Summary
قياس القدرة افلوكس نسبة الكولسترول في الدم في المختبر للمصل أو البلازما في نماذج خلية سنخية أداة واعدة كالعلامات البيولوجية لتصلّب الشرايين. في الدراسة الحالية، وتحسين وتوحيد أسلوب efflux بنك دبي الوطني-الكوليسترول فلورسنت ووضع تحليل الفائق باستخدام لوحات 96-جيدا.
Abstract
تصلب الشرايين يؤدي إلى أمراض القلب والأوعية الدموية (الرسوم التعويضية). لا يزال غير واضح ما إذا كان تركيز الكوليسترول في الدم-الحميد (تشدل) يلعب دوراً سببية في تطور تصلب الشرايين. ومع ذلك، عاملاً هاما في المراحل الأولى من تشكيل اللوحة عصيدة هو الكوليسترول افلوكس القدرة على الحميد (قدرة جسيمات HDL على قبول نسبة الكولسترول في الدم من الضامة) تفاديا لتشكيل خلية الرغاوي. هذا خطوة أساسية في تجنب تراكم الكولسترول في البطانة وجزء من الكوليسترول عكس النقل (RCT) للقضاء على نسبة الكولسترول في الدم عن طريق الكبد. نسبة الكولسترول في الدم افلوكس القدرات للمصل أو البلازما في نماذج خلية سنخية هو أداة واعدة التي يمكن استخدامها كالعلامات البيولوجية لتصلّب الشرايين. وتقليدياً، [ح]3[-الكوليسترول وقد استخدمت في فحوصات افلوكس نسبة الكولسترول في الدم. في هذه الدراسة، ونحن نهدف إلى وضع استراتيجية أكثر أماناً وأسرع استخدام الفلورية المسمى-الكوليسترول (دبي-الكوليسترول) في مقايسة خلوية لتتبع عملية امتصاص و efflux الكولسترول في الضامة THP-1-مشتقة. أخيرا، نحن تحسين وتوحيد الأسلوب efflux بنك دبي الوطني-الكوليسترول ووضع تحليل الفائق باستخدام لوحات 96-جيدا.
Introduction
ووفقا "منظمة الصحة العالمية"، هي الحالية الأسباب الرئيسية للوفاة في العالم مرض القلب الاقفاري والسكتة الدماغية (في حساب إجمالي الوفيات 15.2 مليون)1. كلاهما أمراض القلب والأوعية الدموية (الرسوم التعويضية) التي يمكن أن تكون مسبوقة بتصلب الشرايين وتمزق لويحات عصيدة في الأوعية الدموية2،3.
تصلب الشرايين هو سفينة جدار مرض تحريضية التي الضامة وخلايا T وخلايا ماست والخلايا الجذعية التسلل البطانة وتتراكم في الدم، في نهاية المطاف تشكيل لويحات تصلب الشرايين. يقدم لويحات تصلب الشرايين الدهون البلورات الأساسية ونسبة الكولسترول في الدم، ويتضح من قياسات الموجات فوق الصوتية ب-وضع الاستبانة البطانية السباتي الوسائط سمك4،5. الضامة، ينفذ efflux الكولسترول نحو جزيئات الدهن يقبلون بالوسائل مستقبلات كاسيت (ABC) ملزمة ATP ABCA1، ATP ملزمة كاسيت الفصيلية ز الأعضاء 1 (ABCG1)، ومستقبلات الزبال ريال والثنائي. ويعتبر عدم التوازن في تدفق نسبة الكولسترول في الدم وافلوكس في الضامة عملية رئيسية في تصلب الشرايين بدء6. افلوكس نسبة الكولسترول في الدم ويعتبر خطوة أساسية في القضاء على نسبة الكولسترول في الدم من الأنسجة الطرفية للبلازما والكبد في عملية تسمى الكوليسترول عكس النقل (RCT). يتم نقل الكوليسترول في الدم من الضامة أساسا إلى الابوليبوبروتين A1 (ApoA1) الموجودة على سطح جزيئات البروتين الدهني الكثافة (HDL). ثم النقل HDLs الكوليسترول إلى الكبد لإفراز وإعادة استعمال7،،من89.
