Summary
Protokollen illustrerer bruken av histopathologic undersøkelse og immunohistochemistry profilen folat reseptor beta macrophage og dens forhold til totalt immun-cellen infiltrere i timelige arterien biopsier i gigantiske celle arteritt.
Abstract
Gigantiske celle arteritt (GCA) er en kronisk immun-mediert sykdom av middels til store store arterier som påvirker eldre voksne. GCA manifester med leddgikt og occlusive symptomer hodepine, hjerneslag eller visjonen tap. Makrofager og T-helper lymfocytter infiltrere vaskulære veggen og produsere en pro-inflammatoriske respons som fører til fartøyet skade og ischemia. Hittil er det ingen GCA biomarkør som kan overvåke sykdom aktivitet og guide terapeutiske svar.
Folat reseptor beta (FRB) er et glycosylphosphatidylinositol protein som er forankret på celle membraner og vanligvis uttrykt i myelomonocytic avstamning og i fleste myelogen leukemi cellene også svulst og Revmatoid synovial makrofager, der uttrykket samsvarer med sykdommens alvorlighetsgrad. Evne til FRB binde folat forbindelser, folsyre-conjugates og antifolate narkotika har gjort det en druggable mål i kreft og betennelsessykdom forskning. Denne rapporten beskriver metodene histopathologic og immunohistochemical brukes til å vurdere uttrykk og distribusjon av FRB i forhold til GCAimmunopathology.
Formalin-fast og parafin-embedded timelige arterien biopsier fra GCA og vanlige kontrollene var farget med Hematoxylin og Eosin å vurdere vev histology og Patognomonisk funksjoner. Immunohistochemistry ble brukt til å oppdage FRB, CD68 og CD3 uttrykk. En microscopic analyse ble utført for å kvantifisere antall positivt farget celler på 10 utvalgte høy-power-feltet deler og deres respektive steder i arterieveggen.
Lymphohistiocytic (LH) betennelse ledsaget av intimal hyperplasia og forstyrret elastisk lamina ble sett i GCA med ingen i kontroller. LH infiltrere var sammensatt av ca 60% lymfocytter og 40% makrofager. FRB uttrykk var begrenset til makrofager, som består av 31% av den totale CD68 + macrophage befolkningen og lokalisert til media og adventitia. Ingen FRB ble sett i kontroller.
Denne protokollen vist en distinkte numeriske og romlig mønster av FRB macrophage i forhold til det vaskulære immun microenvironment i GCA.
Introduction
Gigantiske celle arteritt (GCA) er en betennelsessykdom i middels til store arteriene, målretting aorta og dens forgreninger og påvirker eldre voksne. Den presenterer med mild til alvorlig iskemiske komplikasjoner som hodepine, kjeve smerter, synstap, hjerneslag og vev koldbrann. Diagnosen er bekreftet av høy inflammatoriske markører som røde blodlegemer sedimentasjonsrate (SR) og et distinkt histopathologic mønster på timelige arterien biopsi (TAB)1. GCA er den vanligste voksen vaskulitt tilgjengelighet i timelige arterien innhentet for diagnose presenterer en fordel over andre vasculopathies, dermed muliggjør en studere sin patogenese lettere. Typisk resultatene kategorien inkluderer en infiltrere makrofager/histiocytter og T-lymfocytter funnet over alle vaskulære lag av tunika intima, media og adventitia med samtidig ødeleggelse av den elastiske lamina som vanligvis skiller dette rom2. Dagens bevisene viser at GCA innebærer et ukjent antigen som aktiverer dendrittiske celler i det vaskulære adventitia, etterfulgt av rekruttering av hjelper T (Th) celler, spesielt Th1 og Th17 undertypene som skiller interleukin-17 og plasma interferon-gamma (IFG) henholdsvis. IFG så rekrutterer og aktiverer makrofager å produsere cytokiner og proteaser. Disse inkluderer pro-inflammatoriske cytokiner; inkludert IL-12, som aktiverer gjensidig Th1 celler dermed gir en positiv feedback loop; tumor nekrose faktor og interleukin-6, som forårsaker artritt og fevers og metalloproteases som skade den elastiske lamina. Glukokortikoider (GC), som utgjør standard kronisk terapi, kontrollere delvis cytokin veier av demping Th17/IL-17 men ikke Th1/IFG armen av immunrespons3,4. Dessverre seponering av GC resulterer i sykdommen tilbakefall. Som et alternativ modalitet, methotrexate har blitt repurposed for GCA behandling, men ønsket klinisk endepunktene ble ikke konsekvent oppnådd selv om mer følsomme biomarkers ikke har vært benyttet for terapeutisk overvåking5,6 . I 2017, ble interleukin 6 blokkering, tocilizumab, godkjent for behandling av GCA som det effektivt demonstrert sykdomskontroll og steroid sparsom effekter7,8.
