כרית החימום בתחנת הניתוח ולהתקין את קונוס האף. לשמן את התרמומטר עם ריבת נפט ולהכניס אותו 5 מ"מ לתוך הרקטום. הקלטת את התרמומטר לבדוק את הזנב ליציבות. החלת משחה אופטלמולוגית לעיניים של העכבר.
- כדי לשמור על מחות, להחיל 200 μL של מענה הפתרון של החיסון על ידי הזרקה תת עורית כל 30 דקות עד סיום הניסוי.
- רסס את dorsum עם 70% אתנול, להסיר פרווה עם קוצץ, ולנקות את האתר עם povidone-יוד.
4. כריתת למינציה
- מקמו את החיה בין פסי האוזן; אלה לשמור על המיקום הראשי של העכבר ביחס האף-קונוס.
- ודא כי בעלי חיים הוא מורדם עמוקות כמו המשוער על ידי חוסר של רפלקס הפינצ ' בתוך המערכת ואת הנשימה יציבה.
- לעשות חתך 1.5 ס מ rostral-caudal על קו האמצע מעל בית החזה התחתון/העליון באזור המותניים באמצעות #11 להב (איור 2). הפרידו את העור על ידי האוחז בו בעזרת מלקחיים בעלי שיניים בוטים ו/או אצבעות כעערות. השתמש מלקחיים כדי להפריד ולקלף לאחור כל רקמת חיבור שקופה שנותרה מתחת לעור. כעת יש לחשוף את השרירים השטפתם; לתפוס את זה עם חנית כירורגית קצף.
- שימוש בחניתות כירורגיים מקלקר (או מכוש) כדי לנקות את השרירים הנותרים, עמוק יותר של חוליית היעד (בית החזה 12). כדי ליצור מושב עבור הלוח האחורי, גם לנקות את השריר מן ההיבט האחורי של בית החזה 11, ואת ההיבט הקדמי של בית החזה 13. לשלוט על כל דימום על ידי החלת לחץ עדין עם חנית כירורגית או להשתמש בדופק מינימלי עם אקדח קאטרי. המשך להסיר את השריר שנותר הרחק הגידים באמצעות מלקחיים
- לאחר הסרת השרירים, לנתק בזהירות את הגידים על ידי חיתוך עם מלקחיים. צריך להיות מקום רב להמחיש ולתמרן את החוט כאשר שלב זה הושלם. בדוק כי החומר הדורא של החלל הבין-החוליות, עצם שקוף למחצה שכבתית, כלי הדם השטחית המרכזי מתחת לעצם, ועורק מקרין קדמי מוצגים כעת בבירור.
- להרטיב את האזור עם aCSF חם. השתמש במיקרו-מקדחה כדי ליישר את העצם הלמינארי באמצעות משיכות ישרות במקביל לציר הארוך של חוט השדרה (איור 2, איור 3). אם רצונך בכך, להשתמש בשלב דאייה כדי לסובב את פלטפורמת כירורגי עבור נוחות ארגונומית משופר (למשל, מפעיל יד ימין יכול לסובב את פלטפורמת כירורגי נגד כיוון הקידוח).
הערה: השלב דאייה המשמש בנוי צלחת אלומיניום העליון השקופיות ± 15 מ"מ ביחס לוחית הבסיס קבוע. - לתפוס בעדינות את התהליך שטחי spinous עם מלקחיים ולהרים את החוליה; העצם צריך להתרחק בקלות. אם יש התנגדות, לחזור על עצם דליל עם התרגיל ואם הצורך להשתמש במספריים הקשתית, להיות זהיר כדי לכוון את קצות המספריים כלפי מעלה כדי למנוע פגיעה ברקמה.
הערה: כדי לשמור על השכבה ללא פגע, זה חיוני לא למשוך את העצם. - השתמש #4 מלקחיים כדי לנקות את רסיסי העצם. השתמש בחנית כירורגית כדי להחיל לחץ יציב בעדינות כדי לשלוט על כל דימום. לשטוף את הרקמה עם aCSF חם. אל תאפשר לרקמות להתייבש.
5. כיסוי-השתלת זכוכית
- בעדינות להחיל 3 מ"מ כיסוי בורוסיליקט-זכוכית לחוט החשוף.
- הבטחה לעלות הצמח מקורר ל-39 ° c. באמצעות מרית קטנה, למרוח חם 2% agarose/aCSF לקצה של זכוכית כיסוי ולאפשר פעולה קפילר לצייר אותו מתחת לפני השטח.
