Summary
In precedenza abbiamo usato un ibrido del peptide di nanoparticelle d'oro per consegnare per via endovenosa un peptide sintetico, inibitore della protein chinasi C-delta, che ha ridotto la lesione di polmone acuta indotta da ischemia-riperfusione. Qui vi mostriamo il protocollo dettagliato della formulazione di droga. Altri peptidi intracellulare possono essere formulate allo stesso modo.
Abstract
Inibitore della protein chinasi C-delta (PKCδi) è un farmaco promettente per evitare ferita indotta da ischemia-riperfusione dell'organo. Esso è solitamente coniugato ad un peptide cellula-penetrante, TAT, per consegna intracellulare. Tuttavia, TAT ha dimostrato attività biologiche non specifici. Nanoparticelle di oro (PNL) possono essere utilizzate come trasportatori di farmaci consegna senza tossicità riconosciuta. Di conseguenza, abbiamo usato un ibrido GNP/peptide per fornire PKCδi. Due brevi peptidi (P2: CAAAAE e P4: CAAAAW), con un rapporto di 95: 5, sono stati utilizzati per modificare le proprietà di superficie del PNL. PNL coniugato con PKCδi (GNP/PKCi) sono stabili in acqua distillata, 0,9% NaCl e tampone fosfato salino (PBS) contenente albumina di siero bovino o siero bovino fetale. L'iniezione endovenosa di GNP-PKCi precedentemente è stato indicato per impedire l'ischemia-riperfusione del polmone. Questo articolo descrive un protocollo per formulare GNP/PKCi e valutare le proprietà chimico-fisico di GNP/PKCi. Abbiamo usato metodi simili per formulare altri farmaci peptidici con PNL. In questo articolo si spera attirerà più attenzione a questa tecnologia di consegna di droga novella intracellulare e sue applicazioni in vivo.
Introduction
Trapianto del polmone Salva i pazienti con stadio finale del polmone malattia1. Tuttavia, le complicazioni serie dopo trapianto del polmone rimangono un ostacolo. Nelle prime fasi dopo il trapianto del polmone, disfunzione dell'innesto primario è il più nocivo di complicazione1, e la sua causa primaria è l'ischemia-riperfusione (IR)-indotta di lesione polmonare acuta2.
Sotto conservazione freddo, metabolismo in un polmone di donatore è limitato ad un livello molto basso. Tuttavia, specie reattive dell'ossigeno e sintesi di ossido nitrico sono attivati a causa la cessazione del flusso di sangue3. Dopo il trapianto, viene ripristinata la circolazione del sangue, e specie reattive dell'ossigeno e dell'ossido di azoto generati durante ischemia fredda che permettono di migliorare l'infiammazione e la morte cellulare, con conseguente danno tissutale.
Per evitare la lesione di IR, un inibitore della protein chinasi Cδ (PKCδi) è stato utilizzato nel cuore, cervello e polmone4,5,6,7,8. Questi studi hanno dimostrato che PKCδi riduce l'infiammazione e gli apoptosi durante la riperfusione. Ha anche impedito ferita polmonare IR in ratti ed in un modello di trapianto del polmone6. PKCδi di solito è coniugato con un peptide cellula-penetrante, TAT, per consegna intracellulare. Tuttavia, è stato dimostrato che il peptide TAT da solo ha effetti biologici non specifici, compresa la promozione dell'angiogenesi, apoptosi e l'inibizione di più citochine9,10,11. Nanoparticelle, piccole particelle che vanno da 1 a 100 nanometro di diametro12, sono stati esplorati come candidati nel facilitare la droga consegna13. In particolare, nanoparticelle di oro (PNL) sono considerate come non invadente e non tossico. Pertanto, abbiamo sviluppato dei PNL come elementi portanti di consegna di droga per farmaci peptidici14,15.
La superficie del PNL può essere manipolata per applicazioni specifiche quali riconoscimento molecolare16,17, rilevamento chimico18, imaging19e consegna della droga. È stato sviluppato un sistema ibrido di GNP/peptide, contenente 20 nm PNL e due brevi peptidi (P2: CAAAAE e P4: CAAAAW) con un rapporto di 95: 5, modificare le proprietà di superficie del PNL. Il peptide di P2, con la carica negativa acido glutammico (E), alla fine, si stabilizza la PNL in soluzione acquosa, e il peptide di P4, con il triptofano idrofobo (W) alla fine, aiuta PNL ingresso in cellule14. Il residuo di cisteina (C) al capolinea di questi peptidi N contiene un gruppo tiolico che sappia coniugare per le superfici in oro14. Questo ibrido di peptide/PNL è stato ulteriormente usato per fornire PKCδi (CSFNSYELGSL). Il rapporto molare ottimizzato di P2:P4 di PKCδi è 47.5:2.5:50. PNL coniugato con PKCδi (GNP/PKCi) sono stabili in acqua distillata, 0,9% NaCl e PBS contenente albumina bovina o siero bovino fetale14. L'iniezione endovenosa di GNP/PKCi ha dimostrato di prevenire l'ischemia-riperfusione del polmone15. Questo articolo descrive un metodo per formulare GNP/PKCi e verrà descritto come valutare le proprietà fisico-chimiche del GNP/PKCi. Abbiamo usato metodi simili per formulare altri farmaci peptidici coniugati a GNP20,21,22. Speriamo che questo articolo attirerà più attenzione a questa formulazione novella per la consegna di droga intracellulare.