Hittil er det ingen bra biomarkers for GCA. Som et resultat, er det vanskelig å overvåke sykdomsaktivitet og sjarmere doser av tilgjengelige narkotika å unngå bivirkninger og redusere byrden av kostnader for samfunnet. Derfor er det viktig å se etter en kandidat biomarkør som samsvarer med sykdomsaktivitet, gi romanen innsikt i patogenesen og bistand i terapeutisk beslutninger.
Feilregulering macrophage aktivisering er en kritisk faktor i GCA patogenesen. Dermed kan et effektivt middel for behandling av GCA være selektiv målrettingen aktivert makrofager. Folat reseptor beta (FRB) er en glycosyl-phosphatidylinositol glykoprotein som er forankret i cellemembranen uttrykt i normal myelomonocytic celler, myelogen leukemi celler og aktivert makrofager. Ligand, folsyre, er en viktig vitamin i formen, som gjør mobilnettet DNA syntese, metylering og reparasjon9. FRB uttrykk er indusert i autoimmune sykdommer og under kreft. Uttrykket er begrenset til overflaten av monocytter eller pro-inflammatoriske M1 makrofager i revmatoid artritt eller anti-inflammatorisk M2 makrofager i solid orgel og myelogen malignitet10,11,12 , 13. i tillegg til sin potensielle rolle som en biomarkør av aktivert makrofager, FRB kan aktivere selektiv narkotika transport gjennom en flertrinnsprosess som starter med reseptor bindingen til folinsyre, antifolates eller folat-konjugerte medisiner på cellen overflaten, etterfulgt av internalisering, utgivelse og eventuell levering av ønsket stoffet til interne celle maskiner12,14,15,16. I motsetning til FRB uttrykt i kreftceller og aktivert makrofager, FRB uttrykt i normal blodkreft cellene kan ikke binde folates og dermed sikre at FRB/folat-mediert narkotika-leveranser er begrenset til FRB-positive inflammatoriske eller kreftceller.
I vår forrige studie vi viste for første gang som FRB uttrykkes i GCA makrofager og uttrykket korrelert med CD68 + og endothelin reseptor beta makrofager, som bidrar til GCA patogenesen17. I denne rapporten beskriver vi de histopathological og immunohistochemical metoder brukes til å vurdere FRB macrophage og analysert de totale lymfocytt og macrophage teller for å få innsikt i den FRB posisjon i GCA vaskulære landskapet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene beskrevet ble godkjent av Penn State institusjonelle Review Board.
1. histopathological forberedelser og behandling etter få timelige arterien biopsi
Merk: Den timelige arterie biopsy (TAB) utføres under lokalbedøvelse og sterile forhold av en sertifisert kirurg. Etter kirurgisk få 3 cm arteriell inndelinger på siden flere berørte, prøven er fast i formalin umiddelbart for 24 h, delt i 3 til 4 mm og innebygd i parafin, betale forsiktig oppmerksomhet til det lated oppstilling av vev i blokken som lagres deretter i romtemperatur. Prøven utvalget utføres etter bekrefter det medisinske postene. Diagnosen er basert på American College of Rheumatology 1990 kriterier som krever at fag oppfylle 3 av 5 domener: alder > 50 år, nye hodepine, timelige arterien ømhet, en røde blodlegemer sedimentasjonsrate > 50 mm/time av Westergren metoden og en unormal kategorien. For sikkerhet, vernehansker må brukes hele tiden ved håndtering av prøver, kjemikalier og antistoffer.
- Klipp 4-5 µm tykke snitt med en mikrotom fra de innebygde blokkene. og med Hematoxylin og Eosin (H & E). Bruk en kontroll delen av valgte normalt vev for kvalitetssikring.
- Float kuttet deler på et varmt vannbad oppvarmet til 40 ° C å fjerne rynker og plukke opp med en mikroskopisk tonet glass. Plass glass lysbilder på en varm plate i 60 ° C ovn i 60 minutter å lette tørking og overholdelse av delen av lysbildet.
