Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 以获得基质血管分数从脂肪组织通过一系列的机械过程, 其中包括乳化和多离心。
Abstract
基质血管分数 (SVF) 已成为各种疾病的再生工具;然而, 立法严格规范了使用胶原酶的细胞产品的临床应用。在这里, 我们提出了一个协议, 以产生注射的混合 SVF 细胞和本机细胞外基质从脂肪组织通过一个纯粹的机械过程。将脂质放入离心机中, 以 1200 x 克的速度旋转 3分钟。中间层被收集并分成两层 (底部是高密度脂肪, 顶部是低密度脂肪)。上层通过注射器间移位直接乳化, 速度为 20 mL/s, 为6倍至8倍。乳化脂肪以 2, 000 x 克离心3分钟, 油层下的粘性物质被收集并定义为细胞外基质 (ecm)//SVF-gel.。收集顶层上的油。在高密度脂肪中加入约5毫升的油, 并通过注射器间移位进行乳化, 速度为 20 mlsx, 速度为6倍至8倍。乳化脂肪以 2, 000 x 克离心 3分钟, 粘性物质也是 ECM/SVF-gel。将 ECM/SVF-gel 移植到裸鼠体内后, 通过组织学检查进行移植和评估。结果表明, 该产品具有再生成正常脂肪组织的潜力。这个过程是一个简单, 有效的机械离解程序, 浓缩 SVF 细胞嵌入在其自然支持 ECM 的再生目的。
Introduction
干细胞疗法为组织修复和再生提供了一个范式转变, 以便它们可以为各种疾病提供替代治疗方案1。干细胞 (如诱导多能干细胞和胚胎干细胞) 具有巨大的治疗潜力, 但由于细胞调节和伦理考虑而受到限制。脂肪源性间充质基质干细胞 (Asc) 很容易从脂质中获得, 不受同样的限制;因此, 它已成为实用再生医学的理想细胞类型2。此外, 它们是非免疫原性的, 从自体脂肪3中获得丰富的资源。
目前, Asc 主要是通过胶原酶介导的脂肪组织消化获得的。脂肪组织的基质血管分数 (SVF) 包含 Asc、内皮祖细胞、周细胞和免疫细胞。虽然酶化获得高密度的 Svf/asc 被证明具有有益的效果, 但一些国家的立法对使用胶原酶4的细胞基产品的临床应用进行了严格的规范。用胶原酶消化脂肪组织30分钟至1小时以获得 SVF 细胞会增加制备过程中的外源材料和生物污染的风险。粘附培养和 Asc 的纯化需要数天到数周的时间, 需要特定的实验室设备。此外, 在大多数研究中, SVF 细胞和 Asc 被用于悬浮液。如果没有细胞外基质 (ECM) 或其他载体的保护, 游离细胞易受攻击, 导致注射后细胞保留不良, 并损害治疗结果5。所有这些原因都限制了干细胞治疗的进一步应用。
为了从没有胶原酶介导消化的脂肪组织中获得 asc, 开发了几种机械加工程序, 包括离心、机械切碎、切碎、粉碎、粉碎和切碎.,8,9. 这些方法被认为通过机械破坏成熟的脂肪细胞及其含油囊来使组织和 asc 凝结。此外, 这些含有高浓度 asc 的制剂在动物模型 8、9、10中显示出相当大的治疗潜力。
2013年, Tonnard等人引进了纳米管接枝技术, 该技术涉及通过注射器间处理生产乳化的聚脂.注射器间移位产生的剪切力可以选择性地破坏成熟的脂肪细胞。根据他们的发现, 我们开发了一种纯机械的处理方法, 去除了脂质中的大部分脂质和液体, 只留下 SVF 细胞和分馏 ecm, 即 ECM/SVF-gel12。在此, 我们描述了人源性脂肪组织产生 ECM/SVF-gel 的机械过程的细节。
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Protocol
这项研究得到了中国广州南方医院伦理评审委员会的批准。脂肪组织是从健康的捐献者那里收集的, 他们书面知情同意参加这项研究。所有动物实验均由南方医院机构动物护理和使用委员会批准, 并按照国家卫生和医学研究委员会 (中国) 的指导方针进行。
1. ecm只能用凝胶制备
- 收获脂肪。
- 用3毫米多端口插管对人体进行吸脂, 其中包含几个直径为1毫米的尖侧孔, 吸气压力为-0.75 atm。
- 在无菌袋中收集200毫升的脂质。
