Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

מודל העובר דג זברה, ויזואליזציה Vivo, ניתוח Intravital של Biomaterial-הקשורים Staphylococcus aureus זיהום

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58523
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 2,3, 4, 1
1Department of Medical Microbiology, Amsterdam UMC, 2Technical Medical Center, Department of Biomaterials Science and Technology, University of Twente, 3Department of Biomedical Engineering, W.J. Kolff Institute, University Medical Center Groningen, University of Groningen, 4Institute of Biology, Leiden University

Summary

המחקר הנוכחי מתאר מודל העובר דג זברה ויזואליזציה ויוו וניתוח intravital לזיהום הקשורים biomaterial לאורך זמן מבוסס על קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. מודל זה היא מערכת מבטיח משלימים מודלים בעלי חיים יונקים כגון עכבר מודלים לימוד הקשורים biomaterial זיהומים ויוו.

Abstract

זיהום הקשורים biomaterial (באי) הוא מהווה גורם מרכזי בכישלון biomaterials/רפואי התקנים. Staphylococcus aureus הוא אחד פתוגנים העיקריים בבאי. הנוכחי ניסיוני באי חיה בתרבית של מודלים כגון עכבר הדוגמניות יקר זמן רב, ולכן לא מתאים לניתוח תפוקה גבוהה. לפיכך, מודלים חדשניים כמערכות משלימים עבור חוקרים באי ויוו הם הרצויה. בהווה לומדים, כיוונו לפתח מודל העובר דג זברה ויזואליזציה ויוו וניתוח intravital של זיהום חיידקי בנוכחות biomaterials מבוסס על קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. בנוסף, התגובה מקרופאג שעורר נחקר. למטרה זו, אנו להביע חלבון פלואורסצנטי S. aureus ו דג זברה מהונדס עוברי המבטאים חלבונים פלורסנט ב מקרופאגים שלהם ופיתח הליך להחדיר חיידקים לבד או יחד עם microspheres לתוך השריר רקמות העובר. כדי לפקח על התקדמות זיהום חיידקי העוברים לחיות לאורך זמן, אנחנו המציאו שיטה פשוטה אך אמין של הניקוד מיקרוסקופיים של חיידקים פלורסנט. התוצאות ניקוד מיקרוסקופיים הראו כי כל העוברים עם יותר מ-20 המושבה יוצרי יחידות (CFU) של חיידקים הניב אות ניאון חיובית של חיידקים. במחקר השפעת פוטנציאל biomaterials על זיהום, קבענו המספרים CFU של S. aureus עם ובלי microspheres 10 מיקרומטר פוליסטירן (נ. ב10) בתור מודל biomaterials ב העוברים. יתר על כן, השתמשנו קובץ פרוייקט ObjectJ "דג זברה-Immunotest" הפועלים ImageJ לכמת את עוצמת קרינה פלואורסצנטית זיהום S. aureus עם ובלי PS10 לאורך זמן. תוצאות של שתי השיטות הראו מספר גבוה יותר של S. aureus עוברי נגועים עם microspheres מאשר בעוברי ללא microspheres, המציין את הרגישות של זיהום מוגבר בנוכחות biomaterial. לפיכך, המחקר הנוכחי מראה את הפוטנציאל של המודל העובר דג זברה ללמוד באי עם השיטות התפתחו כאן.

Introduction

מגוון רחב של מכשירים רפואיים (המכונה "biomaterials") משמשים יותר ויותר ברפואה המודרנית לשחזר או להחליף את גוף האדם חלקים1. עם זאת, ההשתלה של biomaterials predisposes מטופל זיהום, בשם הקשורים biomaterial זיהום (באי), אשר אחד הסיבוכים העיקריים של שתלים בניתוח. Staphylococcus aureus סטפילוקוקוס epidermidis שתי הנפוצות ביותר מיני החיידקים אחראי באי2,3,4,5,6בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. מושתלים biomaterials טופס משטח ביופילמים חיידקים רגישים. יתר על כן, תגובה חיסונית מקומית עשויה להיות מופרע על ידי biomaterials מושתל, גורם היעילות מופחתת של חיסול חיידקים סיווג ראשוני של הדבקה חיידקים מתבצע בעיקר על ידי הסתננות נויטרופילים, אשר בתוקף מופחתת קיבולת אחרים בנוכחות שנוסף או מושתל biomaterial7. יתר על כן, מקרופאגים שחדר הרקמה אחרי זרם הראשונית של נויטרופילים phagocytose את החיידקים הנותרים אבל לא יעיל להרוג אותם intracellularly, עקב מטורף החיסונית איתות כי הוא תוצאה של המצאות משולב biomaterial וחיידקים8. לכן, הנוכחות של biomaterials יכול להקל על תאיים הישרדות של חיידקים9,10,11,12,13 biofilm היווצרות על מושתל 4,biomaterials14. כתוצאה מכך, באי עשוי להוביל לכשל, זקוק להחלפה של מושתל biomaterials, גורם תחלואה מוגברת ואת התמותה, אשפוז ממושך עם עלויות נוספות2,15.

מספר גדל והולך של אנטי-באי אסטרטגיות מתבצעת מפותחת2,16,17. In vivo הערכת יעילות של אסטרטגיות אלו הרלוונטיים במודלים של בעלי חיים היא חיונית. אולם, מסורתי באי בעלי חיים ניסיוניות (למשל, העכבר דגמים) הם בדרך כלל יקרים, זמן רב, ולכן לא מתאים לבדיקה תפוקה גבוהה של אסטרטגיות מרובות18. התפתחות של ביו-אופטיים טכניקות הדמיה המבוססת על זוהרים/פלורסנט תיוג של התאים המארחים וחיידקים עשוי לאפשר לניטור רציף של האינטראקציות התקדמות, המארח-פתוגן/מארח-חומר באי בודד חיות קטנות כגון עכברים18,19,20,21. עם זאת, טכניקה זו מורכבות יחסית עדיין בחיתוליו, ויש מספר בעיות שמחייבות לניתוח כמותי של באי18. למשל, מנה האתגר גבוהה נדרשת כדי להמחיש מושבת חיידקים. בנוסף, אור פיזור, ספיחה של אותות ביולומינסנציה/זריחה ברקמות של מבחן בתרבית של בעלי חיים צריך להיות גם התייחס18,19,21. לכן, חדשנית, חסכונית מודלים בעלי חיים המאפשר ויזואליזציה intravital וניתוח כמותי לאורך זמן הן מערכות משלימות יקר ללמוד באי ויוו.