- Plass glass lysbilder på en varm plate i 60 ° C ovn i 60 minutter å lette tørking og overholdelse av delen av lysbildet.
- Monter 3 deler på objektglass.
- Plasser lysbilder i en loddrett rack og tørr overnatting på 37 ° C for 24 timer.
- Plasser lysbilder i en beholder butikken på 4 ° C.
2. Immunohistochemical forberedelse, Dewaxing, Antigen henting og flekker15,18,19,20
- Laste inn lysbilder i en objektglasstativet. Kjøre stativet gjennom retter som følger: to ganger i 100% xylen i 5 minutter med 10 sekunder av mild agitasjon 30 sekunder, i 100% etanol med 10 sekunder agitasjon, når 90% etanol med 10 sekunder agitasjon, når 70% etanol med 10 sekunder omrøring , og to ganger i dobbel destillert H2O med 10 sekunder agitasjon.
Merk: Xylen og aceton bør gjøres i ventilert hetter å unngå innånding og respiratoriske toksisitet. - Hente antigen ved overføring stativet til en glassbeholder med 200 mL 10 mmol/L, pH 6.0 citrate buffer prewarmed til 95 ° C. Stille inn timeren i 30 minutter i vannbad, deretter avkjøles i romtemperatur i 20 minutter og skyll med rennende vann i 5 minutter.
- Fjerne endogene peroxidase aktivitet ved rugende i 200 mL 3% Hydrogenperoksid i 10 minutter. Vask lysbilder 3 ganger i 200 µL av Tris-bufret saltvannsoppløsning (TBSS).
- Fjerne lysbildene fra stativet og dab hver en forsiktig å tørke av overflødig buffer. Legge til 200 µL av følgende primære antistoffer, legge cover slips på lysbilder og ruge i et fuktig kammer i 1 time ved romtemperatur for flekker:
Anti-FRB antistoff fortynnet 1:800
Monoklonalt musen anti-menneskelige CD68, 1:200 fortynning
Polyklonale kanin anti-CD3 1: 100 fortynning
Merk: Formalin-fast parafin-embedded deler av morkaken ble også behandlet som beskrevet i fremgangsmåten 2.1 2.9 og inkubert med anti-FRB18 og brukt som positive kontroll. Farging resultater ble oppnådd ved å finne den optimale antistoff konsentrasjonen og ble utført av titrating antistoffer i dobbel fortynninger (f.eks 1:50, 1: 100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600). - Fjerne cover slip etter inkubasjon og kast. Skyll lysbilder 3 ganger i 2 minutter hver med TBSS, avløp og tørk overflødig buffer.
- Legge til 200 µL av sekundær antistoff løsning som inneholder biotinylated Rabbit/mus sekundære antistoff å reagere med unconjugated primære antistoff bundet til vev antigen. Plasser coverslips på lysbilder og ruge i et fuktig kammer i 45 minutter ved romtemperatur.
- Fjerne cover slip etter inkubasjon og kast. Skyll lysbilder 3 ganger i 2 minutter hver med SS, avløp og tørk overflødig buffer.
- Legge til 200 µL diaminobenzidine (DAB) + substrat buffer (Imidazole HCl)-chromogen systemet og Inkuber minutter å visualisere flekker mønster. Vask med TBSS deretter i rennende vann i 10 minutter.
- Counterstain med hematoxylin i 3 minutter.
- Montere lysbildene ved å bruke 70 µL av montering medium overflaten av lysbildet. Sakte tips dekkglassvæske til montering mediet og unngå å skape bobler som du senke den på plass. Vente 24 timer å tørke.
3. histopathologic og Immunohistochemical (IHC) analyse
Undersøke H & E og IHC farget deler fra GCA positive og vanlig fag med lys mikroskop.
-
For H & E farget deler:
- Vurdere vaskulær arkitekturen og identifisere endotelceller i tunika intima, glatte muskelcellene i tunika media, og fibroblaster og vasa vasorum i tunica adventitia21,22.
- Identifisere GCA funksjoner som inkluderer lymfocytt og macrophage/histiocyte infiltrasjon, mobilnettet hyperplasia og interne elastisk lamina degradering.
- Analysere lymphohistiocytic infiltrere ved å identifisere og kvantifisere antall makrofager i forhold til lymfocytter. Vurdere omfanget av interne elastisk lamina avbrudd og hyperplastic endringer i bosatt celler og sammenligne med kontroller.
