Summary
Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la integridad de barrera Hematotesticular inyectando inulina-FITC en los testículos. Este es un método eficiente en vivo para el estudio de integridad de barrera Hematotesticular que puede estar comprometida por elementos genéticos y ambientales.
Abstract
Espermatogénesis es el desarrollo de espermatogonias en espermatozoides maduros en los túbulos seminíferos de los testículos. Este proceso es apoyado por las ensambladuras de la célula de Sertoli en la barrera del sangre-testis (BTB), que es la barrera de tejido más apretada en el cuerpo mamífero y segrega el epitelio seminífero en dos compartimentos, una basal y adluminal un. La BTB crea un microambiente único de las células germinales en la meiosis I / II y para el desarrollo de postmeiotic espermátides en espermatozoides por medio de la espermiogénesis. Aquí, describimos un análisis confiable para monitorear la integridad BTB de testículo de ratón en vivo. Un BTB intacto bloquea la difusión de la inulina FITC conjugado desde la basal en el compartimento apical de los túbulos seminíferos. Esta técnica es adecuada para el estudio de candidatos de genes, virus o tóxicos ambientales que pueden afectar la función BTB o integridad, con un procedimiento fácil y un requisito mínimo de habilidades quirúrgicas en comparación con métodos alternativos.
Introduction
Espermatogénesis mamíferos se consideran un proceso altamente estructurado que comprende espermatogonias de auto renovación y diferenciación a espermatocitos en espermatozoides haploides por mitosis, meiosis y espermiogénesis, que dramático ocurren cambios bioquímicos y morfológicos. Células germinales en desarrollo progresivamente son transportadas desde la base de los túbulos seminíferos hacia el lumen. Este proceso está regulado por los contactos de la célula entre las células germinales y células de Sertoli1,2. Las células de Sertoli adyacentes forman la BTB se encuentra cerca de la base del túbulo seminífero. La BTB físicamente divide el epitelio en un básico y un compartimento adluminal. Durante las etapas VIII - IX del ciclo epitelial, espermatocitos preleptotene/leptoteno de los compartimentos basals migran a través de la BTB, entrar en los compartimientos adluminal del3. Por lo tanto, la función de la BTB es proporcionar un microambiente de immunoprivileged para la terminación de la meiosis y espermiogénesis4,5,6. A diferencia de otras sangre-tejido barreras (e.g., barrera blood - brain) que se componen sólo de uniones estrechas (TJs), el BTB está formado por cuatro diferentes cruces (TJs, especializaciones ectoplasmáticos, ensambladuras de gap y base de filamento intermedio desmosomas) entre el Sertoli de células1,7.
Muchos estudios han utilizado ratones modificados genéticamente, infecciones por virus y sustancias tóxicas ambientales para investigar mecanismos de BTB integridad7,8,9. La interrupción de la BTB induce la espermatogénesis deteriorada y subfertilidad o infertilidad. Puesto que la formación de la BTB y la integridad han sido confirmados para ser afectado por los contactos entre las células de Sertoli8, un modelo en vitro basado en cultivo primario de células de Sertoli aisladas se ha utilizado para el estudio BTB. Sin embargo, este modelo no puede imitar exactamente BTB dinámica en vivo. Por otra parte, esa cultura no Co de las células germinales con las células de Sertoli se ha establecido como capaz de reflejar todos los componentes estructurales y funcionales relevantes de la BTB10,11.
En general, en vivo ensayos de integridad BTB se basan normalmente en moléculas pequeñas, como EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotina y conjugados con FITC inulina (inulina-FITC). Normalmente, la difusión de la biotina o inulina-FITC desde el compartimiento basal es bloqueada por estructura BTB. Por lo tanto, somos capaces de utilizar este método para evaluar la magnitud del daño de la BTB en comparación con grupos control. Mientras que TBB puede verse comprometida con ciertos tipos de estímulos, tales como el tratamiento con cadmio cloruro (CdCl2)12, BTB se convierte en accesible a moléculas pequeñas, que finalmente entran en el compartimento adluminal como indicadores.