הערה: בטמפרטורה מתחת 39 ° c, העלה עשוי להתחיל ג'ל. אם זה קורה, לחמם מחדש באמצעות אמבט מים או מיקרוגל. מפעילים מסוימים מעדיפים להחיל תחילה טיפה אחת של הצמח ולהניח את העטיפה על הזכוכית העליונה. - החלת דבק רקמה על התהליכים הגרקולריות חשוף של החוליה הסמוכה שלמה ברמת הבית החזה 11 החוליות עמוד השדרה ואת החזה ברמה 13 החוליות השדרה. החל דבק רקמות נוסף בטבעת סביב האתר כריתת למינציה, על הגיד הסמוך ואת התהליך הרוחבי.
הערה: דבק ברקמה נדרש לדבקות מתאימה של מלט שיניים בשלבים הבאים. התהליכים הפרקולתיים יוצרים מושב טבעי שעליו משענת הלוחית האחורית (איור 3). הדבקה לתהליכים הפרקולתיים מהווה את נקודות ההחזקה החזקות ביותר. - מערבבים מלט שיניים עם מאיץ במגש ערבוב פורצלן. לנצל מרית קטנה כדי להעביר צמנט שיניים על שכבת דבק רקמה. השתמש מלט שיניים לדבוק את הלוחית האחורית לשדה כירורגי, ממורכז מעל החלון. הרשו 10 דקות להמלט שיניים לרפא.
הערה: החברה הדבקה של הלוח האחורי לתהליכים המדעיים הקדמי והאחוריים מספקת את יציבות המבנה הבסיסית של השתל. - השתמש במלט שיניים נוספים כדי למלא את הבסיס הפנימי של הלוחית האחורית, ואת החלק התחתון של הלוחית האחורית: ממשק הרקמה.
הערה: היישום הנוסף של מלט שיניים משפר את הדבקות ומפחית את הסיכון של דליפה של נוזלי טבילה אובייקטיבית מיקרוסקופ (מלוחים) החוצה את החלק התחתון של לוחית האחוריות. - העבר את מחזיק לוחית הגיבוי למיקום המתאים מהחלון. לאבטח את הלוחית האחורית לתוך מחזיק לוחית הגיבוי עם ברגים.
הערה: פרוטוקול זה ניצל מחזיק מראש לוחית לאחור (איור 2G\U2012H). - החלת תמיסת מלח על הלוחית האחורית כדי לבדוק דליפה. אם כל נוזל דולף, לייבש את האזור ולהחיל מלט שיניים יותר.
6. הכנת הדמיה
- העבירו את החיה על המשטח הכירורגי לשולחן האופטי.
הערה: הפלטפורמה הכירורגית שלנו, מחזיק לוחית הגיבוי, ומחזיק האף-קונוס של המערכת ניתן להעביר בין תחנות ניתוח והדמיה של שני הפוטונים כיחידה אחת, תוך החלת הרדמה רציפה (איור 2D,H). יחידות דומות ניתן להרכיב מתוך החזקת מזלגות, קורות, תמיכה עמוד הודעות השגה ממקורות מסחריים (g. מעבדות המשך). עבור המיקרוסקופיה, צריך להיות לפחות 11 סנטימטרים של סיווג בין מטרת המיקרוסקופ לבין הטבלה האופטית כדי להתאים את הגובה של הפלטפורמה הכירורגית. - לצרף את הפלטפורמה כירורגי לטבלה אופטית באמצעות הצבה הרכבה נירוסטה ומזלג לאחר הסתעפות משועמם.
- החלת תמיסת מלח טרייה. בבאר של הלוחית האחורית להוריד עדשה טבילה במים לתוך הבאר.
