Summary
यह प्रोटोकॉल 7 दिन पुराने चूहों में नवजात पूति की स्थापना और मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक कदम प्रदान करता है ।
Abstract
नवजात पूति एक वैश्विक बोझ बना हुआ है । प्रभावी नियत्रंण या चिकित्सीय हस्तक्षेप स्क्रीन करने के लिए एक नैदानिक मॉडल की जरूरत है । नवजात माउस polymicrobial पूति जीवन के दिन 7 चूहों में cecal घोल intraperitoneally इंजेक्शन द्वारा प्रेरित किया जा सकता है और उन्हें अगले सप्ताह के लिए निगरानी. यहां प्रस्तुत विस्तृत इस नवजात पूति मॉडल के कार्यांवयन के लिए आवश्यक कदम उठाए हैं । यह एक सजातीय cecal घोल स्टॉक बनाने शामिल है, यह एक वजन के लिए कमजोर और कूड़े-खुराक समायोजित, निगरानी अनुसूची की एक रूपरेखा, और मनाया स्वास्थ्य के लिए मानव अंतिमबिंदु परिभाषित इस्तेमाल श्रेणियों की एक परिभाषा । एक सजातीय cecal घोल की पीढ़ी परित दानदाताओं से कई कूड़े में प्रशासन के लिए समय पर अनुमति देता है, दाताओं के बीच भिंनता को कम करने, और संभावित विषाक्त ग्लिसरॉल के उपयोग को रोकने । निगरानी की रणनीति का इस्तेमाल अस्तित्व के परिणाम की प्रत्याशा के लिए अनुमति देता है और चूहों की पहचान है कि बाद में मौत की प्रगति, मानव समापन बिंदु की एक पूर्व पहचान के लिए अनुमति देगा । दो मुख्य व्यवहार सुविधाओं के लिए स्वास्थ्य स्कोर को परिभाषित किया जाता है, अर्थात्, नवजात चूहे की क्षमता को सही खुद को जब उनकी पीठ पर रखा और गतिशीलता के अपने स्तर पर । इन मानदंडों संभावित चूहों में नवजात रोग के अन्य अध्ययनों में मानवीय अंतिमबिंदु पता करने के लिए लागू किया जा सकता है, जब तक एक पायलट अध्ययन सटीकता की पुष्टि करने के लिए किया जाता है. अंत में, इस दृष्टिकोण को चूहों में मॉडल नवजात पूति के लिए एक मानकीकृत विधि प्रदान करता है, जबकि पशुओं को चुनौती दी जानवरों के लिए जल्दी मानवीय अंतिमबिंदु परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया कल्याण का आकलन करने के लिए संसाधनों प्रदान ।
Introduction
पूति मानव नवजात संक्रामक मौतों का एक प्रमुख कारण है1. क्योंकि नवजात पूति खराब समझ है, कम प्रगति में जोखिम नवजात शिशुओं की पहचान में किया गया है जल्दी रोग और प्रभावोत्पादक उपचार या prophylaxes के विकास के दौरान । इस प्रक्रिया को बेहतर ढंग से समझने और संभव उपायों का परीक्षण करने के लिए पूति के पशु मॉडलों का उपयोग आवश्यक । इसके अलावा, वयस्क कुतर पूति को अलग तरह से जवाब, बैक्टीरिया की संख्या में सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर के साथ एक ही घातक खुराक (LD) और परिणामी मेजबान प्रतिक्रिया में अंतर प्राप्त करने के लिए प्रशासन के रूप में नवजात शिशुओं की तुलना में2. इस प्रकार नवजात शिशुओं में नवजात पूति का अध्ययन किया जाना है । पूति रिसर्च में कई एडल्ट पूति मॉडल्स का इस्तेमाल किया गया है । ये वयस्क मानव पूति या cecal बंधाव और पंचर (CLP) में फंसा विशिष्ट जीवों के साथ एक नसों में चुनौती शामिल हैं । CLP एक अंतर्जात चुनौती मॉडल है जहां अंधान्त्र शल्य चिकित्सा पृथक है, ligated, और के लिए, अंततः रोगाणुओं और उनके उत्पादों के प्रणालीगत प्रसार के लिए अग्रणी में आंतों सामग्री के रिसाव की अनुमति पंचर । हालांकि, शल्य चिकित्सा CLP स्थापित करने के लिए आवश्यक प्रक्रिया नवजात जानवरों के लिए घातक है; इसलिए, एक वैकल्पिक विधि CLP के polymicrobial चुनौती नवजात पूति प्रेरित करने के लिए नकल करने के लिए आवश्यक है । नवजात polymicrobial पूति के लिए cecal गारा मॉडल इस जरूरत को संबोधित करने के लिए विकसित किया गया था, जिससे जानवरों की cecal सामग्री काटा जाता है, पानी में बाँझ डेक्सट्रोज 5% में निलंबित (D5W), और intraperitoneally नवजात चूहों में इंजेक्शन2. यह है, के बाद से, दोनों नवजात और वयस्क पशुओं में पूति का अध्ययन करने के लिए एक तेजी से लोकप्रिय मॉडल बन गया है और रोग की प्रक्रिया में काफी उन्नत यंत्रवत अंतर्दृष्टि4,5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15।
इस मॉडल और शोधकर्ताओं की इच्छा के बढ़ते उपयोग को देखते हुए सीधे प्रकाशनों भर में परिणाम की तुलना, वहां तकनीकी पहलुओं के लिए एक की जरूरत है अच्छी तरह से वर्णित है और अध्ययन के पार मानकीकृत । मानकीकरण मॉडल के तीन पहलुओं पर लागू होता है, अर्थात्, i) cecal घोल स्टॉक की तैयारी, ii) प्रायोगिक पशुओं में इंजेक्शन के लिए चुनौती aliquots की तैयारी, और iii) मानव समापन बिंदु की परिभाषा जिससे जानवरों चुनौती प्रयोगों में जीवित बचे समझी जाती हैं. विशेष रूप से, तरीके cecal घोल स्टॉक तैयार करने के लिए अक्सर मूल मॉडल2शुरू लेख को संदर्भित कर रहे हैं । कि मॉडल का एक संक्षिप्त सारांश यह है कि वयस्क चूहों से cecal सामग्री काटा गया, बाँझ D5W में ८० मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता के लिए निलंबित कर दिया, और 2 के भीतर इस्तेमाल किया प्रायोगिक पशुओं इंजेक्षन करने के लिए एच । इस मूल मॉडल एक ही उंर के चूहों का इस्तेमाल किया, एक ही विक्रेता स्थान है, जो अपने अनुसंधान सुविधाओं में से कम 2 सप्ताह के लिए cecal सामग्री संचयन से पहले के लिए स्थित थे से । घर में चूहों नस्ल का उपयोग करते हैं, हालांकि नियमित रूप से विक्रेता के वितरण से लागत को कम करने और सेक्स और उंर की एक व्यापक रेंज के अतिरिक्त चूहों के उपयोग के लिए अनुमति देता है, भी काफी बढ़ दाता को दाता परिवर्तनशीलता । यह एक वैकल्पिक तकनीक के विकास के लिए प्रेरित किया, जिससे कई चूहों से cecal सामग्री एक साथ परित थे एक बड़े भंडार है, जो तब aliquoted और पर संग्रहित-८० डिग्री सेल्सियस13तैयार थे । इस वैकल्पिक विधि कई समूहों द्वारा अनुकूलित किया गया था14,15. हालांकि, कि अनुकूलन कुछ तकनीकी बदलाव के परिणामस्वरूप, दोनों भंडारण मीडिया में इस्तेमाल किया (10% या 15% ग्लिसरॉल, या अकेले D5W) और निस्पंदन की रणनीति में कण को हटाने के लिए (एक ८६० µm के माध्यम से multistage निस्पंदन और, तो, एक १९० µm फ़िल्टर, या व्यक्तिगत १०० µm या ७० µm फिल्टर के माध्यम से निस्पंदन)13,14,15. अकेले ग्लिसरॉल के इंजेक्शन संभावित नुकसान का कारण हो सकता है, यह देखते हुए कि 25%-५०% ग्लिसरॉल इंजेक्शन गुर्दे की चोट का एक कुतर मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है16,17,18,19, 20। ग्लिसरॉल के अवांछित दुष्प्रभाव से बचने के लिए, इस अध्ययन में चूहों के लिए cecal घोल स्टॉक तैयारी ग्लिसरॉल बिना D5W में जम जाता है, और-८० डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से बैक्टीरियल व्यवहार्यता का परीक्षण किया जाता है । इस अध्ययन में इस्तेमाल किया निस्पंदन रणनीति सूचीबद्ध अन्य निस्पंदन रणनीतियों की तुलना में सीधे नहीं किया गया है, जो एक ७० µm फिल्टर, के माध्यम से एक पास है ।
घातक वजन-इंजेक्शन cecal घोल की खुराक समायोजित सुविधा से सुविधा के लिए भिन्न हो सकते हैं और व्यक्तिगत समूहों के लिए वांछित घातकता के लिए बाहर titered किया जाना चाहिए. अलग चुनौती खुराक के साथ, आवश्यकता के साथ चुनौती संस्करणों में परिवर्तन. हालांकि, इस methodological विस्तार से पहले रिपोर्ट नहीं की गई है । इसके अलावा, intraperitoneal इंजेक्शन के रूप में मानक प्रक्रियाओं, के लिए रणनीतियों, शायद ही कभी साहित्य के भीतर पर सविस्तार हैं, लेकिन व्यक्तिगत तकनीक को प्रभावित कर सकता है कि नवजात चूहों रिसाव जब इंजेक्शन और उनके अंतिम परिणाम प्रभाव ।
