Summary
혈 청 또는 대 식 세포 세포 모델에서 플라즈마를 생체 외에서 콜레스테롤 경과 용량 측정은 동맥 경화에 대 한 biomarker로 유망한 도구입니다. 현재 연구에서 우리 최적화 및 형광 NBD 콜레스테롤 경과 방법을 표준화 하 고 96 잘 접시를 사용 하 여 높은 처리량 분석을 개발.
Abstract
동맥 경화는 심장 혈관 질병 (CVD)에 리드. 그것은 여전히 분명 콜레스테롤-HDL (cHDL) 농도 롬 개발에 인과 역할을 담당 하는 여부입니다. 그러나, atheroma 플 라크 형성의 초기 단계에서 중요 한 요소는 콜레스테롤 경과 용량 HDL (동의 대 식 세포에서 콜레스테롤을 HDL 입자의 능력)을 거품 세포 형성을 피하기 위하여. 이것은 endothelium 및 반전 콜레스테롤 수송 (RCT)를 통해 콜레스테롤 제거의 부분에 콜레스테롤의 축적을 방지에 중요 한 단계 이다. 혈 청 또는 대 식 세포 세포 모델에서 플라즈마 콜레스테롤 경과 용량 동맥 경화에 대 한 biomarker로 사용 될 수 있는 유망한 도구입니다. 전통적으로, [3H]-콜레스테롤은 콜레스테롤 경과 분석 실험에 사용 되었습니다. 이 연구에서 우리 THP 1 파생 된 세포에 콜레스테롤 통풍 관 및 경과 과정을 추적 하는 세포 분석 결과에서 형광 표시-콜레스테롤 (NBD-콜레스테롤)을 사용 하 여 안전 하 고 빠른 전략을 개발 목표로 합니다. 마지막으로, 우리 최적화 및 NBD 콜레스테롤 경과 방법을 표준화 하 고 96 잘 접시를 사용 하 여 높은 처리량 분석을 개발.
Introduction
세계 보건 기구에 따르면는 현재 교장의 죽음은 전세계 원인은 허 혈 성 심장 질환과 뇌졸중 (15.2 백만 죽음의 총에 대 한 회계)1. 둘 다 심장 혈관 질병 (CVD) 동맥 경화 및 혈관2,3atheroma 플 라크의 파열에 의해 선행 될 수 있습니다.
동맥 경화는 혈관 벽 염증 성 질환 대 식 세포, T 세포, 돛대 세포 그리고 수지상 세포는 내 피를 침투와 결국 동맥 경 화성 플 라크를 형성 하는 혈액에서 축적 이다. 동맥 경 화성 플 라크는 지질 코어 및 콜레스테롤 결정, 경 동맥 intima 미디어 두께4,5의 고해상도 B 모드 초음파 측정에 의해 입증 제시. 세포, 지질 수락자 입자 쪽으로 콜레스테롤 경과 ABCA1, ATP 의무적인 카세트 G 인도의 회원 1 ATP 묶는 카세트 (ABC) 수용 체의 수단 (ABCG1), 및 SR-BI 폐품 수용 체에 의해 수행 됩니다. 콜레스테롤 유입 및 세포에 경과의 불균형 동맥 경화 개시6핵심 과정으로 간주 됩니다. 콜레스테롤 경과 플라즈마 주변 조직에서 콜레스테롤 제거에 중요 한 단계 및 반전 콜레스테롤 수송 (RCT) 라는 프로세스에서 간으로 간주 됩니다. 콜레스테롤은 세포 apolipoprotein A1에 주로 (ApoA1) 고밀도 지단백 (HDL) 입자의 표면에서 발견에서 전송 됩니다. HDLs는 다음 배설 및 재 사용률7,,89간 콜레스테롤 수송.