تقليديا، الكولسترول وصفت الإذاعة التريتيوم (3ح) قد استخدمت في نسبة الكولسترول في الدم افلوكس10. إشارة الانبعاثات من النظائر المشعة هي حساسة للغاية10؛ ومع ذلك، يعرض الكولسترول وصفت الإذاعة المعوقات الواضحة مثل بروتوكولات طويلة وخطر التعرض للإشعاعات المؤينة، والحاجة إلى مرافق النشاط الإشعاعي الخاصة والمعدات لضمان المناولة الآمنة للانبعاثات المشعة. على العكس من ذلك، أدرجت الأسفار بنجاح في تقنيات التشخيص نظراً لبساطته في الكشف عن إشارة الفلورسنت، وتشكيله واسعة من فلوروفوريس المتاحة، و سلامة11. استخدمت عدة والاستيرولات المسمى الفلورسنت لدراسة الأيض نسبة الكولسترول في الدم بما في ذلك ديهيدرورجوستيرول (مع الأسفار الجوهرية)، والكوليسترول دانسيل، 4, 4-ديفلورو-3 أ، 4adiaza-s-إينداسيني (بوديبي)-نسبة الكولسترول في الدم، و 22-(N-(7- Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol (دبي-الكوليسترول في الدم). خاصة، يقدم بنك دبي الوطني-الكوليسترول كفاءة امتصاص في الخلايا البشرية12. اثنين مختلفة بنك دبي الوطني المسمى الكولسترول المتوفرة حاليا: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-بنك دبي الوطني) و 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-بنك دبي الوطني؛ الشكل 1). نسبة الكولسترول في الدم المسمى مع مجموعة 22-بنك دبي الوطني قد تناسب الدراسات افلوكس نسبة الكولسترول في الدم، بينما 25-دبي-الكولسترول وهي تستخدم أساسا في الغشاء الخلوي ديناميات البحث13،14.
هي خطوط الخلايا المستخدمة عادة في نسبة الكولسترول في الدم في المختبر فحوصات efflux الوحيدات مثل الخلايا مثل الخلايا البشرية THP-1 المستمدة من سرطان الدم أو الخلايا 264.7 الخام موريني15J774.1. كل من هذه الخلايا يمكن أن تكون متباينة في الضامة في المختبر باستخدام phorbol 12-ميريستاتي 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية)، ولكن تعكس THP-1-المستمدة الضامة (دمثب-1) أفضل وتقليد الضامة البشرية16.
في الدراسة الحالية، وتحسين وتوحيد أسلوب الفائق فلورسنت لتحديد قدرة efflux الكولسترول عينات المصل في دمثب-1، باستخدام الكولسترول-22-بنك دبي الوطني كبديل ل [ح]3[-نسبة الكولسترول في الدم. وباﻹضافة إلى ذلك، قارنا تقنية نيون الأمثل مع التناظرية المشعة القياسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
لهذه الدراسة، تم الحصول على الموافقة الخطية، علم من جميع المواضيع وموافقة اللجنة الأخلاقية (Comitè Ètic d 'Investigació Clínica،"مستشفى عيادة"، برشلونة؛ والموافقة على عدد شتلويرث/سداسي كلورو البنزين/2014).
1-إعداد الكولسترول-بنك دبي الوطني
- حل بنك دبي الوطني-الكوليسترول (494.63 ميغاواط؛ انظر الجدول للمواد) في الإيثانول النقي للحصول على الأوراق المالية (2 مم). لقنينة 10 ملغ، إذابة محتويات القنينة كاملة في وحدة تخزين مل 10.1 من الإيثانول للحصول على أسهم 2 مم.
- تمييع بنك دبي الوطني-الكوليسترول من المخزون في ربمي 1640 تستكمل مع 10% الجنيني البقري المصل و 5% البنسلين/ستربتوميسين (R10 المتوسطة) للوصول إلى تركيز نهائي من 5 ميكرومترات (مثل، الحصول على 10 مل من بنك دبي الوطني-الكولسترول في 5 ميكرومترات التركيز النهائي) التي تمييع 25 ميكروليتر من الأسهم بنك دبي الوطني-نسبة الكولسترول في الدم (2 مم) في المتوسط R10. هذا المجلد كاف لصفيحة 96-جيدا.
2-خلية الثقافة وبذر (اليوم-2)
- الثقافة THP-1 الخلايا في المتوسطة R10 على 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2. ضبط إلى 0.3 × 106 خلايا/مل كل 3 أيام.
- بذور الخلايا في صفيحة 96-بئر أبيض مع قاع مسطح، واضحة في 0.2 × 106 خلايا/بئر في R10 المتوسطة (100 ميكروليتر كل بئر).
- علاج الخلايا مع 100 نانومتر phorbol 12-ميريستاتي 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية؛ ومن أصل 10 ميكرومترات) ح 48 – 72، تفرخ في 37 درجة مئوية، الخلايا 5% CO2 التفريق بين THP-1 دمثب-1.