- השתמש באור שמועבר או אפילייט כדי לזהות את אזור העניין והמיקוד. עבור למצב סריקת לייזר ולבצע הדמיה vivo על פי המתאים שני הפוטון לייזר הריגוש גל, dichroics ו-bandpass מסננים עבור fluorophores נוכח ברקמה6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
חלונות זכוכית מושתלים ומיקרוסקופ שני-פוטון מספק כלי שימושי להערכת שינויים דינמיים בחלבונים של המערכת. השלמות הפונקציונלית של BBB מושפעת מהביטוי, לוקליזציה תת-תאית ושיעורי תחלופה של חלבונים בעלי צומת צר7. מחקרים קודמים הוכיחו כי חלבונים הצומת צר עוברים שיפוץ מהיר ודינאמי במצב יציב8. כריתת למינציה המתואר כרגע וחלון זכוכית הכנה שימש הטרנסגניים eGFP: פרנסואז-5 עכברים9, אשר דוב פלורסנט הצומת הדוק חלבונים, כדי להעריך שיפוץ הצומת bbb צר בחיסון העצמי ניסיוני encephalomyelitis (ים) המודל של טרשת נפוצה10. בנתוני הנציג, הדמיה של eGFP: פרנסואז-5 הושגה עם מיקרוסקופ שני פוטון עם 920 ננומטר עירור, a 40 × אינפרא אדום מטרה (0.8 NA), ו מסנן פליטת זריחה ירוקה (איור 4). ערימות אופטיות נדגמו ב 2 יקרומטר שלבים צירית 100 יקרומטר מתחת לפני השטח ריר. מתארים נתונים ויזואליזציה של הצמתים בעלי תווית בעלת תוויות ברחבי מקלעת כלי הדם. פרוסות אופטיות בודדות ותמונות הקרנה Z כלולות (איור 4). התיחום הברור של מבני הצומת הדוקים ב-Z-הקרנה (איור 4B) מצביע על כך שעקירה של תמונת X-Y מינימלית מופקת לאחר כריתת למינציה מוצלחת, הצבת חלון והשתלת לוח החזרה.
איור 1. מתקן ייצוב מודפס מותאם אישית. A) צפיות בלוח החזרה האורתוגונלי . B-D) מודלים של רשת שינוי מדגמים של משטחים מאחור של הלוחית האחורית. E) מודפס כהלכה בלוח החזרה. F) מודפס באופן שגוי בלוח החזרה. ראה קבצים משלימים 1 ו- 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. צעדים כירורגיים עבור כריתת למינציה. A) isofלוריאן מערכת ההרדמה הרדמה ניצול משולבת דיגיטלי משולב כולל (i) מסך מגע להציג עבור שליטה הרדמה, (ii) שליטה מחייג, (iii) תשומות לתוספת אופציונלית על מודולים פיזיולוגיה, (iv) ריכוז הרדמה כפתור התאמה, (v) מזרק משאבת דוחס בלוק, (vi) מזרק עם isofלוריאן, (vii) משולב מאדה דיגיטלית, (viii) השראה אבובים, (ix) השראה אבובים לחדר אינדוקציה, (x) השראה קאמרית, (xi) ההשראה אבובים עבור האף קונוס, (xii) התפוגה אבובים עבור אף קונוס, (xiii) התפוגה אבובים עבור חדר אינדוקציה. ב) כלים המשמשים בניתוח למינציה כוללים (i) משוב מבוקרת יחידת חימום, (Ii) K-בשילוב בדיקה טרמומטר רקטלי, (iii) גמיש הסקה סיליקון pad, (iv) #11 להב, (v) #5 מלקחיים, (vi) שיניים טיטניום מלקחיים, (vii) טיטניום קשתית מספריים, (viii) עצם מיקרוקדוח, (ix) אקדח קאולטרי, (x) 3D מודפס backplate, (xi) כירורגי מוקצף חניתות, (xii) מגשים קרמיקה של שרף אקרילי, (xiii) שרף אקרילי ומאיץ, (xiii) רקמת הרקמה, (הארבעה) חומר סיכה אופטלמולוגי, (החמישה עשר) 3 מ"מ כיסוי זכוכית. ג) Stereomicroscope ומערכת כירורגית. במהלך הניתוח, הפלטפורמה הכירורגית יושבת על במת גלישה (בסיס עגול ושחור על במת המיקרוסקופ). D) העכבר ממוקם על פלטפורמת כירורגי מותאם אישית עם מיטה מחוממת, לאחר החתך שטחי באמצע המסילה. המחזיק מתכוונן בצירי Y ו-Z כדי להכיל עכברים קטנים וגדולים. מוטות האוזניים מייצב. את הראש ביחס לnosecone הגלימה הרקטלית. מודדת את טמפרטורת הליבה E) שדה כירורגי בשלב הסרת שרירים. F) שדה כירורגי לאחר הסרת שריר. G) תחום כירורגי במהלך דילול עצם החוליות. H) שדה כירורגי לאחר הסרת עצם החוליות. I) שדה כירורגי בזמן הצבת שמיכות. J) שדה