- 准备科尔曼脂肪。
- 将脂质输送到四个50毫升管中, 让收获的脂肪静止不动10分钟。
- 通过使用宽尖端移液器将顶层上的脂肪收集到两个50毫升管中, 并丢弃底层的液体部分。
- 使用50毫升管, 在室温 (RT) 下以 1200 x 克的温度离心脂肪层3分钟。
- 将上层 (约80毫升) 定义为科尔曼脂肪。
- 使用宽尖端移液器将科尔曼脂肪的上部 2/转移到20毫升管中, 并将这一部分定义为低密度脂肪。
- 使用宽尖端移液器将科尔曼脂肪的下部转移到另一个20毫升管, 并将这一部分定义为高密度脂肪。
- 用低密度脂肪生产 ECM/SVF-gel。
- 使用两个由女性到女性 Lu-lock 连接器连接的20毫升注射器 (内径为 2.4 mm), 以内移20毫升的低密度脂肪。
- 保持移动速度稳定 (20 mL/s), 并重复6倍至8倍。
- 在 RT 以 2, 000 x 克的速度离心混合物3分钟。
- 在 RT 使用宽尖端移液器, 将油部分收集在顶部的10毫升管中, 以便进一步使用。
- 通过使用宽尖端移液器, 收集中间层 (即 ecm/svf-gel) 中的粘性物质, 并丢弃底层的液体。
- 用高密度脂肪生产 ECM/SVF-gel。
- 加入5毫升的油 (从1.3.4 步骤收集) 到15毫升的高密度脂肪。
- 在注射器之间间隔混合脂肪6x 至 8倍, 直到在乳剂内观察到絮凝剂。
- 在 RT 以 2, 000 x 克的速度离心混合物3分钟。
- 丢弃顶部的油部分。
- 使用宽尖端移液器收集中间层 (ECM/SVF-gel) 中的粘性物质, 并丢弃底层的液体。
- 将1.3.5 和1.4.5 的步骤中的 ecm只能 svf 凝胶混合。
2. 裸鼠 ecmw-硅胶移植模型
- 用异氟烷对裸鼠 (8周大, 女性) 进行麻醉 (1%-3%)动物手术室的吸入麻醉。
- 将 ECM/SVF-gel 转移到1毫升注射器中。
- 用钝器渗透插管连接1毫升注射器。
- 将插管皮下注射到鼠标的每个侧面。
- 注入0.3 毫升的 ecm只能用凝胶。
3. 在 ecm只能凝胶注射后3天、15天和90天进行组织采集
- 用异氟醚对小鼠进行麻醉 (1%-3%)吸入麻醉。
- 采用颈椎脱位法产小鼠。
- 用手术剪刀在老鼠背侧皮肤的中线做一个切口。
- 解剖和收获老鼠两侧的脂肪移植物。在 RT 隔夜将脂肪移植物植入4% 的甲醛中。
- 在乙醇浓度增加的情况下使组织脱水: 70% 乙醇, 两次变化, 每次 1小时;80% 乙醇, 一个变化, 1小时;95% 乙醇, 一次变化, 1小时;100% 乙醇, 三种变化, 每次1.5 小时;二甲苯, 三个变化, 每个1.5 小时。
- 用石蜡 (58-60°c) 渗透组织, 两个变化, 每个变化2小时。
- 将组织嵌入石蜡块中。在厚度约为4微米的情况下切割截面, 并将其放在幻灯片上。
4. 血红素和 Eosin 染色
- 将石蜡浸泡在二甲苯 i、II 和 III 中 (各 10分钟), 使其分离。
- 通过降低浓度 (100%、100%、95%、80%、70%) 来补充组织切片乙醇浴池, 每次3分钟。
- 用蒸馏水冲洗组织切片 (5分钟)。
- 在血红素中染色5分钟。
- 将自来水中的组织部分冲洗 20分钟, 用1% 的酸性酒精 (70% 的酒精中的 1% HCl) 脱色 5秒, 用自来水冲洗, 直到部分再次变蓝。
- 通过移液器将两到三滴 Eosin Y 染料直接添加到幻灯片上, 并将染料设置为10分钟。
- 在自来水中清洗滑梯1-5分钟。
- 在浓度增加的情况下脱水 (70%、80%、95%、100%、100%)乙醇为3分钟。
- 清除二甲苯 i 和 II 中的幻灯片, 每次5分钟。
- 将幻灯片安装在安装介质中。
5. 免疫荧光染色
- 将二甲苯 i、II 和 III 中的组织切片进行分离 (各 5分钟)。
- 通过不同的浓度 (100%、100%、95%、95%、70%) 补充组织切片。酒精浴池, 每次3分钟。
- 在 RT 的甲醇中培养 3% h2o2溶液中的部分 10分钟.