דג זברה (עוברי) שימשו ככלי ויוו רב-תכליתי ניקוד אינטראקציות פתוגן-פונדקאי, זיהום בפתוגנזה של מספר מינים חיידקי mycobacteria22, Pseudomonas aeruginosa23, Escherichia coli26,24, Enterococcus faecalis25ו- staphylococci27. דג זברה עוברי יש יתרונות רבים כגון שקיפות אופטית, עלות תחזוקה נמוכה יחסית וכן אחזקת מערכת חיסונית דומה מאוד לזו יונקים28,29. זה הופך את העוברים דג זברה אורגניזם מודל כלכלי מאוד, חי ויזואליזציה intravital וניתוח של התקדמות הזיהום, המארח המשויך תגובות28,29. כדי לאפשר ויזואליזציה של התנהגות התא דג זברה ויוו, הטרנסגניים קווים עם סוגים שונים של תאים חיסוניים (למשל, מקרופאגים, נויטרופילים), אפילו עם מבנים subcellular fluorescently מתויג היה פותח28 ,29. בנוסף, שיעור גבוה רבייה של דג זברה מספק את האפשרות לפתח מערכות בחינה תפוקה גבוהה הכוללת הזרקה אוטומטית רובוטית, כימות פלורסצנטיות אוטומטיות ולאחר ניתוח רצף הרנ א27, 30.

במחקר הנוכחי, כיוונו לפתח מודל העובר דג זברה biomaterial-הקשורים בזיהום באמצעות טכניקות הדמיה זריחה. לשם כך, פיתחנו הליך להזריק חיידקים (S. aureus) בנוכחות biomaterial microspheres לתוך רקמות שריר של דג זברה העוברים. השתמשנו S. aureus RN4220 לביטוי mCherry חלבון פלואורסצנטי (S. aureus- mCherry), אשר נבנה כמתואר עבור S. aureus עוד זן10,31. הקו דג זברה מהונדס (mpeg1: קאךה/UAS) המבטאת קאךה חלבון פלואורסצנטי ירוק, המקרופאגים32 ו כחול ניאון פוליסטירן microspheres שימשו. במחקר הקודם, אנחנו הראו כי זריקה תוך שרירית של microspheres לתוך דג זברה עוברי לחקות biomaterial ההשתלה הוא ריאלי33. לנתח באופן כמותי את ההתקדמות של באי וחדירה תא המשויך של אחד העוברים לאורך זמן, היינו את קובץ הפרוייקט "דג זברה-Immunotest" המופעל בתוך "ObjectJ" (יישום plug-in עבור ImageJ) לכמת את עוצמת קרינה פלואורסצנטית חיידקים השוכנים ומקרופגים שחדר באזור ההזרקה של microspheres33. בנוסף, קבענו את המספרים של המושבה יוצרי יחידות (CFU) של חיידקים הנוכחות ואת היעדר microspheres של העוברים ללמוד ההשפעות האפשריות של biomaterials על זיהום. המחקר הנוכחי שלנו מדגים השיטות התפתחו כאן, העובר דג זברה הוא מודל בעלי חוליות מבטיח, הרומן לימוד הקשורים biomaterial זיהומים ויוו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ב פרוטוקול זה, תחזוקה של דג זברה בוגרת עומדת בדרישות תקנות רווחת בעלי חיים מקומיים כפי שאושר על ידי ועדת רווחת בעלי חיים מקומיים. ניסויים עם עוברי בוצעו על פי הדירקטיבה 2010/63/האיחוד האירופי.

1. הכנת "חיידקים בלבד", תרחיפי החיידקים-microspheres

הערה: המתח RN4220 S. aureus לבטא mCherry חלבון פלואורסצנטי (S. aureus- mCherry) משמש. המתח RN4220 S. aureus הוא מוטציה של התקפה אלימה מווסת הגן אגרה (ג'ין אביזר הרגולטור א)34, לכן ייתכן שיהיה נמוך יחסית התקפה אלימה במודל העובר דג זברה. זנים אחרים aureus ס או מיני חיידקים אחרים עבור באי יכול לשמש.

  1. לקחת 4 עד 5 מושבות של חיידקים RN4220 S. aureus מן tryptic סויה אגר תרבות צלחות בתוספת 10 µg/mL כלורמפניקול, התרבות החיידקים לשלב צמיחה אמצע-לוגריתמי ב 10 מ ל מרק tryptic סויה בתוספת 10 µg/mL כלורמפניקול ב 37 ° C תחת רועדת.
    1. במהלך תרבות, לדלל µL 100 של ההשעיה חיידקי ב µL 900 תמיסת סטרילית פוספט buffered (PBS) ב cuvette (רוחב של 1 ס מ) למדידה צפיפות אופטית (OD)-620 nm (OD620). התרבות החיידק עד יתר620 מגיע 0.4 – 0.8.
      הערה: את יתר620 של 0.1 בדרך כלל מתייחס 3.0 x 107 CFU/mL S. aureus. יתר620 של inoculum של חיידקים בשלב הצמיחה לוגריתמי באמצע הוא בין 0.4-0.8. ייתכן שיהיה צורך ובתקופות זמן שונות culturing עבור מינים אחרים של זנים של חיידקים.
  2. צנטריפוגה חיידקים ב x 3,500 g למשך 10 דקות, מחדש להשעות את החיידקים pelleted ב 1 מ"ל של PBS סטרילי. לאחר מכן לשטוף את החיידקים עם פי PBS 2 סטרילי, סוף סוף מחדש להשעות את החיידקים ב 1.1 מ של 4% (w/v) פוליוינילפירולידון40 (PVP40) פתרון PBS.
  3. מערבולת ההשעייה חיידקי, שתדללו 100 µL של ההשעיה ב µL 900 ל- PBS סטרילי ב cuvette עבור המידה620 OD. התאם את הריכוז של המתלה חיידקי עם פתרון40 PVP. זהו ההשעיה "חיידקים בלבד".
  4. Biomaterials ניתן לבחור באופן חופשי לערבב עם חיידקי ההשעיה. במחקר הנוכחי, נעשה שימוש מסחרי פוליסטירן (PS) microspheres (פלורסנט כחול, 10 מיקרומטר). כדי להפיק השעיה חיידקים-Microspheres, centrifuge את microspheres עבור 1 דקות ב- 1,000 x g, בטמפרטורת החדר, למחוק את תגובת שיקוע, מחדש להשעות את microspheres ההשעיה "חיידקים בלבד" (בפתרון40 PVP).
  5. כדי להזריק מינון שווים בקירוב של חיידקים הנוכחות, בהיעדרו של microspheres, הריכוז של חיידקים-Microspheres הבולם צריכה להיות שני שלישים של הריכוז של המתלה "חיידקים בלבד" (ללא microspheres). זו מושגת על ידי דילול ההשעיה חיידקים-Microspheres עם נפח 0.5 בפתרון40 PVP. מערבבים את המתלים על-ידי vortexing. ראוי לציין, היחס הזה (שני שלישים) יש כבר שקובעת S. aureus. זה גם מתאים epidermidis ס, אך מומלץ לבדוק אם יחס זה חל גם על מיני חיידקים אחרים, אחרים (מ- 10 מיקרומטר) או צורות biomaterials (מ- microspheres) כדי להיות מוזרק.
  6. בדוק את הריכוז של המתלה "חיידקים בלבד" של חיידקים-Microspheres על-ידי תרבות כמותית של דילולים טורי 10-fold להלן: העברת 100 µL של המתלים היה טוב-plate ורכים באופן סדרתי על ידי העברת aliquots 10 µL של ההשעיה לתוך µL 90 ל- PBS סטרילי. צלחת aliquots µL 10 כפולים של המתלים מדולל, מדולל על צלחות agarose, דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה, לספור את המושבות ולחשב את המספרים של חיידקים (המושבה יוצרי יחידות. CFU).