전통적으로, 트리 티 움 (3H) 라디오 이라는 콜레스테롤 콜레스테롤 경과10에 사용 되었습니다. Radioisotopes의 방출 신호는 매우 민감한10; 그러나, 라디오 이라는 콜레스테롤 긴 프로토콜, 이온화 방사선에 노출의 위험과 방사성 방출의 안전한 취급을 위해 특별 한 방사능 시설 및 장비에 대 한 필요성 등 분명 한 장애를 선물 한다. 그와 반대로, 형광은 형광 신호 검색과 fluorophores 사용할 수의 광범위 한, 그것의 안전11에 그것의 단순 진단 기법에 성공적으로 통합 되었습니다. 여러 형광 표시 스 테 롤 콜레스테롤 물질 대사 (본질적인 형광)와 dehydroergosterol, dansyl 콜레스테롤, 4,4-difluoro-3a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) 연구에 사용 되었습니다-콜레스테롤, 및 22-(N-(7- Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol (NBD-콜레스테롤)입니다. 특히, NBD 콜레스테롤 인간 세포12효율적인 통풍 관을 선물 한다. 두 개의 다른 NBD 표시-콜레스테롤 현재 사용할 수 있습니다: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) 및 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; 그림 1)입니다. 25-NBD-콜레스테롤은 세포 막 역학 연구13,14에서 주로 사용 하는 동안 22 NBD moiety 함께 셔 서 콜레스테롤 콜레스테롤 경과 연구에 맞게 최고의 수 있습니다.
일반적으로 생체 외에서 콜레스테롤 경과 분석 실험에서 사용 하는 셀 라인 인간의 백혈병 파생 THP-1 셀, murine Raw 264.7 세포15또는 J774.1 같은 monocyte 모양의 세포 이다. 이러한 셀의 모든 phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA)를 사용 하 여 체 외에서 세포로 분화 될 수 있다 하지만 THP 1 파생 된 대 식 세포 (dmTHP-1) 최고의 반영 하 고 인간의 세포16모방.
현재 연구에서 우리는 최적화 하 고 22 NBD 콜레스테롤 [3H] 하는 대신 사용 하 여 dmTHP-1, 혈 청 샘플의 콜레스테롤 경과 용량을 결정 하는 형광 높은 처리량 방법을 표준화-콜레스테롤. 또한, 우리는 표준 방사성 아날로그와 최적화 된 형광 기법을 비교합니다.
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Protocol
이 연구에 대 한 윤리 위원회 승인 (다 Ètic d'Investigació Clínica, 병원 클리닉, 바르셀로나, 승인 번호 HCB/2014/0756) 및 서 면, 정보 동의 모든 과목에서 얻은 했다.
1. NBD-콜레스테롤 준비
- NBD-콜레스테롤 (MW 494.63; 참조 테이블의 재료) 순수 에탄올에 주식 (2mm)를 분해. 10 mg 유리병 2 m m 재고를 에탄올의 10.1 mL 볼륨에 전체 유리병 내용 분해.
- 5 μ M의 최종 농도 도달 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 5% 페니실린/스 (R10 매체) 보충 RPMI 1640 년에서 재고에서 NBD 콜레스테롤 희석 (예:, 5 μ M 최종 농도에서 NBD 콜레스테롤의 10 mL를 얻을)에 의해 25 μ r 10 매체에 NBD 콜레스테롤 재고 (2 mM)의 희석 이 볼륨은 96 잘 접시에 대 한 충분 합니다.
2. 세포 문화 및 시드 (주 2)
- 37 ° c, 5% CO2R10 매체에서 문화 THP-1 셀. 3 일 마다 106 셀/mL x 0.3을 조정 합니다.
- 시드 106 셀/잘 R10 매체 (잘 당 100 μ) x 0.2에서 평면, 분명 바닥 흰색 96 잘 접시에 셀입니다.
- 100 nM phorbol myristate 12 13-아세테이트와 셀 치료 (PMA; 10 μ M 재고에서) 37 ° C에서 배양 하는 48-72 h THP-1을 차별화 하는 데 5% CO2 dmTHP-1에 셀.
참고: R10 매체의 500 μ에서 PMA 재고 (10 μ M)의 5 μ를 사용 하도록 추천 된다. 이 앞서, 준비는 10 μ M PMA 재고 동결 건조 된 1 g 유리병 디 메 틸 sulfoxide (DMSO), aliquot, 및-20 ° c.에 재고의 10 mL에 용 해 하 여 - 또는 (제안) 결합 2.2 및 2.3을 위한 단계 더 균질. 15 mL 튜브에서 THP-1 셀의 10 mL를 준비 하 고, PMA 재고 (10 μ M)의 200 μ를 추가 하 고 부드럽게, 믹스 한 즉시 접시에 잘 당 100 μ 씨앗. 2.3 단계에서 설명한 대로 셀을 품 어.
3. Apolipoprotein B 고갈 세럼 (ABDS) 준비 (2 또는 3 일)
- 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) 솔루션을 준비, 글리신 pH 7.4에서 200 mM의 농도를 (살 균 H2O)와 10 %PBS 희석. 페그를 던지다 8000의 10 g 40 mL 200 m m 글리신의 추가 20% (w/v). 균질을 적극적으로 솔루션을 믹스.
- 4 적용 20%의 혈 청/플라즈마 1.5 mL 튜브에 각 혈 청/혈장 샘플의 10 개 부분 당 목이 부분과 25 분17 얼음 혼합물을 두고 (예를 들어, 100 μ 플라스마 또는 혈 청, 추가 20 %40 μ 던지다 솔루션).
- 13000 x g 4 ° c.에서 15 분에 못 apolipoprotein B 침전 물은 원심
- 침전을 삭제 합니다. 새로운 튜브에는 상쾌한을 전송.
참고: (신선한) 3 일에는 ABDS를 준비 하는 것이 좋습니다. 그것은 가능, 하루에 2는 ABDS를 준비 하 고 하룻밤 4 ° C에서 그것을 유지.
4. NBD-콜레스테롤 셀 로드 (주 2)
- DmTHP-1의 문화 매체를 삭제 하 고 셀 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1 두 번 씻어.
- 로드 5 μ M와 셀 NBD-콜레스테롤 (잘 당 100 μ) R10 매체에서 37 ° C, 5% CO2에서 밤새 품 어 고.
5. 콜레스테롤 수락자 (주 3)를 가진 외피
- 매체를 삭제 하 고 PBS로 두 번 셀을 씻어.
- 2-5 %ABDS 또는 정화 지질 수락자 (HDL, ApoA, ApoE, 등) 4-6 h 37 ° c.에 대 한 무색 RPMI 1640 매체 (잘 당 100 μ)에 희석의 원하는 농도와 셀을 품 어
참고: 수락자 및 긍정적인 제어 (C +) (건강 한 기증자의 수영장에서 예: ABDS) 또는 정화 HDLs 없이 무색 RPMI 1640 매체 구성 된 (C-) 부정적인 컨트롤 포함. 참고 (보조 그림 1) 분석 긍정적인 통제 환자 샘플 (질병 조건)은 특히 적용 됩니다. - 200 mL 재고 세포 세포의 용 해 솔루션 1 (50 mM Tris 버퍼, 150 m m NaCl, H2O)를 준비 합니다. 세포 세포의 용 해 솔루션 1 1:1 (v: v) 비 세포 솔루션 2를 순수 에탄올 혼합.
6. 형광 신호 캡처 (3 일)
-
미디어 NBD 콜레스테롤 검출
- 격판덮개에서 셀 매체를 제거 하 고 불투명 한 평면 바닥 새로운 백색 96 잘 접시에 그것을 수집.
- 미디어 샘플에 최적의 형광 신호 감지, 96-잘 흰 접시에 1:1 비율을 얻기 위해 각 중간 샘플의 100 μ를 순수한 에타 놀의 100 μ를 추가 합니다.
- 계속 치료 미디어 접시 더 측정 형광 강도 (FI)는 루미 노에 463⁄536 nm (여기/방출) 파장에.
-
세포내 NBD 콜레스테롤 검출
- PBS로 두 번 셀을 씻어.
- 세포내 콜레스테롤을 얻으려면 세포 솔루션 2 잘 당 100 μ와 그들을 배양 하 여 세포를 lyse 하 고 25 분 동안 실 온 (RT)에서 접시를 흔들.
- 세포 lysate 샘플에서 최적의 형광 신호 감지 캡처 같은 흰색 세포 lysates의 형광 강도 대 한 96 잘 접시 (셀 단계 2.2에서에서 시드 했다 같은 접시)를 분명 평면 바닥.
- 6.3 소프트웨어에서 50 감도 매개 변수를 조정 하는 동안에 루미 노 형광 강도 (FI) 측정 ( 재료의 표참조).
7. 결과 분석
- 수식에 의해 계산 된 비율으로 샘플의 콜레스테롤 경과 율을 표현:
- CE에서 부정적인 컨트롤 (샘플 NBD-콜레스테롤으로 로드 하지만 콜레스테롤 수락자 없이 무색 RPMI 1640 매체와 인 큐베이 팅)의 CE를 빼서 콜레스테롤 경과 (CE)의 마지막 측정을 얻기는 주어진 샘플:
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Representative Results
콜레스테롤 경과 분석 결과의 목표는 주어진된 혈 청, 플라스마, 또는 HDL 입자를 포함 하는 상쾌한의 콜레스테롤 경과 용량 생체 외에서 결정 하는. 메서드는 표준 대 식 세포 세포 선의 문화에 셔 서 콜레스테롤을 로드 하 고 접촉을 유도 하는 세포와 FBS 무료 미디어로 희석 테스트 샘플로 이루어져 있다. 마지막으로, 미디어에 세포 lysate에 NBD에서 형광 레벨 측정 됩니다. 측정을 최적화 하려면 셀에서 미디어의 effluxed 콜레스테롤 에탄올을 포함 하는 용 매에의 한 볼륨 혼합입니다. 셀에 남아 있는 NBD 콜레스테롤은 에탄올 또는 측정 하기 전에 세제를 포함 하는 용 매로 resuspended. 마지막으로, effluxed/총 이라는 콜레스테롤의 비율에 따라 결정 됩니다. 기술을 설정 하려면, apolipoprotein B 고갈 혈 청 (ABDS) 건강 한 기증자의 수영장에서 사용 되었다.
매체와 에탄올에 NBD 콜레스테롤에 대 한 최고의 희석 조건 조사 되었다. 우리는 에탄올과 무색 RPMI 1640의 다른 비율을 포함 하 여 여러 용 매 환경에서 무료 NBD-콜레스테롤의 형광 동작 테스트. NBD-콜레스테롤은 수 용액에 희석의 형광 강도 (FI) 순수 에탄올 내 NBD 콜레스테롤 높은 FI 방출 동안 낮은 FI 값을 보였다. 이 22-NBD-콜레스테롤 분자의 형광 방출은 매우 포함 된 매체에 따라 나왔다. 따라서, 22 NBD 콜레스테롤의 형광 신호는 상당히 높은 미디어를 포함 하는 에탄올에 배치 하는 때 이다. 우리는 1:1 미디어: 에탄올의 비율, 형광 강도 신호 증가 비례 아날로그 프로브의 적절 한 동작을이 경우에 제안 하는 0.5-50 μ M의 범위에서 콜레스테롤의 농도와 (그림 2 관찰 ). 1:1 상태 (미디어: 에탄올)에서 선형 동작 따라 방정식에 의해 대표 된다: y = 20.88 x + 146.7 R2 = 0.9341.
이 방법에서 중요 한 단계는 콜레스테롤은 수 경과 콜레스테롤 수락자와 로드 셀 배양 시간입니다. 확인 필요한 보육 시간, 셀 미디어는 다른 timepoints (1 ~ 24 h;에 수확 했다 그림 3)입니다. 0 ~ 6 h의 범위에서 콜레스테롤 경과 진화 선형 (p < 0.0001; y = 18.2 x + 127.3) 시간-종속 방식에서. ABDS 셀에 추가 된 후 최대 신호 캡처 6 h에서 했다. 6 h 후 콜레스테롤 있으므로 다양성 ABDS (그림 3)를 가진 외피의 6 h 후 경과에서 규칙을 잃었다.
HDL에 포함 된 미디어 (ABDS)의 다른 백분율에 CE를 측정 하 여 인간의 ABDS에 적용 한 대로 우리는 또한 채도 임계값 및 동적 범위를 테스트. 높은 처리량 분석 결과 (96 잘 접시)에 NBD 콜레스테롤 경과 1-7 %ABDS, FI 콜레스테롤 경과 용량 7 %ABDS (그림 4)의 절정에 도달 하는 ABDS와 농도 의존 방식에서 증가 내 선형 진화. 7% 보다 높은 농도에서 FI ABDS 비율로 반비례 관계에 감소. 이 수 발생 콜레스테롤은 다시 입력 셀 NBD-콜레스테롤에서 HDL 미디어에 로드 합니다.
콜레스테롤 경과 측정 하는 표준 방법은 라디오 표시 (3H) 콜레스테롤16을 사용 합니다. 우리의 형광 기반 방법의 성능을 평가 하 우리가 수행 하 고 형광 고 라디오 라는 기술을 비교. 우리는 전통적인 방사능 기술과 우리의 NBD-콜레스테롤 방법을 했다 높은 상관을 발견 (피어슨의 r = 0.97; p < 0.001) ABDS (1-8%;의 다른 농도 사용 하 여 그림 5)입니다. 전반적으로,이 우리의 형광 메서드가 방사능 기법 보다 안전한 대체 있을 수 있습니다 제안 합니다.
마지막으로, 우리 형광 프로브 NBD에서 다른 우리의 방법을 비교합니다. 우리 세포에 콜레스테롤 경과 확인 하는 목적으로 상업 높은 처리량 세포 기반 시험 키트를 우리의 메서드 비교 (콜레스테롤 경과 분석 결과 키트, 셀 기반). 우리 그룹에서 개발 하는 방법은 수락자 농도 (%ABDS) CE 값 5와 15% 사이의 증가에 민감한 이었다. 그러나, 상업 키트, 수행 제조업체의 지침에 따라 분석; ABDS의 범위에 따라 5 %CE 조치 결과 따라서, 결과 CE 아니었다 근본적으로 영향을 받는 때 ABDS는 증가 (그림 6).
그림 1: 자연 콜레스테롤 (A), 22-NBD-콜레스테롤 (B), 및 25-NBD-콜레스테롤 (C)의 분자 구조. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 에탄올과 무색 RPMI 1640 매체의 다른 비율 NBD 콜레스테롤 형광 강도 (FI). NBD 콜레스테롤 0에 1:0, 3:1, 1:1, 1:3 희석 했다: 1 에탄올: 0.5와 사이 50 µ M. FI NBD 콜레스테롤 농도에서 수성 매체 비율 신호 감도 매개 변수 fluorimeter 소프트웨어에 70는 루미 노에 의해 감지 되었다. 미디어와 세포 lysate의 FI 신호 흰색 96 잘 접시를 사용 하 여 측정 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 시간-진행 NBD-콜레스테롤 경과 THP 1 파생 된 세포에. DmTHP-1 5 µ M와 적재 된 NBD 콜레스테롤 5 %ABDS 인 큐베이 팅 하 고. 세포 미디어는 다른 timepoints (1-24 h)에 흰색 96 잘 접시에 측정 되었다. 값은 quadruplicate 우물의 평균 ± 표준 편차로 표시 됩니다. FI 신호 감도 매개 변수 fluorimeter 소프트웨어에 70는 루미 노에 의해 발견 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: ABDS의 다른 농도와 96 잘 접시에서 THP 1 파생 된 세포에 NBD 콜레스테롤 경과. DmTHP-1 셀 5로 치료 했다 µ M NBD-콜레스테롤, ABDS의 다른 비율으로 인 큐베이 팅 및 에탄올 lysed. 미디어와 세포 lysate의 FI 신호 1:1 (에탄올: 세포 솔루션 1)에서 fluorimeter에 백색 96 잘 접시를 사용 하 여 측정 했다. 부정적인 컨트롤 (ABDS 치료 미디어)의 측정을 제공 하는 수준에서 뺍니다 했다. 값 triplicate 우물의 평균 ± 표준 편차로 표시 됩니다. FI 신호 감도 매개 변수 fluorimeter 소프트웨어에 50는 루미 노에 의해 발견 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: NBD 콜레스테롤 [3H]의 상관 관계-THP 1 파생 된 세포에 콜레스테롤 경과. 6 h에 대 한 대응 이라는 콜레스테롤과 다음 dmTHP-1. 콜레스테롤 경과 1-8 %ABDS 사용 하 여 측정 했다. NBD 콜레스테롤 샘플에 대 한 형광 신호는 1:1 에탄올: 세포 해결책 1에 fluorimeter에 백색 96 잘 접시를 사용 하 여 검색 되었습니다. FI 신호 감도 매개 변수 fluorimeter 소프트웨어에 50는 루미 노에 의해 발견 되었다. [3시간]-콜레스테롤 샘플, 방사성 신호 매체의 100 µ L를 사용 하 여 검색 및 세포 lysate 섞인 칵테일 및 낮은 외.17. 에 의해 설명 하는 프로토콜에 따라 섬광 카운터에 빨간색 섬광 상관 관계 효율 피어슨의 r 상관 계수를 사용 하 여 결정 했다. 부정적인 컨트롤 (ABDS 치료 미디어)의 측정은 형광 및 방사성 수준 제공에서 뺍니다. 값 triplicate 우물의 평균 ± 표준 편차로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 높은 처리량 NBD 콜레스테롤 경과 분석 결과 및 상용화 형광 세포 기반 시험 키트 사이 비교. ABDS에서 콜레스테롤 경과 설명된 프로토콜, 세포의 용 해 용 에탄올 (50%) 또는 트윈 80 (1%)를 사용 하 여 다음과 같은 평가 했다. 형광 세포 기반 분석 결과 키트 키트에서 제조 업체의 프로토콜에 따라 평가 했다. 값 triplicate 우물의 평균 ± 표준 편차로 표시 됩니다. FI 신호 감도 매개 변수 fluorimeter 소프트웨어에 50는 루미 노에 의해 검색 되었습니다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 워크플로 다이어그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 1: HIV에 감염 된 환자와 표준 긍정적인 제어 (C +)에서 혈 청 샘플의 NBD 콜레스테롤 경과. 에이즈에 감염 된 환자 들의 집합에 적용 된 NBD 콜레스테롤 경과 방법의 간 개별 변형 표시 됩니다. 긍정적인 내부 제어 (C +) 8 건강 한 환자의 혈 청 샘플의 수영장에서 드 NBD-콜레스테롤 경과를 나타냅니다. 오차 막대는 표준 편차를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
