Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att erhålla stromal vaskulär fraktion från adipose vävnad genom en serie av mekaniska processer, som inkluderar emulgering och flera centrifugations.
Abstract
Stromaceller vaskulär bråkdel (SVF) har blivit en regenerativ verktyg för olika sjukdomar. lagstiftningen reglerar dock strikt kliniska tillämpningen av cell produkter med kollagenas. Här presenterar vi ett protokoll för att generera en injicerbara blandning av SVF celler och native extracellulär matrix från adipose vävnad genom en rent mekanisk process. Lipoaspirates placeras i en centrifug och snurrade på 1,200 x g i 3 min. Det mellersta lagret samlas in och delas upp i två lager (högdensitets fett längst ned) och låg densitet fett på toppen. Det övre lagret är direkt emulgerade av intersyringe växling, med en hastighet av 20 mL/s för 6 x till 8 x. Emulgerade fettet centrifugeras vid 2000 x g i 3 min, och den klibbig substansen under olja lager samlas in och definieras som den extracellulär Matrixen (ECM) / SVF-gel. Oljan på det översta lagret samlas. Cirka 5 mL olja tillsätts 15 mL av högdensitets fett och emulgerade av intersyringe växling, med en hastighet av 20 mL/s för 6 x till 8 x. Emulgerade fettet centrifugeras vid 2000 x g i 3 min, och den klibbig substansen är också ECM/SVF-gel. Efter transplantationen av ECM/SVF-gelen i nakna möss, graften skördas och bedömas av histologisk undersökning. Resultatet visar att denna produkt har potential att regenerera till normal fettvävnad. Detta förfarande är en enkel, effektiv mekanisk dissociation procedur att kondensera SVF celler inbäddade i deras naturliga stödjande ECM för regenerativ ändamål.
Introduction
Stem cell terapier ger ett paradigmskifte för vävnad reparation och förnyelse så att de kan erbjuda en alternativ terapeutiska regimen för olika sjukdomar1. Stamceller (t.ex., inducerade pluripotenta stamceller och stamceller) har stor terapeutisk potential men är begränsad på grund av cell förordning och etiska överväganden. Adipose-derived mesenkymala stromaceller/stamceller (ASCs) är lätt att få från lipoaspirates och inte föremål för samma begränsningar; Således har det blivit en idealisk celltyp för praktisk regenerativ medicin2. Dessutom, de är nonimmunogenic och har rikliga resurser från autolog fett3.
För närvarande erhålls ASCs huvudsakligen genom kollagenas-medierad nedbrytning av fettvävnad. Stromaceller vaskulär fraktionen (SVF) av fettvävnad innehåller ASCs, endothelial progenitor cell, pericyter och immunceller. Även om att erhålla en hög täthet av SVF/ASCs enzymatiskt visade sig ha positiva effekter, reglerar lagstiftningen i flera länder strikt kliniska tillämpningen av cellbaserade produkter använder kollagenas4. Smälta fettvävnaden med kollagenas för 30 min till 1 h att få SVF celler ökar risken för både exogena material i förberedelse och biologisk förorening. Vidhäftande kulturen och rening av ASCs, som tar dagar till veckor, kräver viss laboratorieutrustning. Dessutom i de flesta studier används SVF celler och ASCs i suspension. Utan skyddet av extracellulär matrix (ECM) eller en annan transportör, gratis celler är sårbara, orsaka en dålig cell lagring efter injektion och äventyra den terapeutiska resultat5. Alla dessa skäl begränsa den fortsatta tillämpningen av stamcellsterapi.
För att erhålla ASCs från fettväv utan kollagenas-medierad matsmältningen, varit flera mekanisk bearbetning förfaranden, inklusive centrifugering, mekaniska hugga, fragmentering, mosning och malning, utvecklade6,7 , 8 , 9. dessa metoder är tänkt att kondensera vävnad och ASCs genom att mekaniskt störa mogen adipocyter och deras olja-innehållande vesikler. Dessutom visade dessa preparat, som innehåller höga koncentrationer av ASCs, stor terapeutisk potential som regenerativ medicin i djur modeller8,9,10.