- 用蒸馏水冲洗 2 x 的滑梯, 每次5分钟。
- 将幻灯片放在幻灯片篮中。加入300毫升的柠檬酸缓冲液 (pH 6.0), 在95-100°c 孵育幻灯片10分钟。
- 在 RT 中冷却幻灯片20分钟。
- 用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 冲洗幻灯片 2倍, 每次5分钟。
- 将100μl 的10% 胎牛血清添加到滑块中, 在 RT 的加湿室中孵育1小时。
- 在4°C 条件下, 用原代抗体溶液 (豚鼠抗小鼠百合素, 1:400) 在4°c 下连夜产下部分。
- 用 PBS 3x 冲洗幻灯片, 每次5分钟。
- 用二级抗体溶液 (山羊抗豚鼠 488 IgG) 在 RT 中培养部分2小时。
- 用 PBS 3x 冲洗幻灯片, 每次5分钟。
- 用干净的纸巾擦拭部分周围的水。
- 将 4 ', 6-二胺-2-苯并丁醇 (DAPI) 和亚历克莎氟化物488共轭隔离素放入圆圈, 以覆盖幻灯片上的部分。
- 登上被单, 让它们在黑暗中干燥。
- 用荧光显微镜观察幻灯片。
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Representative Results
在将 Coleman 脂肪加工成 ECM/SVF-gel 后, 废弃油的体积占最终体积的 80%, 在油层下保存的脂肪组织中只有20% 被视为 ECM/SVF-gel (图 1a)。ecmmsvf 凝胶具有光滑的液体状质地, 使其能够穿过27g 细针;然而, 科尔曼脂肪是由一个整体脂肪结构与大纤维, 只能通过 18 G 插管 (图 1b)。
移植后第3天出现大量具有多个细胞内脂滴、广泛的血管化结缔组织和浸润炎细胞的小型前脂肪细胞。从第15天开始, 炎症细胞的数量开始逐渐减少, 脂肪细胞开始成熟。到第90天, 移植物中大多数血管化结缔组织已被成熟的脂肪细胞所取代 (图 2, 上面板)。
在移植3天后, ecmmsvf-凝胶移植中含有少量环联阳性脂肪细胞。第15天开始出现具有多个细胞内脂滴的小型前脂肪细胞。第90天 Ecm/svf-凝胶移植切片的每个字段都显示出许多内皮素阳性脂肪细胞和新形成的血管 (图 2, 下面板)。
图 1: ECM/SVF-gel 的图像.离心科尔曼脂肪和 ECM/SVF-gel 加工后 (a)。ecmmsvf-凝胶可以很容易地通过 27 G 针注射;然而, 科尔曼的脂肪只能通过 18 G 的插管 (b)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 移植后 ECM/SVF-gel 的组织学改变.ECM/SVF-gel 在第3天表现出广泛的血管良好的结缔组织和浸润的炎症细胞。随后, 大多数血管化结缔组织被含有成熟脂肪细胞 (上板) 的结构所取代。免疫荧光染色显示, 大部分组织在第3天由花药阴性区组成。到第15天, 大部分的内皮素 + 脂肪细胞出现。90天后发现大量的内皮素阳性脂肪细胞 (下面板)。刻度条 = 100μm. 请点击这里查看这个数字的更大版本.