-
For IHC farget deler:
- Undersøke flekker mønster av FRB, tar notat av uttrykket av en bestemt type eller typer celler og distribusjon i vaskulær lag og sitt forhold til den totale immun infiltrere, totalt macrophage markøren, anti-CD68 og pan lymfocytt markør anti CD3.
- Kvantifisere uttrykk for cellene FRB, CD68 og CD3 ved å telle positivt farget celler på 10 flere tilfeldig valgt kraftkrevende felt (hpf) og spille inn midler.
Merk: Identifikasjon av disse normal og patologisk cellene og strukturer ble utført av en sertifisert hjerte patologen (JM) og revmatolog (S.A.A.) og resultatene ble registrert for alle tilfeller. - Ta representant bilder med et digitalt kamera.
Merk: Etter disse trinnene, kan gjenværende dele være lagret på-80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Histopathologic funn
H & E flekker i normal prøver demonstrert normal arteriell anatomi med endotelceller i tunika intima, glatte muskelcellene i tunika media, og en heterogene kollagen matrise fibroblaster og mater skip kalt vasa vasorum i tunica adventitia. Det er ingen inflammatoriske infiltrere identifisert. GCA positive timelige arterier vist moderat til alvorlig betennelse med aggregat makrofager/histiocytter, lymfocytter, sporadisk plasma celler og multinucleated gigantiske celler. Luminal innsnevring ble registrert og ledsaget av intimal jevning og 90% forstyrrelse av den interne elastisk lamina (figur 1).
Immunohistochemical funn
CD3 + lymfocytter og CD68 + makrofager var tilstede i alle GCA + prøvene og vist lignende flekker mønstre i alle biopsier. Lymfocytter fått over makrofager med forholdet CD3/CD68 1.6. Flekker for FRB var begrenset til makrofager og multinucleated gigantiske celler som fortrinnsvis lokalisert i adventitia og media (tabell 1 og figur 2). Kontrollere prøver viste minimal leukocytter (< 5 celler/høy-power feltet) og ingen FRB uttrykk.
Figur 1: H & E bilder av timelige arterier. (A) representant H & E bilde av en vanlig timelige arterien med forskjellige sjiktene av tunika (t) adventitia, media og intima fra det ytterste til den innerste/Luminal side henholdsvis. Merk nettverk av kollagen og vasa vasorum adventitia (tykk piler), den glatte muskelcellene i media (tynn piler) og endotelceller i intima (10 x forstørrelse). (B) en forstørret mikroskop-bilde av intima media grensesnittet er merket med den rektangulære rammemargen i A og deles av den interne elastisk lamina (pilspisser) (20 x forstørrelse). (C) representant H & E bilde av en TA med gigantiske celle arteritt preget av en transmuralt lymphohistiocytic infiltrere (tykk piler), intimal hyperplasia og ødeleggelsen av den interne elastisk lamina (pilspisser) (10 x forstørrelse). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Immunohistochemical farging av timelige arterier med gigantiske celle arteritt. (A) representant bilder viser en omfattende inflammatoriske infiltrere med CD68 positive makrofager og gigantiske celler (piler) finnes hovedsakelig i media og adventitia (10 x forstørrelse). (B) folat reseptor beta (FRB) ble selektivt uttrykt i aktivert makrofager (piler) (10 x forstørrelse). Bildet tatt på høyere makt vist FRB positiv makrofager i (C) og CD68 positive makrofager i (D) (100 x forstørrelse). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| GCA fag (n = 5) | Mener (±SD) |
| CD3 (% av immun infiltrere) | 61,7 ± 4.1 |
| CD68 (% av immun infiltrere) | 38.3 ± 4.1 |
| CD68 histiocytter/makrofager (celler/hpf) | 34.8 ± 10.4 |
| FRB + makrofager (celler/.hpf) | 10,8 ± 4.4 |
| %FRB/%CD68 | 31 ± 12.7 |
Tabell 1: Sammendrag av FRB, CD68 og CD3 uttrykk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GCA er den vanligste vaskulitt i voksne og sin patologisk hallmark eksemplifiserer en potent kombinasjon av T-lymfocytter helper og aktivert makrofager som kan også finnes i andre granulomatøs sykdommer eller vasculopathies som Sarkoidose og granulomatøs polyangiitis2,3. I GCA, timelige arterien gir en god representasjon av en middels til store store arterien og TA biopsi gir en betydelig utvalg som kan lagres i parafinblokkene år dermed skape muligheter til å studere roller av nye diagnostiske og terapeutiske mål som FRB i den vaskulitisk microenvironment. Vi tok fordel presentert av tilgjengelig vev og standard immunopathologic metoder for å spørre om FRB kan bli pålitelig analysert gjennom IHC. Våre funn viser at histopatologi og IHC kan tjene som verdifulle verktøy ikke bare i å bekrefte diagnose og omfanget av vaskulære skader, men også i validere rollen annerledes macrophage subtyper i GCA.