I 2013 införde Tonnard et al. den nanofat ympning teknik, vilket innebär att producera emulgerade lipoaspirates genom intersyringe bearbetning11. Den klippning kraft som skapas av intersyringe skiftande kan selektivt bryta mogen adipocyter. Baserat på deras resultat, utvecklat vi en rent mekanisk bearbetningsmetod som avlägsnar de flesta lipid och vätska i lipoaspirates, lämnar bara SVF celler och fraktionerade ECM, som är ECM/SVF-gel12. Häri, beskriver vi Detaljer den mekaniska processen av människa fettvävnad att producera ECM/SVF-gelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna forskning godkändes av den etikprövningsnämnden i Nanfang sjukhus, Guangzhou, Kina. Fettvävnad inhämtades från friska donatorer som gav skriftligt informerat samtycke att delta i studien. Alla djurförsök godkändes av Nanfang sjukhus institutionella djur vård och användning kommittén och utförs enligt riktlinjerna för de nationella hälso- och medicinska forskningsrådet (Kina).
1. ECM/SVF-gel förberedelse
- Skörda fett.
- Utför fettsugning på en människa med en 3-mm multiport kanyl, som innehåller flera vassa sida hål 1 mm i diameter, på-0.75 atm av undertryck.
- Samla lipoaspirates i en steril påse 200 mL.
- Förbereda Coleman fett.
- Överför lipoaspirates till fyra 50 mL rör och tillåta skördade fettet stå stilla i 10 min.
- Samla in fettet om det översta lagret på två 50 mL rör med wide-tip pipett för att överföra och kassera den flytande delen på bottenlagret.
- Med 50 mL rör, centrifugate fett lager vid 1200 x g vid rumstemperatur (RT) för 3 min.
- Definiera det övre lagret (ungefär 80 mL) som Coleman fett.
- Överföra den övre 2/3 av Coleman fettet till en 20 mL tub med wide-tip pipett och definiera denna del som låg densitet fett.
- Överföra den nedersta 1/3 av Coleman fettet till en annan 20 mL tub med wide-tip pipett och definiera denna del som hög densitet fett.
- Producera ECM/SVF-gel från låg densitet fett.
- Använda två 20 mL sprutor ansluten av en kvinna-till-kvinna Luer-Lock-anslutningen (med en innerdiameter på 2,4 mm) för att intershift 20 mL av låg densitet fett.
- Hålla den skiftande hastigheten stabilt (vid 20 mL/s) och upprepa för 6 x till 8 x.
- Centrifugate blandningen vid 2000 x g på RT i 3 min.
- Samla in olja portion överst i en 10 mL röret med hjälp av wide-tip pipett på RT för vidare användning.
- Samla den klibbig substansen i det mellersta skiktet, som är ECM/SVF-gel (figur 1A), med hjälp av wide-tip pipett, och kassera vätskan på bottenlagret.
- Producera ECM/SVF-gel från högdensitets fett.
- Tillsätt 5 mL olja (som insamlats från steg 1.3.4) till 15 mL hög densitet fett.
- Intershift blandade fett mellan sprutor 6 x till 8 x tills en flockas observeras inom emulsionen.
- Centrifugate blandningen vid 2000 x g på RT i 3 min.
- Kassera olja portion på toppen.
- Samla den klibbig substansen i det mellersta skiktet (ECM/SVF-gel) med hjälp av wide-tip pipett och kassera vätskan på bottenlagret.
- Blanda ECM/SVF-gelen från steg 1.3.5 och 1.4.5.
2. naken mus ECM/SVF-gel Graft modell
- Söva naken möss (8 veckor gammal, kvinnliga) med isofluran (1% - 3%) inandning anestesi i ett djurs operation rum.
- Överföra ECM/SVF-gelen till en 1 mL spruta.
- Anslut 1 mL sprutan med en trubbig infiltration kanyl.
- För in kanylen subkutant varje flanken av musen.
- Injicera 0,3 mL av ECM/SVF-gel.
3. vävnad skörd på 3, 15 och 90 dagar efter ECM/SVF-gel injektion
- Söva möss med isofluran (1% - 3%) inandning anestesi.
- Offra möss av metoden cervikal Dislokation.
- Gör ett snitt vid mittlinjen av musens dorsala huden med kirurgisk sax.
- Dissekera och skörda fett hudtransplantat på båda sidorna av musen. Bädda in fett grafterna i de 4% paraformaldehyd på RT över natten.
- Torkar ut vävnaden i ökande koncentrationer av etanol: 70% etanol, två förändringar, 1 h vardera; 80% etanol, en förändring, 1 h; 95% etanol, en förändring, 1 h; 100% etanol, tre förändringar, 1,5 h vardera; xylen, tre förändringar, 1,5 h varje.
- Infiltrera vävnaden med paraffin vax (58-60 ° C), två förändringar, 2 h varje.
