Summary
ZW10 상호 작용 단백질 (ZWINT)은 유사분열 스핀들 체크포인트 및 암종의 병인에 참여합니다. 여기에서, 우리는 인간 적인 폐암 조직에 있는 ZWINT의 면역점의 방법론을 소개하고, 전체 슬라이드 및 심상 분석의 디지털 스캐닝에 선행합니다. 이 방법론은 고품질의 디지털 이미지와 신뢰할 수 있는 결과를 제공할 수 있습니다.
Abstract
이 연구의 목적은 인간 폐 조직의 면역 염색 방법론을 소개하고 전체 슬라이드 디지털 스캐닝 및 이미지 분석을 도입하는 것입니다. 디지털 스캐닝은 슬라이드 스택을 스캔하고 고품질의 디지털 이미지를 생성하는 빠른 방법입니다. 그것은 병리학자에 의해 전통적인 가벼운 현미경 검사법 (CLM)와 일치하는 결과를 생성할 수 있습니다. 또한 디지털 이미지의 가용성을 통해 여러 사람이 동일한 슬라이드를 동시에 관찰할 수 있습니다. 또한 슬라이드의 디지털 이미지를 데이터베이스에 저장할 수 있어 유리 슬라이드의 장기적인 열화를 피할 수 있습니다. 이 기술의 한계는 다음과 같습니다. 첫째, 고품질의 준비 된 조직과 원래의 면역 조직 화학 (IHC) 슬라이드가 손상또는 과도한 밀봉 잔류물없이 필요합니다. 둘째, 종양 또는 비종양 부위는 채점 하는 동안 종양 또는 비 종양 영역에 대한 혼란을 피하기 위해 소프트웨어를 사용하여 분석하기 전에 숙련 된 병리학자가 지정해야합니다. 셋째, 작업자는 전체 슬라이드 이미징에서 디지털화 프로세스 전반에 걸쳐 색상 재현을 제어해야 합니다.
Introduction
ZW10 상호 작용 단백질(ZWINT)은 유사분열 스핀들 체크포인트1,2,3에관여하는 키네토코레 복합체의 필수 성분이다. ZWINT의 고갈은 비정상적인 조기 염색체 분리 1,2,3으로이어진다고 보고되었다. 최근 연구는 ZWINT가 종양 세포의 증식을 촉진하여 다발성 종양의 발병기전에 관여하는 것으로 4,5. 우리는 이전에 폐암에 있는 ZWINT의과발현을 보고했습니다 5. CLM을 이용한 병리학자에 의한 슬라이드 분석은 시간이 많이 소요되고 정량적이지 않다는 것이 널리 받아들여지고있다6,7,8. 또한 저장된 유리 슬라이드의 열화로 인해 이전에 생성된 슬라이드를 철회할 수 없습니다. 컴퓨터 기반의 디지털 전체 슬라이드 이미징(WSI)의 새로운 방법은이러한 한계를 극복할 수 있는 6,7,8.
이를 위해, 우리는 전체 슬라이드 디지털 스캐닝 및 소프트웨어 기반 이미지 분석과 결합된 인간 폐암 조직에서 ZWINT의 면역 염색방법론을 설명합니다. 이 방법론의 주요 장점은 CLM과 일치하는 결과를 생산하는 것입니다. 이 기술은 헤마톡실린-에오신 염색(H&E) 및 IHC, 현자 형질화(FISH), 조직 미세어레이(TMA), 약물 발견 및 개발의 병리학적 채점 분야에서 널리 사용될 수 있다.
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Protocol
여기에 설명된 모든 방법은 우한 대학의 중난 병원과 우한 대학의 인민 병원의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다.
1. IHC 슬라이드 준비
- 실온(RT)에서 24시간 동안 인산완충식염수(PBS)에서 4% 파라포름알데히드에 인간 폐 조직 단편(약 3 x 3cm)을 침지하여 폐 조직 샘플을 고정시.
- 실온에서 각각 80, 95%, 100% 에탄올을 15분, 20분, 20분동안 탈수시한다. 마지막으로, 실온에서 각각 20 분 동안 100 % 자일렌 3 x에 조직을 담그다.