2. גידול, קציר, ותחזוקה של עוברי דג זברה

  1. בצע את שגרות כלליות שתואר קודמות35,36 רבייה, קציר, ותחזוקה של דג זברה עוברי, עם השינויים המתוארים להלן. לחצות משפחה של פראי סוג Tupfel פין ארוך (TL) דג זברה או דג זברה של הקו הטרנסגניים שנבחר (כאן, Mpeg1: קאךה) במיכל עם רשת הוסיף לזירוז הנקבות מבוגרים כדי ליצר ביצים לאחר נדלקת, ואז להפריד מבוגרים מן הביצים המיוצר.
  2. לאסוף את העוברים למחרת ולמחוק את אלה שאינם שקופים אשר אינם קיימא. להוציא כ 60 העוברים לכל צלחת פטרי (100 מ מ קוטר) E3 בינוני37 : דגירה ב 28 º C. להסיר עוברי מת ולא תקינה, ולרענן את המדיום E3 מדי יום.

3. הכנת מחטים הזרקת

  1. הכינו את המחטים microcapillary זכוכית להזרקה שימוש בכלי פולר micropipette. השתמש בהגדרות הבאות: חום: 772, משיכה: 100, ול: 200, זמן: 40, גז: 75.
  2. לשבור את מחט עם מלקחיים במיקום שבו יש המחט של הקוטר החיצוני של 20 מיקרומטר (עבור 10 מיקרומטר microspheres), באמצעות מיקרוסקופ אור עם בר בקנה מידה העינים. הימנע מחטים עם גודל הפתיחה גדולים מאוד, כמו שהם תסכן את ההישרדות של העוברים.
    הערה: הפתח עשוי להיבחר להיות קטן או גדול יותר, בהתאם לגודל ולצורה של biomaterials כדי להיות מוזרק. בספרות, זריקות באמצעות מחטים עם פתיחה של-50 מיקרומטר דווחו לגרום ירידה משמעותית העובר הישרדות38.

4. הזרקה של "חיידקים בלבד" או השעיה של חיידקים-microspheres לתוך עוברי דג זברה

  1. מחממים agarose פתרון (1-1.5% (wt) במים-דמי) באמצעות תנור מיקרוגל ויוצקים לתוך צלחת פטרי 100-מ מ. מניחים תבנית כייר פלסטיק על הפתרון agarose בצלוחית הפטרי ליצור כניסות agarose להנחה עוברי בעמדות נאות, דבר המקל על זריקות. דגירה בטמפרטורת החדר ולהסיר את התבנית כאשר הפתרון agarose התחזק.
  2. ב 3 d שלאחר ההפריה, מקם את העוברים בצלוחית 100 מ מ המכיל חומצה 0.02% (w/v) 3-aminobenzoic (Tricaine) כדי להרדים אותם. לאחר 5 דקות, להעביר את העוברים הצלחת agarose ועליהן E3 בינוני המכיל 0.02% (w/v) Tricaine וליישר אותן באותו כיוון להזרקה. עבור Mpeg1: קאךה הטרנסגניים קו ראשון להרדים עוברי ב- E3 בינוני המכיל tricaine 0.02% (w/v). לאחר מכן בחר עוברי המבטאים חלבונים ניאון ירוק באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות סטריאו.
  3. לטעון את המחט עם µL כ 10 של ההשעיה "חיידקים בלבד" או חיידקים-Microspheres באמצעות טיפ פיפטה microloader. לטעון את המחט אל micromanipulator מחובר המיקרו-מזרק. עבור מזרק משמש כאן (ראה טבלה של חומרים), השתמש בהגדרות הבאות זריקות של 2-3 nL: לחץ: 300-350, לחץ אחורי: 0, זמן: 2 מילי-שניות.
    הערה: ההגדרות עבור המיקרו-מזרק תלויות מזרק בשימוש. מזרק הגדרות ייתכן שתצטרך לכוונן את זריקות של חיידקים מעורבב עם biomaterials עם צורות או גדלים אחרים.
    1. השתמש מחטים עם פתיחת זהה עבור ההזרקה של המתלה "חיידקים בלבד" ואף מאששות חיידקים-Microspheres. אם המחט שבורה או סתומות, תמיד לשנות עבור מחט חדשה לזריקות עוד יותר.
  4. הכנס את המחט לתוך רקמות שריר של העוברים תחת מיקרוסקופ אור (איור 1), בזווית של 45 – 60 מעלות בין המחט לגוף העובר. להתאים את המיקום של המחט בתוך רקמת בעדינות להזיז את זה אחורה וקדימה. להזריק את העוברים באמצעות דוושת מחובר המיקרו-מזרק.
  5. לאחר ההזרקה של חיידקים פלורסנט, להבקיע את העוברים זיהום מוצלח תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות סטריאו. למחוק את השלילי עוברי הבקיע (אין בקטריות פלורסנט גלוי או לא microspheres פלורסנט גלוי). לשמור על עוברי בנפרד ב- E3 במדיום. ובכן 48 לוחות. רענן המדיום מדי יום.

5. ריסוק של העוברים, הבקיע מיקרוסקופיים והתרבות כמותית של חיידקים

  1. ציון כל העוברים ברמה המיקרוסקופית, נוכחות של חיידקים פלורסנט באמצעות מיקרוסקופ סטריאו פלורסצנטיות, החל מיד לאחר הזריקות, ועל כל יום לאחר מכן עד העוברים נבחרו באופן אקראי לתרבות כמותית.
  2. באופן אקראי בחר מספר העוברים נגוע בשידור חי (5 עד 6 במחקר הנוכחי) זמן קצר לאחר ההזרקה, להעביר אותם בנפרד microtubes mL 2 נפרדים באמצעות טיפים סטרילי. להסיר את המדיום, לשטוף את העוברים בעדינות עם PBS סטרילי פעם ולהוסיף µL 100 ל- PBS סטרילי.
  3. להוסיף 2-3 סטרילי זרקוניה חרוזים (2 מ מ קוטר) כל בקבוקון ולרסק את העוברים באמצעות את מהמגן (ראה טבלה של חומרים) ב 3500 סל ד ל 30 ס' תרבות homogenate באופן כמותי כפי שמתואר בשלב 1.3.
    הערה: לטקס אחרים עשויים לדרוש הגדרות שונות.
  4. לבחור באקראי העוברים בימים הבאים לאחר ההזרקה לתרבות כמותי לפי שלב 5.3.