ملاحظة: من المستحسن استخدام 5 ميكروليتر من سلطة النقد الفلسطينية الأسهم (10 ميكرومترات) في 500 ميكروليتر من المتوسطة R10. وقبل ذلك، إعداد 10 ميكرومترات الأسهم سلطة النقد الفلسطينية بتذويب قنينة ز 1 المجففة بالتبريد في 10 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])، الكوة، والأوراق المالية في-20 درجة مئوية. - وبدلاً من ذلك (اقتراح) الجمع بين الخطوات 2.2 و 2.3 لتجانس أفضل. إعداد 10 مل خلايا THP-1 في أنبوب 15 مل وإضافة 200 ميكروليتر من سلطة النقد الفلسطينية الأسهم (10 ميكرومترات) وتخلط بلطف وفورا البذور 100 ميكروليتر كل بئر على اللوحة. احتضان الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2، 3.
3-الابوليبوبروتين ب المنضب المصل (أبدس) إعداد (اليوم 2 أو 3)
- إعداد حلاً البولي إثيلين غليكول (شماعة)، يؤدي إلى تمييع جليكاين في برنامج تلفزيوني 10% (مع العقيم ح2س) بتركيز 200 ملم في درجة الحموضة 7.4. إضافة 40 مل من 200 مم جليكاين إلى 10 غم من 8000 ربط الحصول على شماعة 20% (w/v). مزيج من الحل بقوة تجانسه.
- تطبيق 4 أجزاء من 20% ربط كل 10 أجزاء من المصل/بلازما في كل عينة المصل/البلازما في أنبوب 1.5 مل وترك الخليط على الجليد ل 25 دقيقة17 (على سبيل المثال، لإضافة 100 ميكروليتر من البلازما أو المصل، 40 ميكروليتر من 20% ربط الحل).
- الطرد المركزي متسرعا شماعة-الابوليبوبروتين ب في س 13,000 ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- تجاهل متسرعا. نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد.
ملاحظة: ونحن نقترح إعداد أبدس في اليوم 3 (جديد). إذا لم يكن ذلك ممكناً، إعداد أبدس في يوم 2 وإبقائه في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
4-بنك دبي الوطني-الكوليسترول خلية التحميل (2 يوم)
- تجاهل المتوسطة الثقافة دمثب-1 وغسل الخلايا مرتين مع 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS).
- تحميل الخلايا مع 5 ميكرومترات بنك دبي الوطني-نسبة الكولسترول في الدم (100 ميكروليتر كل بئر) في المتوسط R10 واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
5-حضانة مع المتقبلين لنسبة الكولسترول في الدم (اليوم الثالث)
- تجاهل على المديين المتوسط وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني.
- احتضان الخلايا مع أبدس 2-5% أو التركيز المطلوب من يقبلون المنقاة في الدهون (الكوليسترول الجيد، وبرنامج عمل ألماتي، والذين، إلخ) مخففة في المتوسط RPMI 1640 عديم اللون (100 ميكروليتر كل بئر) النسبة ح 4 – 6 عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: تضمين عنصر تحكم سلبية (ج-) تتكون من عديم اللون المتوسط RPMI 1640 دون المتقبلين وعنصر إيجابي (ج +) (مثلاً، أبدس من مجموعة مانحين صحي) أو HDLs المنقي. علما بأن عنصر التحكم الإيجابي ينطبق خاصة عندما تكون عينات المرضى (الحالات المرضية) حلل (تكميلية الشكل 1). - إعداد مخزون 200 مل من حل تحلل الخلية 1 (العازلة تريس 50 مم, 150 مم كلوريد الصوديوم، ح2س). مزيج نسبة الحل 1 في 1:1 (الخامس: الخامس) تحلل الخلية مع الإيثانول النقي للحصول على حل تحلل 2.
6. التقاط إشارة فلوري (اليوم الثالث)
-
كشف الكولسترول بنك دبي الوطني-وسائط الإعلام
- إزالة متوسط الخلية من اللوحات وأنه جمع في صفيحة 96-جيدا بيضاء جديدة مع أسفل شقة معتمة.
- اكتشاف إشارات أمثل fluorescence في عينات وسائل الإعلام، لإضافة 100 ميكروليتر من الإيثانول النقي إلى 100 ميكروليتر من كل عينة متوسطة للحصول على نسبة 1:1 في لوحة بيضاء 96-جيدا.
- إبقاء اللوحة مع وسائل الإعلام تعامل لتدبير آخر كثافة الفلورية (وأي فأي) في الطول موجي نانومتر (الإثارة/الانبعاثات) 463⁄536 في لومينوميتير.
-
كشف بنك دبي الوطني-الكولسترول داخل الخلايا
- تغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني.
- للحصول على نسبة الكولسترول في الدم داخل الخلايا، الخلايا التي تفرخ لهم مع 100 ميكروليتر من تحلل الحل 2 كل بئر ويهز اللوحة في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 25 دقيقة.
- لالتقاط الكشف عن إشارة fluorescence أمثل في عينات ليساتي الخلية، شدة الأسفار ليساتيس خلية بنفس اللون الأبيض أسفل لوحة 96-جيدا مع واضحة مسطحة (نفس اللوحة التي كانت تبذر الخلايا في الخطوة 2، 2).
- 6.3 قياس كثافة الفلورية (وأي فأي) في لومينوميتير حين ضبط المعلمة حساسية إلى 50 في البرنامج (انظر الجدول للمواد).
7-نتائج التحليل
- التعبير عن معدل الكوليسترول افلوكس من عينة كنسبة مئوية محسوبة بالمعادلة:
- الحصول على المقياس النهائي لنسبة الكولسترول في الدم افلوكس (CE) بطرح CE السيطرة السلبية (عينة محملة بدبي-الكوليسترول ولكن المحتضنة مع المتوسط RPMI 1640 عديم اللون، دون المتقبلين لنسبة الكولسترول في الدم) من CE من نظراً للعينات:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هدف التحليل افلوكس نسبة الكولسترول في الدم تحديد في المختبر قدرة efflux الكولسترول مصل معين أو البلازما، أو المادة طافية تحتوي على جزيئات الكوليسترول الجيد. الأسلوب الذي يتكون من تحميل الكوليسترول المسمى إلى ثقافة خط خلية سنخية القياسية وحمل الاتصال مع عينة الاختبار المخفف في وسائل الإعلام الحرة FBS مع الخلايا. أخيرا، يتم قياس مستويات الفلورسنت من بنك دبي الوطني في وسائل الإعلام وخلية ليساتي. لتحسين القياسات، مختلطة مع حجم واحد من المذيبات التي تحتوي على الإيثانول الكوليسترول افلوكسيد من الخلايا لوسائل الإعلام. بنك دبي الوطني-الكوليسترول المتبقية في الخلايا هو حراكه في المذيبات التي تحتوي على الإيثانول أو المنظفات قبل القياسات. وأخيراً، يتم تحديد نسبة الكوليسترول المسمى افلوكسيد إلى مجموع. واستخدمت لإعداد الأسلوب، الابوليبوبروتين ب المنضب المصل (أبدس) من مجموعة مانحين صحي.
تم التحقيق في أفضل الأحوال تمييع لبنك دبي الوطني-الكوليسترول في المتوسطة والإيثانول. نحن اختبار السلوك الفلورسنت الكولسترول دبي الحرة في بيئات المذيبات متعددة، بما في ذلك نسب مختلفة من الإيثانول وعديم اللون RPMI 1640. أظهرت كثافة الفلورية (وأي فأي) دبي-نسبة الكولسترول في الدم المخفف في محلول مائي أدنى القيم وأي فأي، حين بنك دبي الوطني-الكولسترول داخل الإيثانول النقي تنبعث أعلى وأي فأي. هذا يوحي بأن انبعاث fluorescence جزيء الكولسترول-22-دبي الوطني اعتماداً كبيرا على المتوسط الذي كان واردا. وبناء على ذلك، إشارة الأسفار 22-دبي-الكولسترول أعلى بكثير عند وضعه في إيثانول التي تحتوي على وسائط الإعلام. لاحظنا أن بنسبة 1:1 وسائل الإعلام: الإيثانول، إشارة شدة الأسفار يزيد تناسبياً مع تركيز الكوليسترول التناظرية في حدود 0.5 – 50 ميكرومتر، مما يوحي سلوك مناسب للتحقيق في هذه القضية (الشكل 2 ). ويمثل السلوك الخطي في الشرط 1:1 (وسائط الإعلام: الإيثانول) بالمعادلة التالية: y = 20.88 146.7 مع آر2 + x = 0.9341.
خطوة أساسية في هذا الأسلوب هو الوقت المستغرق من حضانة الخلايا المحملة المتقبلين الكولسترول حيث الكوليسترول قادرة على افلوكس. من أجل تحديد الوقت المطلوب من الحضانة، وكان حصاد خلية الإعلام تيميبوينتس مختلفة (1 إلى 24 ساعة؛ الشكل 3). افلوكس الكولسترول في النطاق من 0 إلى 6 ح تطورت خطيا (ف < 0.0001; y = 18.2 x + 127.3) بطريقة تعتمد على الوقت. تم إشارة الحد الأقصى بالقبض في ح 6 بعد أن تمت إضافة أبدس إلى الخلايا. بعد ح 6، فقدت الكوليسترول الانتظام في افلوكس، حيث زادت تقلب بعد ح 6 الحضانة مع أبدس (الشكل 3).
بالإضافة إلى ذلك اختبرنا عتبة الإشباع والنطاق الديناميكي كما تنطبق على الإنسان أبدس بقياس CE في نسب مختلفة من الوسائط التي تحتوي على الكوليسترول الجيد (أبدس). Efflux بنك دبي الوطني-الكولسترول في مقايسة عالية الإنتاجية (96-جيدا لوحة) تطور خطيا ضمن أبدس 1-7 في المائة، حيث زاد وأي فأي بطريقة تعتمد على التركيز مع أبدس، وصلت إلى ذروة قدرة efflux الكولسترول في أبدس 7% (الشكل 4). بتركيزات أعلى من نسبة 7 في المائة، انخفضت وأي فأي في علاقة عكسية مع النسبة المئوية أبدس. قد يكون ذلك لأنه تمت إعادة إدخال الكوليسترول تحميل الخلايا من بنك دبي الوطني-الكوليسترول الحميد موجودة في وسائل الإعلام.
ويستخدم الأسلوب القياسي لقياس نسبة الكولسترول في الدم افلوكس الكولسترول المسماة راديو (3ح)16. لتقييم أداء لدينا أسلوب المستندة إلى الأسفار، أداء، ومقارنة تقنيات الفلورسنت ووصفت الإذاعة. وجدنا أن الأسلوب التقليدي في النشاط الإشعاعي واسلوبنا الكولسترول بنك دبي الوطني-كانت ارتباطاً وثيقا (r بيرسون = 0.97؛ ف < 0.001) باستخدام تركيزات مختلفة من أبدس (1 – 8%؛ الشكل 5). وعموما، هذا يوحي بأن لدينا أسلوب الفلورية قد يكون بديلاً أكثر أماناً من تقنية المشعة.
وأخيراً، نحن مقارنة أسلوبنا مختلفة من بنك دبي الوطني فلورسنت التحقيق. قارنا لدينا طريقة لمجموعة تحليل يستند إلى الخلية الفائق تجاري يهدف إلى تحديد افلوكس الكولسترول في الخلايا (طقم المقايسة افلوكس نسبة الكولسترول في الدم؛ ويستند إلى الخلية). الطريقة التي وضعت في مجموعتنا كانت حساسة لزيادة تركيز يقبلون (% أبدس) ضمن القيم CE بين 5 و 15 في المائة. بيد مجموعة تجارية، يؤديها اتباع إرشادات الشركة المصنعة، أسفرت التدابير CE أقل من 5 في المائة على امتداد النطاق أبدس جزيئي؛ وهكذا، CE الناتجة عن ذلك كان أساسا تتأثر عندما كان أبدس زيادة (الشكل 6).
رقم 1: الهياكل الجزيئية الطبيعية نسبة الكولسترول في الدم (A) والكولسترول-22-بنك دبي الوطني (ب) والكولسترول-دبي-25 (ج)- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: دبي-الكوليسترول fluorescence كثافة (وأي فأي) بنسب مختلفة من الإيثانول وعديم اللون المتوسط RPMI 1640. كان المخفف دبي-الكولسترول في 1:0، 3:1، 1:1، 1:3، و 0:1 الإيثانول: مائي نسب متوسط تركيزات الكولسترول بنك دبي الوطني-بين 0.5 و 50 ميكرون. وأي فأي إشارة اكتشفت من قبل لومينوميتير مع المعلمة حساسية في 70 في برنامج فلوريميتير. وتم قياس إشارة وأي فأي من وسائط الإعلام وخلية ليستي استخدام الأبيض 96-جيدا لوحات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: efflux الوقت-تطور بنك دبي الوطني-الكولسترول في الضامة مشتقة THP-1- دمثب-1 كانت محملة 5 ميكرومتر بنك دبي الوطني-الكوليسترول والمحتضنة مع أبدس 5%. وقيست خلية الإعلام في صفيحة 96-جيدا أبيض في تيميبوينتس مختلفة (ح 1 – 24). وترد القيم ± متوسط الانحراف المعياري لآبار كوادروبليكاتي. تم الكشف عن إشارة وأي فأي قبل لومينوميتير مع المعلمة حساسية في 70 في برنامج فلوريميتير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: افلوكس دبي-الكولسترول في الضامة THP-1-مشتقة في لوحة 96-جيدا بتركيزات مختلفة من أبدس- دمثب-1 الخلايا تعامل مع 5 ميكرومتر بنك دبي الوطني-الكولسترول، المحتضنة مع نسب مختلفة من أبدس، وتفكيك مع الإيثانول. وتم قياس إشارة وأي فأي من وسائط الإعلام وخلية ليستي استخدام لوحة بيضاء 96-جيدا في فلوريميتير 1:1 (الإيثانول: تحلل الحل 1). تم طرح تدابير المراقبة السلبية (أبدس وسائل الإعلام غير المعالجة) على المستويات المقدمة. يتم عرض القيم كالانحراف المعياري ± يعني ثلاث آبار. تم الكشف عن إشارة وأي فأي قبل لومينوميتير مع المعلمة حساسية في 50 في برنامج فلوريميتير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5: العلاقة بين بنك دبي الوطني-الكوليسترول و [ح]3[-افلوكس نسبة الكولسترول في الدم في الضامة THP-1-مشتقة. وبعد دمثب-1 مع الكوليسترول المسمى المقابلة ح 6. وتم قياس efflux الكولسترول استخدام أبدس 1-8%. لعينات بنك دبي الوطني-نسبة الكولسترول في الدم، وتم الكشف عن إشارة الفلورية استخدام الأبيض 96-جيدا لوحات في فلوريميتير في 1:1 الإيثانول: تحلل الحل 1. تم الكشف عن إشارة وأي فأي قبل لومينوميتير مع المعلمة حساسية في 50 في برنامج فلوريميتير. [3ح]-عينات الكولسترول، إشارة المشعة تم الكشف عن استخدام 100 ميليلتر من المتوسطة وخلية ليستي مختلطة مع التﻷلؤ كوكتيل والأحمر في عداد التﻷلؤ، يتبع البروتوكول وصف منخفضة et al.17. كان تحديد فعالية الارتباط باستخدام معامل ارتباط بيرسون للبحث والتطوير. تم طرح تدابير المراقبة السلبية (أبدس وسائل الإعلام غير المعالجة) من الأسفار ومستويات المشعة التي يوفرها. يتم عرض القيم كالانحراف المعياري ± يعني ثلاث آبار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: مقارنة بين الفائق بنك دبي الوطني-الكوليسترول efflux المقايسة ومجموعة أدوات تحليل يستند إلى الخلية فلورسنت تجارياً. وقيمت نسبة الكولسترول في الدم افلوكس من أبدس بعد البروتوكول وصف استخدام الإيثانول تحلل المذيبات (50%) أو توين 80 (1%). تم تقييم الطقم الفلورسنت التحليل يستند إلى الخلية وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة في هذه المجموعة. يتم عرض القيم كالانحراف المعياري ± يعني ثلاث آبار. تم الكشف عن إشارة وأي فأي قبل لومينوميتير مع المعلمة حساسية في 50 في البرنامج فلوريميتير الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 7: رسم تخطيطي لسير العمل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
التكميلية الرقم 1: افلوكس دبي-الكوليسترول عينات المصل من المرضى المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية، وعنصر تحكم قياسية إيجابية (ج +)- يتم إظهار التباين بين فرادى الأسلوب efflux الكولسترول بنك دبي الوطني-تطبق على مجموعة من المرضى المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية. يمثل عنصر تحكم داخلية إيجابية (ج +) efflux دي بنك دبي الوطني-الكولسترول من مجموعة عينات الأمصال للمرضى الأصحاء 8. إظهار أشرطة الخطأ المعياري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الكوليسترول المسمى الفلورسنت استراتيجية واعدة لتحليل والتحقيق في خصائص واستقلاب الكوليسترول الطبيعية في المختبر. مميزاتها الرئيسية هي أنه يمكن أن تتناولها الخلايا، ويسمح لداخل الخلية والغشاء توزيع الدراسات، ويمكن تطبيقها على نسبة الكولسترول في الدم افلوكس فحوصات مثل هذا البروتوكول (الشكل 7). تسمح بعض والاستيرولات المسمى الفلورسنت الكولسترول تتبع في المختبر بما في ذلك بوديبي-نسبة الكولسترول في الدم والكوليسترول دانسيل وديهيدروجروستيرول والكولسترول 22 و 25 بنك دبي الوطني12. وبخاصة، 22-دبي-الكولسترول مناسبة لدراسة ديناميات الكولسترول مع أنواع مختلفة من الخلايا و كبديل الكولسترول المسماة راديو18. لا يوجد أي أسلوب توافق الآراء تقييم إشارة الفلورسنت في الإنزيم افلوكس نسبة الكولسترول في الدم. أغنية et al.14 حصاد ليساتيس المتوسطة وخلية لقياس وأي فأي على حدة؛ ليو et al.14 نقل المتوسطة إلى لوحات أخرى، وتم قياس إشارة مضيئة داخل الخلايا مباشرة في لوحة الثقافة؛ وتستخدم تشانغ وآخرون15 المخزن مؤقت تحلل للخلايا، متبوعاً بتنقية الكولسترول الفلورية تمييع في الإيثانول النقي والكشف عن إشارة شدة الأسفار19. في أعمالنا الإنزيم افلوكس نسبة الكولسترول في الدم، استخدام نفس تكوين المذيبات النهائي في وسائل الإعلام ويسمح بتجانس وسائل الإعلام الخلية وقياسات ليساتي كفاءة الخلايا.
هذه الدراسة لمحة عن efflux بنك دبي الوطني-الكولسترول على مر الزمن، والاطلاع على تطور تعتمد على الوقت حتى 6 ح الحضانة مع أبدس يقبلون، مماثلة لأغنية et al.14 وليو et al.14 وعلى عكس تشانغ وآخرون الذين استخدموا فترة حضانة ح 1 مع متقبلون الدهن19. لقد وجدنا أن الكوليسترول افلوكسيد بعد 6 ح الحضانة، فقدت الخطي؛ ولذلك، من أهمية قصوى ليس لتتجاوز ح 6. كان لدينا مجموعة الأمثل للكوليسترول افلوكس بين ح 3 إلى 6 بعد إضافة المتقبلين. ونحن نقترح تفرخ الخلايا ح 4 مع متقبلون نسبة الكولسترول في الدم. خطوات حاسمة إضافية استخدام وسائط الإعلام عديم اللون تنطبق المتقبلين تفاديا للخلفية، وبذر طبقة ثقافة خلية شبه المتلاقية، وضمان التزام صحيح لتلك اللوحة. تجدر الإشارة إلى أن واضح أسفل اللوح الأبيض مفيد لتتبع الخلايا تحت مجهر خفيفة معكوس.
ويضطلع معظم فحوصات efflux الكولسترول استخدام المتقبلين لتنقية المحتوى الدهني في اختبار افلوكس نسبة الكولسترول في الدم. التقنية الحالية التي وضعت للحصول على قدرة افلوكس نسبة الكولسترول في الدم من مصل الدم البشري أو عينات البلازما. نستخدم متقبلون الكولسترول الجوهرية الموجودة في المصل، ولكن من الأهمية بمكان لإزالة الجسيمات التي تحتوي على الابوليبوبروتين ب، التي سوف أوافيكم جزيئات الكولسترول داخل خلايا20،21. كالتعديلات، يمكن أيضا استخدام المنقي أبواي والحميد المتقبلين. أيضا، خطوط الخلايا عدا البشرية THP-1 قد استخدمت بنجاح في فحوصات efflux الكولسترول الفلورية، مثل الضامة 264.7 الخام أو J774A1 وأن ذلك العمل المحتمل في15،الأسلوب لدينا22.
أوجه القصور الرئيسية في هذا الأسلوب هو أن النتائج تعتمد على خط الخلية المحددة، خط خلية قياسية ولكن أسلوب الخلية الحرة سيكون مفيداً لاستخدامه كالعلامات البيولوجية. أيضا، تم تجميد الأمصال المستخدمة لتوحيد هذا الأسلوب؛ مجموعة بنك دبي الوطني على نسبة الكولسترول في الدم الفسيولوجية أقل من واحد وصفت الإذاعة، ويختلف عن امتصاص الكوليسترول الذاتية؛ ونحن اختبار النتيجة النهائية لمجموعة من العمليات (أي جزيئات المصل التي تشمل، ، خط الخلية، الأسترة ممكن لنسبة الكولسترول في الدم، ونشر ممكن لنسبة الكولسترول في الدم أو عمليات متزامنة efflux وتدفق). ومع ذلك، كميزة، أظهرت التقنيات المستندة إلى الأسفار إمكانيات عالية كبدائل للأساليب التقليدية التي وصفت الإذاعة وفي الاستبدال [ح]3[-نسبة الكولسترول في الدم، من جزيء فلوري المسمى لرصد فحوصات الكوليسترول افلوكس14.