- 포함을 위해, 30 분 동안 파라핀 (63 °C)에 조직을 담그고 파라핀을 변경하고 또 다른 45 분 동안 조직을 다시 담그십시오. 마지막으로, 파라핀을 다시 변경하고 추가 로 조직을 담그고 1 시간.
- 로터리 마이크로토메를 사용하여 조직을 5 μm 두께의 섹션으로 자르고 20 μg/mL 폴리-L-리신 코팅 슬라이드에 놓습니다.
- 디왁싱을 위해 슬라이드를 65°C 오븐에 2시간 동안 넣고 디메틸벤젠에 15분 동안 담근 다음 100% 자일렌을 15분 동안 담그십시오.
- 100% 에탄올에서 5분 동안 5분 동안 조직 섹션으로 슬라이드에 수화하고, 95% 에탄올에서 5분, 80% 에탄올에서 5분, 70% 에탄올에서 5분, 50% 에탄올로 5분씩 연속 희석된 에탄올로 처리합니다.
- 항원 수리를 수행합니다.
- 이중 증류H 2O(ddH 2O)로 구연산수리액(20x)을 1x로 희석합니다.
- 조직 섹션과 1x 구연산 수리 액 (300 mL)을 항원 수리 상자에 넣고 전자 레인지에서 2 분 동안 고출력으로 가열 한 다음 저전력으로 가열하여 6 분 동안 끓입니다.
- 섹션이 실온까지 자연적으로 식힙니다.
- 구연산 수리 액을 0.01 M PBS로 교체하고 실온에서 회전 쉐이커에서 5 분 동안 섹션 3 x를 씻으하십시오.
- 내인성 과산화를 제거하십시오.
- DdH 2 O로 H2O 2~ 3 %의 30 %를 희석하고 슬라이드에 추가하고 (모든 조직을 덮는지 확인) 실온에서 젖은 상자에 슬라이드를 30 분 동안 배양하십시오.
참고 : 젖은 상자는 10 x 15cm의 플라스틱 상자이며 물을 포함 할 수 있습니다. - 슬라이드를 5분 동안 3회 세척하고 실온에서 회전 셰이커에 0.01M PBS를 장착합니다.
- DdH 2 O로 H2O 2~ 3 %의 30 %를 희석하고 슬라이드에 추가하고 (모든 조직을 덮는지 확인) 실온에서 젖은 상자에 슬라이드를 30 분 동안 배양하십시오.
- 비특이적 항원을 차단합니다.
- 농축된 일반 염소 세럼을 PBS로 10% 염소 세럼에 0.1% 트웬 20(PBST)로 희석합니다.
- 슬라이드에 10 % 염소 세럼을 넣고 37 °C에서 30 분 동안 젖은 상자에 배양하십시오.
참고: 염소 세럼은 슬라이드의 모든 조직을 덮어야 합니다.
- 조직에 얼룩을 지트하십시오.
- 밤새 4°C에서 토끼 항인간 항-ZWINT 항체(1:50)로 슬라이드를 배양한다.
- 실온에서 회전 쉐이커에서 0.01 M PBST (1 mL 0.1 % 트웬트 20 1,000 mL PBS)로 5 분 동안 슬라이드를 3 x 세척하십시오.
- 슬라이드를 37°C에서 30분 동안 이차 항체(항토끼 검출 시스템, 1:200)로 배양합니다.
- 회전 식 셰이커에 0.01 M PBST로 5 분 동안 매번 슬라이드를 3 x 씻으십시오.
- 면역 염색을 시각화하려면 슬라이드를 신선한 3,3-diaminobenzidine 300 μL에 추가한 다음 실온에서 수돗물로 슬라이드를 씻으십시오.
참고: 염색 정도는 현미경(배율 10X - 40X)으로 모니터링됩니다. - 조직을 카운터 스테인. 실온에서 2 분 동안 hematoxylin 염색 용액으로 슬라이드를 염색한 다음 슬라이드를 수돗물로 15 분 동안 씻으십시오.