כירורגי לאחר הצבת שמיכות. K) כירורגי שדה במהלך הציפוי הראשוני עם אקריליק. L) שדה כירורגי לאחר סיום ההשתלות האחוריות. M-N) העכבר ממוקם בתחנה כירורגית לאחר השלמת כריתת למינציה. המזלג פליז הוא מתכוונן ב-X-, Y, ו-Z צירים עבור מיקום מעל חוט השדרה באתר כריתת למינציה. המזלג מעוגן מכנית לפלטפורמה הכירורגית כדי לספק ייצוב מיטבי של תחום ההדמיה במהלך הניתוח והמטה, כולל מיקרוסקופ שני פוטון. במהלך הניתוח מותקן הפלטפורמה הכירורגית על במת דאייה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. תיאור סכמטי של מיקום אנטומי של חלון חוט השדרה. A) תיאור סכמטי של הנוף המעולה של גוף תחתון החוליות בבית החזה, תהליך spinous, ואת חוט השדרה (sc) קטע. מעגל מנוקד מתאר את מושב התהליך הארטיאני, נקודת התמיכה העיקרית להדבקה במשטח האחורי. ב) תיאור סכמטי של הנוף המעולה של חלון חוט השדרה. עמוד השדרה החוליות היעד (כאן, T12) הוסר. שכבה דקה של כיסויי שכבות. בחוט השדרה שמיכות מונחת על גבי הצמח. דבק הרקמה מוחל על התהליכים הרוחביים (ולא מוצג כאן, על התהליך האומנותי החשוף של השדרה הסמוכה, שלמה של החוליות). מלט שיניים שכבות דבק רקמה. לוחית הגב מדבקה במלט הרקמה, מונחת על התהליכים הרוחביים (מוצג) ואת התהליך הפרקולארית של השדרה הסמוכה, שלמה של החוליות (לא מוצג בלוח זה). שכבה דקה נוספת של מלט שיניים מוחל על הפנים של החישוק לאחור. לוחית הגב מתוארת בתצוגה טוחה כדי להמחיש את הזכוכית המכסה. ג) תיאור סכמטי של המראה הרוחבי של חלון חוט השדרה. עמוד השדרה החוליות היעד (כאן, T12) הוסר. שכבה דקה של כיסויי שכבות. בחוט השדרה כיסוי זכוכית מונח על גבי הצמח. דבק הרקמה מיושם על התהליך האומנותי החשוף של T11 הסמוכה, שלמים והשדרה T13 החוליות. מלט שיניים שכבות דבק רקמה. לוחית הגב מדבקה במלט הרקמה, מונחת על התהליכים הרוחביים ועל התהליך הפרקולאני של השדרה הסמוכה, החוליה הצמודה (מוצגת). לוח החזרה מתואר בתצוגה מטוחה; בתצוגה לרוחב אמיתי את הצמח ואת העטיפה-זכוכית יהיה מעורפל על ידי הקיר לרוחב של הלוח האחורית. מבנים אנטומיים מבוססים על דימות תהודה מגנטית מפורטת של עמוד השדרה C57Bl/6 שנערך על ידי הריסון ועמיתיו 11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4. מיקרומבנה הצומת הדוק דמיינו על ידי eGFP: קלאודין 5 בחוט השדרה של העכבר על ידי מיקרוסקופ שני-פוטון. A) מקטע אופטי יחיד שנלקח ב 30 יקרומטר מתחת לפני השטח ריר ב-egfp בריא: קלאודין 5 עכבר. החץ האדום מתאר את ה-eGFP: מקטע הצומת הצמוד הנמתח בניצב לאורך ציר הצומת הצר. סרגל קנה מידה מייצג 5 יקרומטר. שיבוץ: סרגל בקנה מידה מייצג 10 יקרומטר. B) Z-הטלה של רשת כלי הדם הארכת 100 יקרומטר מתחת למשטח ריר של חוט השדרה של העכבר הבריא. המחסנית האופטית דגמנה בגודל של 2 יקרומטר משלב צירית וכוללת את הפרוסה מלוח A. לא בוצעה יישור תמונה. תיחום שארפ של המבנים הjunctional בהקרנה Z מדגים הזחה מינימלית של תמונה בין מסגרות עוקבות. C) מערכת משנה ייצוגית של פרוסות אופטיות שצולמו במרווחי זמן של 10 יקרומטר ממחסנית התוצאות Z. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
קובץ משלים 1. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 2. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המתוארת כאן מאפשרת הדמיה יציבה של חוט השדרה בעכברים דרך חלון זכוכית. שיטה זו הוחל על הערכת שיפוץ BBB ב-הטרנסגניים eGFP: Claudin5 +/-עכברים המבטאים חלבון מהיר BBB הצומת צר, אבל זה יכול להיות מיושם גם היטב למחקרים של חלבונים פלורסנט או תאים בחוט השדרה.