- Bädda in vävnaden i paraffinblock. Skär delar med en tjocklek av ca 4 µm och sätta dem på bilder.
4. hematoxylin och Eosin färgning
- Deparaffinize paraffin-block bilderna genom att blötlägga dem i xylen I, II och III (10 min varje).
- Rehydrera avsnitten vävnad genom att passera dem genom minskande koncentrationer (100%, 100%, 95%, 80%, 70%) av etanol bad för 3 min varje.
- Skölj vävnadssnitt i destillerat vatten (5 min).
- Fläcken avsnitten vävnad i hematoxylin för 5 min.
- Skölj avsnitten vävnad i rinnande vatten i 20 min. Decolorize i 1% syra alkohol (1% HCl i 70% alkohol) för 5 s. Skölj i rinnande vatten tills avsnitten är blå igen.
- Tillsätt två till tre droppar Eosin Y dye direkt på bilderna med pipett och låt färgen för 10 min.
- Tvätta bilderna i kranvatten för 1-5 min.
- Torka glasen i ökande koncentrationer (70%, 80%, 95%, 100%, 100%) etanol för 3 min varje.
- Klara bilder i xylen I och II för 5 min varje.
- Montera bilder i montering media.
5. Immunofluorescerande färgning
- Deparaffinize avsnitten vävnad i xylen I, II och III (5 min varje).
- Rehydrera avsnitten vävnad genom att passera dem genom olika koncentrationer (100%, 100%, 95%, 95%, 70%) av alkohol bad för 3 min varje.
- Inkubera i avsnitt i en 3% H2O2 lösning i metanol på RT i 10 min.
- Skölj glasen 2 x med destillerat vatten, 5 min varje.
- Släppa bilderna i bildspel korg. Tillsätt 300 mL 10 mM citratbuffert (pH 6.0) och inkubera bilderna på 95-100 ° C i 10 min.
- Coola bilder i RT i 20 min.
- Skölj glasen 2 x med fosfatbuffrad saltlösning (PBS), 5 min varje.
- Tillsätt 100 µL 10% fetalt bovint serum på bilderna och inkubera i en fuktig kammare vid RT för 1 h.
- Inkubera i avsnitt med primär antikropp lösning (marsvin anti mus Perilipin, 1: 400) vid 4 ° C över natten.
- Skölj glasen med PBS 3 x, 5 min varje.
- Inkubera i avsnitt med sekundär antikropp lösning (get anti guinea gris-488 IgG) för 2 h på RT.
- Skölj glasen med PBS 3 x, 5 min varje.
- Torka bort vattnet runt avsnittet med rent läskpapper.
- Släpp 4, 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) och Alexa Fluor 488-konjugerad isolectin i cirkeln för att täcka avsnittet i bilden.
- Montera coverslips och låt dem torka i mörker.
- Observera glasen med fluorescerande Mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter bearbetning Coleman fettet till ECM/SVF-gel, volymen av förbrukad olja tar upp 80% av den slutliga volymen, och endast 20% av fettvävnad som bevaras under olja lager betraktas som ECM/SVF-gel (figur 1A). ECM/SVF-gel har en slät vätska-liknande konsistens som gör det möjligt att gå igenom en 27 G fin nål; dock Coleman fett består av en integrerad fett struktur med stora fibrer och kan bara gå igenom en 18 G kanyl (figur 1B).
Dag 3 efter transplantation visades ett stort antal små Preadipocyter med flera intracellulära lipid droppar, omfattande välutvecklad simblåsa bindväv och infiltrerade inflammatoriska celler. Början på dag 15, antalet inflammatoriska celler börjat få minskas gradvis, och adipocyter började att mogna. Av dag 90, hade de flesta av simblåsa bindväv i grafterna ersatts av mogen adipocyter (figur 2, övre panelen).
ECM/SVF-gel ympkvistar innehöll några perilipin-positiv adipocyter, 3 dagar efter transplantationen. Små Preadipocyter med flera intracellulära lipid droppar började dyka upp på dag 15. Varje fält i ECM/SVF-gelen ympa sektioner dag 90 visade talrika perilipin-positiv adipocyter och nybildade blodkärl (figur 2, undre panelen).