참고 : 핵은 현미경 (배율 10X - 40X)에서 파란색으로 나타납니다. 청색 염색정도가 더 강력하면, 염산알코올분화를 3-5s에 사용할 수 있으며, 이어서 조직을 수돗물로 다시 청색으로 헹구어 조직의 눈에 띄는 염색을 용이하게 한다. - 슬라이드를 50% 에탄올에서 5분, 70% 에탄올에서 5분, 에탄올 80% 에탄올에서 2회, 5분 동안 95% 에탄올로 5분, 마지막으로 실온에서 100% 에탄올에 각각 5분씩 2회 탈신합니다.
- 투명성을 위해 100% 자일렌이 들어있는 탱크에 15분 동안 담그고 실온에서 15분 동안 100% 자일렌이 함유된 다른 탱크로 섹션을 옮니다.
- 밀봉을 위해 중성 껌 50 - 100 μL을 취하고 혼합물에 5 % 자일렌을 추가하십시오 (거품에 섞이지 마십시오). 상기에 언급된 혼합물의 15 μL을 폐 조직 섹션에 첨가한다. 커버 유리로 필름을 밀봉하고 거품을 부드럽게 누릅니다.
2. IHC 슬라이드의 자동 전체 슬라이드 스캔
- 밀봉된 슬라이드가 실온에서 12시간 동안 건조되도록 하여 건조시다.
- [밝은 필드] 옵션을 수동으로 선택하고 수동 스캐닝 인터페이스를 입력합니다.
- 슬라이드 이름을 수정하고 이미지의 저장 경로를 선택합니다.
- 검색 영역을 설정하고 사용자 설정 임계값을 사용하여 샘플 스캔옵션을 선택합니다. 임계값은 약 50이며 스캐닝 영역 확장 값이 200 μm입니다.
- 스캔 포커스 값을 설정하고 1050에서 2650까지의 범위의 포커스를 자동으로 선택하고 마지막으로 단일 레이어 모드를선택합니다.
- 워크스테이션에서 IHC 슬라이드를 로드하고 자동 스캔을 시작합니다.
참고: 슬라이드가 손상되지 않았는지 확인합니다. 슬라이드를 깨끗하고 반투명하게 유지하고 슬라이드의 먼지, 색종이 및 과도한 실란트 잔류물을 피하십시오. 유리 슬라이드와 커버 슬립에는 마크가 없어야 합니다. 실렌으로 슬라이드를 청소하지 마십시오. 슬라이드의 크기는 표1에 있습니다. - 20배, 40배 또는 100배 배율로 슬라이드의 전체 조직 섹션을 자동으로 스캔합니다.
- 전체 슬라이드 스캔이 끝날 때 이미지를 수집하고 저장합니다.
3. 이미징 소프트웨어에 의한 슬라이드 분석
- 조직 병리학 이미지 분석 소프트웨어를 시작하고 로컬 컴퓨터를선택합니다.
- 검색 데이터를 저장하는 파일을 엽니다.
- 범위 2X에서 40X까지의 적절한 줌 레벨을 선택합니다.
- 토글 색상을 통해 최적의 콘트라스트를 설정하려면 색상을 조정합니다.
- 각 이미지에 관심 있는 부분을 수동으로 동그라미를 치고 이름을 지정합니다.
참고: 예를 들어 한 영역에 동그라미를 치고 종양영역으로 이름을 지정할 수 있습니다. - 플러그인 및 QC를선택합니다. 이 때 시나리오 작성기 팝업입니다.
- 밀도 퀀트를 선택하고 감지 막대를 조정합니다.
참고: 이 프로세스는 신중하게 수행해야 합니다. 청색 공차의 막대는 세포 핵의 색깔을 조정하기 위하여 이용됩니다. 갈색 공차의 막대는 이미지의 채우기 색상의 채도를 조정하는 데 사용됩니다. 조정 후 이미지의 결과는 원래의 이미지와 일치해야 합니다. - 점수 수준을 조정하여 원본 이미지와 유사한 동그라미 영역의 염색 강도를 만듭니다.