Un temprano en vivo TBB integridad ensayo implica la inyección de biotina o inulina-FITC en la vena yugular, que consiste en una cirugía y es invasiva, complicado y desperdiciador de tiempo. Además, como las sustancias reportero difunden a través de todo el cuerpo vía la circulación, la concentración local de biotina o inulina-FITC en los túbulos seminíferos es limitada. Por otra parte, la exposición sistémica puede inducir reacciones inmunes. Aquí, presentamos un sencillo y eficaz en vivo TBB integridad ensayo que permite la inyección directa de una pequeña alícuota de inulina-FITC en el intersticio de un testículo. Usando el fluorescente etiquetado método, el proceso de tinción es conveniente, como anticuerpos secundarios no son necesarios. Aquí, se visualiza el proceso de colorante fluorescente en el testículo.
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Protocol
Todos los experimentos con animales realizados han sido aprobados por el Comité de la Universidad médica de Nanjing. Ratones machos C57BL/6 fueron mantenidos bajo condiciones de fotoperíodo controlado y proveyeron de alimentos y agua.
1. preparaciones
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Capilares de microinyección
- Utilice capilares de microinyección con un diámetro externo, diámetro interno y longitud de 1.0 mm, 0,8 mm y 10,0 cm, respectivamente.
- Tire los capilares de vidrio con un capilar extractor (figura 1A). Prueba y ajuste la configuración según la máquina extractor capilar que está siendo utilizado.
- Romper las puntas de pipetas con pinzas a utilizar para obtener los capilares de un diámetro de 50 μm en la punta.
Nota: Las puntas pueden ser demasiado largas para penetrar los testículos. - Afilar la punta en un ángulo de 30° usando un beveler micropipeta (figura 1).
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Reactivos
- Preparar 1% pentobarbital sódico: disolver sodio pentobarbital 100 mg en 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (paso 2.3.3).
- Preparar la inulina-FITC de 10 mg/mL: disolver 1 mg en 100 μL de PBS (paso 2.1.6) inulina-FITC.
- Preparación de paraformaldehído al 4%: disolver paraformaldehido (PFA) 4 g en 100 mL de PBS (paso 2.3.3).
- Preparar 30% sacarosa: sacarosa 3 g en 10 mL de PBS (paso 2.3.4) se disuelven.
- Preparación de cloruro de cadmio 0.1%: disolver 10 mg en 10 mL de PBS (paso 2.1.1) de cloruro de cadmio.
2. métodos
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Preparación anestesia y PREQUIRGICA
- Pesar de ratones machos de 8 semanas de edad C57BL/6 y calcular la dosis necesaria de CdCl2. Tratar un grupo de ratones (n = 3) con CdCl2 (5 mg/kg p.v., i.p.) durante 3 días antes de la cirugía. Tratar a otro grupo de ratones machos de 8 semanas de edad C57BL/6 (n = 3) con PBS como control.
- Realizar cirugía en condiciones asépticas mediante pinzas, aguja, tijeras y jeringa estéril.
- Preparar la solución de trabajo de anestesia recién. La dosis requerida de la anestesia es de 70 mg de pentobarbital de sodio/kg de peso corporal. En promedio, un adulto ratón C57BL/6 a 8 semanas de edad pesa ~ 25 g, que corresponde a 175 μL de 1% pentobarbital sódico (1,75 mg por ratón).
Nota: El pentobarbital sódico se disuelve en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS). La solución es filtrada por 0.22 um unidad de filtro antes de ser utilizados. - Limpiar la zona para la cirugía con etanol al 75% y cubrir la zona con una toalla de papel limpia.
- Encienda el calentador termostático y ajustar la temperatura a 37 ° C.
- Preparar solución de trabajo de inulina-FITC (10 mg/mL) en el día de la cirugía.
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Procedimiento quirúrgico
- Pesar de ratones machos de 8 semanas de edad C57BL/6 y calcular la dosis requerida de la anestesia.
- Realizar una inyección intraperitoneal de pentobarbital de sodio utilizando la jeringa estéril de 1 mL. Mantenga el ratón en una jaula limpia.
- Observar la respuesta refleja del ojo y patrón de respiración del ratón para confirmar que está bajo anestesia completa.