6. זריחה מיקרוסקופיה של התקדמות הזיהום, שעורר תא בחדירת עוברי דג זברה

  1. להרדים את העוברים כפי שמתואר בשלב 4.2. פיפטה µL 500 של PBS - 2% (wt) מתיל תאית פתרון לתוך צלחת פטרי המכילות בינוני E3 עם 0.02% (w/v) Tricaine. הכנס את העוברים הפתרון מתיל תאית ולשמור אותם ישר ואופקי.
    הערה: מתיל תאית פתרון משמש "דבק", אשר עקב שלו צמיגות, יכול לשתק זמנית עוברי בכיוון הטוב ביותר עבור הדמיה.
  2. שימוש במיקרוסקופ פלורסצנטיות סטריאו מצויד עם שדה בהיר, mCherry, חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ו- UV מסננים העוברים הבודדים תמונה תחת הגדרות ממוטבת זהה (למשל, עוצמת הגברה, חשיפה זמן) בהגדלה 160 x . להגדיר את מטוס מוקד כך הנזק לרקמות שנגרם על ידי ההזרקה נמצא בפוקוס, באמצעות מסנן שדה בהיר. הגדר את עומק Z-מחסנית בגודל מיקרומטר, שלב 10-5 מיקרומטר, המאפשר הקלטה של 3 תמונות רצופות.
  3. התמונה עוברי בודדים מדי יום מ- 5 שעות לאחר הזרקת עד 2 ימים שלאחר הזרקת. הכללת עוברי המת (אין דופק או העובר בחלקו מושפל) עבור הדמיה נוספות וניתוח. לשמור על עוברי בנפרד ב- E3 במדיום. ובכן 48 לוחות. רענן המדיום מדי יום.

7. ניתוח כמותי של עוצמת קרינה פלואורסצנטית התקדמות הזיהום, שעורר תא חדירה באמצעות קובץ הפרוייקט אובייקט J "דג זברה-Immunotest"

  1. הורד "דג זברה-Immunotest", המדריך מפורט מהקישור: < https://sils.fnwi.uva.nl/bcb/objectj/examples/zebrafish/MD/zebrafish-immunotest.htmL>, כפי שמתואר במחקר הקודם33. בקצרה, לפתוח תמונות עבור ניתוח עם "דג זברה-Immunotest", שפעלו תחת התוכנית freeware תמונה ג' לכל תמונה שנטענה, סימון ידני של ההזרקה בהתבסס על הנזק נצפתה רקמה של העוברים.
    הערה: האתר מסומן משמש "דג זברה-Immunotest" בתור נקודת המרכז לזהות קרינה פלואורסצנטית השיא למרחק של 50 מיקרומטר. הפסגה פלורסצנטיות שזוהו ואז משמש כמרכז אזור מתוקנן (קוטר של 100 מיקרומטר) פלורסצנטיות מדידה.
  2. לחץ על "חישוב" בתפריט ' אובייקט J ' כדי להפעיל את המידה פלורסנט עבור ערוצים מרובים, אם רלוונטי, באופן אוטומטי עבור כל התמונות. לייצא את הנתונים ולנתח על ידי שיטות המבחן הסטטיסטי המתאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

המחקר הנוכחי העריכו את הישימות של דג זברה עוברי כמודל הרומן חוליות בבעלי חיים עבור חוקרים הקשורים biomaterial זיהום. טכניקת microinjection כבר בשימוש נפוץ להחדיר מינים שונים של חיידקים לתוך דג זברה עוברי לגרום זיהום22,26,27,30,36. שימוש בהליך המתואר באיור1, S. aureus לבד או יחד עם 10 מיקרומטר PS microspheres (נ. ב10) היו מוזרק לרקמת שריר דג זברה עוברי במחקר הנוכחי. זריקה תוך שרירית של S. aureus גרם למינון זיהום עוברי (איור 2). המנות מוזרק היו קרובים המנות אתגר מכוונים (יום 0 באיור2). נצפו הבדלים קלים בלבד בתוך קבוצות. עוברי מוזרק עם מינונים גבוהים אתגר הראו התקדמות הזיהום משתנה-יום 1 ו- 2 ימים שלאחר ההזרקה (איור 2, CFU 6000 ו-2000). מוזרק S. aureus חיידקים או הושמדו או היה התרבו והקימו לאחר מכן רמות גבוהות של הזיהום העוברים. זה דומה ההתקדמות המדווחת של S. aureus זיהום לאחר לעירוי הזרקה לתוך דג זברה עוברי26. עוברי הזריק במינון נמוך אתגר של S. aureus שניקית את החיידקים (איור 2, 600 ו-200 CFU). תוצאות אלו ציינו כי המינון האתגר של S. aureus חריפה השפעות שלהם התקדמות זיהום עוברי דג זברה.

שיתוף הזרקה של חיידקים, microspheres הביא מספרים גבוהים יותר של חיידקים מוזרק מאשר הזרקה של חיידקים בלבד (נתונים לא מוצג). על-ידי הכנת inoculum חיידקי על הזריקות "חיידקים בלבד"-ריכוז גבוה יותר (כ 1.5 פעמים גבוה יותר) מאשר ההשעיה חיידקים-Microspheres, הצלחנו להתגבר על ההבדל במספר CFU מוזרק. בדרך זו, זה אפשרי להחדיר מספרים דומים של חיידקים לתוך עוברי הנוכחות, בהיעדר PS10 (יום 0, איור 3). המספרים של microspheres לכל זריקה מגוונות. לדוגמה, אחד הניסויים שלנו, מחצית עוברי התקבלו microspheres 1 עד 2 לכל זריקה (12 מתוך 25 העוברים S. aureus + קבוצה10 PS), כמה קיבל 3 או 4 (8 מתוך 25 עוברי) ולאחר כמה התקבלו microspheres 5-7 (5 מתוך 25 em bryos). עם זאת, כזה וריאציות לא להשפיע הרמות של התגובות הסלולר שעורר, כפי שדווח ב המחקר הקודם33.

בשלב הבא, חקרנו אם הנוכחות של microspheres יש השפעה על ההתקדמות זיהום בדג זברה העוברים הם אתגר במינון נמוך של S. aureus. לשם כך, הזרקנו כ 600 CFU של S. aureus- mCherry עם או בלי נ. ב10. השתמשנו בשתי שיטות כדי ללמוד את התקדמות הזיהום: תרבות כמותיים קונבנציונאלי (i) של העוברים הנגוע לאחר ריסוק, ו (ii) הניקוד של זיהוי מיקרוסקופי ("הניקוד מיקרוסקופיים") של חיידקים פלורסנט (S. aureus- mCherry). השווינו את התוצאות של שתי השיטות. התוצאה מוגדר כ- "כן או לא" ניראות של חיידקים פלורסנט העוברים, משנה עוצמת קרינה פלואורסצנטית. התוצאות שלנו הראה כי כל העוברים עם יותר מ-20 CFU של S. aureus- mCherry היו חיובי מיקרוסקופיים הבקיע (אדומים נקודות ב איור 3). עבור CFU 600 של S. aureus לכל העובר, הנוכחות של PS10 נראה לא להשפיע באופן משמעותי את התקדמות הזיהום. על כל הזמן נקודות, הן את התדירות של זיהום עוברי (מסומן על גבי איור 3, במינון נמוך אתגר), ולא המספרים של CFU לאחר ריסוק היו שונים עבור עוברי עם או בלי PS10 (איור 3, במינון נמוך אתגר). זה הציע כי מינונים גבוהים יותר אתגר של S. aureus נדרשים ללמוד השפעת פוטנציאל biomaterials על התקדמות זיהום עוברי דג זברה. לפיכך, אנו מוזרק כ 1,000 CFU של S. aureus נוכחות, היעדרות של PS10 עוברי. מניה מיקרוסקופיים לא הראה הבדלים התדירות של העוברים נגועים עם ובלי PS10 בכל נקודת זמן (איור 3, במינון גבוה אתגר). כמותיים התרבות, לעומת זאת, הראה מספרי CFU גבוהים יותר שאוחזר העוברים S. aureus + PS קבוצה10 מאלה שאוחזר מ- S. aureus -הקבוצה היחידה ב 2 ימים שלאחר ההזרקה (איור 3, גבוהה אתגר במינון).