참고: 다크 브라운은 강한 긍정을 나타내고, 갈색 노란색은 적당히 긍정적이고, 밝은 노란색은 약하게 양수이고, 흰색은 음수입니다. - 모델을 파일로 저장하고 이름을 지정합니다. 모델을 다른 슬라이드에 적용하고 선택한 어노미"를 선택합니다.
- 소프트웨어가 이미지의 동그라미 영역에 대한 H 점수를 자동으로 계산하도록 합니다.
4. H 점수 시스템을 사용하여 점수의정량화 9,10
- 면역 염색의 백분율과 염색 강도를 계산합니다 (0 : 음수, 1 +: 약한, 2 +: 보통, 3 +: 강한).
- 점수 매기기 시스템(H-score)을 사용하여 종양 및 인접한 비종양 부위의 병리학적 점수를 계산합니다.
참고 : H 점수 = (약한 강도x 1) + (중간 강도x2) + (강도가 강한 세포의 % x 3). 따라서, 최대 H 점수는 세포의 100%가 강한 강도로 정량화되는 경우 300이다.
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Representative Results
우리는 IHC에 의하여 14개의 편평상피세포 암 (SCC) 및 14선암 (ADC)을 포함하여 비소세포 폐암 (NSCLC) 견본 (종양 및 인접한 비종양 조직)의 28 쌍에서 ZWINT의 발현 수준을 측정했습니다. 슬라이드의 전체 슬라이드 디지털 스캐닝은 고품질의디지털 이미지를 제공했습니다(그림 1A). 결과는 폐암의 H 점수가 인접한 비암 조직(P< 0.0001, 2꼬리 t-시험)보다유의히 높았다는 것을 보여주었다(도1A 및 1B). 또한 SCC에서 ZWINT의 발현 수준이 ADC(그림 1C)보다 훨씬 높다는것을발견했습니다.
그림 1 : 폐암 조직에 대한 면역 조직화학적 염색. 이 수치는 위안 외에서 수정되었습니다. 5 비둘기 프레스의 허가. (A) 이 패널은 폐암 환자의 대표적인 면역성 화학적 이미지(배율: 10X 및 40X)를 보여줍니다. (B) 이 패널은 폐암 및 인접한 비암 조직의 H 점수를 나타낸다. (C) 이 패널에는 ADC 및 SCC의 H 점수가 표시됩니다. 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다. * P & 0.05; P < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 최소(mm) | 최대(mm) | |
| 너비 | 25개 | 26세 |
| 길이 | 75세 | 76세 |
| 두께 | 0.9 | 1.2 |
표 1: 슬라이드 크기.
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Discussion
전체 슬라이드 스캐닝은 임상 및 연구 목적으로 고품질 이미지의 강력한 스캐닝 및 생산에 대한 화제가 되고 있습니다11,12,13. 이미지는 분11,12,13이내에 슬라이드 스캐닝 현미경에 의해 생성 될 수있다. 이 방법론을 적용해서, 우리는 ZWINT IHC 슬라이드를 위한 고품질 심상을 얻고 종양과 비종양 조직 사이 H 점수를 비교했습니다. 여기에 제시된 프로토콜에서, 가장 중요한 단계는 병리학적 채점13,14 전에 고품질 IHC 슬라이드의 제조, 이미지 획득 및 종양 및 비종양 영역의 사양이다. , 15세 , 16.
현재 방법은 (CLM)에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 디지털 스캐닝은 슬라이드 스택을 스캔하고 고품질 디지털 이미지를 생성할 수 있을 만큼 충분히 빠릅니다(시간당 20개). CLM과 일치하는 결과를 생성할 수 있지만 상대적으로 적은 시간이 소요됩니다. 디지털 이미지의 가용성은 여러 사람이 동일한 슬라이드를 동시에 관찰 할 수 있게 합니다. 슬라이드의 디지털 이미지는 데이터베이스에 저장할 수 있으며, 이는 유리 슬라이드의 장기적인 열화를 피할 수 있다는 것을 의미합니다.