मानव समापन बिंदु की एक परिभाषा सहित पशु कल्याण, इस मॉडल का एक केंद्रीय पहलू और21कुतर में संक्रमण और सूजन के किसी भी मॉडल में है । १९९८ में, कनाडा के पशु देखभाल पर परिषद (CCAC) मानव समापन बिंदु चयन के लिए व्यापक दिशानिर्देश प्रकाशित, "किसी भी वास्तविक या संभावित दर्द, संकट, या असुविधा के रूप में मानव समापन बिंदु को परिभाषित किया जाना चाहिए कम या ज्यादा से जल्द से कम समापन बिंदु है कि अनुसंधान के वैज्ञानिक उद्देश्यों के साथ संगत है "22। दूसरों को भी चेतावनी है कि मानव अंतिमबिंदु वैज्ञानिक औचित्य के आधार पर स्थापित किया जाना चाहिए बजाय21अकेले पशु राज्य की एक व्यक्तिपरक व्याख्या पर । जबकि वहां नैदानिक, व्यवहार के लिए संसाधनों का खजाना है, और मानव समापन बिंदु के लिए शरीर की स्थिति पर हस्ताक्षर आधारित मानदंडों, यहां तक कि संक्रमण और सूजन के संदर्भ में विशेष रूप से21,23,24, इनमें से कोई नहीं , मानव समापन बिंदु22के लिए CCAC दिशानिर्देश सहित, नवजात चूहों का उल्लेख । इस प्रकार, होना चाहए और वैज्ञानिक रूप से न्यायोचित मानव अंतिमबिंदु है और अधिक कठिन नवजात जानवरों के लिए स्थापित करने के लिए, दोनों अपने सीमित व्यवहार क्षमताओं और वजन घटाने, जो आमतौर पर वयस्क के लिए इस्तेमाल किया जाता है जैसे मानदंडों से सबूत की कमी को देखते हुए चूहों. वर्तमान में, मानव समापन बिंदु के लिए मानदंड 5 के लिए इस्तेमाल किया cecal घोल साहित्य में 12 दिन पुराने नवजात चूहे सभी मूल पांडुलिपि है कि मॉडल2शुरू करने के लिए वापस संदर्भ । इस मूल पत्र में, नवजात पशुओं के लिए मानव समापन बिंदु की परिभाषा दो मानदंडों पर आधारित थी; अर्थात्, घोंसला के बाहर एक चूहे का स्थान (कैटरिंग) और दूध के धब्बे की कमी के कारण घंटों के भीतर मौत का परिणाम देखा गया था । एक मानवीय समापन बिंदु निर्दिष्ट करने में एक उलझी बात यह है कि दूध स्पॉट ऐसे आमतौर पर कार्यरत C57BL/6J तनाव के रूप में अंधेरे फर, जीवन के पहले सप्ताह के बाद के रूप में, जबकि बीमार पशुओं को जीवन के 14 दिन (राजभाषा) तक नजर रखी है के साथ माउस उपभेदों में देखना मुश्किल हो गया है । इसके अलावा, मृत जानवरों postchallenge पाया जा सकता है जब इन मानदंडों को लागू (स्वयं अवलोकन; अप्रकाशित); इस प्रकार, मानव समापन बिंदु की एक और अधिक कठोर परिभाषा प्रयोगात्मक पशुओं को पीड़ित को कम करने और स्थितियों में मृत्यु दर से बचने के लिए आवश्यक है, जहां परिणाम सही पहले समझदार हो सकता है ।
cecal घोल मॉडल के सभी तीन methodological पहलुओं एक मानक ऑपरेटिंग cecal घोल स्टॉक की तैयारी का ब्यौरा प्रक्रिया में प्रस्तुत कर रहे हैं, प्रयोगात्मक जानवरों है कि खुराक के बीच लगातार इंजेक्शन की मात्रा रहता है और इंजेक्शन के लिए एक विधि लीक के जोखिम को कम कर देता है, और 7 के लिए मानव समापन बिंदु की परिभाषा-दिन-पुराने चूहों व्यवहार मॉडलिंग की एक प्रणाली पर आधारित है । २४० से अधिक प्रयोगात्मक पशुओं से माउस स्वास्थ्य स्कोर के व्यवहार की जानकारी एकत्र की और अंतिम अस्तित्व के परिणाम द्वारा समूहीकृत किया गया था, एक सबूत के प्रदर्शन मानव समापन बिंदु की परिभाषा संचालित । प्रयोगात्मक पशुओं की पीड़ा से कम से जल्द संभव समय बिंदु पर मरणासन्न नवजात चूहों की पहचान, जबकि जैविक रूप से महत्वपूर्ण अस्तित्व के परिणामों के प्रमुख चर देख द्वारा आस्थगित किया जा सकता है । दोनों cecal घोल तैयारी और नवजात माउस व्यवहार के दृश्य प्रतिनिधित्व किसी भी समूह पूति या नवजात चुनौती मॉडल जानवरों का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट संसाधन के रूप में काम करेंगे ।
Protocol
इस प्रोटोकॉल में सभी प्रयोगों को यूनिवर्सिटी ऑफ ब्रिटिश कोलंबिया एनिमल केयर कमेटी ने प्रोटोकॉल नंबर A17-0110 के तहत मंजूरी दी है ।
1. टूल नसबंदी
- एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में, चालू करें और गर्म मनका बंध्याकरण २५० डिग्री सेल्सियस, उपयोग करने से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए कचौरी ।
- ७०% इथेनॉल में उपकरण डुबकी ।
- 1 मिनट की एक ंयूनतम के लिए गरम गर्म मनका नसबंदी में उपकरण जलमग्न ।
नोट: उपकरण के हैंडल गर्म हो जाएगा और अगर १.५ मिनट के लिए गर्म मनका नसबंदी में छोड़ दिया जला सकते हैं । - यह निष्फल करने के लिए ७०% इथेनॉल के साथ कागज तौलिए की एक चटाई स्प्रे ।
- अंय जलमग्न उपकरण के बाँझ संभालती करने के लिए उपकरण के निष्फल भाग को छूने और उंहें इथेनॉल छिड़काव कागज तौलिए पर जगह के बिना गर्म मनका बंध्याकरण से उपकरण निकालें । । । । ।
- 30 एस के लिए उपकरण के लिए 2 मिनट के लिए रुको उंहें विच्छेदन के लिए उपयोग करने से पहले शांत हो जाओ ।
2. Cecal घोल तैयार करना
- 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों (हर पांच चूहों euthanized जा रहा है के लिए एक ट्यूब) का वजन ।
- Euthanize cecal घोल दाताओं स्थानीय पशु देखभाल दिशानिर्देश के अनुसार या नीचे प्रोटोकॉल का उपयोग करें ।
नोट: अप करने के लिए ४० C57BL/6J चूहों के बीच 6 और 12 सप्ताह पुरानी cecal घोल तैयारी के लिए इस्तेमाल किया गया, अप करने के लिए पांच चूहों के साथ एक समय में euthanized जा रहा है.- इच्छामृत्यु चैंबर में चूहों स्थानांतरण और ऑक्सीजन छिड़काव के साथ 5% करने के लिए isoflurane संज्ञाहरण मशीन सेट ।
- चूहों की निगरानी करने के लिए ले जाने की क्षमता के नुकसान का पालन करने के लिए और उन्हें संज्ञाहरण के सर्जिकल विमान में प्रवेश देखने के लिए और अंत में, साँस लेना बंद करो.
- इच्छामृत्यु चैंबर से एक माउस को हटाने के लिए, अपने पंजा चुटकी और किसी भी पैर कर्षण या साँस लेना निरीक्षण । या तो मौजूद है, इच्छामृत्यु चैंबर के लिए माउस वापस; अंयथा, जारी रखें ।
- टर्मिनली तेज ग्रीवा विस्थापन द्वारा चूहों euthanize ।
- अंधान्त्र विच्छेदन, एक बीएससी में (देखें अनुभाग 1) का उपयोग कर, निष्फल और ठंडा उपकरण का प्रदर्शन ।
- माउस के पैरों को पिन एक बाहर polystyrene फोम बोर्ड का उपयोग कर 23 जी सुई ताकि माउस अपने पेट ऊपर है । सुरक्षित और फिर ७०% इथेनॉल के साथ पेट स्प्रे ।
- बाँझ संदंश और कैंची, त्वचा के माध्यम से कटौती का उपयोग करना, कैंची के साथ पेरिटोनियल अस्तर से त्वचा को ढीला, और उरोस्थि करने के लिए कमर से एक आयताकार क्षेत्र खोलने में कटौती, और दाईं ओर बाईं ओर. किसी भी फर से निकालो ।
- बाँझ उपकरण की एक नई जोड़ी के लिए स्विच करने के लिए, त्वचा के लिए किया गया था के रूप में एक आयताकार खोलने बनाने, उपकरण स्विचन अगर लोगों को त्वचा से संपर्क किया ।
- अंधान्त्र, जो शरीर के पार सही करने के लिए छोड़ दिया चलना चाहिए की पहचान । संयोजी ऊतक को बाधित आंतों से अंधान्त्र शाखाओं की पहचान करने के लिए और आंतों से दूर अंधान्त्र में कटौती । वजनी कागज की निष्फल चादर पर अंधान्त्र रखें ।
नोट: कागज वजनी यह दोनों पक्षों पर ७०% इथेनॉल के साथ छिड़काव और यह शुष्क, या यूवी विकिरण द्वारा छोड़ने के द्वारा या तो निष्फल किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, अंधान्त्र बाँझ पेट्री प्लेट पर विच्छेदित किया जा सकता है ।
- Cecal सामग्री बाहर निकालना
- एक बीएससी में, अंधान्त्र के दोनों सिरों के माध्यम से कटौती करने के लिए बाँझ उपकरण का उपयोग करें.