Nota: Generalmente, 10-15 min se necesitan hasta que el ratón está profundamente anestesiado, con una total falta de respuesta de pellizco del dedo del pie y el mantenimiento de la respiración lenta y constante. - Mueva el ratón a la zona de operación y cubrir la zona de los ojos con un papel de seda húmedo para evitar la sequedad durante la anestesia (figura 2A).
- Afeite su pelo abdominal con una afeitadora y desinfectar el área quirúrgica con etanol al 75%.
- Con unas tijeras afiladas, hacer una incisión en la piel de 1 cm por encima de las glándulas prepuciales para exponer la pared abdominal. Elevar la pared abdominal con pinzas pequeñas y haga una incisión de 0.5 cm para exponer la cavidad peritoneal (figura 2B).
- Utilice pinzas para buscar cojines gordos todo el epidídimo y testículo. Saque con cuidado las almohadillas de grasa para exponer claramente los testículos adjunto (figura 2 y 2D). Por lo general, operan sobre un testículo a la vez.
Nota: Evite tocar las almohadillas de grasa y testículos con las manos. - Coloca un papel (9 cm de diámetro) debajo de los cojines gordos y testículo (figura 2).
- Inyectar inulina-FITC en una pipeta de microinyección y conéctelo a la unidad de instrumental quirúrgico (figura 1). Suavemente inserte la pipeta de microinyección en la túnica albugínea y cargar un total de 20 μL de inulina-FITC en el intersticio del testículo (Figura 2E y 2F).
Nota: Presione con cuidado la pipeta de microinyección para evitar moverlo. - Vigilar el movimiento de inulina-FITC en los testículos (figura 2).
- Inmediatamente Coloque los testículos en la cavidad abdominal después de la terminación de la inyección.
- Repita el procedimiento en el testículo contralateral. Este testículo se inyecta con 20 μL de PBS como un control.
- Cierre la piel con una sutura quirúrgica y mueva el ratón a una almohadilla de calor de un calentador termostático (figura 1B). Administrar una dosis de 1 mg de analgésicos (buprenorfina) por 1 kg de peso corporal vía inyección subcutánea.
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Recolección de los testículos y la preparación de secciones congeladas
- 40 minutos después de la inyección, eutanasia el ratón receptor mediante dislocación cervical según el cuidado de los animales y utilizar las pautas.
- Utilice un par de tijeras afiladas para recoger los testículos. Coloque 1 mL de PBS helada para quitar cualquier contaminación de la sangre a los testículos.
- Fijar los testículos en paraformaldehído al 4% (PFA) a 4 ° C durante 12-24 h. descartar el 4% PFA y lavado del tejido 3 x 1,5 ml de PBS 1% a temperatura ambiente.
- Deshidratar los tejidos en sacarosa al 30% durante la noche. Poner los testículos en el marco de la inclusión y cubrir el tejido con la temperatura óptima de corte compuesto (OCT). Después del OCT se congela, llene el marco de la inclusión de OCT para que el testículo entero puede ser cubierto con OCT.
- Corte secciones de 5 μm de espesor, congeladas de los testículos en un criostato a-20 ° C y que se adhieren al portaobjetos de microscopio.
Nota: Volver a congelar tejidos embebidos en el hielo seco puede aumentar la rigidez para el corte.
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Requisición de imagen
- Coloque los portaobjetos en una caja humidificada. Caliente las diapositivas en temperatura ambiente durante 10 minutos.
- Lávese las secciones de 3 x con solución salina tamponada con Tris (TBS) a temperatura ambiente.
- Secado con aire por 5 min en la oscuridad. Limpie cualquier residual TBS con papel libre de polvo.
- Cubrir las secciones transversales con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Coloque el cubreobjetos invertido sobre un portaobjetos de microscopio.
- Adquisición de imágenes mediante un microscopio confocal. Un total de 20 aumentos es suficiente para la detección de la señal fluorescente brillante.
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Representative Results
El montaje experimental para realizar el análisis de integridad BTB se muestra en la figura 1. Tire y afilar los capilares de la microinyección con tirador capilar y beveler micropipeta, respectivamente (figura 1A y 1C). El calentador termostático y equipo para la microinyección se ilustran en la figura 1B y 1D.