이 기술의 한계는 고품질 조직 및 IHC 슬라이드 6,8,11 및 화상 진찰 소프트웨어를 사용하여 분석하기 전에 종양 또는 비종양 조직 견본을 지정하는 기술적인 전문 지식에 대한 필요를 포함합니다 , 점수6,7동안 종양 또는 비 종양 영역에 대한 혼란을 피하기 위해. 또한 작업자는 전체 슬라이드 이미징17에서디지털화 프로세스 전반에 걸쳐 색상 재현을 모니터링해야 합니다.
이 방법은 FISH, TMA 및 신약 개발 및개발 6,18에적극적으로 적용할 수 있습니다. 타바타 외. 1 차적인 병리학 진단에 있는 WSI의 사용을 조사했습니다19. 그(것)들은 일본에 있는 9개의 병원에서 1070의 WSI 견본을 소급해서 분석하고 1 차적인 진단에 있는 WSI의 사용의 유효성을 확인했습니다. WSI의 주요 장점 중 하나는 여러 학생(20)에의해 슬라이드의 동시 보기를 허용한다는 것입니다. 따라서, 전체 슬라이드 스캐닝 이미지의 유효성 검사는 교육 및 연구목적을 위한 디지털 진단의 개발에 기여할 수 6,18,21.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 프로젝트는 중국 국립 자연 재단 (81500151, 81400121, 81270607, 81541027 및 81501352)과 후베이성 자연 재단 (2017CFB631 호)에 의해 지원되었습니다. 저자들은 구오진, 창민, 리후이, 그리고 우한 구글 생물학 기술 유한공사의 동료들에게 기술 지원에 감사를 표한다. 저자는 또한 언어 편집 무하마드 자말 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pannoramic MIDI | 3D HISTECH | Cat: PMIDI-040709 | An automated digital slide scanner with a remarkable feature set :12-slide capacity, fluorescence scanning, and many more. |
| QuantCenter | 3D HISTECH | Downloaded from the official website of the company | The framework for 3DHISTCH's image analysis applications. |
| LEICA RM2235 | Leica Microsystems | Cat: 14050038604 | The enhanced precision of the new accessories will add convenience to block to knife approach as well as specimen orientation. |
| Rabbit anti-human Anti-ZWINT antibody | Abcam | Cat: ab197794 | Immunohistochemical analysis of ZWINT in human lung tissue. |
| Anti-rabbit secondary antibody | Wuhan Goodbio Technology | Cat:GB23303-1 | Secondary antibody for IHC staining. |
| Phosphate-buffered saline | Wuhan Goodbio Technology | Cat:G0002 | A solution containing a phosphate buffer. |
| OLYMPUS CX23 | OLYMPUS | Cat:6M87620 | Microscope for detection of H&E or IHC slides. |
| Dimethylbenzene | Shanghai Lingfeng Chemical Reagent | Cat:1330-20-7 | A colorless, flammable fluid used as a solvent and clarifying agent in the preparation of tissue sections for microscopic study. |
| Hematoxylin Staining Solution | Wuhan Servicebio technology | Cat:G1039 | It is commonly used for histologic studies, oftern colors the nuclei of cells blue. |
| Tween 20 | Baitg | Cat:2005-64-5 | It is a polysorbate-type nonionic surfactant formed by the ethoxylation of sorbitan before the addition of lauric acid. It is used as a deterent and emulsifier in pharmacological applications. |
| Citric acid repair liquid | Wuhan Servicebio technology | Cat:G1202 | Is is used to repair antigen after fixation during IHC procedure. |
| LEICA ASP200s | Leica | Cat: 14048043626 | It was designed for routine and research histopathology of up to 200 cassettes. |
| LEICA Arcadia H | Leica | Cat: 14039354103 | It is a heated paraffin embedding station and allows for simple operation and precise control, resulting in improved quality, a smooth workflow and reliability. |
| LEICA Arcadia C | Leica | Cat: 14039354102 | It is a cold plate holding more than 60/65 cassettes on its large working surface. It was designed with an environment adaptive control module to make sure the operating temperature is always stabilized at -6°C. |
| CaseViewer Software | 3DHISTECH |
References
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