Figur 1 : Bilder av ECM/SVF-gelen. Centrifugeras Coleman fett och ECM/SVF-gel efter bearbetning (A). ECM/SVF-gel kan injiceras enkelt genom en 27 G nål; Coleman fett kan dock bara passera en 18 G kanyl (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Histologiska förändringar i ECM/SVF-gel efter transplantation. ECM/SVF-gel visade omfattande välutvecklad simblåsa bindväv och infiltrera inflammatoriska celler på dag 3. Därefter ersattes de flesta av simblåsa bindväv av en struktur som innehåller mogna adipocyter (övre panel). Immunofluorescerande färgning visar att de flesta av vävnaden består av perilipin-negativa området på dag 3. Dag 15 verkade en stor del av perilipin + adipocyter. Talrika perilipin-positiv adipocyter hittades efter 90 dagar (nedre panelen). Skala barer = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stem cell-baserad regenerativ terapi har visat en stor potentiell fördel i olika sjukdomar. ASCs är utestående terapeutiska kandidater eftersom de är lätta att få och har kapacitet för vävnad reparera och regenerering av nya vävnader15. Dock finns det begränsningar att utöka dess kliniska tillämpning, eftersom det kräver komplicerade förfaranden för att isolera cellerna och kollagenas för bearbetning av6. Därför är det viktigt att utveckla en enkel teknik för att erhålla stamceller utan användning av kollagenas.
I denna studie presenterade vi en rent mekanisk process av fettvävnad att erhålla SVF celler, som är skyddade av infödda fett ECM. Denna process är dessutom fritt från kollagenas. En tidigare studie jämfördes olika intersyringe handläggningstider och visade att genom intersyringe bearbetning av standard Coleman fett för 1 min med en flödeshastighet på 10 mL/s är det optimala protokollet för att producera ECM/SVF-gel12. Genom att använda intersyringe skiftande, förstörs de flesta adipocyter i lipoaspirates, med de flesta SVF celler och ECM bevarade. Således är intersyringe skiftande det viktigaste steget i hela processen. Intersyringe skiftande hastighet och den tid som tillbringas på dirigering skifta fastställa förstörelse av fettvävnaden eftersom den sheering kraft som skapas av intersyringe processen är associerad med skiftande hastighet. Vi föreslår att den skiftande hastigheten bör vara stabil på 20 mL/s. otillräcklig förstörelse leder till återstående oönskade fettceller, medan overdestruction resulterar i skadliga SVF cellerna. Produkten av detta protokoll kan definieras som ECM/SVF-gel endast om det nått följande kriterier: 1) sin slutliga volym är ca 20% av den ursprungliga volymen; (2) det injiceras enkelt genom en 27 G nål. En tidigare studie visat att ECM/SVF-gelen innehåller höga tätheter av både CD45-/ CD31- / CD34 + ASCs och SVF cell densiteten är > 4.0 x 105 celler/mL12.
Under processen att skapa ECM/SVF-gel, var centrifugering genomfört 2 x, före och efter intersyringe skiftande. Innan den intersyringe skiftande, använder vi centrifugering för att skapa ”graderade tätheter” av fett. Detta är ett annat viktigt steg. Det har bevisats att högdensitets fett lager längst ner, efter centrifugeringen, är rik på kondenserad ECM men har mindre olja, medan låg densitet fett lager på toppen har mer olja men mindre ECM fiber16,17. Således bör dessa två lager behandlas på två olika sätt. Låg densitet fett kan direkt genomgå intersyringe behandling för att förstöra adipocyter. Hög densitet fettet på bottenlagret kräver dock ytterligare olja för att underlätta förstörelsen av adipocyter. De tillsatt oljan kan minska tätheten av högdensitets fett, att göra skifta mycket lättare. Dessutom kan oljan hjälpa till att utvinna mer olja från de trasiga adipocyter; Vattenhaltigt flytande kan emellertid inte. Således, vi lagt till extra olja till högdensitets fett. Centrifugeringen efter den intersyringe skiftande är att separera olja portion från SVF cellerna och ECM. Olja bör undvikas i slutprodukten.
Transplantation av ECM/SVF-gel resulterade i en stor avdragssatsen. Som vi nämnde ovan, det viktigaste steget för behandlingen av ECM/SVF-gel är intersyringe växling, som förstör de flesta av adipocyter. Således, lilla adipocyter återstod i ECM/SVF-gel. I figur 2visas ett litet perilipin-positiv område dök upp i transplanterade ECM/SVF-gel på dag 3. Men efter 15 dagar, massor av perilipin-positiv adipocyter dök upp och blev mogen efter 90 dagar. En tidigare studie har visat att transplantation av ECM/SVF-gel inducerade värd cellmedierad fettvävnad regenerering14. Använder Anti-humant leukocytantigen för att identifiera ursprunget för de nybildade fettceller, upptäckte vi att, även om de flesta av cellerna i SVF var graft-derived, de flesta av nybildade fettvävnaden värd-härledda. ECM/SVF-gel har en stor regenerativ funktion, som vi tidigare rapporterat. Denna produkt hade stora terapeutiska effekter i sårläkning12. Dessutom hjälpte till att förbättra överlevnaden av de gratis fliken i en musmodell av accelererande angiogenes10.
