Strukturell verwandte Proteine üben häufig unterschiedliche biologische Funktionen. Der Austausch von äquivalenten Regionen dieser Proteine um Chimären Proteinen zu schaffen stellt einen innovativen Ansatz zur kritischen Protein Regionen zu identifizieren, die für ihre funktionale Divergenz verantwortlich sind.
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Methodenartikel
Festlegung der funktionellen Protein Regionen durch chimäres Protein Aufbau
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das Ziel dieses Protokolls umfasst das Design von Chimären Proteinen in die unterschiedliche Regionen eines Proteins durch ihre entsprechenden Sequenzen in einem strukturell ähnlichen Protein ersetzt werden, um die funktionelle Bedeutung dieser Regionen zu ermitteln. Diese Chimären entstehen mittels einer verschachtelten PCR-Protokoll mit überlappenden DNA-Fragmente und angemessen entworfen, Grundierungen, gefolgt von ihren Ausdruck in einem Säugetier-System nativen Sekundärstruktur und post-translationalen Modifikationen zu gewährleisten.
Die funktionale Rolle der eigenständige Region wird dann durch einen Verlust der Aktivität der Schimäre in einer entsprechenden Anzeige-Assay. In der Folge werden Regionen beherbergen eine Reihe von wichtigen Aminosäuren identifiziert, die weiter durch ergänzende Techniken (z.B. Site-verwiesene Mutagenese) zur Erhöhung der molekularen Auflösung gezeigt werden. Obwohl auf Fälle begrenzt, in denen strukturell verwandte Proteine mit unterschiedlichen Funktionen gefunden werden kann, haben Chimäre Proteinen erfolgreich eingesetzt worden, um kritische verbindliche Regionen in Proteine wie Zytokine und Zytokin-Rezeptoren zu identifizieren. Diese Methode eignet sich besonders in Fällen, in denen das Protein funktionale Regionen nicht gut definiert sind, und ist einen wertvollen erste Schritt gerichtete Evolution Ansätze zur Eingrenzung der Regionen von Interesse und reduzieren den Aufwand für Screening.
Einleitung
Verschiedene Arten von Proteinen, einschließlich Zytokine und Wachstumsfaktoren, werden in Familien zusammengefasst, deren Mitglieder teilen ähnliche dreidimensionale Strukturen aber oft üben unterschiedliche biologische Funktionen1,2. Diese Funktionsvielfalt ist in der Regel die Folge der kleine Unterschiede in der Aminosäure-Zusammensetzung innerhalb des Moleküls aktive Zentren3. Identifikation von solchen Websites und funktionelle Determinanten bieten nicht nur evolutionäre Erkenntnisse sondern auch spezifischere Agonisten und Inhibitoren4zu entwerfen. Allerdi....
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Protokoll
(1) chimäres Protein-Design
- Wählen Sie eine geeignete Protein (Spender), Regionen mit dem Protein des Interesses (Empfänger) auszutauschen, die die Spender-Protein strukturell ähnlich, im Idealfall, gehören zur gleichen Proteinfamilie, aber es fehlte die biologische Aktivität als Anzeige verwendet werden sollen. Wenn keine strukturell verwandte Proteine bekannt sind, können potenzielle Kandidaten identifiziert mit Hilfe eines automatisierten Tools wie die Vector Alignment Search Tool (VAST)14,15
- Zugriff auf die Protein Data Bank (PDB)16 Europäische Website (https://www....
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Ergebnisse
Konstruktion und Erstellung von ein chimäres Protein (Abbildung 1) werden mit zwei Mitgliedern der Familie Zytokin Interleukin-6, OSM und LIF, die Gegenstand einer kürzlich veröffentlichten Studie6waren veranschaulicht werden. Abbildung 2 zeigt die dreidimensionale Struktur dieser Proteine. Beide Moleküle übernehmen die charakteristische Sekundärstruktur der Klasse ich Zytokine, mit vier Helices (genannt A.......
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Diskussion
Die Generation von Chimären Proteinen stellt eine vielseitige Technik, die über die Grenzen der abgeschnittenen Proteine zu Fragen wie die Modularität der Zytokin-Rezeptor bindende Domänen13gehen kann. Das Design der Chimären ist ein wichtiger Schritt in dieser Art von Studien und erfordert eine sorgfältige Prüfung. Vorstudien, Funktionsbereiche zu etablieren erfordert in der Regel Substitution von weite Regionen in einer ersten Phase, während kleinere Erneuerungen von variabler Länge für detailli.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der Max-Planck-Gesellschaft und der Schüchtermann-Klinik (Bad Rothenfelde, Deutschland) unterstützt. Teil dieser Forschung wurde ursprünglich im Journal of Biological Chemistry veröffentlicht. Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. Die AB Schleife und D-Helix in Bindungsstelle III des menschlichen Oncostatin M (OSM) sind für die OSM-Rezeptor-Aktivierung erforderlich. J Biol Chem 2018; 18:7017-7029. © der Autoren.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Labcycler Thermocycler | Sensoquest | 011-103 | Jedes herkömmliche PCR-Gerät kann zur Durchführung dieses Protokolls verwendet werden |
| NanoDrop 2000c UV-Vis Spektralphotometer ThermoFisher | Scientific | ND-2000C | DNA-Quantifizierung |
| GeneRuler 100 bp DNA-Leiter | ThermoFisher Scientific | SM0241 | |
| GeneRuler DNA-Leitermischung | ThermoFisher Scientific | SM0331 | |
| Asci-Restriktionsenzym | New England Biolabs | R0558 | |
| PacI-Restriktionsenzym | New England Biolabs | R0547 | |
| Phusion Hot Start II DNA-Polymerase | ThermoFisher Scientific | F-549S | |
| dNTP-Set (100 mM) | Invitrogen | 10297018 | |
| Promega | M1804 | ||
| NucleoSpin Gel und PCR-Aufreinigungskit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| MGC Human LIF Sequence-verified cDNA (CloneId:7939578), Glycerinstamm | ThermoFisher Scientific | MHS6278-202857165 | |
| LE Agarose | Biozym | ||
| Primer | Sigma-Aldrich | Sonderanfertigung | |
| Human Oncostatin M cDNA | Geschenk von Dr. Heike Hermanns (Klinische Abteilung für Hepatologie, Universitätsklinikum Wü rzburg, Deutschland) | ||
| pCAGGS-Vektor mit PacI- und ASCI-Restriktionsstellen | Geschenk von Dr. André Schneider (Max-Planck-Institut für Herz- und Lungenforschung, Bad Nauheim, Deutschland) |
Referenzen
- Huising, M. O., Kruiswijk, C. P., Flik, G. Phylogeny and evolution of class-I helical cytokines. The Journal of Endocrinology. 189 (1), 1-25 (2006).
- Brocker, C., Thompson, D., Matsumoto, A., Nebert, D. W., Vasiliou, V. Evolutionary divergence and functions of the ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