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Discussion
基于干细胞的再生疗法在不同的疾病中显示出巨大的潜在优势。Asc 是优秀的治疗候选, 因为它们易于获得, 并具有组织修复和新组织再生的能力15。然而, 扩大其临床应用是有局限性的, 因为需要复杂的程序来分离细胞和胶原酶进行加工.因此, 必须开发一种简单的技术, 在不使用胶原酶的情况下获得干细胞。
在这项研究中, 我们提出了一个纯粹的机械过程的脂肪组织, 以获得 SVF 细胞, 这是由本地脂肪 ECM 保护。此外, 这一过程是无胶原蛋白的。先前的一项研究比较了不同的注射器间处理时间, 表明在 10 mls 的流速下, 对标准科尔曼脂肪进行1分钟的注射器间处理是生产 Ecm/svf-cel12的最佳方案。通过使用注射器间移位, 脂质中的大多数脂肪细胞被破坏, 大部分的 SVF 细胞和 ECM 被保存。因此, 注射器间移位是整个过程的关键步骤。注射器间移动速度和用于进行移位的时间决定了脂肪组织的破坏程度, 因为注射器间过程产生的剪切力与移位速度有关。我们建议, 移动速度应稳定在 20 mL/s. 销毁不足导致剩余的不需要的脂肪细胞, 而过度破坏导致破坏 SVF 细胞。该协议的乘积只有在达到以下标准的情况下才能定义为 ECM/SVF-gel: 1) 其最终体积约为初始体积的 20%;2) 它很容易通过27g 针注射。先前的一项研究表明, Ecm/Svf-gel 含有高密度的 CD4-/CDCH1-CD34 + Asc 和 svf 细胞密度为 & gt;4.0 x10 5 细胞/12.
在创建 ECM/SVF-gel 的过程中, 进行了2倍的离心, 前后注射器间移位。在插入式转移之前, 我们使用离心来创建脂肪的 "分级密度"。这是另一个关键步骤。已证明, 在离心后, 底部的高密度脂肪层含有丰富的浓缩 ecm, 但含油量较小, 而顶部的低密度脂肪层具有较多的油, 但减少了 ecm 纤维16, 17.因此, 这两个图层应以两种不同的方式进行处理。低密度脂肪可以直接经过注射器间处理来破坏脂肪细胞。然而, 在底层的高密度脂肪需要额外的油, 以促进脂肪细胞的破坏。添加的油可以降低高密度脂肪的密度, 使转移容易得多。此外, 油可以帮助从破碎的脂肪细胞中提取更多的油;然而, 水液体不能。因此, 我们添加了额外的油, 高密度脂肪。针筒移位后的离心是将油部分与 SVF 细胞和 ECM 分离。最终产品中应避免使用油。
ecm只能用凝胶移植, 保留率极高。正如我们上面提到的, Ecm/svf-凝胶加工的关键步骤是注射器间移位, 它破坏了大多数脂肪细胞。因此, 少量脂肪细胞仍然留在 ECM/SVF-gel 胶中。如图 2所示, 第3天移植的 ecm/svf-gel 中出现了一个小的环素阳性区域。然而, 15天后, 出现了大量的联定阳性脂肪细胞, 并在90天后成熟。先前的研究表明, ECM/SVF-gel 的移植诱导宿主细胞介导的脂肪组织再生14。利用抗人类白细胞抗原来鉴定新形成的脂肪细胞的起源, 我们发现, 虽然 SVF 中的大多数细胞是移植物衍生的, 但大多数新形成的脂肪组织都是宿主衍生的。正如我们之前所报道的, ECM/SVF-gel 具有很好的再生功能。本品对创面愈合有较好的治疗效果。此外, 它还通过加速血管生成 10, 帮助提高小鼠模型中游离皮瓣的成活率.
svf-凝胶是一种自体注射剂, 含有本机 ECM 和功能细胞成分。该产品是由简单的机械工艺产生的, 可以很容易地进行, 而无需担心监管问题。然而, ecm只能用 cm只能用凝胶的再生作用尚不清楚。为了更好地表征 ecm只能用凝胶的有益作用, 进一步研究了 ecm只能用凝胶再生效应的潜在分子机制。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了中国国家自然科学基金 (81471881、81471881、81471881)、中国广东省自然科学基金 (2014A030310155) 和南方医院院长基金会 (2014B009、2015Z002, 2015Z002, 2016B001)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488-conjugated isolectin GS-IB4 | Molecular Probes | I21411 | |
| guinea pig anti-mouse perilipin | Progen | GP29 | |
| DAPI | Thermofisher | D1306 | |
| wide tip pipet | Celltreat | 229211B | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP2 | |
| nude nice | Southern Mdical University | / | |
| light microscope | Olympus | / | |
| 50 mL tube | Cornig | 430828 | |
| sterile bag | Laishi | / | |
| microtome | Leica | CM1900 | |
| centrifuge | Heraus |
References
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