SVF-gel är en autolog injicerbara som innehåller infödda ECM och funktionella cellulära komponenter. Produkten genereras från lipoaspirate genom en enkel mekanisk process, som kan utföras enkelt utan någon oro för regleringsfrågor. Regenerativ effekten av ECM/SVF-gel är dock fortfarande oklart. För att bättre karaktärisera de positiva effekterna av ECM/SVF-gel, är ytterligare utredningar att karakterisera de underliggande molekylära mekanismerna av ECM/SVF-gel regenerativ effekt på väg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av National natur Science Foundation Kina (81471881, 81601702, 81671931), Stiftelsen naturvetenskap i provinsen Guangdong i Kina (2014A030310155), och administratören Foundation av Nanfang sjukhuset (2014B009, 2015Z002, 2016Z010, 2016B001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488-conjugated isolectin GS-IB4 | Molecular Probes | I21411 | |
| guinea pig anti-mouse perilipin | Progen | GP29 | |
| DAPI | Thermofisher | D1306 | |
| wide tip pipet | Celltreat | 229211B | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP2 | |
| nude nice | Southern Mdical University | / | |
| light microscope | Olympus | / | |
| 50 mL tube | Cornig | 430828 | |
| sterile bag | Laishi | / | |
| microtome | Leica | CM1900 | |
| centrifuge | Heraus |
References
- Bateman, M. E., et al. Using Fat to Fight Disease: A Systematic Review of Non-Homologous Adipose-Derived Stromal/Stem Cell Therapies. Stem Cells. 36 (9), 1311-1328 (2018).
- Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. , 812693 (2012).
- Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circulation Research. 100 (9), 1249-1260 (2017).
- Halme, D. G., Kessler, D. A.
- Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
- van Dongen, J. A., et al. Comparison of intraoperative procedures for isolation of clinical grade stromal vascular fraction for regenerative purposes: a systematic review. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 261-274 (2018).
- van Dongen, J. A., et al. The fractionation of adipose tissue procedure to obtain stromal vascular fractions for regenerative purposes. Wound Repair and Regeneration. 24 (6), 994-1003 (2016).
- Mashiko, T., et al. Mechanical Micronization of Lipoaspirates: Squeeze and Emulsification Techniques. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (1), 79-90 (2017).
- Feng, J., et al. Micronized cellular adipose matrix as a therapeutic injectable for diabetic ulcer. Regenerative Medicine. 10 (6), 699-708 (2015).
- Zhang, P., et al. Ischemic flap survival improvement by composition-selective fat grafting with novel adipose tissue derived product - stromal vascular fraction gel. Biochemistry and Biophysics Research Communication. 495 (3), 2249-2256 (2018).
- Tonnard, P., et al. Nanofat grafting: basic research and clinical applications. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (4), 1017-1026 (2013).
- Yao, Y., et al. Adipose Extracellular Matrix/Stromal Vascular Fraction Gel: A Novel Adipose Tissue-Derived Injectable for Stem Cell Therapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (4), 867-879 (2017).
- Yao, Y., et al. Adipose Stromal Vascular Fraction Gel Grafting: A New Method for Tissue Volumization and Rejuvenation. Dermatologic Surgery. 44 (10), 1278-1286 (2018).
- Zhang, Y., et al. Improved Long-Term Volume Retention of Stromal Vascular Fraction Gel Grafting with Enhanced Angiogenesis and Adipogenesis. Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (5), 676-686 (2018).
- Sun, B., et al. Applications of stem cell-derived exosomes in tissue engineering and neurological diseases. Reviews in the Neurosciences. 29 (5), 531-546 (2018).
- Allen, R. J., et al. Grading lipoaspirate: is there an optimal density for fat grafting. Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (1), 38-45 (2013).
- Qiu, L., et al. Identification of the Centrifuged Lipoaspirate Fractions Suitable for Postgrafting Survival. Plastic and Reconstructive Surgery. 137 (1), 67-76 (2016).