La figura 2 muestra algunos de los pasos claves para la inyección de inulina-FITC. Utilice tijeras para hacer una pequeña incisión después de que el ratón ha experimentado anestesia completa (figura 2A y 2B). El testículo de ratón expuesto e inyectó colorante fluorescente con una pipeta de microinyección (figura 2 - 2 G).
Figura 3 muestra las imágenes típicas de un estudio para evaluar la integridad BTB basada en un ensayo en vivo . Los ratones en el CdCl2-grupo de tratamiento se inyectan con una dosis aguda de CdCl2 (5 mg/kg p.v., i.p.) por 3 días. La difusión de la inulina-FITC desde el compartimiento basal es bloqueada por estructura BTB en el grupo control, mientras que la construcción de la BTB es dañada y pasajes de inulina (fluorescencia verde) en el compartimento apical del epitelio seminífero en el CdCl2 -grupo de tratamiento. Segmentos de línea blanca indican la distancia recorrida por la inulina de la membrana basal (Figura 3A). La magnitud del daño de la BTB es determinada por la distancia. Para una luz elíptica, el radio es el medio de la más corta y la larga distancia del compartimiento basal al centro del túbulo. Utilizamos tal cociente como índice de la magnitud de los daños de la TBB:
Aquí, D lainulina es la distancia recorrida por la inulina del compartimiento basal y Dradio es el radio del mismo túbulo seminífero (figura 3B). La BTB intacto en Powderfl / + ratones bloquea la difusión de la inulina a través de la barrera para entrar en el compartimento apical. En cambio, Powdercko ratones tienen un BTB comprometida permitiendo la difusión de la inulina (figura 3).
Figura 1: equipo de microinyección intersticial testicular ratón. (A) Tire de vidrio capilares con un tirador vertical capilar. ()B) este panel muestra el calentador termostático. (C) las puntas se afilan utilizando el beveler micropipeta. (D) la unidad de microinyección incluye una bomba de microinyección y un microscopio estéreo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes representativas de un procedimiento de microinyección intersticial testicular en vivo en un ratón. (A) este panel muestra el retiro del pelo abdominal por una máquina de afeitar. (B) este panel muestra la incisión de 0.5 cm de la pared abdominal para exponer la cavidad peritoneal. (C) tirar la grasa pastillas exponer claramente los testículos adjuntos. (D) este panel muestra la posición de los testículos y el epidídimo. (E) este panel muestra la posición de la pipeta de microinyección. (F) introducir la pipeta de microinyección en el intersticio del testículo. (G) este panel muestra un testículo con una inyección exitosa en el intersticio del testículo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Un estudio para evaluar la integridad de la BTB basado en un análisis funcional en vivo . Ratones machos adultos (n = 3 en el grupo de tratamiento y el grupo de control) son tratados con CdCl2 (5 mg/kg p.v., i.p.) por 3 días (grupo de tratamiento) o tratamiento con PBS durante 3 días (grupo control). Inulina-FITC (fluorescencia verde) está situado cerca de la base del túbulo seminífero en el grupo control, mientras que la inulina-FITC inicia un pasaje a través de la BTB en el grupo de tratamiento CdCl2. (A) en este panel, segmentos de línea blanca indican la distancia inulina-FITC invade. Las barras de escala son 20 μm. (B) los datos de los ensayos de integridad BTB se muestran en este histograma que muestra la distancia recorrida por la inulina (Dinulina) vs el radio del mismo túbulo (Dradio). Ochenta los túbulos se seleccionan aleatoriamente. P < 0,001 (de Student t-test). (C) la BTB integridad está comprometida en testículos de ratones Powdercko . En los túbulos de ratón Powdercko , la inulina penetra profundamente en el epitelio seminífero, llegar a la luz del túbulo. Las barras de escala son 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Espermatogénesis tiene lugar en el epitelio seminífero y es un proceso altamente ordenado y dinámico que está regido por las células germinales y células somáticas (p. ej., las células de Sertoli)13. La estructura de la BTB, que está construida por células de Sertoli, divide el epitelio seminífero en un básico y un compartimiento apical. El desarrollo de las células germinales meióticas y haploides se produce en el compartimento apical que forma una barrera inmunológica14.