כדי לכמת את מידת הזיהום הנוכחות, בהיעדר biomaterials בדג זברה העוברים על ידי ניתוח תמונות, הקלטנו סדרה של תמונות מראה את ההתקדמות זיהום של S. aureus- mCherry (1,000 CFU לכל העובר) הנוכחות, היעדרות של PS10 בשידור חי העוברים לאורך זמן (איור 4A). גם הקלטנו את חדירת קאךה ירוק ניאון המבטאים חלבונים מקרופאגים שעורר העוברים לכמת את התגובה תא החיסון (איור 4B). חלבון פלואורסצנטי קאךה עלול לעבור המרת צבע מירוק לאדום תחת בחשיפה לאור אולטרא סגול, בהתאם לזמן חשיפה עוצמת אור39. עם זאת, המרת צבע כזה לא נצפתה בתנאי הניסוי השתמשו במחקר הנוכחי. עוצמת קרינה פלואורסצנטית של החיידק המזהם גם החל המקרופאגים infiltrating בתוך אזור מתוקננת סביב ההזרקה נמדדה על ידי קובץ הפרוייקט שלנו ObjectJ "דג זברה-Immunotest", הפועלת בתוך התמונה ג'יי" דג זברה-Immunotest"מגדיר את אזור סטנדרטית עם קוטר של 100 מיקרומטר (צהוב עיגולים באיור4) סביב נקודת המצוין של הזרקת. ב העוברים, אזור זה כלל את רוב החיידקים פלורסנט המתגוררים בקרבה את microspheres מוזרק, כמו גם את המקרופאגים infiltrating. הנוכחות של biomaterial הוצגה להשפיע על שני הרגישות תגובות תא זיהום ו החיסונית הראשונית. 5 שעות לאחר ההזרקה, הסתננות מקרופאג בתגובה S. aureus רק היה גבוה משמעותית מאשר בתגובה S. aureus + PS10 (איור 5, חדירה macrophage, מדד מחירי הבתים של 5). ב- 1 יום שלאחר הזרקת העוברים עם PS10 הראו רמות גבוהות באופן משמעותי להידבקות של S. aureus מאשר עוברי ללא PS10 (איור 5, התקדמות הזיהום, 1 dpi). לפיכך, תוצאות כמותיות אלו הראו כי השילוב של קרינה פלואורסצנטית תמונה הקלטת את קובץ הפרוייקט של ObjectJ "דג זברה-Immunotest" יכול לשמש כדי לכמת את התקדמות הזיהום, עוררה תגובה תא החיסון רכוש biomaterial במודל העובר דג זברה. המודל מאפשר להערכת הבדלים קטנים תגובות תא החיסון ורמות של זיהום חיידקי ויוו, זה רק דורש מיקרוסקופ פלורסצנטיות סטריאו (עם תמונה הקלטת) גישה פתוחה "דג זברה-Immunotest" להערכה.

Figure 1
איור 1: הליך סכמטי של הזרקת שיתוף של חיידקים-Microspheres השעיה לתוך השריר זנב של דג זברה העוברים. איור זה שונה מג'אנג et al.33 עם הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: מספר CFU של S. aureus שאוחזר מדג זברה עוברי הזריק inocula, ועד 6,000 CFU 200 לאדם העובר, מוערך ב- 0-2 ימים לאחר הזרקת. הקווים האדומים מייצגים את מספרי החציוני של CFU. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: מספרים של CFU וניקוד מיקרוסקופיים של mCherry חלבון-ביטוי S. aureus (S. aureus- mCherry) העוברים דג זברה, העריך בנקודות זמן שונות. במינון נמוך אתגר: CFU 600 לאדם העובר; מינון גבוה אתגר: CFU 1,000 לכל העובר; נ. ב10: 10 מיקרומטר PS microspheres; "+", העוברים הזריק S. aureus- mCherry יחד עם PS10; "-", העוברים הזריק S. aureus- mCherry בלבד, אז בלי נ. ב10. העוברים היו ברמה המיקרוסקופית הבקיע עבור חיידקים פלורסנט, נבחר באקראי לתרבות כמותית של חיידקים לאחר ריסוק של העוברים היום של הזרקה (יום 0) ובבית הזרקת שלאחר יום 1 ו- 2 יום. העוברים ברמה המיקרוסקופית הבקיע חיובי ושלילי חיידקים פלורסנט מוצגים בשחור ואדום נקודות, בהתאמה. המספרים של מאכל הניקוד חיובי עוברי מחולק כלל מספר העוברים הבקיע (תדירות העובר נגוע) בכל נקודה בזמן מסומנים בחלק העליון של הגרף. ההבדלים בתדרים של העוברים נגוע, במספר CFU בין S. aureus + PS10 S. aureus רק את הקבוצות בכל נקודה בזמן נותחו על ידי פישר ' ליתר דיוק מבחן, מבחן מאן-ויטני, בהתאמה. p ≤ 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: להחליפן בתמונות להקליט את התקדמות הזיהום לבטא mCherry S. aureus (A, אדום) הנוכחות, היעדר מיקרומטר PS 10 microspheres (נ. ב10, כחול) ואת חדירת שעורר קאךה חלבון-לבטא מקרופאגים (כחול, ירוק) בעוברי, מ- 5 שעות לאחר הזרקת. מדד מחירי הבתים (. של) עד 2 ימים שלאחר ההזרקה (dpi). מטופלים שאינם עוברי (NT) שימשו פקדים. העיגולים הצהובים (100 מיקרומטר בקוטר) לציין את האזור מתוקננת באתר הזרקת על ידי קרינה פלואורסצנטית כימות באמצעות קובץ פרוייקט ObjectJ "דג זברה-Immunotest'. קרינה פלואורסצנטית כימות של חיידקים, של מקרופאגים מתואר באיור5. גודל ברים = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: זריחה כימות של התקדמות הזיהום S. aureus , בחדירת מקרופאג שעורר הנוכחות ואת היעדר 10 מיקרומטר PS microspheres (נ. ב10) בדג זברה העוברים מ- 5 שעות לאחר הזרקת. מדד מחירי הבתים (. של) על 2 ימים שלאחר ההזרקה (dpi), באמצעות הפרויקט ObjectJ קובץ "דג זברה-Immunotest". אזור מתוקננת באתר הזרקת שימש על כימות קרינה פלואורסצנטית (בקוטר של 100 מיקרומטר, ציינו גם העיגולים הצהובים באיור4). מטופלים שאינם עוברי (NT) שימשו פקדים. ההבדלים בין כל שתי קבוצות בכל מועד נקודת נותחו על ידי מאן-ויטני לבדוק, *p ≤ 0.05, * *p < 0.01, * * *p < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

זיהום הקשורים biomaterial (באי) הוא סיבוך רפואי חמור. הבנה טובה יותר של הפתוגנזה של באי ויוו תספק תובנות חדשות על מנת לשפר את מניעה וטיפול של באי. עם זאת, הנוכחי ניסיוני באי מודלים בעלי חיים כגון מודלים מאתר יקר, עתירי עבודה, והן דורשות אנשי סגל מומחים ברפואת טכניקות ניתוחיות מורכבות. לכן, מודלים אלה אינם מתאימים לניתוח תפוקה גבוהה. כיוון דרישות עבור דג זברה העובר מודלים מורכבים פחות עלויות באופן כללי נמוכים לדגמים מאתר, המחקר הנוכחי העריך אם דג זברה עוברי יכול לשמש כמודל בעלי חוליות חדשניים עבור חוקרים באי ויוו, משלים הדגמים יונקים.