פותחו מספר שיטות לניתוח למינציה ולייצוב חוט השדרה. כל הפרוטוקולים מייצבים את חוט השדרה במהלך הטמעת ההדמיה והחלון לגישה חזותית למבנה העניין. מספר החוליה הוסר ומידת הפולשנית של הפרוטוקולים הזמינים משתנה (לדוגמה, רכיבים המודבקים על פני עצם שטחית, כמו בפרוטוקול הנוכחי, לעומת מוטבע עמוק יותר). Davalos ו Akassoglou2 פיתחה שיטה כריתת למינציה באמצעות מלחציים נשלפים בכל צד של עמוד השדרה ומלחציים אחד בבסיס הזנב של העכבר כדי לייצב את חוט השדרה. זו אסטרטגיה חדשנית להשעות את החיה הקלה חלק העקירה החזה שנגרם על ידי התנועה של הריאות להתרחב נגד השולחן הכירורגי. כדי ליצור באר עבור המכיל נוזל טבילה לעדשה מיקרוסקופית המים הטבילה, שפת גושפנקה ג'לטין (g. gelseal) נעשה סביב חוט השדרה מילא עם acsf. השפה החותמות יכול להיות מופרת במהלך הדמיה, אבל יכול להיות גם בקלות להימחק בסוף המפגש כדי לאפשר סגירת הפצע והדמיה מחדש של החוצה. שיטה זו אומצה באופןנרחב12,13. קבוצות אחרות פיתחו שיטות ייצוב חלופיות. . פנריץ ואח ' 4 שינוי יד מוכן קליפים נייר כדרך לאבטח את עמוד השדרה. קטעי נייר שהשתנו אלה היו מאובטחים בתוך החוליות לרוחב עם דבק ציאנואקרילי ומתוחזק כנקודות אחיזה מושתלים לצמיתות עבור קליפ חיצוני נשלף ומזלג החזקת חיצוני עבור יציבות תנועה מעולה. Cupido ועמיתיו הציגו וריאציות על השיטות הנ ל עם שילוב של agarose בשכבות על חוט2,4,12. פאראר ושייפר3 פיתח מייצב מתכת מרובע שיכול לאפשר יישום של חלון זכוכית על שלוש חוליות ולא רק אחד. שיטה זו אפשרה גם חוט השדרה להיות מחובר עם ברגים מייצב גשר גדול יותר במהלך הדמיה כדי להפחית את התנועה הפוטנציאלית. מיקרוסקופ אחד פוטון מיניאטורי מושתל ישירות על חדר הדמיה כריתת למינציה גם פותחה עבור הקלטה vivo בחופשיות הזזת עכברים ברמה אחת-פוטון, אבל עדיין לא זמין לרוב מעבדות13 . בגישה אחרת, וויינגר ואח '. 1 גזור חוט השדרה כולו והוטבע אותו agarose עבור לשעבר הדמיה vivo, אשר מאפשר יציבות תנועה ללא הפסקה וגישה לחוט השדרה הגחוני, אבל האברושערים זרימת הדם. כמה מגבלות של פיתוחים אלה כוללים זמן כירורגי ממושך4, הפרעה אפשרית של השפה חותם הג2, הצורך להתאים אישית את ממדי כיסוי זכוכית כדי להתאים את האזור הרצוי של חוט השדרה4, ידני שינוי של אטבי נייר4,12, באופן יחסי פולשני טכניקות כירורגי12,14, ובועות אוויר להרכיב בעת שימוש הסיליקון אלסטורר3,4.
פיתחנו שיטה חלופית המציעה מספר יתרונות. פרוטוקול זה הותאם במיוחד כדי להקטין את משך הזמן שהושקע במהלך הניתוח. בעוד שפרוטוקולים כירורגיים מסוימים דורשים שעות הליך ארוכות יותר החל משעה וחצי4 עד שעה3; שולט פעם אחת, שיטת כריתת למינציה זו ניתן לבצע בתוך כ 30 דקות. הפחתת הזמן המושקע בניתוח עלולה להקטין את הלחץ הפיזיולוגי לעכבר ולהקל על ניסויים בתפוקה גבוהה יותר. פרוטוקול זה מסיר חוליה אחת, ומשלבת הדבקה שטחית של התקן הייצוב ההופך אותו פחות פולשני מאשר כמה פרוטוקולים דומים4,5,12,14. כמו השיטה של תאנה et al., על ידי ניצול שתל פלסטיק פרוטוקול זה מציע תאימות עם הדמיה אקוסטית5.