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Protocol
1. preparazione delle soluzioni di Peptide
- Recuperare i peptidi (P2: CAAAAE, P4: CAAAAW, PKCδi: CSFNSYELGSL) da-20 ° C e scongelare a temperatura ambiente (TA).
Nota: Tenere il flacone chiuso per evitare che l'umidità da condensa sui peptidi. - Pesare 0,01 g di ciascun peptide su un Microscala. Mettere ogni peptide in una provetta conica da mL 50 separato.
- Aggiungere 18,74 mL di acqua deionizzata (DI) sul tubo di P2.
- Aggiungere 16,93 mL di acqua deionizzata al tubo P4.
- Aggiungere 8,21 mL di acetonitrile 50% diluito in acqua distillata per il tubo di PKCδi.
- Vortice brevemente le soluzioni del peptide. Mettere le provette coniche da 50 mL in un sonicatore (40 MHz) per 5 min.
- Portare le soluzioni del peptide di una cappa di biosicurezza. Tutte le soluzioni del peptide preparate dovrebbero essere 1 mM.
- Trasferire 1 mL di ciascuna soluzione del peptide in una nuova provetta conica 50 mL. Aggiungere 19 mL di acqua deionizzata a tubi di P2 e P4 e aggiungere 19 mL di acetonitrile 50% al tubo PKCδi, tale che ogni soluzione viene diluito a 50 µM e memorizzati in un tubo.
2. formulazione di PNL/PKCi
- Peptidi dovrebbero essere aggiunto alla soluzione GNP mentre ancora in BSC
- Aggiungere 475 μL di P2, 25μL di P4 e 500 μL di soluzione di δPKCi in una provetta da 15 mL. Aggiungere 9 mL di soluzione di 20 nm GNP (7.0x1011 particelle/mL) per la stessa provetta da 15 mL.
- Uscita la cappa di biosicurezza. Avvolgere il tubo da 15 mL con carta stagnola. Lasciarlo tutta la notte su un agitatore a RT.
- Restituire i campioni per la biosicurezza armadietto. Aliquotare 1 mL di GNP/PKCi in ogni microprovette da 1,5 mL.
- Centrifugare le provette in una micro-centrifuga per 30 min a 15.294 x g a 4 ° C.
- Rimuovere il surnatante da ciascuna provetta sotto una cappa di biosicurezza.
Nota: Fare attenzione a rimuovere il supernatante, garantendo nel contempo che il pellet GNP rimane intatto e non viene aspirato. - Risospendere il pellet nel solvente desiderato secondo la concentrazione necessaria. Applicabile solventi possono essere DI acqua, PBS e 0,9% NaCl.
Nota: A partire da 1 mL di GNP/PKCi, il pellet GNP contiene 6.3 x 10 particelle11 , sulla base della concentrazione di GNP fornita dal produttore. Per amministrare 1.3 x 1012 particelle in 500 µ l di 0,9% NaCl, aggiungiamo µ l 232 del 0,9% NaCl a ciascuno dei tre palline. Dopo la messa in comune con loro insieme, possiamo quindi raccogliere 500 µ l di soluzione di GNP/PKCi.
Nota: Mescolare il desiderato solvente ben prima di diluire il pellet GNP/PKCi, altrimenti sarà aggregato il GNP/PKCi.
3. valutazione della PNL/PKCi ibrido solubilità
- Versare 0,5 mL di soluzione di GNP/PKCi in una cuvetta di acryl. Disponga la provetta di acryl su uno spettrofotometro UV-Vis e testare il picco di assorbimento15.
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Representative Results
Cura dovrebbe essere presa per valutare le proprietà biofisiche del GNP/PKCi ibrido, come GNP tende ad aggregare in solvente. Quando GNP è aggregato, il colore della soluzione cambia dal rosa al viola (Figura 1a). Spettrofotometro UV-Vis è in grado di rilevare i cambiamenti più sensibile. Se non è aggregato il GNP/PKCi il picco di assorbimento dovrebbe essere a 525 nm (Figura 1b). Se il PNL è aggregato, il picco di assorbimento sarà spostato a destra. Come metodo alternativo di analisi, quando gli aggregati hanno formato il ΔOptical densità (ΔOD = OD a 525 nm - OD a 440 nm) diminuisce.
Figura 1 : Qualità di PNL/PKCi. (A) adeguatamente preparati GNP/PKCi è di colore rosa a colore (a sinistra). Aggregati GNP/PKCi appare luce viola (a destra). (B) buona GNP/PKCi preparato è stabile in acqua, PBS, o in soluzione di NaCl 0,9%. Letture su uno spettrometro UV-Vis hanno indicato che il picco di assorbimento era a 525 nm in tutte le soluzioni. (C) un esempio di preparazioni GNP/PKCi buoni e cattivi. Quando la PNL era aggregata, il picco di assorbimento è stato spostato a destra. Inoltre, ΔOD è diminuito. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Per garantire la corretta formulazione, è fondamentale che la soluzione di δPKCi subisce il passo di sonicazione delineato in 1.6. Sequenza del peptide δPKCi contiene molecole idrofobiche, quindi un sonicatore assiste nello sciogliere PKCi nella soluzione 50% acetonitrile. Inoltre, è molto importante mescolare il solvente meticolosamente, come indicato al punto 2.7. L'ibrido di GNP/PKCi non sarà formulato anche se questi passaggi non vengono eseguiti correttamente, a causa l'aggregazione del peptide δPKCi23.
Formulazione farmaceutica basata sul PNL offre diversi vantaggi. In primo luogo, PNL può essere facilmente sintetizzato in dimensioni ben controllati, che vanno da pochi nanometri a ~ 100 nm. Di solito, il PNL di dimensioni più piccole possono fornire farmaci nelle cellule in modo più efficiente rispetto a quelle più grandi come i più piccoli possono diffondersi facilmente nella loro destinazione regione24. In secondo luogo, PNL sono atossici in vitro e in vivo25, rendendoli i vettori farmaco sicuro. Terza, idrofobiche droghe possono essere caricate sulla PNL modificate26. Indietro, la chimica di superficie del PNL è prontamente modificata per applicazioni specifiche. Nei nostri studi, due brevi peptidi vengono utilizzati per modificare la superficie di GNP, per stabilizzarli in condizioni fisiologiche e impartire nuove bioattività. I peptidi sono stati studiati con tre regioni tra cui l'associazione oro, spaziatura e regioni funzionali. In particolare, il capolinea di N del peptide ha residui di cisteina (C) contenenti il gruppo tiolico che possa legarsi con oro. La parte centrale ha quattro residui di alanina idrofobo di promuovere l'Assemblea del peptide in un monostrato densamente imballato sulla PNL. L'aminoacido al C terminale è un aminoacido funzionale rivolte verso l'esterno, che può essere utilizzato per manipolare le proprietà superficiali del PNL. Il rapporto di 95: 5 di questi due peptidi sistemica è stato selezionato in un precedente studio14. Il rapporto tra peptidi PKCi e P2/P4 era anche sistematicamente testato e selezionati15.
D'altra parte, il sistema di consegna della droga GNP presenta limitazioni. PNL non sono tipo di cellula o tessuto specifico. PNL sono principalmente accumulato nel polmone, fegato e milza dopo somministrazione endovenosa27,28,29. Finora, questa formula è stata testata solo in colture cellulari e animali piccoli modelli. Per tradurlo in applicazioni cliniche, ulteriori studi su modelli animali di grandi dimensioni e la sua farmacocinetica, tossicità di distribuzione e le potenzialità del tessuto devono essere determinate.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla di divulgare su questo progetto.
Acknowledgments
Questo lavoro è sostenuto da sovvenzioni di ricerca da istituti canadesi di ricerca sanitaria (PJT-148847), Ministero della ricerca e dell'innovazione dell'Ontario (RE-08-029) e Canada prima di eccellenza programma di ricerca, medicina di Design all'Università di Toronto. Dr. Mingyao Liu è James e Mary Davie sedia in Lung Injury, riparazione e rigenerazione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| negatively charged glutamic acid peptide (P2) | CanPeptide | Sequence: CAAAAE-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
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| hydrophobic tryptophan peptide (P4) | CanPeptide | Sequence: CAAAAW-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| δPKCi peptide | CanPeptide | Seqeuence: CSFNSYELGSL-NH2 Length: 11aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| Conical tube(50ml) | Corning Life Sciences | 3582070 | |
| Conical tube(15ml) | Corning Life Sciences | 3582096 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-100ML | |
| Sonicator | Branson Ultrasonics Corp. | Branson 2510MTH | |
| Microtube | Diamed.ca | AD 150-N | |
| Gold nanoparticle solution | Ted Pella | 15705-5 | A particle size is 20nm |
| Rocking Platform shaker | VWR international | 40000-304 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Acryl cuvette | SARSREDT | 67.758 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Agilent | Caty 60 UV-Vis |
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