La función BTB puede verse afectada por sustancias tóxicas o por defectos en genes implicados en la formación de uniones celulares, conduciendo a la infertilidad masculina. Para examinar la integridad de la BTB, una en vitro Sertoli Sistema del cultivo celular se ha establecido que es capaz del epitelio funcional formación cerca imita la BTB en vivo15. Este sistema in vitro proporciona un modelo simple para estudiar la estructura y función de las ensambladuras de la célula de Sertoli. Sin embargo, aislaron de las células de Sertoli del testículo y cultivadas en vitro son limitados con respecto a animales edad y celular densidad15,16. Además, la pureza de las células de Sertoli y la presencia de ultraestructuras mímico funciones TBB deben ser monitoreado17. Más importante, integridad y estructura BTB también requieren interacciones entre células germinales y células de Sertoli, como evidencia de los estudios de germen-célula-específico ratones mutantes nulos con BTB defectos10,18,19. Por lo tanto, crear un cocultivo de las células germinales con Sertoli células in vitro para el propósito de recapitular todos crucial en vivo la función de la TBB sigue siendo un reto11,20.
Este protocolo describe un método de evaluación de integridad BTB en vivo inyectando inulina-FITC, que fue modificado de un procedimiento por Chen et al. 21. el protocolo describe la anestesia de ratones machos, la exposición de la cavidad peritoneal, la microinyección de contraste en el intersticio de los testículos, los testículos de cosecha y corte en secciones congeladas y la adquisición de imágenes. Para un buen fin, cabe señalar varios pasos. En primer lugar, es importante usar una dosis adecuada de anestesia, porque anestesia muy profunda puede causar la muerte. También, la longitud de la punta de la inyección capilar no debe ser demasiado larga; de lo contrario, la pipeta no puede penetrar el testículo.
El procedimiento aquí presentado puede ser utilizado para analizar el papel de virus, sustancias químicas tóxicas o candidato proteínas involucradas en la regulación de la TBB. Este ensayo es sensible, confiable y accesible para monitorear la integridad BTB en vivo.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por la nacional clave de R & D programa de China (2016YFA0500902), el nacional Ciencias naturales Fundación de China (31471228, 31771653), la Fundación de ciencia de Jiangsu para jóvenes distinguidos eruditos (BK20150047), la Ciencia Natural Fundación de la provincia de Jiangsu (BK20140897, 14KJA180005) y el programa de innovador y emprendedor de la provincia de Jiangsu a K.Z.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capillary puller | SUTTER INSTRUMENT (USA) | P-97 | |
| 10x PBS | Hyclone (USA) | SH30258.01 | dilution to 1× in ddH2O |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma (USA) | F6057 | |
| Adhesion microscope slides | CITOGLAS (China) | 80312-3161 | |
| Cadmium chloride | Sigma (USA) | 655198-5G | |
| Confocal microscope | Zeiss (Germany) | LSM700 | |
| Dust-free paper | Kimberly-Clark (USA) | 34120 | |
| Inulin-FITC | Sigma (USA) | F3272 | |
| Microinjection capillaries | Zhengtianyi (China) | BJ-40 | 1.0 mm × 0.8 mm × 100 mm |
| Micropipette beveler | NARISHIGE (JAPAN) | EG-400 | |
| OCT | SAKURA (JAPAN) | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma (USA) | P6148 | |
| Pentobarbital sodium | Merck (Germany) | P11011 | |
| Shaver | Yashen (China) | ||
| Stereo microscope | Nikon (JAPAN) | SMZ1000 | |
| Sucrose | Sangon Biotech (China) | A610498 | |
| Surgical instruments | Stronger (China) | scissors, forceps, needle holder | |
| Syringe | KDL (China) | 20163150518 | 0.45 mm × 0.16 mm RW LB |
| thermostatic heater | KELL (Nanjing, China) | KEL-2010 | |
| 10x TBS, pH 7.6 | |||
| 0.2 M Tris | Sangon Biotech (China) | A600194 | |
| 1.37 M Nacl | Sangon Biotech (China) | A610476 |
References
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