כדי למנוע פיזור אור (במהלך המיקרוסקופיה החיצונית) שיכול להיגרם על ידי ההבדלים בין מדדי השבירה של האוויר, המים והרקמה, רוב הפרוטוקולים כיסוי המצע שקוף אופטית מעל חוט השדרה החשופה. מצעים נפוצים כוללים טוהר גבוה, טמפרטורה נמוכה ההיתוך agarose10,12 או פולימרים סיליקון3,4,5. Agarose מציעה את היתרון של קלות השימוש, עם היווצרות בועה מינימלית, והוא מתאים להפעלות הדמיה חריפה. כדי להגן על הרקמה מפני נזקי חום, נוח לחמם את הצמח אל מעבר לנקודת התכה ולאחר מכן לאפשר לו להתקרר עד ~ 39 ° c באמבט מים במהלך הניתוח למינציה, כך שהוא יכול להיות מוכן בזמן המתאים ליישום לחוט השדרה החשוף. עבור דימות כרוני, פולימרים סיליקון עמידים יותר להתייבשות. משפטי פיילוט במהלך הפיתוח של הפרוטוקול הנוכחי הושמט או שכבת הכיסוי או המכסה, ומצאו שהאור הסוגר פיזור הפחית את העומק הזמין של הדמיה.
תכונה מבדילים של פרוטוקול זה הוא שילוב של לוח הדפסה תלת-ממדי מודפס ותומך מחזיק המזלג לאחור תומכת. לאחר כריתת למינציה והשרשה חלון, ההכנה מיוצב על-ידי תוספת של לוחית אליפסה מודפסת תלת-ממדית הקבועה במקום עם צמנט שיניים. הלוחית האחורית משרתת שתי פונקציות: ראשית, היא מספקת תמיכה מבנית וייצוב של חוט השדרה, ושנית, היא יוצרת שפתיים להחזיק נוזלים למטרות טבילה עבור מיקרוסקופ. ב-אב טיפוס של התקנה זו, נעשה שימוש בהצבות עמוד זמינים מסחרית, מתאמים ומזלגות מחזיקים; לאחרונה עברנו לחלקים מסוימים המכונה כמתואר כאן. בכל מקרה, התכונה החיונית היא לספק הקשיחות מבנית כדי לייצב את שדה ההדמיה נגד רטבאליות בחלל והזמן המושרה על ידי פעימות לב ונשימה. למרות שהגוף של בעל החיים נח באופן רופף על כרית החימום, חוט השדרה ותחום ההדמיה שלו מושעה מעט מן המזלג המחזיק, אשר גם מקטין את התזוזה בדרכי הנשימה. המצע פלסטיק מציע גמישות קלה כדי להתאים את המתח מתוך התעסקות למחזיק הצלחת. צבע הפלסטיק השחור המשמש להדפסה משקף אור מינימלי לשדה הזריחה. באמצעות שיטות אלה, אנו מייצרים בהצלחה ערימות של תמונות שניתן להשתמש בהן ללא התאמת יישור אד הוק . יתרה מזאת, לוח החזרה התלת-ממדי שמתואר בזאת הוא זול להפקת, עולה רק פרוטות בחומר עבור כל הדפסה, לאחר שרכשת את המדפסת. יתרה מזאת, העלויות של מדפסות תלת-ממד נפלו בשנים האחרונות. 3D המודפס מודפס קבצים מבניים (ראה קבצים משלימים 1 ו- 2) פורסם עם פרוטוקול זה ניתן לשנות בקלות כדי להתאים את צורכי המעבדה האישית. עיצבנו את המימד הארוך של הלוחית האחורית כדי להתאים את המרחב הבין-חולייתי שנוצר על ידי הסרת החזה של השדרה 12 החוליות, אשר overlies 2/3 המותני מקטעים חוט השדרה11. כדי להחיל טכניקה זו על מקטע שונה בחוליות, ניתן לשנות את קבצי ה-CAD הנלווים.