قد افلوكس نسبة الكولسترول في الدم بمثابة العلامات البيولوجية من23من تصلب الشرايين، كما أنها ترتبط بأحداث القلب والأوعية الدموية في المستقبل24،25. وهناك إمكانية لدراسة دور الضامة في تصلب الشرايين من خلال HDLs المنقي وتكوينه؛ ومع ذلك، تنقية HDLs عملية شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً. إلى جانب ذلك، أثناء التنقية، مكونات المصل الأخرى مع تأثير atherogenic قد تكون الاستهانة أو فقدت. ولهذا السبب، اختير أبدس يقبلون الدهن. النطاق الفائق، والحد من الوقت أمكن باستبدال العداد التﻷلؤ لقارئ لوحة وقياس الإشارات الفلورسنت في نفس لوحة الثقافة (في حالة الخلية ليساتي)، وتخفيض البروتوكول قبل يومين. وعلاوة على ذلك، يبين هذا الأسلوب حساسية أعلى عندما تتعرض الخلايا بتركيزات مختلفة من المصل من التدابير التي تم الحصول عليها من مجموعة تجارياً لتقييم افلوكس نسبة الكولسترول في الدم.
وفي الختام، لقد وصفت مقايسة efflux بنك دبي الوطني-الكولسترول الذي يرتبط بالطريقة التقليدية في المشعة. علينا تحديد الوقت الأمثل لاحتضان متقبلون الدهن من العينات البشرية (المصل أو البلازما) في شكل أبدس. نحن الأمثل بذر الخلية التمايز والنطاق الديناميكي، ونقطة التشبع تقنية. أما بالنسبة لها الجدة الرئيسية، نحن الأمثل مزيج المذيبات المستخدمة في القياسات للحصول على درجات عالية ومجموعة خطي محسنة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تود أن تعلن أن هم المخترعين طلب البراءة (17 مايو 2018 البراءات؛ 18382337.6-1118) بعنوان "أسلوب لتحديد نسبة الكولسترول في الدم افلوكس" استناداً إلى هذا الأسلوب.
Acknowledgments
دعمت هذا العمل جزئيا بالمنح البحثية الجبهة الإسلامية للإنقاذ (PS12/00866) من معهد الصحة كارلوس الثالث، مدريد، إسبانيا؛ ش الفقرة Europeo فوندو التنمية الإقليمية (فدر)؛ الأحمر لبحوث أون سيدا (RIS)، إيسسيي-ريتيك (RD16/0025/0002) وبرنامج سيركا/محافظة كاتالونيا. يشكر المؤلفون ريتروفيرولوجي والفيروسية مختبر إيمونوباثولوجي من معهد d'Investigacions Biomèdiques آب/أغسطس Pi I سونير (إيديبابس). نشكر ت. Escribà وجيم-روفيرا هورتادو جيم للمساعدة و Cufí س. من مكتب نقل التكنولوجيا والمعرفة لتوجيهاتها في حماية الاختراع.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well collecting plate | Corning Inc | Costar 3912 | white 96-well plate with opaque clear bottom |
| 96-well culture plate | Corning Inc | Costar 3610 | white 96-well plate with flat clear bottom |
| Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based) | Abcam | ab196985 | commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux |
| colorless RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R7509 | RPMI 1640 with no pehnol-red |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Version 2.0 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | Glycine, non-animal use |
| Luminometer | Biotek | SYNERGY HT | Multi-Detection Microplate Reader |
| Lysis Solution 1 | in-house | 50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O | |
| Lysis Solution 2 | in-house | Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v) | |
| NBD-cholesterol | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Phosphate-buffered saline |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 202452-250G | polyethylene glycol |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | Phorbol 12-merystate B-acetate. |
| R10 | in-house | RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 5% Penicillin/Streptomycin. | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | RPMI 1640 with 2 mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose |
| THP-1 cells | Sigma-Aldrich | ATCC, #TIB-202 | monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
References
- The top 10 causes of death. , Available from: http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2018).
- Hansson, G. K., Hermansson, A.
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).
- Ilhan, F. Atherosclerosis and the role of immune cells. World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345 (2015).
- Greaves, D. R., Gordon, S. Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease. Trends Immunol. 22, (2001).
- Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis. Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).
- Escolà-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection. Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).
- Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL. Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).
- Rothblat, G. H., Phillips, M. C. High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport. Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).
- Hafiane, A., Genest, J. HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method. Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).
- Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature. Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).
- Mcintosh, A. L., et al. Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells. Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).
- Ostašov, P., et al. FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion. Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).
- Song, W., et al. Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages. Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).
- Liu, N., Wu, C., Sun, L., Zheng, J., Guo, P. Sesamin enhances cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages. Molecules. 19 (6), 7516-7527 (2014).
- Qin, Z. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221 (1), 2-11 (2012).
- Low, H., Hoang, A., Sviridov, D.
- Gimpl, G., Gehrig-Burger, K.
- Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol. ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).
- Rader, D. D. J. Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).
- Davidson, W. S., et al. The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function. Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).
- Park, S. H., et al. Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).
- Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches. Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).
- Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).
- Rohatgi, A., et al. HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events. New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).