형광 표시 콜레스테롤은 분석 하 고 속성 및 자연 콜레스테롤 체 외의 물질 대사를 조사 하는 유망한 전략 이다. 그것의 주요 이점은 그것은 세포에 의해 채택 될 수 있다, 세포내 수 막 유통 연구, 콜레스테롤 경과 분석 실험 등이 프로토콜 (그림 7)에 적용할 수 있습니다. 일부 형광 표시 스 테 롤 콜레스테롤 추적 BODIPY-콜레스테롤, dansyl 콜레스테롤, dehydroegrosterol, 및 22 및 25-NBD-콜레스테롤12를 포함 하 여 생체 외에서 수 있습니다. 특히, 22-NBD-콜레스테롤은 콜레스테롤 역학을 공부 하는 다른 세포 유형으로 고 라디오 라는 콜레스테롤18의 대용으로 적합 합니다. 합의 방법 콜레스테롤 경과 분석 결과에서 형광 신호 평가에 있다. 노래 외14 수확 매체와 세포 lysates 별도로; FI를 측정 하 Liu 외14 다른 접시에 매체를 전송 하 고 세포내 형광 신호 문화 접시; 직접 측정 되었다 그리고 장 외15 순수 에탄올에 희석 하 여 형광 강도 신호19감지 형광 콜레스테롤의 정화 다음 세포를 lyse 세포의 용 해 버퍼 사용. 우리의 콜레스테롤 경과 분석 결과에서 미디어와 셀 셀 미디어의 균질 화 및 lysate의 측정을 효율적으로 허용에 동일한 마지막 용 매 구성의 사용.
현재 연구 시간이 지남에 NBD 콜레스테롤 경과 프로 파일링 하 고 시간에 따라 진행 되는 6 h까지 수락자 ABDS, 유사한 노래 외14 하 리 우 외.14 와 달리 장 외 1 시간 잠복기를 사용을 가진 외피를 발견 지질 수락자19와. 우리 후 보육의 6 h, effluxed 콜레스테롤 선형성; 잃은 발견 따라서, 그것은 최고 6 h를 초과할 수 없습니다. 콜레스테롤 경과의 최적 범위는 수락자를 추가한 후 3 ~ 6 h 사이 했다. 콜레스테롤 수락자와 4 h에 대 한 세포를 배양 하는 것이 좋습니다. 추가적인 중요 한 단계는 배경, 세미 confluent 셀 문화 계층 시드 고 접시에 그들의 정확한 준수를 피하기 위하여는 수락자를 적용할 무색 미디어의 사용 합니다. 흰 판의 분명 하단 역 가벼운 현미경 세포를 따라 유용 주목 한다.
대부분 콜레스테롤 경과 분석 수행 됩니다 콜레스테롤 경과 테스트에서 순화 된 지질 수락자를 사용 하 여. 현재 기술은 인간 혈 청 또는 혈장 샘플에서 콜레스테롤 경과 용량을 얻기 위해 개발 되었다. 우리는 혈 청에 있는 본질적인 콜레스테롤 수락자를 사용 하지만 apolipoprotein B 세포20,21안에 콜레스테롤 분자 recirculate 것을 포함 하는 입자를 제거 하는 것이 중요. 로 수정, 순화 된 ApoAI 및 HDL도 사용할 수 있습니다 수락자로. 또한, 인간의 THP-1 이외의 셀 라인 성공적으로 Raw 264.7 또는 J774A1 세포와 같은 형광 콜레스테롤 경과 분석 실험에서 사용 되 고 따라서 우리의 방법15,22에 가능성이 일 것 이다.
이 방법의 주요 제한 결과 특정 셀 라인, 표준 셀 라인에 따라 달라 집니다 하지만 셀 무료 메서드는 biomarker로 사용 하 여 유리한 것입니다. 또한,이 방법을 표준화 하는 데 사용 하는 세라 언 했다; 콜레스테롤에 NBD moiety는 라디오에 표시 된 것 보다 덜 생리 그리고 내 인 성 콜레스테롤; 다릅니다의 이해 그리고 우리는 일련의 프로세스 (예:, 관련 된 혈 청 입자, 셀 라인, 콜레스테롤의 가능한 에스테 르 화, 콜레스테롤 또는 동시 경과 및 유입 프로세스의 가능한 확산)의 최종 결과 테스트. 그러나, 장점,으로 형광 기반 기술을 보여주었다 [3H]의 대체와 전통적인 라디오 분류 기법에 대 한 대체로 서 높은 잠재력을가지고-콜레스테롤, 형광 표시 분자 모니터링 하 여 콜레스테롤 경과14분석 실험.
그것은 미래 심장 혈관 사건의24,25상관으로 콜레스테롤 경과 수 있습니다 동맥 경화23, 바이오 마커 역할을 합니다. 동맥 경화에 대 식 세포의 역할을 연구 하기 가능성은 통해 순화 HDLs와 그것의 구성; 그러나, HDLs 정화는 힘든 시간이 걸리는 과정 이다. 게다가, 정화, 동안 atherogenic 효과와 다른 혈 청 구성 요소 수 있습니다 과소 평가 또는 손실. 그 이유로, ABDS 지질 수락자로 선정 되었다. 높은 처리량 규모와 시간 감소는 섬광 카운터 플레이트 리더에 대 한 대체 (의 경우 세포 lysate), 같은 문화 접시에 형광 신호를 측정 하 고 이틀 프로토콜을 감소 가능 했다. 또한,이 기술은 세포 콜레스테롤 경과 평가 하기 위해 상용화 키트에서 얻은 측정값 보다 혈 청의 다른 농도에 노출 되 면 더 높은 감도 보여줍니다.
결론적으로, 전통적인 방사성 방법와 상관 관계가 NBD 콜레스테롤 경과 분석 결과 설명 하고있다. 우리는 ABDS의 형태로 인간의 샘플 (혈 청 또는 플라스마)에서 지질 수락자를 품 어에 최적의 시간을 결정. 우리 셀 시드, 차별화, 동적 범위, 및 채도 포인트는 기술의 최적화. 그것의 주요 참신에 관해서는 우리는 높은 농도 및 향상 된 선형 범위에 대 한 측정에 사용 되는 용 매 조합 최적화.
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Disclosures
저자 권리 특허 출원 (EPO, 18382337.6-1118, 17 5 월 2018)의 발명가 선언 하고자 "콜레스테롤 경과 확인 하기 위한 방법"이이 방법에 따라.
Acknowledgments
이 작품은 부분적으로 지원 된 연구 기관 드 건배 카를로스 III에 마드리드, 스페인;에서 FIS (PS12/00866) 부여 Fondo Europeo 파라 엘 개발 지역 (페더); 레드 드 Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) 및 검색 프로그램 / Generalitat 드 Catalunya. 저자는 Retrovirology 인 d'Investigacions Biomèdiques 8 월 Pi 나 Sunyer (IDIBAPS)의 바이러스 Immunopathology 실험실을 감사합니다. 우리 감사 합니다 T. Escribà, C. Rovira, 및 C. Hurtado 그들의 지원 및 지식 및 기술 이전 사무실에서 S. Cufí에 대 한 발명을 보호에 대 한 그녀의.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well collecting plate | Corning Inc | Costar 3912 | white 96-well plate with opaque clear bottom |
| 96-well culture plate | Corning Inc | Costar 3610 | white 96-well plate with flat clear bottom |
| Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based) | Abcam | ab196985 | commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux |
| colorless RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R7509 | RPMI 1640 with no pehnol-red |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Version 2.0 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | Glycine, non-animal use |
| Luminometer | Biotek | SYNERGY HT | Multi-Detection Microplate Reader |
| Lysis Solution 1 | in-house | 50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O | |
| Lysis Solution 2 | in-house | Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v) | |
| NBD-cholesterol | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Phosphate-buffered saline |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 202452-250G | polyethylene glycol |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | Phorbol 12-merystate B-acetate. |
| R10 | in-house | RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 5% Penicillin/Streptomycin. | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | RPMI 1640 with 2 mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose |
| THP-1 cells | Sigma-Aldrich | ATCC, #TIB-202 | monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
References
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