- बाँझ संदंश के साथ अंधान्त्र के बीच पकड़ो और एक फ्लैट बाँझ धातु रंग का उपयोग करने के लिए धीरे कटौती से बाहर cecal सामग्री धक्का समाप्त होता है, एक रोलिंग गति का उपयोग कर और एक परिमार्जन प्रस्ताव है कि उपकला फाड़ सकता से परहेज. सामग्री ले लीजिए और उंहें एक तौला 15 एमएल केंद्रापसारक ट्यूब में जगह है ।
- एक ही ट्यूब में पांच चूहों की एक अधिकतम से cecal सामग्री पूल. फिर से एक बार सभी सामग्री जोड़ा गया है ट्यूब तौलना ।
नोट: ३०० मिलीग्राम की एक औसत की उंमीद है, और अप करने के लिए ३९० मिलीग्राम प्रति माउस cecal घोल के, १.८ की आवश्यकता होती है D5W के २.४ मिलीलीटर प्रति माउस resuspension के लिए; इसलिए, इस चरण के दौरान पांच से अधिक चूहों का उपयोग कर 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब भर में परिणाम कर सकते हैं । - एक इथेनॉल छिड़काव कागज तौलिया के साथ साफ उपकरण पोंछ और उंहें दोहराएं कदम 1.2-1.6 द्वारा पुनः निष्फल ।
- Cecal घोल निस्पंदन
- cecal सामग्री से भरे केंद्रापसारक ट्यूब वजन और D5W की राशि की गणना milliliter प्रति मिलीग्राम में वांछित शेयर एकाग्रता द्वारा cecal सामग्री के वजन को विभाजित करके cecal सामग्री को जोड़ने के लिए, के रूप में नीचे समीकरण में ।
- एक बीएससी में, cecal सामग्री युक्त 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए बर्फ ठंड D5W की आवश्यक राशि जोड़ें ।
- भंवर 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब खड़ी और क्षैतिज के लिए 30 एस व्यास में 1-3 मिमी से अधिक के कण के लिए जांच करें, और यदि वर्तमान, भंवर जारी जब तक सभी बड़े कण दिख गायब हो गया है ।
- एक ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब कि बर्फ पर रखा गया है में एक बाँझ ७० µm सेल छलनी प्लेस । पिपेट सेल छलनी में resuspend cecal घोल के 4 मिलीलीटर और, तो संग्रह ट्यूब के लिए । pipetting ऊपर और नीचे 2x-3x द्वारा कण resuspend । धीरे बुलबुले को छानने की गति बढ़ाने के लिए पिपेट टिप के साथ सामग्री सरगर्मी जब तक वहां कोई और बूंदें फ़िल्टर किया जा रहा है ।
नोट: जब मिश्रण, वहां काफी बड़े कण को 5 मिलीलीटर पिपेट प्लग हो सकता है । इस मामले में, कदम 2.5.3 से भंवर दोहराने, और अगर समाधान अभी भी अलग नहीं तोड़ करता है, पिपेट का उपयोग करने के लिए केंद्रापसारक ट्यूब की दीवार के खिलाफ कण दबाएं । - दोहराएँ चरण 2.5.4, cecal घोल के प्रत्येक ट्यूब के बीच सेल उपभेदों बदलने, और एक ही ५० मिलीलीटर में सभी सामग्री पूल, संग्रह ट्यूब बर्फ पर रखा, या एक दूसरे में ५० एमएल केंद्रापसारक ट्यूब अगर छानने का खंड बर्फ के बॉक्स में बर्फ के स्तर से अधिक है ।
- cecal सामग्री से भरे केंद्रापसारक ट्यूब वजन और D5W की राशि की गणना milliliter प्रति मिलीग्राम में वांछित शेयर एकाग्रता द्वारा cecal सामग्री के वजन को विभाजित करके cecal सामग्री को जोड़ने के लिए, के रूप में नीचे समीकरण में ।
- cecal घोल को Aliquot ।
- यदि लागू हो, एक बड़ा बाँझ कंटेनर (जैसे, एक १,००० मिलीलीटर भंडारण बोतल) में कदम 2.5.5 से एकाधिक ५० मिलीलीटर cecal घोल निस्पंदन ट्यूबों का मिश्रण । फिर, 15 एस के लिए भंवर और जगह 20 मिलीलीटर एक नया ५० एमएल केंद्रापसारक ट्यूब में ।
- भंवर cecal घोल स्टॉक है कि 5-10 एस के लिए ५० एमएल केंद्रापसारक ट्यूब में है, और aliquot ५०० µ एल तीन 2 मिलीलीटर क्रायोजेनिक शीशियों में है कि एक रबर सील है, समय के साथ वाष्पीकरण को रोकने के लिए । तुरंत मास्टर स्टॉक और aliquoted क्रायोजेनिक शीशी को बर्फ पर लगाएं.
- दोहराएं कदम 2.6.1 और 2.6.2 जब तक cecal घोल के सभी aliquoted गया है, हर तीन क्रायोजेनिक शीशियों के बाद किसी भी कण के बसने को रोकने के लिए और एक सजातीय मिश्रण बनाए रखने के बाद मास्टर स्टॉक भंवर ।
- -८० ° c पर cecal घोल aliquots फ्रीज ।
नोट: प्रत्येक वयस्क माउस से ५०० µ l पर तीन से चार स्टॉक शीशियों के बीच अपेक्षा करें । प्रत्येक शेयर शीशी लगभग पर्याप्त के लिए एक लिटर 7 पर आठ चूहों के कूड़े चुनौती होना चाहिए ।
3.7 दिन पुराने नवजात चूहों की पूति चुनौती
- अलग, पहचान, और नवजात चूहों तौलना.
- एक बीएससी में चूहों को बांध से दूर रखने और बांध को तनाव कम करने के लिए नवजात चूहों को एक नए पिंजरे में ट्रांसफर करें ।
- निकालें और दस्ताने के लिए पिंजरे की गंध हस्तांतरण करने के लिए के साथ घोंसले के माल सामग्री का हिस्सा रगड़ना । फिर, घोंसले के एक छोटे घोंसले में सामग्री मोल्ड और बांध के बिना एक नए पिंजरे में जगह है ।
- नवजात चूहों को नए पिंजरे में घोंसले के माल के लिए स्थानांतरण ।
- नए पिंजरे में एक दूसरा, खाली घोंसला बनाने के लिए और अधिक घोंसले के माल हस्तांतरण ।
- बंद करो और हुड से बांध के पिंजरे को हटा दें ताकि बांध को नवजात चूहों के कष्टों में से कोई भी सुनने से तनाव न हो ।
- समय के साथ कूड़े के भीतर व्यक्तिगत नवजात चूहों को ट्रैक करने के लिए, एक इथेनॉल प्रूफ मार्कर का उपयोग करने के सामने या पूंछ के रिवर्स पर एक से पांच डॉट्स निशान, जरूरत के रूप में हर 12-24 एच फिर से लागू ।
- प्रत्येक माउस है कि, चुनौती दी जाएगी वजन के बाद माध्यमिक घोंसले में प्रत्येक रखकर तौलना, और सभी चूहों के लिए इस दोहराने ।
- cecal घोल तैयार करने से पहले बांध के लिए पूरे कूड़े को लौटाना चुनौती aliquot.
- व्यक्तिगत वजन cecal घोल की खुराक समायोजित की गणना और प्रत्येक कूड़े के लिए इस कदम को पूरा करने के द्वारा D5W के साथ आवश्यक कमजोर पड़ने, नीचे की गणना का उपयोग कर या उपलब्ध कराए गए कार्यपत्रक का उपयोग ( पूरक फ़ाइलदेखें) ।
- cecal घोल की मिलीग्राम की गणना (एक) के लिए ग्राम में माउस के वजन गुणा द्वारा प्रत्येक माउस के लिए प्रशासित किया जा (ख) माउस के ग्राम प्रति cecal घोल की मिलीग्राम में वांछित चैलेंज खुराक द्वारा (ग).
- पतला cecal घोल microliters में प्रति माउस की व्यक्तिगत मात्रा की गणना (डी) cecal घोल की मिलीग्राम प्रति कदम से माउस की जरूरत 3.2.1 (एक) द्वारा शेयर cecal घोल एकाग्रता, cecal घोल के १६० मिलीग्राम विभाजित करके D5W (e) के प्रति milliliter, और १,००० µ l से गुणा करके milliliter को मिलीलीटर से microliters में रूपांतरित करना.
- cecal प्रति माउस (जी) की मात्रा cecal घोल स्टॉक (डी) n चूहों के एक कूड़े में प्रति माउस, चूहों की संख्या (एन) से विभाजित द्वारा माप के औसत स्टॉक मात्रा ।
- cecal घोल स्टॉक (एच) के लिए औसत कमजोर पड़ने फैक्टर की गणना औसत इंजेक्शन की मात्रा (१०० µ एल) द्वारा cecal घोल की औसत स्टॉक मात्रा प्रति माउस (g) के अनुसार विभाजित करके ।
- microliters में प्रत्येक माउस के विशिष्ट इंजेक्शन की मात्रा कीगणना स्टॉक cecal घोल के प्रत्येक माउस की मात्रा को गुणा करके (घ) औसत कमजोर पड़ने कारक (एच) द्वारा, और फिर यह दौर से निकटतम दस (मैच के लिए इंजेक्शन सिरिंज के 10 µ l वेतन वृद्धि).
- औसत इंजेक्शन मात्रा (१०० µ l) से औसत cecal घोल स्टॉक (g) घटाकर cecal घोल स्टॉक (k) को पतला करने के लिए D5W की औसत आवश्यक मात्रा की गणना करें.
- इस कूड़े (n) में चूहों की संख्या के द्वारा microliters (g) में प्रति माउस औसत स्टॉक cecal घोल गुणा करके microliters (एल) में cecal गारा स्टॉक की कुल राशि की गणना और अतिरिक्त बनाने के लिए १.४ से गुणा ।
- microliters (m) में D5W की कुल राशि की गणना चूहों की संख्या (n) द्वारा D5W (k) की औसत अपेक्षित मात्रा गुणा करके cecal घोल स्टॉक को पतला करने के लिए और अतिरिक्त बनाने के लिए १.४ द्वारा गुणा करने के लिए आवश्यक.
- cecal घोल की मिलीग्राम की गणना (एक) के लिए ग्राम में माउस के वजन गुणा द्वारा प्रत्येक माउस के लिए प्रशासित किया जा (ख) माउस के ग्राम प्रति cecal घोल की मिलीग्राम में वांछित चैलेंज खुराक द्वारा (ग).
- तैयार स्टॉक cecal घोल की मात्रा की गणना के बाद चुनौती aliquot (एल से कदम 3.2.7) । एक बीएससी में, गल cecal घोल की अपेक्षित संख्या कमरे के तापमान पर स्टॉक शीशियों, pipetting अपनी सामग्री मिश्रण करने के लिए ।
- जब कोई और अधिक दिखाई बर्फ पिघला हुआ cecal घोल में क्रिस्टल मौजूद हैं, cecal घोल स्टॉक की गणना की राशि (एल कदम 3.2.7 से) एक बाँझ १.८ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब हस्तांतरण ।
- कदम 3.2.8 (एम) में परिकलित के रूप में बर्फ शीत D5W जोड़कर आवश्यक एकाग्रता को पतला । बर्फ पर चैलेंज aliquot स्टोर ।
- सिरिंज लोड करने से पहले, यह 20x, ऊपर ड्राइंग और एक ५०० सीसी 28 जी ½ इंच इंसुलिन सिरिंज के साथ cecal घोल के 300-500 µ एल को निष्कासित करने के 3x द्वारा पीछा द्वारा microcentrifuge ट्यूब मिश्रण ।
- एक ही सिरिंज में पतला cecal घोल के मोटे तौर पर १५० µ एल ड्रा ।
- गोताख़ोर से बुलबुले बेदखल करने के लिए सिरिंज झटका, सिरिंज पर थोड़ा वापस आकर्षित, और फिर बुलबुले निष्कासित.