כדי להגדיר את המודל באי של העובר דג זברה, פיתחנו פרוטוקול של הזרקת שיתוף של חיידקים, microspheres מבוסס על שיטה של זריקה תוך שרירית של microspheres לתוך עוברי תיאר לפני33. בדרך זו, רוב החיידקים נמצאים באזור microspheres העוברים, מחקה את האינטראקציה חיידקים-biomaterial אשר מתרחש במהלך או מיד לאחר ההשתלה של biomaterials ביונקים/בני אדם.

כדי שניתן יהיה להשוות התקדמות הזיהום הנוכחות, בהיעדרו של microspheres, העוברים דג זברה, העוברים צריך להיות אתגר דומה המספרים הראשוניים של חיידקים עם ובלי microspheres. עם זאת, הניסיון שלנו הזרקת שיתוף של חיידקים-Microspheres השעיה תוצאות חיידקים להיות מוזרק מאשר הזרקה של השעיה "חיידקים בלבד". כדי לטפל בבעיה זו, היחס בין ריכוז חיידקים ב השעיות "חיידקים בלבד" (ללא microspheres) וב -תרחיפי החיידקים-microspheres צריך להיות מותאם. במחקר הנוכחי, הריכוז של S. aureus ההשעיה "חיידקים בלבד" צריך להיות כ 1.5 פעמים גבוה יותר ריכוז חיידקים-Microspheres ההשעיה. היחס הזה חל גם על מיני חיידקים אחרים, אחרים biomaterials נשאר להיבדק. ראוי לציין, להזריק מספרים דומים של חיידקים עם ובלי microspheres, הפתח של המחטים המשמשות זריקות של השעיה או צריך להיות זהה קרוב ככל האפשר.

מספר מאפיינים של biomaterial כגון גודל וצורה יש תפקיד חשוב בקביעת שלה injectability, הזרקת שיתוף עם חיידקים. בהווה לומדים, השתמשנו microspheres 10 מיקרומטר פוליסטירן (נ. ב10) בתור מודל biomaterials. הניסיון שלנו להזרקה microspheres בגודל של עד 15 מיקרומטר במשך 3 ימים העוברים הישן בעקבות הפרוטוקול שפותח בשנת המחקר הנוכחי33. עבור microspheres של גודל גדול יחסית (למשל, ≥ 10 מיקרומטר), אנחנו לא מעודדים את השימוש הלא-monodispersed או microspheres/microparticles חריגה אשר נוטים לגרום סתימת של המחט. אם biomaterials בצורות אחרות מאשר עגול, בגדלים שונים הם נבחרו כדי לשמש, injectability שלהם צריך להיבדק. עבור (co-) הזרקה של microspheres וחיידקים, השתמשנו פתרון פוליוינילפירולידון (PVP) 4% כדי להקל על פיזור. זה עשוי להיות מועיל עבור הזרקה של biomaterials עם ובלי חיידקים לתוך עוברי באופן כללי.

כפי שהיה לזריקות של microspheres רק33,40, המספרים של microspheres מוזרק יחד עם החיידקים העוברים מגוונות לכל זריקה, בעיקר בטווח שבין 1 ל 4 microspheres לכל העובר. עם זאת, מאז וריאציות כזה לא לגרום הבדלים ברמות של תגובת תא החיסון שעורר בעוברי33, הם גם לא ציפו להשפיע על השפעת פוטנציאל microspheres על התקדמות הזיהום. בכל זאת, בעיצובן רומן גישות ומאפשר זריקות של ננו-ספירה אחת (לבד או יחד עם חיידקים).

אנחנו העריך אם הניקוד מיקרוסקופיים של נוכחות של חיידקים פלורסנט יכול לשמש "כן או לא" שיטת הניקוד כדי לנתח את התקדמות זיהום עוברי בשידור חי. הקריטריון של ציון חיובי מיקרוסקופיים הוגדר הנוכחות של חיידקים פלורסנט גלוי, ללא קשר עוצמת קרינה פלואורסצנטית. בהשוואה כמותית התרבות של חיידקים, התוצאות נציג שלנו הציע כי הניקוד מיקרוסקופיים יכול להבחין העוברים עם CFU 20 או יותר של חיידקים S. aureus מעוברים עם מספרים נמוכים CFU או אין זיהום. לפיכך, מאז מספרים נמוכים בלבד של חיידקים נדרשים עבור תוצאה חיובית, שיטה זו היא כמעט רגישה כמו תרבות כמותית. מאז העוברים לא צריך להיות קורבן, ללא מיקרוסקופ באיכות גבוהה או מערכות מיון עבור קרינה פלואורסצנטית הנדרשים לביצוע ניתוחים בשיטה זו, אנו רואים מיקרוסקופיים הבקיע שיטה פשוטה אך אמין כדי לנטר את התקדמות הזיהום חיידקים עוברים בשידור חי. ניתוח כמותי של רמת זיהום (במקום "כן או לא" מערכת התוצאות כפי שתואר לעיל), תגובת תא חיסוני יחיד עוברי בשידור חי, הוספנו את קובץ הפרוייקט של ObjectJ "דג זברה-Immunotest" לכמת עוצמת קרינה פלואורסצנטית חיידקים פלורסנט ומקרופגים פלורסנט הקליט לאורך זמן. השתמשנו אזור מתוקנן (בקוטר של 100 מ') סביב ההזרקה למדוד קרינה פלואורסצנטית, שכן אזור זה הוצגה כדי לכלול את רוב החיידקים ומקרופגים infiltrating. מדריך מפורט של "דג זברה-Immunotest" פורסם בעבר33,40. ראוי לציין, "דג זברה-Immunotest" היא גישה פתוחה plug-in עבור ImageJ, אשר ניתן להתאימו על-ידי המשתמש. למשל, הקוטר של האזור של ניתוח ופרמטרים אחרים של "דג זברה-Immunotest" ניתן לשנות באופן חופשי על פי הגדרת המחקר (ראה דוגמאות בקישור הניתנים בשלב 7 בפרוטוקול).