פרוטוקול זה מנצל מסחרי זמין מסחרית זרימה נמוכה מערכת הרדמה הפורס מכשיר משולב דיגיטלי הזרקה ישירה כחלופה המסורתי מאדה פסיבית. התכונה העיקרית של יחידת הזרימה הנמוכה היא החשיפה של המפעיל הנמוך ביותר ל-isofלאנה, הטבה בריאותית משמעותית. יחידת ההרדמה בעלת זרימה נמוכה מציעה גם חיסכון בעלויות בשל צריכת מופחתת של isof, הניצול של אוויר החדר במקום גז דחוס. במחקר הנוכחי, 2% isof, המועבר על ידי מכשיר דיגיטלי משולב ב 150 mL/min, יחד עם תמיכה תרמית משוב מבוקר, השיגו מטוס יציב של הרדמה ותחזוקה הולמת של טמפרטורת הגוף ליבה. בהתאם לזה, השוואות שפורסמו של משולב דיגיטלי משולבים ומסורתיים המסורתית הגיעו גם למסקנה כי מכשיר דיגיטלי משולב אידוי מטוס יציב של הרדמה ושימור טוב של טמפרטורת הגוף הליבה, קצב הלב, שיעור הנשימה וההתאוששות בזמן ניצול פחות של15,16.
תרופה שאינה סטרואידיות אנטי דלקתית (NSAID) כגון carprofen יכול להיות מנוהל טרום הניתוח כמו כאבים משלימים. במהלך מספר שעות, NSAIDs מעכבים שעתוק ציטוקין דלקתית ובצקת ביניים; ניהול מרובה ימים מחליש את חומרת מחלות נוירודלקתיות כולל encephalomyelitis אוטואימוניות ניסיוני, מודל בעל חיים של טרשת נפוצה17,18. במיוחד במחקר של מחלות נוירודלקתיות, את ההשפעות היעילות של כאבים carprofen sia חייב להיות שוקלת בזהירות נגד המחלה שינוי השפעות בעת קביעת כאבים והרדמה לניסוי בתיאום צמוד עם לוחות הרגולציה המתאימים.
הגבלה של שיטה זו היא שלא קל לחזור על הפעלות הדמיה חוזרות ונשנות בימים מרובים. הסיבה העיקרית היא כי מבנה לוחית הגיבוי גדול מדי כדי לסגור את העור מעל. לכן, יש סיכון כי העכבר היה להוציא את הלוח לאחור על התעוררות מן ההרדמה. אם הדמיה חוזרת הייתה חיונית, קיימות מספר אסטרטגיות שניתן לפרוס, כולל הפחתת גודל הלוחית האחורית, או שינוי הטעינה. כמו בכל הליך כירורגי, יש עקומת למידה עבור אופרטורים. יש צורך בתיאום צמוד עם משרדי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ולוחות סקירה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
S.E. לוץ נתמך על ידי המרכז הלאומי לקידום המדעים הטרנסלאומיים, המכון הלאומי לבריאות, תחת גרנט KL2TR002002 ואוניברסיטת אילינוי שיקגו המכללה להתחלת הרפואה. סיימון Alford נתמך על ידי RO1 MH084874. התוכן הוא רק באחריות המחברים ואינו מייצג בהכרח את ההשקפות הרשמיות של ה-NIH. המחברים מודים לdritan Agalliu במחלקה לנוירולוגיה במרכז הרפואי של אוניברסיטת קולומביה, עבור העכברים Tg-5, הידברות המדעית והתובנות לגבי פיתוח הפרוטוקול הכירורגי ויישומי ההדמיה. המחברים מודים סוניל P. גנדי במחלקה לנוירוביולוגיה והתנהגות באוניברסיטת קליפורניה, אירווין לעיצוב האבטיפוס הראשון של מנגנון הסטריאוטקטיקה ובקר בעלי החיים, דיון בפרוטוקול הכירורגי ו אימונים. במיקרוסקופיה של שתי פוטון המחברים גם מודים לסטיב פיקנס (Nuhsbaum, Inc) לקבלת סיוע בהתאמה אישית של stereomicroscope כירורגי, רון ליפסקי (ייצור לוויתן) לעיבוד חלקי סטריאוטקטיקה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Raise3D | Pro2 | For printing backplates |
| PLA 3D printing filament | Inland | PLA+-175-B | Black plastic 3D printing material |
| 3D CAD software | Dassault Systemes | Solidworks software | used to design 3D shapes |
| 3D printer software | Raise3D | Ideamaker software | software used to interface with the 3D printer |
| 3D printed oval backplate | custom | Stabilizing imaging field | |
| Surgical dissecting microscope | Leica | M205 C | Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage |
| Microscope camera | Leica | MC170 | HD color camera for visualizing surgical field |
| Gliding stage | Leica | 10446301 | The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement. |
| Surgical station and stabilization fork | Whale Manufactoring | custom | Laminectomy |
| SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit | Kent Scientific | SS-01 | Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer |
| Stainless steel 1.5 inch mounting post | ThorLabs | P50/M | For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging |
| Counterbored Clamping Fork for 1.5" mounting Post | ThorLabs | PF175 | For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging |
| Ideal bone microdrill | Harvard apparatus | 72-6065 | Thinning bone for laminectomy |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | Warming saline |
| Cautery gun | FST | 18010-00 | Cauterizing minor bleeds |
| Heating pad | Benchmark | BF11222 | 1.9” x 4.5” silicone heater with 20” Teflon leads, 10W, 5V |