- अतिरिक्त cecal घोल वापस microcentrifuge ट्यूब में एक माउस के लिए cecal घोल की सही मात्रा तक वितरण, के रूप में कदम 3.2.5 (जे) में व्यक्तिगत चूहों के लिए गणना की गई, सिरिंज में भरी हुई है ।
- Intraperitoneally cecal घोल सुई, प्रासंगिक स्थानीय पशु देखभाल संस्था के दिशा निर्देशों के अनुसार, या नीचे उल्लिखित चरणों का उपयोग करें ।
- एक बीएससी में चरण ३.१ में बताए गए अनुसार नवजात चूहों को बांध से अलग करें ।
- गर्दन के पीछे से माउस को Scruff, अंगूठे और तर्जनी का प्रयोग करें ।
- बीच और अंगूठी उंगलियों, या अंगूठी और गुलाबी रंग की उंगलियों के मोर्चे पर पीठ के पार माउस की पूंछ सुरक्षित ।
- रिसावों को कम करने के लिए, नवजात माउस झुकाव इतना है कि यह नीचे चेहरे और सुई की सुई बेवल डालने का सामना करना पड़, पैर और जननांग के बीच, सुई उथले और चमड़े के नीचे रखने.
- जब सुई 1 सेमी के लिए डाला जाता है, नीचे प्रेस और आगे सुई महसूस करने के लिए, आँख पंचर । पार्श्व आंदोलनों माउस के अंगों को नुकसान पहुंचा सकता है के रूप में धीरे से, गोताख़ोर दबाना, संभव के रूप में स्थिर सुई की नोक रखते हुए ।
- ध्यान से 5-10 एस पर सुई वापस लेने के रूप में बाहर एक ही मार्ग के बाद, हटाने के दौरान बीच की उंगली आराम करने के लिए है माउस शरीर में तनाव को कम ।
- लीक के लिए जांच करने के लिए, सुई के हटाने के बाद कुछ सेकंड के लिए माउस पकड़, इंजेक्शन साइट को बंद करने के लिए समय की अनुमति है, और किसी भी रिसाव या इंजेक्शन साइट पर उभार का पालन, जिस पर बात माउस विश्लेषण में इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए.
नोट: इंजेक्शन साइट पर त्वचा के उभार एक असफल intraperitoneal इंजेक्शन, इंजेक्शन के साथ चमड़े के नीचे जा रहा है इंगित करता है । - एक कागज तौलिया पर माउस प्लेस और माउस एक कदम उठाने की अनुमति । अगर माउस 5 एस के लिए मोबाइल है, तो हल्के से पूंछ दबाएं ।
- माउस उठाओ और इंजेक्शन साइट पर cecal घोल के किसी भी रिसाव के लिए जांच करें । यदि कोई रिसाव है, तो माउस को विश्लेषण से बाहर निकालें और माउस को euthanize ।
4. माउस की निगरानी
- एक मानवीय समापन बिंदु पर पहुंचने के लिए उंहें जांच करने के लिए नियमित रूप से चूहों की निगरानी ।
- किसी भी इंजेक्शन से संबंधित जटिलताओं के लिए चूहों 2 एच postchallenge का निरीक्षण ।
- पूति से संबंधित रुग्णता और एक मानवीय समापन बिंदु पर चूहों की पहचान के लिए चूहों 12 ज postchallenge मॉनिटर (कदम 4.2-4.3 मानदंड के लिए देखें).
- बाद में पहले 2 दिनों के लिए हर 4-6 ज की निगरानी, 8 घंटे के अलावा रात, जब नवजात चूहों को उपेक्षित कर रहे हैं ।
- परे 2 दिन postchallenge, मॉनिटर 1x-2x प्रति दिन । यदि बीमार चूहों या चूहों जिसका स्वास्थ्य स्कोर कम हो जाता है मनाया, तो हर 4-6 एच के लिए निगरानी आवृत्ति को बढ़ाने के.
- नवजात चूहों की निगरानी
- किसी भी नवजात चूहों को शामिल प्रक्रिया के लिए, एक नया पिंजरे के लिए बिस्तर सामग्री हस्तांतरण के रूप में ३.१ कदम में वर्णित (एक ही कारण के रूप में वहां उल्लेख किया है) । ध्यान से किसी भी नवजात शिशुओं है कि घोंसले से घसीटा है जबकि नर्सिंग के लिए जांच करें । किसी भी चूहे कि कूड़े से बाहर घसीटा जाता है जबकि नर्सिंग को चूहों को बिखरा हुआ नहीं माना जाना चाहिए.
- जब घोंसले के ऊपर हटाने, नवजात चूहों के किसी भी तितर बितर की पहचान या तो घोंसला से दूर या घोंसले के माल में फंस गया है, लेकिन अपने littermates से दूर, जबकि नर्सिंग कूड़े से दूर घसीटा चूहों के अपवाद के साथ. यदि कोई माउस बिखरा हुआ पाया जाता है, तो चरण ४.५ में मानव समापन बिंदु मापदंड देखें ।
- चूहों की लेकन सजगता और गतिशीलता को मापने.
- एक कागज तौलिया पर, अपनी पीठ पर एक माउस प्लेस और मॉनिटर अपनी क्षमता के लिए सही खुद को 4 एस की एक अधिकतम के भीतर । जब इसकी पीठ पर रखा, माउस या तो छोड़ दिया है या सही पक्ष है, जो है जब 4 एस गिनती शुरू होता है गिर जाएगी ।
नोट: "अधिकार" समूह में वर्गीकृत किया जा करने के लिए, माउस के लिए कागज तौलिया पर चार पंजा पैड के कम से तीन पाने के लिए सक्षम होना चाहिए 1 एस । यह अभी भी के रूप में समूहीकृत किया जा रहा है सही खुद को सक्षम अगर यह खत्म हो जाता है ।- अगर माउस सही ही कर सकते हैं, तो 8 एस के लिए प्रतीक्षा करने के लिए गतिशीलता के अपने स्तर का निर्धारण ।
- "अधिकार-मोबाइल" के रूप में माउस श्रेणीबद्ध करें यदि यह सही खुद कर सकते है और एक पंक्ति में कई कदम उठा कर अपने पर्यावरण का पता लगाने ।
- "अधिकार सुस्त" अगर यह सही ही कर सकते है और अपने पर्यावरण का पता लगाने के लिए कुछ कदम उठाने के रूप में माउस वर्गीकृत । इस समूह में चूहे एक कदम उठाते समय गिर सकते हैं, अपने पैरों पर अस्थिर देखो, और कदम के बीच थामने ।
- "अधिकार-गैर-मोबाइल" के रूप में माउस श्रेणीबद्ध अगर यह सही ही कर सकते हैं, लेकिन एक बहुत चारों ओर कदम नहीं है । यह अभी भी गिर सकता है, और अगर यह 8 एस के भीतर कोई कदम नहीं ले करता है, यह अधिकार के रूप में वर्गीकृत है-गैर-मोबाइल ।
- अगर माउस ही सही नहीं है, तो मनाया हिप आंदोलन के आधार पर अपनी गतिशीलता वर्गीकृत कर सकता है ।
नोट: निगरानी दोहराने से बचें या समय की लंबाई बढ़ाने के लिए माउस उनकी पीठ पर खर्च करता है क्योंकि यह स्कोरिंग प्रणाली और मानव समापन बिंदु को प्रभावित कर सकता है, एक माउस के रूप में है कि खुद को सही में विफल रहता है 4 s के भीतर ही कभी ऐसा कर सकते है तो अधिक समय दिया ।- "विफल करने के लिए सही (FTR) के रूप में माउस वर्गीकृत-मोबाइल" अगर यह सही ही करने में असमर्थ है और हिप आंदोलन है कि क्षैतिज से ९० ° कोण से अधिक प्रदर्शित करता है । कुछ चूहों को खुद को सही कर सकते हैं अगर 4 से अधिक एस दिया लेकिन अभी भी FTR के रूप में वर्गीकृत किया जाना चाहिए, गतिशीलता हिप आंदोलन के आधार पर स्कोर के साथ.
- "FTR-सुस्ती" के रूप में माउस वर्गीकृत अगर यह सही ही करने में असमर्थ है और क्षैतिज से ९० ° कोण नीचे हिप आंदोलन को प्रदर्शित करता है ।
- "FTR-गैर-मोबाइल" के रूप में माउस वर्गीकृत अगर यह सही ही करने में असमर्थ है और पैर है कि हिला या कांपना लेकिन कोई हिप आंदोलन है । अंगों का विस्तार या मुकर सकता है लेकिन पार्श्व आंदोलन नहीं है । माउस दिख रहा है बीमार है और मानवीय समापन बिंदु तक पहुंच गया है ।
- एक कागज तौलिया पर, अपनी पीठ पर एक माउस प्लेस और मॉनिटर अपनी क्षमता के लिए सही खुद को 4 एस की एक अधिकतम के भीतर । जब इसकी पीठ पर रखा, माउस या तो छोड़ दिया है या सही पक्ष है, जो है जब 4 एस गिनती शुरू होता है गिर जाएगी ।
- दोहराएं चरण ४.३ माउस के दूसरी ओर, दोनों पक्षों रिकॉर्डिंग ।
नोट: अवलोकन रिकॉर्डिंग के लिए अनुपूरक फ़ाइल देखें । - निर्धारित करें कि क्या माउस एक मानवीय समापन बिंदु पर है और इच्छामृत्यु की आवश्यकता के रूप में तालिका 1में उल्लिखित, और नीचे ।
- चूहों अलग लेकन और गतिशीलता के स्तर में ४.३ और ४.४ चरणों में नोट निगरानी टिप्पणियों के आधार पर वर्गीकृत. माउस की गतिशीलता प्रत्येक पक्ष के लिए मापा जाता है, और मोबाइल व्यवहार माउस इच्छामृत्यु की आवश्यकता है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
- या तो (क) FTR-गैर-मोबाइल या (ख) FTR-सुस्ती के एक लेकन पलटा के साथ किसी भी चूहों असाइन करें और एक मानवीय समापन बिंदु पर होना करने के लिए घोंसले से अलग पाया.
- निगरानी में 20 ज postchallenge से परे समय अंक में, एक मानवीय समापन बिंदु पर जा रहा है के रूप में दोनों पक्षों पर "सही करने के लिए असफल" के एक लेकन पलटा के साथ किसी भी माउस को वर्गीकृत, क्योंकि प्रस्तुत डेटा उच्च सटीकता के साथ भविष्यवाणी है कि इन चूहों अंततः रोग का शिकार, और नहीं पुनर्प्राप्त.