Histopatologi og IHC metoder er begge arbeids intense og krever ferdigheter histochemical tekniker, patologen og revmatolog, men teknikkene er godt etablert og kan tjene som et lansere pad for å bruke andre metoder som immunofluorescence og flyt cytometri. Ulempen med slike metoder, er imidlertid behovet for friske frossent som krever potensielle samling. IHC, sammen med histopathologic eksamen, er uvurderlig i å presentere en panoramautsikt perspektiv av det vaskulære immun microenvironment som gjentatte ganger kan åpnes og analysert spesielt med fremveksten av romanen proteiner som FRB. Den Hematoxylin og Eosin (H & E) flekker kan en se vev histology. Hematoxylin flekker kjernen og uthever kjernefysiske detaljene mens eosin fungerer som en counterstain som hjelpemidler i viser forskjellene mellom de kjernefysiske og cytoplasmatiske funksjonene. Bruk av en kontroll del av valgte normalt vev er viktig å vurdere for kvalitetssikring.
IHC gjenkjenner antigen rundt i frosne eller formalin-fast og parafin-embedded vev ved hjelp av flere antistoffer som er visualisert ved mikroskopi. Protokollen beskrevet ble tilpasset fra van der Heijden et al.15, som viste FRB uttrykk i synovial makrofager i revmatoid artritt. Viktig IHC trinnene inkluderer vev forberedelse, dewaxing/deparaffinization, antigen henting og flekker23. Det er viktig å sikre at vevet fjernet fra pasienten er umiddelbart løst i formalin og vev justeringen og retningen omhyggelig bevart når fast i parafin. Vevet er tynt delt med bruk av en mikrotom og gjennomgår en dewaxing trinn som krever flere vasker i xylen, etanol og vann. Det neste trinnet, kalt antigen henting, er nødvendig for å bryte ned methylene sammenhengen dannet under formalin fiksering og krever en citrate-baserte buffer og fuktighet heten. Lysbildene behandles med hydrogenperoksid blokkere endogene peroxidase enzymer som kan forstyrre antigen gjenkjenning. Farging prosedyren utføres neste rugende lysbildene med fortynnet primære antistoffer som vil binde antigen rundt etterfulgt av å bruke en sekundær antistoff som vil oppdage primære antigen-antistoff reaksjonen. Dette etterfølges av merking med en chromogen DAB-substrat som danner en brun pigment som er visualisert under mikroskopet. Det siste trinnet er forsiktig montering av vev med en permanent løsning å sørge for at ingen forstyrrende stoffer som bobler dannes mellom cover slip og overflaten. Protokollen kreves endringer for bruk av arteriell vev. Siden studien var først til å vurdere FRB i GCA, optimal antistoff konsentrasjonen var ukjent og trengte flere fortynninger på 1:50, 1: 100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1, 600, 1:3200 med de beste flekker kvalitet på laveste bakgrunnsstøy eller signal oppnås ved 1:800.
Membranen-assosiert FRB var tidligere godkjent av Ross et al.18,24 og fant uttrykkes i normale placental celler, nøytrofile, leukemic støt i Kronisk myelogen leukemi, promyelocytic leukemi, myeloblast bestander av myelomonocytic og erythroleukemias og ulik i M1/M2 akutt myelogen leukemi. Affinitet-renset kanin polyklonale antistoffer spesifikke for FRB brukes i disse tidligere arbeider har siden brukt på studier av revmatoid artritt positiv synovial makrofager og solid orgel svulster. FRB antistoffer i denne protokollen er ikke kommersielt tilgjengelig og kan hemme bred anvendelse. Tenkes, metodikk beskrevet her kan også arbeide for andre FRB antistoffer, men vil kreve personlige optimalisering før bruk i større tall. Siden FRB uttrykkes betydelig morkaken, er dette vevet brukt gjentatte ganger som en positiv.