| K type thermocoupled rectal probe | Physitemp | RET3 | Measuring mouse body temperature |
| petroleum jelly | Sigma | 8009-03-8 | Lubricating rectal probe |
| Feedback-regulated thermal controller | custom | NA | Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series |
| PVA Surgical eye spears | Beaver-visitec international | 40400-8 | Absorbing blood |
| Electric trimmer | Wahl | 41590-0438 | Trimming mouse fur |
| Blade, #11 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Forceps, #5 | FST | 11254-20 | Surgical tool |
| Forceps, #4 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Titatnium toothed forceps | WPI | 555047FT | Surgical tool |
| Titanium Iris scissors | WPI | 555562S | Surgical tool |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 084-1469SB | Preparing tissue surface for dental acrylic |
| Ceramic mixing tray | Jack Richeson | 420716 | Mixing dental acrylic agent with accelerant |
| Orthojet dental acrylic | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | Permanently bonding backplate to tissue |
| Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm | Harvard apparatus | 64-0720 | optical window |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | For aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | For aCSF |
| Glucose | Fisher Scientific | 50-99-7 | For aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | For aCSF |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | For aCSF |
| CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | For aCSF |
| Carprofen | Rimadyl | QM01AE91 | Analgesia |
| Bacteriostatic water | Henry Schein | 2587428 | Diluent for carprofen |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-6776-2 | Anesthesia |
| Lactated ringer solution | Baxter | 0338-0117-04 | Hydration for mouse |
| Agarose High EEO | Sigma | A9793 | gel point 34-37 degrees C |
| Opthalmic lubricating ointment | Akwa Tears | 68788-0697 | Prevent corneal drying |
| MOM Two-Photon Microscope | Sutter |
References
- Weinger, J. G., et al. Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).
- Farrar, M. J., Schaffer, C. B. A procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. (82), e50826 (2013).
- Figley, S. A., et al. A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model. PLOS ONE. 8 (3), e58081 (2013).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135 (3), 311-336 (2018).
- Shen, L., Weber, C. R., Turner, J. R. The tight junction protein complex undergoes rapid and continuous molecular remodeling at steady state. Journal of Cell Biology. 181 (4), 683-695 (2008).
- Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82, 1-15 (2014).
- Lutz, S. E., et al. Caveolin1 Is Required for Th1 Cell Infiltration, but Not Tight Junction Remodeling, at the Blood-Brain Barrier in Autoimmune Neuroinflammation. Cell Reports. 21 (8), 2104-2117 (2017).
- Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. Neuroimage. 68, 22-29 (2013).
- Cupido, A., Catalin, B., Steffens, H., Kirchhoff, F. Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue. Bakota, L., Brandt, R. , Springer. New York. 37-50 (2014).
- Sekiguchi, K. J., et al. Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice. Nature Communications. 7, 11450 (2016).
- Nadrigny, F., Le Meur, K., Schomburg, E. D., Safavi-Abbasi, S., Dibaj, P. Two-photon laser-scanning microscopy for single and repetitive imaging of dorsal and lateral spinal white matter in vivo. Physiological Research. 66 (3), 531-537 (2017).
- Adelsperger, A. R., Bigiarelli-Nogas, K. J., Toore, I., Goergen, C. J. Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Damen, F. W., Adelsperger, A. R., Wilson, K. E., Goergen, C. J. Comparison of Traditional and Integrated Digital Anesthetic Vaporizers. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 756-762 (2015).
- Miyamoto, K., et al. Selective COX-2 inhibitor celecoxib prevents experimental autoimmune encephalomyelitis through COX-2-independent pathway. Brain. 129 (Pt 8), 1984-1992 (2006).
- Muthian, G., et al. COX-2 inhibitors modulate IL-12 signaling through JAK-STAT pathway leading to Th1 response in experimental allergic encephalomyelitis. Journal of Clinical Immunology. 26 (1), 73-85 (2006).