- अलग चूहों कि euthanized किया जा करने के लिए कर रहे हैं, चरण ४.५ में निर्धारित के रूप में. यदि मॉनिटर माउस के रूप में एक मानवीय समापन बिंदु पर नहीं देखा है, यह बांध के बिना नए पिंजरे में दूसरा खाली घोंसला में जगह है, और अंय नवजात चूहों के साथ जारी है ।
- एक बार पूरे कूड़े पर नजर रखी गई है, बांध के साथ पिंजरे में घोंसले के माल के आधे हटो, नवजात चूहों के लिए बीच में कमरे के साथ एक घोंसला सुधार ।
नोट: एक गलत तरीके से बनाए गए घोंसले के कारण चूहों को तितर-बितर कर सकते हैं और उपलब्ध देखभाल की मात्रा को कम कर सकते हैं जो बांध पेश कर सकता है. - नवजात चूहों को बांध के साथ पिंजरे में वापस स्थानांतरण ।
- कूड़े पर बचे हुए घोंसले के माल डाल द्वारा घोंसले में कूड़े को बंद कर देना और धीरे जगह में घोंसले के माल को सुरक्षित करने के लिए ढक्कन के आसपास यह चुटकी ।
- Euthanize नवजात चूहों स्थानीय संस्था आवश्यकताओं के अनुसार चरण ४.६ में अलग कर दिया ।
5. cecal के घोल का अनुमापन
- वांछित चैलेंज खुराक पर चूहों को चुनौती (धारा 3) और परिणामों की निगरानी (धारा 4).
- निरीक्षण चाहे अंतिम परिणाम वांछित LD में, और यदि नहीं, दोहराने वर्गों 3 और 4 एक नए कूड़े के साथ एक उच्च या कम चुनौती खुराक पर, यह 5% द्वारा समायोजन-10%.
नोट: चैलेंज खुराक संख्या 1b के समान हो सकता है, लेकिन प्रत्येक सुविधा और चूहों के तनाव में titered होने की जरूरत है । - इसके अलावा, निरीक्षण क्या चूहों एक मानवीय समापन बिंदु को प्राप्त करने के तेजी से या आंकड़ा 1bमें उंमीद कैनेटीक्स की तुलना में धीमी है, और दोहराने वर्गों 3 और 4 एक उच्च या कम चुनौती खुराक में एक नया कूड़े के साथ, यह 5%-10% द्वारा समायोजन ।
Representative Results
Cecal घोल व्यवहार्यता पर संग्रहित-८० ° c समय पर परीक्षण किया जा सकता है प्रश्नपत्र कमजोर और चढ़ाना aliquots पर Cecal घोल स्टॉक की 5% भेड़ रक्त tryptic सोया आगर के द्वारा 24 के बाद ३७ डिग्री सेल्सियस पर एरोबिक मशीन । culturable कॉलोनी बनाने की इकाई (CFU) एक cecal घोल तैयारी की सामग्री के बाद की गिनती एक 6 महीने की अवधि में बदल नहीं पाया गया था, और व्यवहार्यता पर लंबे समय तक भंडारण से प्रभावित नहीं था-८० ° c (चित्रा 2) । प्रत्येक दाता माउस के परिणामस्वरूप, औसत पर, पर्याप्त cecal घोल में तीन से चार कूड़े को चुनौती (डेटा नहीं दिखाया गया है) ।
चूहों cecal घोल के साथ डॉल 7 पर चुनौती के लिए प्रेरित करने के लिए polymicrobial पूति को चुनौती के 12 ज के भीतर मानव समापन बिंदु तक पहुंचने शुरू हुआ, और polymicrobial पूति ज्यादातर ४८ एच postchallenge द्वारा हल किया गया था, के रूप में एक कापलान-Meier अस्तित्व से संयुक्त वक्र में मनाया २०० से अधिक के डेटा को चुनौती दी चूहों (आंकड़ा 1a). मृत्यु दर चुनौती खुराक पर निर्भर था, चुनौती खुराक में एक 5% परिवर्तन के साथ जीवित रहने की गति में एक मोटे तौर पर 15% अंतर (आंकड़ा 1b) जिसके परिणामस्वरूप । प्रत्येक निगरानी यात्रा में माउस शरीर के वजन मापा गया था । वजन घटाने के सभी चुनौती दी पशुओं में देखा गया था, चूहों के बीच भेदभाव किया जा रहा है कि खत्म हो जीवित और उन है कि प्रारंभिक 24 घंटे के दौरान नहीं किया postchallenge (चित्रा 1C) । 24 घंटे के बाद, सबसे जीवित पशुओं को अपना वजन हासिल करने के लिए शुरू किया, जबकि सभी जीवित बचे लोगों के लिए वजन कम और उनके मानवीय समापन बिंदु पर ले जाया जारी रखा । हालांकि, जीवित पशुओं के एक छोटे से अनुपात है कि उनके लेकन पलटा भी वजन कम करने के लिए जारी रखा था या वजन, प्रयोग के अंत तक विफल रहा है, यहां तक कि उनके प्रारंभिक शरीर के वजन के रूप में ज्यादा के रूप में 20% खो चुनौती के ४० ज के भीतर । के रूप में वहां चूहों के बीच वजन घटाने के एक ओवरलैप है कि ऊपर जीवित समाप्त हो गया था और उन है कि नहीं था, वजन में परिवर्तन या वजन घटाने की दहलीज मानवीय समापन बिंदु के लिए एक कसौटी के रूप में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है, जबकि अभी भी सही विभाजन के बचे लक्ष्य को बनाए रखने से न बचे ।
प्रोटोकॉल में और तालिका 2में उल्लिखित के रूप में चूहों का व्यवहार मॉनीटर किया गया था । स्वास्थ्य श्रेणियों के स्नैपशॉट प्रदर्शित कर रहे है (चित्र 3सी) । इन तस्वीरों को चूहों के विभिंन स्वास्थ्य श्रेणियों जो अपनी पीठ पर रखा जा रहा है और FTR-मोबाइल और FTR-सुस्ती है, जो एक महत्वपूर्ण अंतर है के बीच अंतर रूपरेखा के बाद सही करने में विफल दिखा । इस उम्र के अनचैलेंज्ड स्वस्थ चूहे FTR-सुस्त गतिविधि को प्रदर्शित नहीं करते हैं; इसलिए, इस स्वास्थ्य श्रेणी के रोग का एक मार्कर और चुनौती के लिए एक प्रतिक्रिया है । बीमार चूहों प्रदर्शित FTR-सुस्ती लक्षण (चित्र 3 बी) और FTR की ओर निकासी सकता है-गैर-मोबाइल (चित्रासी), जहां ऊपरी पैर नीचे पैर के साथ समानांतर रहता है, थोड़ा के साथ शूंय कूल्हे का घोड़ा आंदोलन है, जो के लिए मानदंड में से एक है मानव समापन बिंदु । चूहे भी ठीक हो, बढ़ हिप आंदोलन और FTR बनने-मोबाइल (3 एआंकड़ा) हो सकता है । लेकन पलटा और गतिशीलता स्कोर प्रत्येक माउस के बाईं और दाईं ओर दोनों के लिए निर्धारित किया गया था, और उच्चतम स्कोर माउस एक मानवीय समापन बिंदु तक पहुँच गया था कि क्या यह निर्धारित करने के लिए उपयोग किया गया था. व्यवहार की जानकारी से अधिक २४० एक घातक खुराक ६० (एलडी६०) cecal घोल के साथ चुनौती दी पशुओं से एकत्र किया गया था, और १४४ मानव अंतिमबिंदु मनाया गया (चित्रा 3 डी-एफ और तालिका 1) । इस साक्ष्य चालित दृष्टिकोण को परिभाषित करने और चार रोग चरणों में मानव समापन बिंदु को परिष्कृत करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, दोनों बचे और बचे के बीच व्यवहार मतभेदों के आधार पर प्रयोगकर्ता द्वारा वर्गीकृत और मानव अंतिमबिंदु के अंश तक पहुंच प्रत्येक समय सीमा के दौरान । प्रारंभिक प्रयोगों के दौरान, FTR-गैर-मोबाइल चूहों कि कोई हिप आंदोलन था लगातार इस व्यवहार के 4-6 ज के भीतर मृत पाया जा रहा है मनाया जा रहा है । प्रस्तुत जानकारी के संग्रह में, एक FTR-गैर-मोबाइल स्वास्थ्य स्कोर एक मानव समापन बिंदु के लिए मापदंड के रूप में उपयोग किया गया था । 12-21 एच postchallenge से, जबकि FTR-मोबाइल चूहों euthanized थे, दोनों जीवित और जीवित पशुओं बहुत समान व्यवहार पैटर्न प्रदर्शित और किसी भी अंय तरीके से प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है (चित्रा 3 डी) । 21-48 ज postchallenge से, जीवित चूहों के बहुमत उनके लेकन पलटा फिर से आ गया, जबकि कम 1% FTR व्यवहार मनाया जानवरों है कि प्रयोग (चित्रा 3E) जीवित रहने पर जाना होगा में थे । इस प्रकार, चूहे कि दोनों पक्षों से सही खुद को विफल इस समय के दौरान मानव समापन बिंदु के लिए एक अतिरिक्त मानदंड बन गया । 12 और 20 एच postchallenge के बीच, मानवतावादी अंतिमबिंदु की कुल संख्या का १२.५% के बीच मनाया गया, बनाम ८०.५% के बीच 20 और ४८ h, और 7% के बाद ४८ h (तालिका 1). चूहों के बीच एक विशिष्ठ विशेषता है कि ऊपर समाप्त हो गया और जो अंततः एक मानवीय समापन बिंदु को बिगड़ा लेकन पलटा का नुकसान था, हिप गतिशीलता (चित्रा 3F) के स्वतंत्र. वास्तव में, 20 और ४८ के बीच ज चुनौती के बाद, १२१ चूहों की कुल खुद को दोनों पक्षों से सही करने में विफल रहा था, इन चूहों के अंत में एक मानवीय समापन बिंदु करने के लिए प्रगति के ११६ के साथ (जो चूहों की पहचान करने में एक ९६% सटीकता का प्रतिनिधित्व करता है कि ठीक नहीं होगा). परे ४८ ज चुनौती के बाद, 11 चूहों को सही खुद को दोनों पक्षों से विफल मनाया गया, और इनमें से 10 एक मानवीय समापन बिंदु (एक ९१% सटीकता) के लिए प्रगति की । चुनौती के बाद 20 ज परे, चूहों कि दोनों पक्षों के लिए लेकन पलटा खो की संख्या से अधिक ९०% की एक सटीकता के साथ अंतिम परिणाम की भविष्यवाणी; इसलिए, यह मानव समापन बिंदु मापदंड करने के लिए जोड़ा गया है, पहले से ही ठीक करने वाले चूहों की पहचान और माउस दुख (तालिका 1) को कम करने के लिए ।
चूहों समय के साथ परिवर्तन की निगरानी की जरूरत है कि आवृत्ति, मौत postchallenge की विभिन्न दरों के कारण, और तालिका 1में उल्लिखित है. एक माउस को किसी भी बिंदु पर अपने मानवीय समापन बिंदु पर माना जाता था अगर यह सही ही में विफल रहा था और दोनों पक्षों पर unmobile हिप आंदोलन प्रदर्शित, या यदि माउस घोंसले से बिखरे हुए पाया गया था, सही ही करने में असमर्थ था, और सुस्त कूल्हे आंदोलन था । इन शर्तों के साथ या तो चूहों के लिए कूड़े को फिर से जोड़ने के लिए सक्षम होने की उंमीद नहीं की गई थी और 4-6 घंटे के भीतर FTR-गैर-मोबाइल होना करने के लिए मनाया गया है 20 एच शुरू चुनौती के बाद, एक नया मानव समापन बिंदु जोड़ा गया था क्योंकि प्रस्तुत जानकारी से पता चलता है कि विशाल चूहों के बहुमत है कि दोनों पक्षों से FTR रोग के सामने झुकने समाप्त होता है ।
इस पांडुलिपि में प्रस्तुत वीडियो, तालिकाओं, और संसाधनों को चुनौती दी चूहों के सही व्यवहार के काम के लिए एक प्रभावी शिक्षण संसाधन हैं । सात experimenters प्रशिक्षण वीडियो देखने के लिए कहा गया था और दोनों प्रोटोकॉल और ६० को चुनौती दी पशुओं के लिए व्यवहार निर्दिष्ट करने से पहले टेबल पढ़ें । मानव समापन बिंदु असाइनमेंट की पहचान दोनों अलग FTR-मोबाइल चूहों कि अंय व्यवहार (चित्रा 4a) और चूहों से FTR चूहों कि खुद को स्वीकार्य समय सीमा के भीतर सही करने में सक्षम थे चूहों से के लिए सटीक था ( चित्रा 4B).