Studien design var begrenset av en liten utvalgsstørrelsen og krever validering i større antall kategorier ideelt oppnådd ved tidlige og sene fasen av GCA. I tillegg siden FRB macrophage kan fungere som et mulig diagnostiske og terapeutiske mål med folic konjugert agenter og antifolates, støtter dataene innhentet her måtte undersøke videre FRB fenotypen i sammenheng med M1 og M2 macrophage polarisasjon. Med hensyn til andre diagnostikk konjugert disse resultatene åpne muligheter for ikke-invasiv tenkelig tilnærminger med FRB målrettet folsyre SPECT av PET imaging agenter. I tillegg, gitt at macrophage infiltrasjon er et kjennetegn på sykdomsprogresjon og aktivitet i aterosklerose, sklerodermi, Sarkoidose og revmatoid artritt, kan bruk av denne protokollen finne programmer i disse forholdene.
Dette er den første protokollen å utforske uttrykk og distribusjon av FRB i GCA. IHC tillatt en panoramisk cross-sectional og flere visninger av TA og analyse av numeriske forholdet mellom den immun infiltrere og arteriell microenvironment. FRB består 30% av de totale makrofagene som infiltrated alle lag av vaskulære veggen, men interessant, FRB ble ikke funnet i intima og lokalisert bare til adventitia og media. Dette mønsteret for distribusjon kan avdekke romanen innsikt i FRB macrophage tropism for differensial kollagen sammensetningen i media og adventitial lag25. Den immun infiltrere besto av rundt 60% lymfocytter (idet avmålt av pan-lymfocytt markør anti-CD3) og 40% makrofager (merket av pan-macrophage markør anti-CD68). En fersk studie korrelert CD3 med en høyere følsomhet for GCA diagnose mens en annen knyttet CD68 uttrykk høyere sykdomsaktivitet. Derfor foreslår vi at tidlig GCA vaskulære immun miljøet starter med 60: 40 forholdet lymfocytter: makrofager med 30% av makrofager blir FRB positiv. Om dette gjelder for og konsekvent vist hos pasienter med tidlig sykdom skal videre validert i fremtiden og potensielle eksperimenter. Hvis mobilnettet infiltrere distribusjonen har konsekvent, kan det deretter tjene som biomarkør sammensatt GCA sykdom aktivitet.
Avslutningsvis vist denne protokollen for første gang tilstedeværelsen av FRB infiltrasjon i media og adventitia av timelige arterier i GCA. FRB makrofager representert omtrent en tredjedel av befolkningen totale macrophage i en tidlig og aktive GCA microenvironment består av 60% lymfocytter og 40% makrofager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble gjort mulig med støtte fra Dr. Douglas Stairs, Marianne Klinger, Ann Benko, avdeling av Rheumatology/Institutt for medisin og molekylære og Histopathologic kjernelaboratorium, Penn State University College of Medicine, Hershey PA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtome | Reichert-Jung | ||
| plain and frosted microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | ||
| Vertical rack | Fisher Scientific | ||
| Light microscope | Olympus BX60 microscope | ||
| Xylene | |||
| Acetone in distilled water | concentrations 100%, 90%, 70% | ||
| Tris-buffered saline solution (TBS) | Dako Wash BufferS3006 | ||
| 3% hydrogen peroxide in TBS | |||
| Diaminobenzidine (DAB) | Sigma Fast Tablet set | ||
| Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP-15-100 | |
| Harleco Gill's III Hematoxylin | Fiisher Scientific 23-750-019 | ||
| Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution | Fisher Scientific | 23-749-977 | |
| 10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0) | |||
| Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta | Manohar Ratnam | optimized at 1:800 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD68 | Dako | M071801 | optimized at 1:200 |
| Polyclonal rabbit anti-CD3 | Agilent Dako | A0452 | optimized at 1:100 |
| Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody | Dako | ||
| Placental tissue | for FRB positive control |
References
- Klippel, J. H., Stone, J. H., White, P. H. Primer on the rheumatic diseases. , Springer Science & Business Media. (2008).
- Weyand, C. M., Goronzy, J. J. Immune mechanisms in medium and large-vessel vasculitis. Nature Reviews Rheumatol. 9 (12), 731-740 (2013).