כדי להציג את ההשפעות אפשרי לשיפור זיהום של biomaterials בדג זברה עוברי, המינון האתגר של חיידקים צריך להיות מוערך. במחקר הנוכחי, מצאנו כי מנה האתגר של 1,000 CFU של S. aureus לכל העובר ומעלה נדרש. על הימים 2 הראשונים לאחר ההזרקה, המציין כי הנוכחות של biomaterials transiently מקלה המוצלח S. aureus נמצאו רמות גבוהות יותר של S. aureus זיהום עוברי עם PS10 מאשר אלה ללא PS10 ב העוברים. אם הזיהום נשאר ברמה גבוהה בנוכחות של biomaterials בנקודות זמן מאוחר יותר צריך להילמד באמצעות עוברי בוגרים תחת אישור מוסרי לפי תקנות הישימים. מאז הסיווג של S. aureus בדג זברה עוברי תלויה בעיקר phagocytosis והרג ידי23,של מקרופאגים, נויטרופילים-24, תוצר של חיידקים יכול להיות מוסבר על ידי יעילות מופחתת phagocytes להרוג את החיידקים בשל נוכחותם של biomaterials. זה עולה בקנה אחד עם שיפור זיהום ידוע-סיכון על ידי biomaterials חולים2,4,15, גם בדרך כלל נצפית מודלים מורכבים יותר כגון עכבר, דגמים בעלי חיים אחרים,10 ,11,12,13. בנוסף S. aureus זיהום, התקדמות הזיהום epidermidis ס או פתוגנים אחרים בנוכחות biomaterials יכול ייחקרו בעקבות פרוטוקול שתוארו במחקר הנוכחי. מנקודת biomaterials, מספר תכונות החומר (למשל ההרכב הכימי, , hydrophobicity, חספוס, והחיובים משטח) עשוי להשפיע על תגובות סלולרית ו/או חיידקים-חומר אינטראקציה41, 42. המחקר הקודם שלנו הראו כי הזרקה של biomaterial (בנוכחות PVP) עורר על הסתננות מקרופאג חזק יותר לעומת הזרקה של רק PVP של דג זברה עוברי. יתר על כן, דג זברה עוברי הגיבו בצורה שונה microspheres עשוי פולי (-caprolactone) פוליסטירן33. לכן, הזרקה של microspheres של טבע שונים יכול להיות גם השפעות דיפרנציאלית על שיפור של זיהום, אשר יכול להיות מוערך בקלות יחסית על ידי השיטה המתוארת כאן.

להמשך פיתוח, מודל באי זה דג זברה העובר שישונו הכוללים מערכת תפוקה גבוהה אוטומטיות רובוטיות הזרקת27,43, ניתוח פרמטרית אובייקטים מורכבים ומיון (COPAS) מערכות תפוקה גבוהה RNA רצף ניתוח27,44. מודל באי שכזה דג זברה תפוקה גבוהה המבוססת על העובר עשוי לשמש כמערכות כל בעלי חיים עבור ויוו הקרנת בדיקה של biomaterials anti-infective (רומן), כמו גם בדיקות יעילות של טיפול אנטיביוטי או אסטרטגיות אחרות אנטי-באי. יתר על כן, הישרדות תאיים הוא אסטרטגיה אחת הגדולות של חיידקים כדי לשרוד בנוכחות biomaterials9,10,11,12,13. התועלת של דג זברה העוברים ללמוד זיהום תאיים הוכח ב מחקרים מספר36,46. לפיכך, המודל העובר שלנו עשוי לשמש ללמוד הישרדות תאיים staphylococci או אחרים פתוגנים תאיים בנוכחות biomaterials, ואסטרטגיות לטיפול בדלקות תאיים כזה. בנוסף, טכניקות היברידיזציה45 ניתן להשתמש במודל כדי לחקור את ההשפעה של חיידקים או biomaterials או השילוב שלהם על הביטוי של גנים מסוימים במקום ההזרקה, אשר עשויים לסייע לגלות סמן גנים של באי.

לסיכום, המחקר הנוכחי מראה את הפוטנציאל של דג זברה העוברים עם השיטות התפתחו כאן ללמוד הקשורים biomaterial זיהום בזמן אמת, אין ויוו. מודל העובר זה דג זברה ולכן עשוי לשמש כדי לחקור הרומן biomaterials זיהום עמידים, מבטיח מניעה ואסטרטגיות טיפול של באי, וכדי לסגור את הפער בין מחקרים במבחנה דגמים בעלי חיים גדולים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

מבחינה כלכלית, מחקר זה היה נתמך על ידי הפרויקט איביזה של התוכנית חומר ביו-רפואי (BMM), והיתה שותפה במימון הולנדית משרד חקירות כלכליות. המחברים רוצה להודות פרופ ' ד ר גרהם Lieschke מאוסטרליה, אוניברסיטת מונש למתן הקו דג זברה מהונדס (mpeg1:Gal4 / UAS:Kaede).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptic soya agar BD Difco 236950 Media preparation unit at AMC
Tryptic soya broth BD Difco 211825
Polyvinylpyrrolidone40 Applichem A2259.0250
10 µm diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent) Life technology/ThemoFisher F8829
Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.) Harvard Apparatus 30-0038
Micropipette puller instrument Sutter Instrument Inc Flaming p-97
Light microscope LM 20 Leica MDG33 10450123
3-aminobenzoic acid (Tricaine) Sigma-Aldrich E10521-50G
Agarose MP Roche 11388991001
Stereo fluorescent microscope LM80 Leica MDG3610450126
Microloader pipette tips Eppendorf 5242956.003
Micromanipulator M3301 with M10 stand World Precision Instruments 00-42-101-0000
FemtoJet express micro-injector Eppendorf 5248ZO100329
Microtrube 2 mL pp Sarstedt 72.693.005
Zirconia beads Bio-connect 11079124ZX
MagNA lyser Roche 41416401
MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2) Biomerieux 43671 Chapmon 2 medium
Methyl cellulose 4000cp Sigma-Aldrich MO512-250G
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
Gyrotory shaker (for bacterial growth) New Brunswick Scientific G10
Zebrafish incubator VWR Incu-line
Cuvettes BRAND 759015
Centrifuge Hettich-Zentrifugen ROTANTA 460R
Spectrometer Pharmacia biotech Ultrospec®2000
Forceps Sigma-Aldrich F6521-1EA
48 well-plates Greiner bio-one 677180
96 well-plates Greiner bio-one 655161
Petri dish Falcon 353003
Petri dish Biomerieux NL-132
ImageJ Not applicable Not applicable link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
GraphPad 7.0 Prism Not applicable