चित्रा 1 : कापलान-Meier जीवन रक्षा वक्र, cecal घोल खुराक अनुमापन, और वजन परिवर्तन cecal घोल चैलेंज के बाद । (क) नवजात C57BL/6J चूहों के अस्तित्व के परिणाम पर एक intraperitoneal cecal घोल इंजेक्शन के साथ चुनौती दी 7. इस आंकड़े के लिए डेटा एकाधिक चैलेंज खुराक का उपयोग कर स्वतंत्र प्रयोगों से संयुक्त थे, ०.७ से लेकर १.३ मिलीग्राम प्रति ग्राम शरीर के वजन के cecal घोल इन चूहों को प्रशासित किया गया. (ख) नवजात चूहों के साथ चुनौती दी ०.८० करने के लिए ०.९५ मिलीग्राम cecal घोल के प्रति ग्राम शरीर के वजन से एक cecal घोल तैयारी cecal घोल दी की राशि और अस्तित्व का प्रतिशत के बीच एक खुराक पर निर्भर संबंध प्रदर्शित. (ग) चुनौती वजन की तुलना में वजन में परिवर्तन का प्रतिशत, बिंदीदार रेखा के साथ चुनौती के समय से वजन का एक 20% नुकसान टिप्पण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2 : cecal घोल स्टॉक में CFU एकाग्रता-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत एक 6 महीने की अवधि में परिवर्तन नहीं करता है । CFU एकाग्रता पर cecal गारा उंर के प्रभाव रैखिक प्रतिगमन का उपयोग कर परीक्षण किया गया था । प्रत्येक बिंदु एक ही cecal घोल तैयारी के एक aliquot का प्रतिनिधित्व करता है, प्रश्नपत्र पतला और एक 6 महीने की अवधि में चढ़ाया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3 : हिप चूहों की गतिशीलता श्रेणियों है कि सही खुद को और विभिंन समय postchallenge में पशु व्यवहार के असफल । चूहों कि पूति के साथ चुनौती दी है, जब उनकी पीठ पर रखा गया है, रुग्णता के लक्षण है कि हिप आंदोलन की डिग्री से मापा जा सकता है प्रदर्शित करेगा । (एक) एक सही करने के लिए असफल (FTR)-मोबाइल माउस अपने ऊपरी क्षैतिज से ९० ° कोण से अधिक पैर के हिप कमाल आंदोलन से पता चलता है । (ख) एक FTR सुस्त माउस से पता चलता है हिप कमाल आंदोलन लेकिन ९० ° कोण से अधिक नहीं है क्षैतिज से निगरानी के 4 एस के दौरान किसी भी बिंदु पर । (ग) कुछ FTR-गैर-मोबाइल चूहों अपने पैर का विस्तार होगा, घुटने पर झुकने, लेकिन बहुत कम दिखाएगा (10 ° से कम कोण) कूल्हे का घोड़ा आंदोलन शूंय करने के लिए, और पैर एक दूसरे के समानांतर रह जाएगा । (घ) पशु व्यवहार 12-21 ज postchallenge बताते है कि केवल FTR-गैर-मोबाइल व्यवहार अलग बचे से बचे । (ङ) 21 से ४८ h postchallenge, केवल 4 से बाहर ५९२ मनाया FTR व्यवहार (०.६७%) बचे के हैं, लेकन पलटा अंतिम परिणाम की भविष्यवाणी करने के लिए और मानव समापन बिंदु के लिए एक नया criterium के रूप में इस्तेमाल किया जा करने की अनुमति । (च) परे ४८ एच postinfection, 6 से बाहर १३१ चूहों (४.५५%) कि एक लेकन पलटा था पर चला गया FTR समूह का हिस्सा बनने के लिए और प्रयोग के अंत तक बलिदान कर दिया गया, वसूली के पाठ्यक्रम में निरंतर निगरानी का औचित्य साबित. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 : अनुदेशात्मक संसाधन स्वतंत्र प्रयोगकर्ता द्वारा सटीक व्यवहार वर्गीकरण में परिणाम । प्रयोग इस प्रोटोकॉल के साथ वीडियो देख द्वारा प्रशिक्षित विभिंन स्वास्थ्य समूहों में ६० नवजात चूहों के वीडियो वर्गीकृत । (a) एक मानव समापन बिंदु को अलग करने की क्षमता निर्धारित किया गया था और व्यवहार के ९७% की एक औसत सही FTR-मोबाइल या नहीं के रूप में वर्गीकृत किया गया था, जबकि केवल 1% FTR-गैर-मोबाइल चूहों को अज्ञात थे । चूहों की दो प्रतिशत FTR-गैर-मोबाइल के रूप में झूठी पहचान की गई. (ख) FTR चूहों के बीच सही ढंग से भेद करने के दूसरे मानव समापन बिंदु criterium की पहचान या उनकी पीठ पर रखा जा रहा है की 4 s के भीतर सही खुद करने की क्षमता वाले उन स्कोरिंग के ९७% में सही ढंग से सौंपा गया था, जबकि केवल ०.९६% चूहों के रूप में गलत तरीके से असाइन किए गए थे स्वयं और 2% चूहों के गलत तरीके से FTR के रूप में असाइन किए गए थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| रोग अवस्था | एक: उच्च रुग्णता, कोई मृत्युदर | बी: उच्च रुग्णता, कम मृत्यु दर | C: उच्च रुग्णता, उच्च मृत्युदर | डी: कम रुग्णता, कम मृत्यु दर |
| घंटे के बाद चुनौती | 0 − 12 | 12 − 20 | 20 − 48 | > 48 |
| निगरानी आवृत्ति | 2 एच पोस्ट चैलेंज | हर 4 − 6 ज | हर 4 − 6 ज, 8 ज, रात भर घरमा | 1 − 2 बार रोजाना, जरूरत से ज्यादा |
| मनाया कुल मानव समापन के अनुपात | 0/144 | 18/144 | 116/144 | 10/144 |
| मनाया मानव समापन का प्रतिशत | 0 | १२.५% | ८०.५% | 7 |
| मानव समापन बिंदु मानदंड | 1. FTR − दोनों ओर से मोबाइल | 1. FTR − दोनों ओर से मोबाइल | ||
| 2. घोंसले से बिखरे हुए और FTR है − सुस्ती | 2. घोंसले से बिखरे हुए और FTR है − सुस्ती | |||
| 3. FTR दोनों बाईं या दाईं ओर (किसी भी गतिशीलता स्कोर के साथ) | ||||
तालिका 1: निगरानी की आवृत्ति और रोग के विभिन्न चरणों में मानव समापन बिंदु मानदंड. निगरानी आवृत्ति, मानव अंतिमबिंदु मनाया, मानव अंतिमबिंदु का प्रतिशत, और मानव समापन बिंदु रोग के विभिन्न चरणों के दौरान मापदंड.
| लेकन पलटा | गतिशीलता | पीठ पर रखे जाने के बाद सही करने के लिए समय सीमा | आंदोलन की राशि को मापने के लिए समय सीमा (मोबाइल/सुस्ती/ | गतिशीलता स्कोरिंग मानदंड |
| अधिकार | मोबाइल | 4 एस | एक अतिरिक्त 8 एस | माउस एक पंक्ति में कई कदम उठाता है, आगे गति बनाए रखने, और अपने पर्यावरण की पड़ताल । पिल्ला पर गिर नहीं होगा । |
| सुस्त | चूहा कोई कदम उठा सकता है लेकिन दूसरा लेने से पहले रुक और रुका रहेगा । पिल्ला पर गिर सकता है । | |||
| मोबाइल | लेकन खुद के बाद माउस कोई कदम नहीं उठाएगा. पिल्ला पर गिर सकता है । | |||
| दाईं ओर विफल | मोबाइल कूल्हों | वही 4 एस को नाप करते थे लेकन पलटा | ऊपरी पैर के साथ ऊर्जावान कूल्हे आंदोलन है क्षैतिज से ९० ° से परे घूर्णन कम एक बार 4 एस के भीतर । | |
| सुस्त कूल्हों | कूल्हे पर आंदोलन क्षैतिज से ९० ° से परे नहीं है । | |||
| मोबाइल कूल्हों | अंगों को विस्तार और वापस लेने के द्वारा स्थानांतरित कर सकते हैं, लेकिन कूल्हों को घुमाएगी नहीं होगा । पिल्ला बहुत बीमार लग रहा है । |
तालिका 2: निगरानी तालिका और मानदंड चूहों के स्वास्थ्य स्कोर का निर्धारण करने में. प्रदान किए गए मापदंड के लिए चूहों को स्वास्थ्य श्रेणी समूहों को परिभाषित करने के लिए उपयोग किया गया, और व्यक्तिगत प्रसरण स्वास्थ्य स्कोर असाइन करने में कम करने के लिए ।
Discussion
जन्मोत्तर नवजात चूहों बहुत सीमित गतिशीलता है और सही खुद को विफल करने के बाद अपनी पीठ पर रखा जा रहा है, यहां तक कि जब चुनौती दी । 7 डॉल द्वारा, चूहों की आयु इस मॉडल में चुनौती दी गई, अधिकारों से फैले आंदोलन की एक सीमा-मोबाइल FTR-मोबाइल को चुनौती दी चूहों में मनाया गया था, एक महत्वपूर्ण अंतर के साथ, अर्थात् है कि इस उंर में एक चुनौती माउस FTR सुस्त व्यवहार प्रदर्शित नहीं किया । केवल polymicrobial पूति के साथ चुनौती दी चूहों FTR सुस्त बन मनाया गया; इसलिए, इस प्रतिक्रिया रोग गंभीरता का एक मार्कर हो सकता है । हिप आंदोलन के लिए क्षैतिज से एक ९० ° कोण के कटऑफ के लिए चौकस होने के नाते चूहों में सुस्ती या मोबाइल हिप आंदोलन के अनुरूप और सही काम के लिए अनुमति देता है. 4 एस की समय सीमा को देखने के लिए अगर एक माउस सही खुद को चुना गया था क्योंकि चुनौती चूहों को लगातार इस समय सीमा के भीतर खुद को सही कर रहे थे । एक ही माउस का दोहराया माप बचा लिया गया था, जबकि समय के लिए सही खुद को और हिप गतिशीलता की माप 4 एस करने के लिए सीमित था, जरूरत से ज्यादा माउस, जो अंयथा अपने भोजन और गर्मी प्राप्त करने के लिए अपनी क्षमता को प्रभावित कर सकता से बचने के लिए और अपने को प्रभावित कर सकता रोग का निदान बेहतर हो । लेकन खुद को छोड़ दिया और दाईं ओर दोनों से मनाया गया, और स्कोर के उच्च अगर माउस एक मानव समापन बिंदु पर था यह निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, क्योंकि कुछ चूहों FTR-गैर-मोबाइल एक तरफ अभी तक प्रदर्शित करने के लिए पाया गया था दूसरी तरफ और बी एक उच्च गतिशीलता है ई अंततः ठीक करने में सक्षम ।
स्कोरिंग प्रणाली को माउस स्वास्थ्य का मूल्यांकन करने के लिए क्या आंदोलन की एक स्पेक्ट्रम है और इसलिए, व्यक्तिगत पूर्वाग्रह से ग्रस्त हो सकता है के लिए स्पष्ट कटऑफ के आवेदन पर भरोसा करते थे । कर्मचारियों को एक साथ प्रशिक्षित किया गया था सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक व्यक्ति एक ही चूहे बनाए; हालांकि, वहां की संभावना भिंनता के लिए अग्रणी मनोवाद के एक स्तर रहेगा । स्कोरिंग की निरंतरता सात शोधकर्ताओं जो पहले नवजात माउस की निगरानी प्रदर्शन नहीं किया था द्वारा मूल्यांकन किया गया इस प्रोटोकॉल और वीडियो में उल्लिखित आवश्यकताओं को जानने के लिए और, तो, स्वतंत्र रूप से व्यवहार असाइन करें और मानव निर्धारित समापन बिंदु. एक ९७% सटीकता ६० चुनौती दी चूहों पर प्रदर्शन स्कोरिंग के साथ मनाया गया था, सुझाव है कि व्यक्तिगत पूर्वाग्रह इस मॉडल के व्यवहार कार्य में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा नहीं है. प्रस्तुत व्यवहार निगरानी प्रोटोकॉल पर आधारित है जानवरों की टिप्पणियों पर चुनौती दी 7 राजभाषा, अभी तक एक चुनौती स्वस्थ राज्य में 6 दिनों से छोटे चूहे लगातार सही खुद नहीं कर सकते । इस प्रकार, वर्णित मानव समापन बिंदु मानदंड सीधे छोटे चूहों को लागू नहीं किया जा सकता है । यदि युवा चूहों इस प्रयोगात्मक मॉडल में उपयोग किया जाता है या अगर अलग रोग कैनेटीक्स के साथ एक अलग चुनौती मॉडल लागू है, तो उपयुक्त मानव समापन बिंदु मानदंड विकसित किया जाना चाहिए और चूहों कि अंयथा, अंततः होगा की इच्छामृत्यु से बचने के लिए प्रायोगिक तौर पर, पुनर्प्राप्त. स्कोरिंग प्रणाली मानव समापन बिंदु वर्गीकरण है कि, परीक्षण और पुष्टि के साथ, संभावित अंय मॉडलों के लिए लागू किया जा सकता है में सुधार लाने की एक मजबूत विधि प्रदर्शित करता है ।
cecal घोल की प्रत्येक तैयारी या एक नए माउस तनाव के उपयोग के लिए cecal घोल खुराक के retitration की आवश्यकता के लिए एक समान घातक खुराक प्राप्त करने के लिए प्रशासन । प्रत्येक तैयारी readout ब्याज की, अर्थात् जीवित रहने के बजाय एक ही जीवाणु गिनती देने के द्वारा मानकीकृत किया गया था । प्रत्येक cecal घोल तैयारी व्यवहार्य बैक्टीरियल एकाग्रता थोड़ा विविध, संभावित दाता खाना खानेवाला बैक्टीरिया में अंतर के कारण या वजन में विचरण के कारण cecal घोल स्टॉक postfiltration के सेल छलनी में छोड़ दिया । cecal घोल के अनुमापन के दौरान पहले दो कूड़े को दो समूहों में बांटा जाता था और कूड़े के प्रत्येक आधे हिस्से को दो खुराकों में से एक के साथ चुनौती दी जाती थी ताकि प्रत्येक खुराक का दो लिटर में परीक्षण किया जा सके । यदि परिणामस्वरूप जीवित रहने की दर अपेक्षित स्तर से मेल नहीं खाती है, तो चुनौती खुराक या तो बढ़ गया था या 5% से कम-10% और प्रयोग दोहराया । कई कूड़े के लिए कूड़े के लिए खाते में कूड़े मतभेद है कि प्रतिरोध या बढ़ संवेदनशीलता एक कूड़े के पार पूति के कारण हो सकता था । यह सुनिश्चित करने के लिए कि cecal घोल के नए अनुमापन पिछले cecal घोल तैयार करने के लिए तुलनीय था एक नई तैयारी के साथ cecal घोल स्टॉक titer सही करने के लिए महत्वपूर्ण था । अतिरिक्त शोर और कंपन की अवधि, विशेष रूप से डामर की कॉंपैक्ट के दौरान और एक पास के भवन और सड़क के निर्माण, बांधों में तनाव को बढ़ाने के लिए मनाया गया । यह cannibalization की वृद्धि की दर के साथ संबंधित है, और अस्तित्व के प्रयोगों की मृत्यु को प्रभावित किया, यहां तक कि चुनौती चूहों को प्रभावित करने, यह दर्शाता है कि नवजात अस्तित्व है कि भी के लिए नियंत्रित करने की आवश्यकता पर बाहरी प्रभावों हो सकता है.
cecal घोल स्टॉक तैयारी के लिए पहले तरीकों या तो ताजा cecal घोल या जमे हुए cecal घोल की तैयारी का उपयोग शामिल है, ग्लिसरॉल में भंडारण कि अनिवार्य रूप से चुनौती के दौरान स्थानांतरित किया जाएगा सहित तरीकों की एक किस्म का उपयोग कर । जबकि ताजा cecal घोल का उपयोग एक बैक्टीरियल मूल cecal सामग्री के निकटतम संरचना होने का लाभ प्रदान करता है, वहां खाना खानेवाला बैक्टीरिया की भिंनता के कारण व्यक्तिगत दाता चूहों के बीच विचरण का खतरा है । हालांकि इस प्रयोग के आगमन और प्रगति के बीच ंयूनतम समय के साथ एक ही विक्रेता से cecal दाताओं का उपयोग करके कम किया गया था, यह कुछ प्रयोगशालाओं के लिए एक लागत प्रतिबंधित विकल्प बन सकता है और एक और समय रसद चुनौती होने में प्रस्तुत उंर मिलान उपलब्ध चूहों जब नवजात चूहों में एक cecal घोल प्रयोग केसाथ कि 7 दिन पुराने थे । ताजा cecal घोल का उपयोग करने के लिए एक वैकल्पिक विधि का उपयोग किया गया था, जहां एकाधिक वयस्क दानदाताओं ' cecal सामग्री परित, D5W में resuspend थे, पर जमे हुए-८० डिग्री सेल्सियस ग्लिसरॉल के बिना, और एक समय में प्रयोग के लिए एक aliquot गल । वयस्क दाता cecal घोल का उपयोग नवजात पूति के अध्ययन के लिए संभावित cecal घोल में मौजूद बैक्टीरिया की प्रजातियों के हस्तांतरण सकता है कि नवजात माउस को उजागर नहीं किया गया है, लेकिन यह एक रणनीति है कि नवजात चूहों में पूति के अध्ययन के लिए अनुमति देता है और पिछले13,14,15में नवजात माउस जीवविज्ञान अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । Cecal घोल D5W में पतला था बैक्टीरिया को पोषण प्रदान करने के लिए, जो एक सक्रिय संक्रमण की स्थापना की अनुमति दी एक बार जीवाणु इंजेक्शन थे, और पेरिटोनियल गुहा में नेक्रोटाइज़िंग के दौरान पोषक तत्वों की उपलब्धता की नकल करने के लिए किया गया था आंत्रशोथ. ग्लिसरॉल क्योंकि संभावित नकारात्मक पक्ष प्रभाव है कि अकेले ग्लिसरॉल इंजेक्शन से पैदा कर सकता ठंड बैक्टीरिया में एक स्थिर एजेंट के रूप में शामिल नहीं किया गया था । यदि ग्लिसरॉल cecal घोल तैयारी में शामिल किया गया था, तो संभावित नुकसान है कि अकेले ग्लिसरॉल पैदा कर सकता है एक ग्लिसरॉल-केवल (cecal घोल कमी) चूहों में इंजेक्शन, जो माउस के उपयोग में वृद्धि हुई है सहित के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए । cecal गारा शेयरों की जीवाणु व्यवहार्यता ग्लिसरॉल के बिना cecal घोल स्टॉक ठंड के बाद परीक्षण किया गया था और लगातार हो पाया था, एक ही cecal घोल तैयारी की अलग aliquots में बैक्टीरिया एकाग्रता में कोई परिवर्तन के साथ-८० ° c पर एक 6 पर संग्रहीत महीने की अवधि । यह पता चलता है कि ग्लिसरॉल के बिना भंडारण एक सुसंगत जैविक परिणाम प्रदान करने में संभव है । एक थोक तैयार जमे हुए cecal घोल स्टॉक भी चूहों के उपयोग के लिए अनुमति दी घर में पैदा, लागत को कम करने और पुरुष चूहों है कि अंयथा प्रजनन से अधिक होगा उपयोग, इसलिए माउस अपव्यय को कम करने के उपयोग ।
चूहों में विफल चुनौतियों की पहचान के लिए सिस्टम में अतिरिक्त शोर जोड़ने से बचने के लिए महत्वपूर्ण था. cecal घोल के एक intraperitoneal इंजेक्शन के दौर से गुजर के बाद, चूहों त्वचा, जो वास्तव में चमड़े के नीचे था एक असफल इंजेक्शन संकेत के नीचे एक उभार की उपस्थिति के लिए मनाया गया । चूहों इंजेक्शन साइट पर लीक के लिए मनाया गया, दोनों तुरंत सुई हटाने के बाद और उन्हें इंजेक्शन के बाद एक कदम उठाने के लिए अनुमति देने के बाद, क्योंकि चूहों कभी कभार (शायद ही) एक कदम उठा कर इंजेक्शन साइट के अंग ले जाने के बाद ही रिसाव. इंजेक्शन के बाद एक उभार या रिसाव की उपस्थिति विश्लेषण से माउस को हटाने में हुई । सब के बाद, इनमें से या तो एक अलग cecal घोल की गलत राशि के कारण चुनौती खुराक में एक 5% अंतर के रूप में इंजेक्शन का परिणाम हो सकता है बाद में अस्तित्व को प्रभावित करने के लिए मनाया गया है ।
Cecal घोल चैलेंज प्रयोगों अक्सर आवश्यक अलग वजन-समायोजित खुराक के साथ घातक खुराक बदलती । इस के कारण, इंजेक्शन की मात्रा के रूप में छोटे रूप में 20 µ एल से रेंज कर सकते है और १०० µ एल के लिए । मृत सुई मात्रा के साथ जुड़े आनुपातिक प्रयोगात्मक त्रुटि भी इंजेक्शन की मात्रा के साथ बदलता है, कठिनाई को बढ़ाने के लिए सीधे अलग खुराक की तुलना. इंजेक्शन की मात्रा का मानकीकरण के सरल संशोधन के साथ, विचरण के इस स्रोत प्रयोग से हटा दिया जाता है ।
नवजात माउस की व्यवहार निगरानी प्रणाली इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल अपनी तरह का पहला है । नवजात चूहों के साथ नैतिक अनुसंधान आयोजित करने पर शोधकर्ताओं की मंशा अक्सर इस उम्र में जानवरों की भलाई का आकलन करने के लिए संसाधनों की चुनौतीपूर्ण कमी के साथ सामना कर रहे हैं । प्रस्तुत सहज और सुसंगत निगरानी प्रणाली इस ज्ञान अंतर को संबोधित करने के लिए शुरू होता है । महत्वपूर्ण बात, यह सबूत संचालित दृष्टिकोण न केवल प्रयोगात्मक डेटा प्राप्त की गुणवत्ता बढ़ जाती है, लेकिन एक ही समय में, यह भी प्रयोगात्मक पशुओं की पीड़ा कम कर देता है ।
Disclosures
डॉ जेंस व्यान स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (NIH)/National जनरल मेडिकल साइंसेज (R01GM128452) और NIH/Eunice कैनेडी श्राइवर राष्ट्रीय बाल स्वास्थ्य और मानव विकास संस्थान (niched) के संस्थान से समर्थन प्राप्त ( R01HD089939) ।
Acknowledgments
क्लेयर हैरिसन और जानवरों की देखभाल के लिए विशेष धंयवाद ब्रिटिश कोलंबिया बाल अस्पताल अनुसंधान संस्थान (BCCHR) में पशु काम में उनके समर्थन के लिए, साथ ही साथ डॉ पो यान चेंग को उनके मार्गदर्शन और पशु निगरानी और भलाई पर इनपुट के लिए ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 - 20 μL pipette tips | VWR | 732-0799 | |
| 1.8 mL Microcentrifuge tube | Costar | 3621 | |
| 100 - 1000 μL pipette tips | VWR | 732-0801 | |
| 1 - 200 μL pipette tips | VWR | 732-0800 | |
| 15 mL Centrifuge tube | FroggaBio | TB15-25 | |
| 23G1 needles | Becton Dickinson | 305145 | only the needle, not the syringe, used for pinning mouse to styrofoam |
| 28G 0.5 mL Insulin syringe | BD | 329461 | |
| 2 mL Cryogenic vial | Corning | 430488 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
| 5 mL pipette | Costar | 4487 | |
| 6 - 10 week old C57BL/6J adult mice | Jackson Laboratories | 664 | |
| 7 + day old C57BL/6J neonatal mice | Bred in house | n.a | |
| 70 μm Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Defibrinated Sheep's Blood | Dalynn | HS30-500 | |
| Dextrose 5% Water (D5W) | Baxter | JB0080 | |
| Dissecting forceps | VWR | 82027-386 | |
| Dissecting Scissors, Sharp Tip | VWR | 82027-592 | |
| Dissecting Scissors, Sharp/Blunt Tip | VWR | 82027-594 | |
| Ethanol (HistoPrep 95% Denatured Ethyl Alcohol) | Fisherbrand | HC11001GL | diluted to 70% with double distilled water |
| Ethanol-proof marker; Lab marker | VWR | 52877-310 | |
| EZ Anesthesia Vaporizer | EZ Anesthesia | EZ-155 | |
| Germinator 500, Dry sterilize surgicial instrument (Hot bead sterilizer) | Braintree Scientific | GER 5287-120V | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi | CP0406V2 | |
| Micro Spatula | Chemglass | CG-1983-12 | |
| Pipette-Aid | Drummond | 4-000-100 | |
| Rainin Classic Pipette PR-1000 | Rainin | 17008653 | |
| Rainin Classic Pipette PR-20 | Rainin | 17008650 | |
| Rainin Classic Pipette PR-200 | Rainin | 17008652 | |
| Scale | Sartorius | BL 150 S | |
| Specimen forceps | VWR | 82027-440 / 82027-442 | |
| Square 1000 mL Storage Bottle | Corning | 431433 | |
| Styrofoam board | Any | n.a | |
| Sure-Seal Mouse/Rat euthanasia chamber | Euthanex | EZ-178 | |
| Tryptic Soy Agar | Sigma-Aldrich | 22091-2.5KG | |
| VX-200 Lab Vortex Mixer | Labnet International | S0200 | |
| weigh paper | Fisherbrand | 09-898-12B |
References
- Liu, L., et al. Global, regional, and national causes of child mortality in 2000-13, with projections to inform post-2015 priorities: an updated systematic analysis. The Lancet. 385 (9966), 430-440 (2015).
- Wynn, J. L., et al. Increased mortality and altered immunity in neonatal sepsis produced by generalized peritonitis. Shock. 28 (6), 675-683 (2007).
- Fink, M. P.
- Wynn, J. L., et al. Defective innate immunity predisposes murine neonates to poor sepsis outcome but is reversed by TLR agonists. Blood. 112 (5), 1750-1758 (2008).
- Cuenca, A. G., et al. Critical role for CXC ligand 10/CXC receptor 3 signaling in the murine neonatal response to sepsis. Infection and Immunity. 79 (7), 2746-2754 (2011).
- Gentile, L. F., et al. Protective immunity and defects in the neonatal and elderly immune response to sepsis. Journal of Immunology. 192 (7), 3156-3165 (2014).
- Cuenca, A. G., et al. Delayed emergency myelopoiesis following polymicrobial sepsis in neonates. Innate Immunity. 21 (4), 386-391 (2015).
- Gentile, L. F., et al. Improved emergency myelopoiesis and survival in neonatal sepsis by caspase-1/11 ablation. Immunology. 145 (2), 300-311 (2015).
- Wynn, J. L., et al. Targeting IL-17A attenuates neonatal sepsis mortality induced by IL-18. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), E2627-E2635 (2016).
- Fallon, E. A., et al. Program Cell Death Receptor-1-Mediated Invariant Natural Killer T-Cell Control of Peritoneal Macrophage Modulates Survival in Neonatal Sepsis. Frontiers in Immunology. 8, 1469 (2017).
- Young, W. A., et al. Improved survival after induction of sepsis by cecal slurry in PD-1 knockout murine neonates. Surgery. 161 (5), 1387-1393 (2017).
- Rincon, J. C., et al. Adjuvant pretreatment with alum protects neonatal mice in sepsis through myeloid cell activation. Clinical & Experimental Immunology. 191 (3), 268-278 (2018).
- Starr, M. E., et al. A new cecal slurry preparation protocol with improved long-term reproducibility for animal models of sepsis. PLoS ONE. 9 (12), e115705 (2014).
- Hansen, L. W., et al. Deficiency in milk fat globule-epidermal growth factor-factor 8 exacerbates organ injury and mortality in neonatal sepsis. Journal of Pediatric Surgery. 52 (9), 1520-1527 (2017).
- Fujioka, K., et al. Induction of heme oxygenase-1 attenuates the severity of sepsis in a non-surgical preterm mouse model. SHOCK. 47 (2), 242-250 (2017).
- Al Asmari, K. A., et al. Protective effect of quinacrine against glycerol-induced acute kidney injury in rats. BMC Nephrology. 18, PMC5273840 (2017).
- Geng, X., et al. Differences in gene expression profiles and signaling pathways in rhabdomyolysis-induced acute kidney injury. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 8 (11), 14087-14098 (2015).
- Kim, J. H., et al. Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice. Nephron Experimental Nephrology. 128 (1-2), 21-29 (2014).
- Nara, A., et al. Evaluations of lipid peroxidation and inflammation in short-term glycerol-induced acute kidney injury in rats. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 43 (11), 1080-1086 (2016).
- Zager, R. A., Johnson, A. C. M., Lund, S., Hanson, S. Acute renal failure: determinants and characteristics of the injury-induced hyperinflammatory response. American Journal of Physiology Renal Physiology. 291 (3), F546-F556 (2006).
- Olfert, E. D., Godson, D. L. Humane Endpoints for Infectious Disease Animal Models. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 99-104 (2000).
- Canadian Council on Animal Care. Guidelines on: choosing an appropriate endpoint in experiments using animals for research, teaching and testing. , https://www.ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/Appropriate_endpoint.pdf (1998).
- Nemzek, J. A., Xiao, H. Y., Minard, A. E., Bolgos, G. L., Remick, D. G.
- Morton, D. B. A systematic approach for establishing humane endpoints. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 80-86 (2000).