- Weyand, C. M., Liao, Y. J., Goronzy, J. J. The immunopathology of giant cell arteritis: diagnostic and therapeutic implications. Journal of Neuro-ophthalmology. 32 (3), 259-265 (2012).
- Deng, J., Younge, B., Olshen, R., Goronzy, J., Weyand, C. Th17 and Th1 T-cell responses in giant cell arteritis. Circulation. 121, 906-915 (2010).
- Mahr, A. D., et al. Adjunctive methotrexate for treatment of giant cell arteritis: an individual patient data meta-analysis. Arthritis & Rheumatology. 56 (8), 2789-2797 (2007).
- Hoffman, G. S., et al. A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial of adjuvant methotrexate treatment for giant cell arteritis. Arthritis & Rheumatology. 46 (5), 1309-1318 (2002).
- Stone, J. H., Klearman, M., Collinson, N.
- Milman, N. Tocilizumab increased sustained glucocorticoid-free remission from giant cell arteritis. Annals of Internal Medicine. 167 (12), JC63 (2017).
- Xia, W., et al. A functional folate receptor is induced during macrophage activation and can be used to target drugs to activated macrophages. Blood. 113 (2), 438-446 (2009).
- Shen, J., et al. Folate receptor-beta constitutes a marker for human proinflammatory monocytes. Journal of Leukocyte Biology. 96 (4), 563-570 (2014).
- Salazar, M. D., Ratnam, M. The folate receptor: what does it promise in tissue-targeted therapeutics. Cancer and Metastasis Reviews. 26 (1), 141-152 (2007).
- Low, P. S., Henne, W. A., Doorneweerd, D. D. Discovery and development of folic-acid-based receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases. Accounts of Chemical Research. 41 (1), 120-129 (2008).
- Puig-Kroger, A., et al. Folate receptor beta is expressed by tumor-associated macrophages and constitutes a marker for M2 anti-inflammatory/regulatory macrophages. Cancer Research. 69 (24), 9395-9403 (2009).
- Nakashima-Matsushita, N., et al. Selective expression of folate receptor beta and its possible role in methotrexate transport in synovial macrophages from patients with rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 42 (8), 1609-1616 (1999).
- vander Heijden, J. W., et al. Folate receptor beta as a potential delivery route for novel folate antagonists to macrophages in the synovial tissue of rheumatoid arthritis patients. Arthritis & Rheumatology. 60 (1), 12-21 (2009).
- Jansen, G., Peters, G. J. Novel insights in folate receptors and transporters: implications for disease and treatment of immune diseases and cancer. Pteridines. 26 (2), 41-53 (2015).
- Albano-Aluquin, S., Malysz, J., Aluquin, V. R., Ratnam, M., Olsen, N. An immunohistochemical analysis of folate receptor beta expression and distribution in giant cell arteritis - a pilot study. American Journal of Clinical and Experimental Immunology. 6 (6), 107-114 (2017).
- Ross, J. F., Chaudhuri, P. K., Ratnam, M. Differential regulation of folate receptor isoforms in normal and malignant tissues in vivo and in established cell lines. Physiologic and clinical implications. Cancer. 73 (9), 2432-2443 (1994).
- Reiner, N. E. Methods in molecular biology. Macrophages and dendritic cells. Methods and protocols. Preface. Methods in Molecular Biology. 531, v-vi (2009).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9, 13 (2008).
- Pawlina, W. Histology: A text and atlas with correlated cell and molecular biology. , Walters Kluwer. (2016).
- Kumar, V., Abbas, A., Robbins Aster, J. Robbins and Cotran pathologic basis of disease. , Elsevier Saunders. (2015).
- Dabbs, D. J. Diagnostic immunohistochemistry. , Elsevier, Inc. (2019).
- Ross, J. F., et al. Folate receptor type beta is a neutrophilic lineage marker and is differentially expressed in myeloid leukemia. Cancer. 85 (2), 348-357 (1999).
- Holzapfel, G. A. Collagen in arterial walls: biomechanical aspects. Collagen. Structure and Mechanics. Fratzl, P. , Springer-Verlag. Heidelberg. 285-324 (2008).
- Sultan, H., Smith, S. V., Lee, A. G., Chevez-Barrios, P. Pathologic Markers Determining Prognosis in Patients with Treated or Healing Giant Cell Arteritis. American Journal of Ophthalmology. , (2018).