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Williams, D. F. On the nature of biomaterials. Biomaterials. 30, 5897-5909 (2009).
  2. Busscher, H. J., et al. Biomaterial-Associated Infection: Locating the Finish Line in the Race for the Surface. Science Translational Medicine. 4, 153rv10 (2012).
  3. Otto, M. Staphylococcus epidermidis - the 'accidental' pathogen. Nature Reviews Microbiology. 7, 555-567 (2009).
  4. Moriarty, T. F., et al. Orthopaedic device-related infection: current and future interventions for improved prevention and treatment. EFORT Open Reviews. 1, 89-99 (2016).
  5. Campoccia, D., Montanaro, L., Arciola, C. R. The significance of infection related to orthopedic devices and issues of antibiotic resistance. Biomaterials. 27, 2331-2339 (2006).
  6. Schierholz, J. M., Beuth, J. Implant infections: a haven for opportunistic bacteria. Journal of Hospital Infection. 49, 87-93 (2001).
  7. Zimmerli, W., Lew, P. D., Waldvogel, F. A. Pathogenesis of foreign body infection. Evidence for a local granulocyte defect. Journal of Clinical Investigation. 73 (4), 1191-1200 (1984).
  8. Boelens, J. J., et al. Biomaterial-associated persistence of Streptococcus epidermidis in pericatheter macrophages. Journal of Infectious Diseases. 181 (4), 1337-1349 (2000).
  9. Broekhuizen, C. A. N., et al. Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection. Critical Care Medicine. 36, 2395-2402 (2008).
  10. Riool, M., et al. Staphylococcus epidermidis originating from titanium implants infects surrounding tissue and immune cells. Acta Biomaterial. 10, 5202-5212 (2014).
  11. Zaat, S. A. J., Broekhuizen, C. A. N., Riool, M. Host tissue as a niche for biomaterial-associated infection. Future Microbiology. 5, 1149-1151 (2010).
  12. Broekhuizen, C. A. N., et al. Staphylococcus epidermidis is cleared from biomaterial implants but persists in peri-implant tissue in mice despite rifampicin/vancomycin treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 85, 498-505 (2008).
  13. Broekhuizen, C. A. N., et al. Peri-implant tissue is an important niche for Staphylococcus epidermidis in experimental biomaterial-associated infection in mice. Infection and Immunity. 75, 1129-1136 (2007).
  14. Zimmerli, W., Sendi, P. Pathogenesis of implant-associated infection: the role of the host. Seminars in Immunopathology. 33, 295-306 (2011).
  15. Darouiche, R. O. Current concepts - Treatment of infections associated with surgical implants. New England Journal of Medicine. 350, 1422-1429 (2004).
  16. Riool, M., de Breij, A., Drijfhout, J. W., Nibbering, P. H., Zaat, S. A. J. Antimicrobial peptides in biomedical device manufacturing. Frontiers in Chemistry. 5, 63 (2017).
  17. Brooks, B. D., Brooks, A. E., Grainger, D. W. Antimicrobial medical devices in preclinical development and clinical use. Biomaterials Associated Infection. Moriaty, F. T., Zaat, S. A., Busscher, H. J. , Springer. New York, NY, USA. 307-354 (2013).
  18. Sjollema, J., et al. The potential for bio-optical imaging of biomaterial-associated infection in vivo. Biomaterials. 31, 1984-1995 (2010).
  19. Suri, S., et al. In vivo fluorescence imaging of biomaterial-associated inflammation and infection in a minimally invasive manner. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103, 76-83 (2015).
  20. Zhou, J., Hu, W. J., Tang, L. P. Non-invasive characterization of immune responses to biomedical implants. Annals of Biomedical Engineering. 44, 693-704 (2016).
  21. van Oosten, M., et al. Real-time in vivo imaging of invasive- and biomaterial-associated bacterial infections using fluorescently labelled vancomycin. Nature Communications. 4, 2584 (2013).
  22. Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current Opinion in Microbiology. 11, 277-283 (2008).
  23. Brannon, M. K., et al. Pseudomonas aeruginosa Type III secretion system interacts with phagocytes to modulate systemic infection of zebrafish embryos. Cellular Microbiology. 11, 755-768 (2009).
  24. Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. Use of zebrafish to probe the divergent virulence potentials and toxin requirements of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. PLoS Pathogens. 5, e1000697 (2009).
  25. Prajsnar, T. K., et al. Zebrafish as a novel vertebrate model to dissect enterococcal pathogenesis. Infection and Immunity. 81, 4271-4279 (2013).
  26. Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus infection reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cellular Microbiology. 10, 2312-2325 (2008).
  27. Veneman, W. J., et al. A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery. BMC Genomics. 14, 255 (2013).
  28. Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Disease Model and Mechanism. 5, 38-47 (2012).
  29. Meijer, A. H., van der Vaart, M., Spaink, H. P. Real-time imaging and genetic dissection of host-microbe interactions in zebrafish. Cellular Microbiology. 16, 39-49 (2014).
  30. Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
  31. Riool, M., et al. A chlorhexidine-releasing epoxy-based coating on titanium implants prevents Staphylococcus aureus experimental biomaterial-associated infection. European Cells and Materials. 33, 143-157 (2017).
  32. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. Mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, E49-E56 (2011).
  33. Zhang, X., et al. The zebrafish embryo as a model to quantify early inflammatory cell responses to biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105, 2522-2532 (2017).
  34. Traber, K., Novick, R. A slipped-mispairing mutation in AgrA of laboratory strains and clinical isolates results in delayed activation of agr and failure to translate delta- and alpha-haemolysins. Molecular Microbiology. 59, 1519-1530 (2006).
  35. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
  36. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. 61, 3781 (2012).
  37. Brand, M., Granato, M., Christiane, N. -V. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish, A Practical Approach. Dahm, R., Nüsslein-Volhard, C. , Oxford University press. Oxford, UK. 7-37 (2002).
  38. Chaplin, W. T. P. Development of a microinjection platform for the examination of host-biomaterial interactions in zebrafish embryos. , Queen's University. Master thesis (2017).
  39. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).
  40. Witherel, C. E., Gurevich, D., Collin, J. D., Martin, P., Spiller, K. L. Host-biomaterial interactions in zebrafish. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4, 1233-1240 (2018).
  41. Anderson, J. M. Biological responses to materials. Annual Review of Materials Research. 31, 81-110 (2001).
  42. Onuki, Y., Bhardwaj, U., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. A review of the biocompatibility of implantable devices: current challenges to overcome foreign body response. Journal of Diabetes Science and Technology. 2, 1003-1015 (2008).
  43. Carvalho, R., et al. A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression. PLoS One. 6, e16779 (2011).
  44. Stockhammer, O. W., et al. Transcriptome analysis of Traf6 function in the innate immune response of zebrafish embryos. Molecular Immunology. 48, 179-190 (2010).
  45. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59 (2007).
  46. Prajsnar, T. K., et al. A privileged intraphagocyte niche is responsible for disseminated infection of Staphylococcus aureus in a zebrafish model. Cellular Microbiology. 14, 1600-1619 (2012).

Tags

בביו-הנדסה גיליון 143 דג זברה עוברי הקשורים biomaterial זיהום Staphylococcus aureus פולימרים microspheres ויוו ויזואליזציה ניתוח intravital כימות קרינה פלואורסצנטית
מודל העובר דג זברה, ויזואליזציה Vivo, ניתוח Intravital של Biomaterial-הקשורים <em>Staphylococcus aureus</em> זיהום
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, X., de Boer, L., Stockhammer, … More

Zhang, X., de Boer, L., Stockhammer, O. W., Grijpma, D. W., Spaink, H. P., Zaat, S. A. J. A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection. J. Vis. Exp. (143), e58523, doi:10.3791/58523 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter