Summary
هنا نقدم طريقة فعالة للتحقيق في النشاط المضاد للفيليمنت من الخلايا السترومال mesenchymal الإنسان غرست عن طريق الوريد التي تم الحصول عليها من الحبل السري كله بعد تحريض إصابة الرئة عن طريق حقن البلوميسين داخل الرغامى في C57BL ستة فئران هذا البروتوكول يمكن أن تمتد بسهولة إلى الاختبار قبل السريرية من العلاجات الأخرى.
Abstract
التليف الرئوي هو السمة المميزة للعديد من أمراض الرئة البشرية مع مسببات مختلفة. وبما أن العلاجات الحالية محدودة إلى حد ما، فإن نماذج الماوس لا تزال أداة أساسية لوضع استراتيجيات جديدة مضادة للفيليتيك. هنا نقدم طريقة فعالة للتحقيق في النشاط المضاد للفيليفي في الجسم الحي من الخلايا السترومال ية mesenchymal الإنسان التي تم الحصول عليها من الحبل السري كله (hUC-MSC) في تخفيف إصابة الرئة الناجمة عن البلوميسين. تتلقى الفئران C57BL/6 حقنة واحدة داخل الرغامى من البلميسين (1.5 U/kg من وزن الجسم)تليها ضخ مزدوج من hUC-MSC (2.5 × 10 5) في الوريد الذيل، 24 ساعة و 7 أيام بعد إدارة البليومسين. عند التضحية في الأيام 8، 14، أو 21، يتم تحليل التغيرات الالتهابية والليفية، ومحتوى الكولاجين، ووجود hUC-MSC في أنسجة الرئة المنفعلة. حقن bleomycin في القصبة الهوائية الماوس يسمح الاستهداف المباشر للرئتين، مما يؤدي إلى التهاب رئوي واسع والتليف. الإدارة النظامية لجرعة مزدوجة من hUC-MSC يؤدي إلى التعمية في وقت مبكر من إصابة الرئة الناجمة عن البلميسين. يتم تطعيم hUC-MSC عن طريق الوريد بشكل عابر في رئتي الماوس، حيث يمارسون نشاطهم المضاد للالتهابات ومضاد للفيليفي. وفي الختام، تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح للاختبار قبل السريري ة hUC-MSC في نموذج الماوس التجريبي للتليف الرئوي البشري. ومع ذلك، يمكن توسيع هذه التقنية بسهولة على حد سواء لدراسة تأثير المواد المختلفة التي تدار داخل التراخالية على الفيزيولوجيا المرضية للرئتين والتحقق من صحة العلاجات النظامية الجديدة المضادة للالتهابات والمضادة للفيلي.
Introduction
التليف الرئوي هو عملية مرضية تقدمية تتميز بالترس المفرط لمكونات المصفوفة خارج الخلية، أساسا النوع الأول الكولاجين، في الانترستيوم الرئة، مما يؤدي إلى ضعف وظيفة الرئة. وهو السمة المميزة للعديد من أمراض الرئة البشرية مع مسببات مختلفة ويمثل عامل التكهن السريري ة الفقراء. وبما أن العلاجات الحالية محدودة إلى حد ما1، لا تزال نماذج الماوس أداة أساسية على حد سواء لمواصلة التحقيق في الآليات المسببة للأمراض التي تؤثر على بداية وتطور المرض ولتطوير مضادات الفيلية الجديدة استراتيجيات2،3.
حتى الآن، كانت إدارة bleomycin النموذج الأكثر شيوعا من التليف الرئوي المستحث تجريبيا4. بجانب طرق التسليم المتعددة (بما في ذلك الحقن الوريدي، داخل البريكيوني، تحت الجلد، والاستنشاق)، ظهرت الحقن داخل الرغامى أوداخل الرغامى من البلميسين كأكثر الطرق استخداما4و5. وقد وضعت الطريقة التي نصفها هنا لتجنب تأثير التحجيم من البلويمايسين على الغشاء المخاطي للرغامى. في الواقع، من خلال تجهر القصبة الهوائية وتصورها من خلال مجهر التشغيل، فمن الممكن تحقيق غرس كامل حجم محلول البلميسين مباشرة في مجرى الهواء السفلي دون أي انسكابات في مجرى الهواء العلوي. عندما تتوفر الخبرة الجراحية المطلوبة والأجهزة، تسمح هذه الطريقة للتحريض الآمن والقوي والقابل للاستنساخ لالتهاب الرئة والتليف، كما هو مبين أدناه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع إجراءات رعاية الحيوانات والإجراءات التجريبية من قبل وزارة الصحة الإيطالية (إذن رقم 456/2016-PR) وتم تنفيذها وفقا لإعلان اتفاقيات هلسنكي.
1- الفئران
- بعد شرائها، والسماح للفئران لالتكيف لمدة 7 أيام على الأقل قبل الحقن.
ملاحظة: تم إيواء الفئران في مرفق الحيوانات في ظروف خالية من مسببات الأمراض، وتم الحفاظ عليها في ظل درجة حرارة ورطوبة ثابتة على دورة ضوء/ظلام 12 ساعة، وأعطيت حرية الوصول إلى المياه والغذاء بيليه القياسية. - استخدام الإناث C57BL/6 الفئران وحقنها في 12 إلى 16 أسبوعا من العمر.
2. حقن الرغامى من البلميسين
- إعداد بلميسين
تحذير: استناداً إلى النظام المتوائم على الصعيد العالمي لتصنيف المواد الكيميائية ووسمها، يصنف البيوميسين على أنه خطر صحي من النظام الموحد عالمياً لتصنيف المواد الكيميائية ووضع العلامات عليها.- إعداد bleomycin تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية.
- للحصول على تركيز العمل المطلوب (0.05 U/100 درجة مئوية)، إعادة تعليق 15 U من كبريتات البلوميسين الليوفيل في 30 مل من المالحة المعقمة.
- خلط بعناية العينة عن طريق عكس الأنبوب لتجنب تشكيل جلطة.
- تسمية الأنبوب بشكل صحيح مع تاريخ إعادة تعليق، وتخزينها في 4 درجة مئوية، واستخدام محتواه في غضون 24 ساعة.
- قبل الغرس، معادلة محلول البلومايسين لدرجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: في هذه التجربة، تم استخدام جرعة واحدة من 1.5 U/kg من وزن الجسم من البلميسين للحث على إصابة الرئة في الفئران C57BL/6. ومع ذلك، كل سلالة الماوس لديه حساسية مختلفة لbleomycin6،7. وينبغي إجراء معايرة البلميسين لتحديد الجرعة المثلى في سلالة الماوس المستخدمة في التجارب.
- التخدير
- إعداد التخدير عن طريق حل 0.2 غرام من 2,2,2-ثلاثي البروم الإيثانول في 9 مل من المالحة المعقمة و1 مل من الإيثانول المطلق (بتركيز عمل قدره 20 ملغ/مل).
- يُمزج المزيج جيداً عن طريق عكس الأنبوب لتجنب تكوّن الجلطة.
- تسمية الأنبوب بشكل صحيح مع تاريخ الإعداد، وتخزينها في 4 درجة مئوية في الظلام، واستخدامها في غضون 3 أيام.
- تخدير الفئران بحقن داخل الصفاق من 250 ميكرولتر من محلول ثلاثي البروم والإيثانول (بجرعة نهائية من 200 ملغم/كغم من وزن الجسم) لكل فأر، باستخدام حقنة 1 مل وإبرة 26 غرام.
ملاحظة: مع هذه الجرعة، الفئران فاقدة الوعي لمدة 20 دقيقة على الأقل. عند الضرورة، وضبط الجرعة وفقا لاستجابة الماوس، بالتشاور مع الطبيب البيطري. - مراقبة التنفس الماوس. معدل التنفس سوف يتباطأ قليلا. بعد بضع دقائق، قرصة واحدة من أقدام الماوس للتحقق من عدم وجود رد الفعل دواسة.
- حقن الرغامى
- الحفاظ على الظروف المعقمة خلال جميع الإجراءات. استخدام الأدوات والمواد الجراحية المعقمة، وارتداء قفازات معقمة وتجنب الاتصال مع أي سطح غير معقمة.
- الاستلقاء على الماوس التخدير على ظهره على منصة جراحية وعقد في مكان من خلال إصلاح بدقة ساقيه مع شرائط الشريط الجراحية.
ملاحظة: ينصح تسجيل لطيف من الساقين الماوس لتجنب انزلاق الماوس بعيداً عن منصة الجراحية أثناء تناوبها (الخطوة 2.3.10). - ضع الماوس على حصيرة ساخنة للحفاظ على درجة حرارة المستقيم مستقرة عند 37 درجة مئوية طوال فترة التدخل. قياس درجة حرارة المستقيم عن طريق مسبار المستقيم.
- توسيع عنق الماوس بلطف عن طريق وضع "وسادة"، على سبيل المثال، لفة القطن الأسنان، تحت منطقة عنق الرحم.
- حلق الحلق بلطف بشفرة حلاقة.
- إزالة الشعر من المنطقة الجراحية مع الكحول وتطهير جلد الماوس عدة مرات مع 1٪ محلول اليود البوفيدون.
- قرصة الجلد مع زوج من الملقط التشريحي وجعل شق قصير في المراسلات من العضلات القصين الماوس، وذلك باستخدام زوج من حلقة التعامل معها، مقص حادة منحنية.
ملاحظة: شق الجلد حوالي 0.5 سم في الطول. قطعة الجلد المقابلة التي تتم إزالتها صغيرة جدا ً بحيث أنها لن تخلق أي توتر في عنق الماوس. - وقف النزيف مع العصي الصوف القطن.
- تُزيّن القصبة الهوائية بتشريح حاد، وتنظفها بلطف من الدهون والأنسجة الأخرى.
- تدوير منصة الجراحية لتوجيه الماوس برأسه نحو المشغل.
ملاحظة: يسمح هذا الموقف للمشغل، أثناء الحقن، بزاوية الحقنة بحيث تتبع المسار الطبيعي للالقصبة الهوائية مباشرة إلى الرئتين. - ضع الماوس تحت مجهر التشغيل للمساعدة في تصور القصبة الهوائية. ضبط الإضاءة وتعيين التكبير (بين 1 و 1.2)، والتركيز، والحدة. يمكن تمييز القصبة الهوائية بسهولة كأنبوب أبيض شفاف، وحلقات القصبة الهوائية واضحة للعيان.
- خلط محلول البلميسين عن طريق الأنابيب بلطف، واستنشاق 100 ميكرولتر في حقنة 0.5 مل مع إبرة 25 G، وتجنب تشكيل فقاعة.
- مرة واحدة في القصبة الهوائية تصور بوضوح، ثقب بعناية مع طرف إبرة في زاوية من 30 درجة (الشكل1A).
- غرس ببطء 100 ميكرولتر من البلوميسين أو المالحة المعقمة (التحكم في السيارة) مباشرة في تجويف القصبة الهوائية. انتظر بضع ثوان حتى ينتقل حجم كامل أسفل الإبرة، ومن ثم إزالته من القصبة الهوائية.
- لاحظ بضع ثوان من انقطاع النفس ، والذي يحدث عندما يتم إدخال الإبرة بشكل صحيح في القصبة الهوائية بحيث يستنشق الماوس على الفور حجم السائل بأكمله.
- إذا كان الماوس لا يستنشق السائل، مراقبة بعناية تنفسه وضبط موقف إبرة. إذا توقف الماوس عن التنفس، قم بإزالة الإبرة على الفور والسماح للماوس باستئناف التنفس بشكل طبيعي قبل إعادة إدخالها.
- تجاهل بأمان الحقنة والإبرة بعد الحقن.
- أغلق اللفافة تحت الجلد وجرح الجلد مع خياطة قابلة للامتصاص 5-0.
ملاحظة: عندما لا يتم إعادة استيعابها بالكامل، قم بإزالة الغرز 7-10 أيام بعد الجراحة.
- استعادة الحيوانات
- وضع الماوس حقن على جانبها على لوحة التدفئة للانتعاش.
- مراقبة التنفس الماوس ومراقبة الماوس حتى يبدأ في التحرك ويستعيد recumbency صارمة والوعي الكامل.
- بمجرد التأكد من أن الماوس في حالة جيدة، إعادته إلى القفص الأصلي. لا تعيده إلى الشركة من الحيوانات الأخرى حتى تعافى تماما.
- لضمان التسكين لفترات طويلة وتجنب أي ألم ما تبقى بعد التدخل، وإدارة البوبرينورفين تحت الجلد (في جرعة نهائية من 0.05 ملغ / كغ من وزن الجسم) للماوس كل 12 ح بعد حقن بطانة الرغامى.
- فحص الفئران لمدة 24 ساعة بعد حقن البلورية من البلميسين والقيام بذلك مرتين في اليوم. مراقبة الفئران لضيق الجهاز التنفسي، وفقدان الوزن، وتشوهات السلوك، ولأي علامة على الاعتلال.
3. الذيل الوريد ضخ من الخلايا الجذعية الحبل البشري mesenchymal
- إعداد الخلايا
ملاحظة: تم وصف عزل وتوصيف وزراعة الخلايا السترومالية mesenchymal من الحبل السري البشري في السابق8و9و10. ينبغي التلاعب hUC-MSC بشكل معقم وغرسها؛ لذلك، تنفيذ جميع الخطوات تحت غطاء محرك السيارة معقمة.- قم بتوسيع hUC-MSC في قوارير ثقافة 75 سم2 إلى الممرات المبكرة (1-3 كحد أقصى).
ملاحظة: يجب أن يكون hUC-MSC 70% مترافقفي يوم ضخها في الفئران. - اغسل الخلايا بمحلول ملحي معقم بـ 10 مل من السالين المعقمة (PBS) في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 2 مل من التربسين وحضانة الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، حتى تبدأ في فصل.
- تحييد التربسين عن طريق إضافة 8 مل من hUC-MSC المتوسطة كاملة تحتوي على 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS).
- جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 350 × ز لمدة 10 دقيقة.
- إعادة تعليق بيليه في المالحة معقمة وعد الخلايا باستخدام غرفة Bürker. إعداد تعليق الخلية للتسريب عن طريق تخفيف الخلايا إلى تركيز نهائي من 2.5 × 105 في 200 درجة مئوية من المالحة المعقمة لكل فأر. إعداد تعليق الخلية الزائدة لضمان وجود حجم كاف لغرس جميع الفئران.
- الحفاظ على الخلايا على الجليد قبل التسريب. يُنفخ في غضون ساعات قليلة، على النحو المبين في الفرع 3-3.
- قم بتوسيع hUC-MSC في قوارير ثقافة 75 سم2 إلى الممرات المبكرة (1-3 كحد أقصى).
- التخدير
ملاحظة: لتقليل خطر إتلاف الوريد الذيل الماوس أثناء الحقن يجب أن الماوس لا تتحرك. لذلك تم تفضيل التخدير على تقييد الماوس البسيط.- التخدير الفئران بنسبة 4٪ استنشاق isoflurane في غرفة التعريفي.
- مراقبة التنفس الماوس. معدل التنفس سوف يتباطأ قليلا. بعد بضع دقائق، قرصة واحدة من أقدام الماوس للتحقق من التخدير السليم.
- ضخ الوريد الذيل
- بمجرد تأكيد فقدان الوعي، ضع الماوس تحت غطاء معقمة للضخ الوريدي hUC-MSC العقيم.
- الحفاظ على التخدير العام طوال التجربة عن طريق قناع الوجه مع تدفق مستمر من 1.5٪ isoflurane.
- لتعزيز توسع الأوعية والسماح لحقن أسهل، نقع ذيل الماوس في الماء الدافئ لمدة 2 دقيقة.
- خلط تعليق الخلية عن طريق الأنابيب بلطف للتأكد من أن الخلايا لا تشكل كتل. يستنشق 200 ميكرولتر في حقنة 1 مل مع إبرة 26 G، وتجنب تشكيل فقاعة.
- عقد ذيل الماوس من طرف وتصويب بلطف.
- تحديد موقع الوريد الجانبي لذيل الماوس. كشط بلطف مع مشرط ومسحها مع الإيثانول 70٪.
ملاحظة: يتم تنفيذ كشط بلطف من الذيل لإزالة الشعر، مما يجعل موقع حقن أكثر سلاسة ونظافة. - بدءا من الجزء القاصي من الذيل، أدخل الإبرة في الوريد في زاوية 15 درجة وضخ ببطء 200 ميكرولتر من hUC-MSC أو المالحة المعقمة (التحكم في السيارة) (الشكل1B).
- رصد التسريب الوريدي الناجح من قبل السائل دخول الوريد دون مقاومة وعدم وجود اكسترافيشن. انتظر بضع ثوان حتى ينتقل حجم كامل أسفل الإبرة، ومن ثم إزالته من الوريد.
- لمنع النزيف، وتطبيق الضغط لفترة وجيزة على الجرح دخول مع الشاش المعقمة.
- تجاهل بأمان الحقنة والإبرة بعد التسريب.
- استعادة الحيوانات
- ضع الماوس الممزوج على جانبها على لوحة تدفئة للتعافي.
- مراقبة التنفس الماوس ومراقبة الماوس حتى يبدأ في التحرك ويستعيد recumbency صارمة والوعي الكامل.
- بمجرد التأكد من أن الماوس في حالة جيدة، إعادته إلى القفص الأصلي. لا تعيده إلى الشركة من الحيوانات الأخرى حتى تعافى تماما.
- فحص الفئران لمدة 24 ساعة بعد ضخ الوريد الذيل وكل يوم، لرصد حالتهم الصحية والكشف عن أي معاناة أو علامة مرضية في وقت مبكر.
4. الجهاز explant والأنسجة تجهيز
- التضحية الفئران في أيام 8، 14، أو 21 بعد إدارة البليومسين (الشكل1C)عن طريق جرعة زائدة من مخدر الحقن.
- استئصال القصبة الهوائية والرئتين وغسلها على الفور في PBS الجليد الباردة.
- التقط تجميد الرئتين اليمنى في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية لتحليل الجزيئية اللاحقة10.
- تضخيم الرئتين اليسرى مع 4٪ بارافورمالهايد وإصلاحها في 10٪ محايدة المخزنة حل الفورماين لمدة 24 ساعة. ثم، وتجفيفها في سلسلة الكحول متدرج، مسح لهم في إكسيلين، وتضمينها في البارافين10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد تسبب إصابة الرئة عن طريق حقن واحد داخل الرغامى من 1.5 U/kg من وزن الجسم من كبريتات البيوميسين في 100 ميكرولتر من المالحة المعقمة. تلقت الحيوانات السيطرة حقن الرغامى من حجم متساو من المالحة. تم غرس طلقتين من hUC-MSC (2.5 × 105 في 200 ميكرولتر من المالحة المعقمة) في الوريد الذيل الماوس، 24 ساعة و 7 أيام بعد إدارة البليوميسين. تلقت الحيوانات السيطرة ضخ عن طريق الوريد من حجم متساو من المالحة المعقمة. تم التضحية الفئران لمعالجة الرئة explant والأنسجة في الأيام 8 و 14و 21 بعد إدارة البليومسين (الشكل 1).
أظهرنا أن غرس مباشر من bleomycin في القصبة الهوائية الماوس سمح انتشار سريع وصولا الى الرئتين، مما أدى إلى التهاب واسع النطاق، والتليف التدريجي، وتشويه هندستها المعمارية الطبيعية، تمشيا مع الدراسات السابقة 11.تم تقييم التغيرات الأنسجة المرضية الرئة من قبل هيماتوكسيلين-يوسين (H & E) وpicrosirius الأحمر تلطيخ10، وأكد التليف من خلال زيادة محتوى هيدروكسيبرولين وترسب الكولاجين (الشكل 2). تم تقييم التغيرات الالتهابية في الأنسجة من قبل نظام التهديف النسيجي على أساس التسلل الالتهابي حول الشعب الهوائية، الشعب الهوائية، والأوعية الدموية، والالتهاب الرئوي الخلالي لوحظ في أقسام الرئة الملطخة هيماتوكسيلين-يوسين10. بعد حقن bleomycin، درجة اشكروفت من أقسام الرئة زادت تدريجيا من متوسط قيمة 1.5 في اليوم 8 إلى متوسط قيمة 4.5 في اليوم 14 و 6.5 في اليوم 2110. التسريب المزدوج من hUC-MSC في الوريد الذيل الماوس مخففة إلى حد كبير إصابة الرئة الناجمة عن bleomycin، مع انخفاض كبير، على الرغم من عدم الإلغاء الكامل، من كل من التسلل الالتهابي ومدى التليف في كل نقطة زمنية ( الشكل2). أظهر التلطيخ المناعي مع أجسام مضادة محددة10 أن غرست hUC-MSC بسرعة وفعالية وصلت إلى الرئتين الماوس، علىالرغم من أنه تم الكشف عن عدد قليل فقط من الخلايا، مع انخفاض عدد من اليوم 8 إلى اليوم 21 (الشكل 3). كما ذكرت سابقا12, هذه البيانات تشير إلى تفكك سريع للخلايا من موقع الإصابة, على الرغم من تأثيرها الوقائي لفترات طويلة. تم إجراء تلطيخ الكيمياء المناعية (IHC) من hUC-MSC، أيضا في العينات المعالجة المالحة، ولكن لا يمكن الكشف عن أي خلية، نظرا لعدم وجود بؤر التهابية جذب hUC-MSC.
الشكل 1: مخطط البروتوكول التجريبي. (أ) تلقت الفئران حقنة واحدة داخل الرغامى (e.t.) من 1.5 U/kg من وزن الجسم من البيوميسين للحث على إصابة الرئة (اليوم 0). (ب) تم إجراء ضخ مزدوج عن طريق الوريد (i.v.) من 2.5 × 105 خلايا سترومال mesenchymal الإنسان التي تم الحصول عليها من الحبل السري كله (hUC-MSC) 24 ساعة (اليوم 1) و 7 أيام (اليوم 7) بعد إدارة البليوميسين. (C) يظهر هنا جدول زمني للحقن ولحظات التضحية. تم التضحية بمجموعات الفئران في الأيام 8 و14 و21 بعد إدارة البلميسين (أي 24 ساعة و7 أيام و14 يوماً بعد ضخ hUC-MSC الثاني، على التوالي). تم تعديل هذا الرقم من Moroncini وآخرون. 10. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: hUC-MSC أسفلتنظيم التهاب الرئة الناجم عن البلميسين والتليف. (ألف وباء) الصور المجهرية التمثيلية (10x التكبير) من الهيماتوكسيلين-يوسين (H&E) وpicrosirius تلطيخ أحمر من أقسام الرئة التي تم الحصول عليها من الفئران C57BL/6، بعد 21 يوما من حقن داخل الرغامى من المالحة المعقمة (المالحة) أو بلميسين (بلميسين)، و كما يتبع هذا الأخير بضخ عن طريق الوريد من hUC-MSC (bleomycin + hUC-MSC) أو المالحة المعقمة (بلومايسين + ملحي). الضوابط المالحة أظهرت بنية الرئة الطبيعية. لوحظ تتسلل التهابية واسعة النطاق بعد 21 يوما من إصابة البروميسين، مع تشويه شديد في بنية الرئة وتشكيل بؤر ليفية. وقد تم تخفيف التعديلات الناجمة عن البيوميسين بشكل كبير من خلال العلاج hUC-MSC ولكن ليس عن طريق المالحة. (C) محتوى هيدروكسيبرولين في الأيام 8 و 14 و 21 في رئات الفئران C57BL/6 التي تلقت العلاجات المذكورة أعلاه. والنتائج هي متوسط ± SD (ن = 8 لكل مجموعة)، وأعرب كنسبة مئوية من القيمة التي تم الحصول عليها من الفئران المعالجة بالمالحة داخل الرغامى، وهي تمثل ثلاث تجارب مستقلة. *P < 0.05, **P < 0.01, بالمقارنة مع الفئران المعالجة بلمليسين. (D) مستويات التعبير Col1A1 الماوس في mRNA الرئة الكاملة التي تم الحصول عليها في الأيام 8 و 14 و 21 من الفئران C57BL/6 التي تلقت العلاجات المذكورة أعلاه. النتائج هي متوسط ± SD(ن = 5 لكل مجموعة) وهي ممثلة لثلاث تجارب مستقلة أجريت في ثلاثة أضعاف. *P < 0.05, **P < 0.01, بالمقارنة مع الفئران المعالجة بلمليسين. تم تعديل هذا الرقم من مورونسيني وآخرون. 10. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الكشف عن hUC-MSC في أنسجة الرئة. (A و B)الصور المجهرية التمثيلية (200x و 400x التكبير، على التوالي) من تلطيخ المناعة مع الأجسام المضادة للHLA-1 من أقسام الرئة التي تم الحصول عليها من C57BL/6 الفئران تلقي البلوريسين داخل الرغامى تليها عن طريق الوريد hUC-MSC. تشير الأسهم الحمراء إلى hUC-MSC ملطخة بالإيجابية. (C) تقييم GAPDH البشرية من خلال التفاعل المتسلسل الكمية في الوقت الحقيقي (PCR) في الحمض النووي الريبي الكامل المستخرج من hUC-MSC المستزرعة قبل التسريب (غرست hUC-MSC) أو من أنسجة الرئة في الأيام 8 و 14 و 21 من الفئران C57BL/6 التي تتلقى endotracheal bleomycin تليها hUC-MSC الوريدي (bleomycin + hUC-MSC). النتائج هي متوسط ± SD(ن = 5 لكل مجموعة) وهي ممثلة لثلاث تجارب مستقلة أجريت في ثلاثة أضعاف. وتجدر الإشارة إلى أن مصدر نسخة الرابطة البشرية من النصوص في هذا البروتوكول التجريبي يمكن توفيرها حصراً من قبل hUC-MSC المنصهر عن طريق الوريد. تم تعديل هذا الرقم من مورونسيني وآخرون. 10. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إدارة الرغامى هو الطريق التفضيلي لإيصال العوامل الخارجية في الرئتين. منذ عدة سنوات ، تم استخدام الحقن المباشر للبلميسين في القصبة الهوائية على نطاق واسع للحث على التليف الرئوي13 ، ومؤخرا ، تم تطوير تقنيات أكثر تقدما ، غير الغازية لتحقيق هذا14،15 ،16.
توفر الطريقة الموضحة هنا العديد من الفوائد ذات المغزى على بعض القيود المحتملة. حقن القصبة الهوائية يتطلب تدخل جراحي، يحمل معها إمكانية حدوث مضاعفات ناجمة عن الإجراء نفسه، جنبا إلى جنب مع الحاجة إلى التخدير الحيواني العميق. ولذلك، هناك حاجة إلى إعداد جيد وممارسة في اتقان الإجراء. إلى جانب ذلك ، للحد من معاناة الماوس ، لا بد من ضبط الجرعة المناسبة من التخدير وفقا لسلالة الماوس والاستجابة الفردية والحفاظ على مراقبة صارمة لحالة التخدير الحيواني. ومع ذلك، لاحظنا معدل وفيات منخفض جدا ً والشفاء الأمثل للحيوانية من التخدير. يمكن استخدام الكيتامين والإكسيلازين للتخدير، وكذلك ثلاثي البروم والإيثانول. ومع ذلك, في الفئران, الجرعة الفعالة من الكيتامين وxylazine قريبة من الجرعة المميتة; وبالتالي، فإنها يمكن أن تحفز بسهولة توقف الجهاز التنفسي. وعلى العكس من ذلك، يمكن تعديل التعمّد ثلاثي البروم الإيثانول بسهولة، وبالتالي فهو عامل مخدر مفضل. بعد حقن البلورية البليماسين في القصبة الهوائية ، لم نلاحظ أي آثار سلبية. كانت الفئران خالية من الحمى ولم تلاحظ أي علامات التهاب أو عدوى حول القصبة الهوائية والجرح الجلدي. لذلك، لم تكن هناك حاجة للوقاية من المضادات الحيوية. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام مجهر التشغيل يضمن ثقة عالية من النجاح من خلال السماح للمشغل لمراقبة بدقة الموضع الصحيح للإبرة في القصبة الهوائية الماوس قبل الغرس، وبالتالي تقليل خطر الإضرار بها.
حقن البروميسين داخل الرغامى يؤدي إلى استجابة قوية التهابية وليفية في كلتا الرئتين ويمكن أن ينظر إليها على أنها طريقة قوية لتوليد نماذج الماوس التجريبية لأمراض الرئة الخلالية البشرية (ILD). ومع ذلك، كما هو موثق سابقا7، والاستجابة الليفية لbleomycin في الفئران هو الاعتماد على سلالة والجنس والعمر ذات الصلة. ولذلك، فمن الأهمية بمكان لنجاح البروتوكول للعثور على جرعة مقبولة من البلميسين في كل إعداد تجريبي. وقد استخدمت الفئران الإناث في هذه الدراسة لأن الاهتمام الرئيسي في هذا البحث كان مرض الرئة الخلالي المرتبطة بالتصلب الجهازي، وهو مرض منتشر إلى حد كبير في الإناث البالغات الشابات. تم اختيار الفئران التي تتراوح أعمارهم بين ثلاثة إلى أربعة أشهر لأن هذا هو العمر الذي يدخلون فيه مرحلة البالغين فقط (الفئران بلوغ النضج الجنسي في 8-12 أسابيع من العمر)17. وهكذا، فإنها تعتبر الفئران الكبار الشباب ويفضل على الحيوانات الأصغر سنا، لأن التليف الرئوي ليست شائعة في الأفراد الصغار جدا. كما أنها أفضل على الحيوانات الأكبر سنا منذ الدراسات السابقة18 أظهرت أن الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين أظهرت تغييرات في النمط الظاهري الليفي الرئة، مما أدى إلى زيادة التعرض للتلف والتليف بعد إصابة الرئة، والتي يمكن أن يمثل تحيزمحتمل في النموذج التجريبي المعروض هنا.
ضخ الوريد الذيل هو وسيلة بسيطة وموثوق بها، وغير الغازية لضمان التسليم السريع والفعال للأدوية إلى مجرى الدم. ويمكن تنفيذها بسهولة مع المعدات الطبية البسيطة، والتدريب اليدوي القصير، وخفض التكاليف.
البروتوكول التجريبي الموصوف هنا، المعدل من الدراسات المنشورة سابقا19،20،21،موجود من ضخ الوريد المزدوج من 2.5 × 105 hUC-MSC لتعزيز تطعيم الخلايا في الماوس الرئتين وتأثيرها العلاجي. في الواقع ، بما أن الإجراء غير صادم ، فإنه يمكن تكراره في نفس الحيوان ، ولكن يوصى بفترة 7 أيام بين حقنتين متتاليتين ، للسماح بجبر الجروح الدافقة في نهاية المطاف. وعلاوة على ذلك، استخدمنا استنشاق الأيسوفلوران لالتخدير الفئران C57BL/6 أثناء الإجراء، لتجنب إصابة الوريد الذيل في حالة الحركات الحيوانية المفاجئة.
وفي الختام، تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح للحث بكفاءة على التليف الرئوي في الفئران C57BL/6 والتحقق من صحة التأثير المضاد للفيليفي في الجسم الحي من hUC-MSC. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لإدارة الأدوية أو وكلاء أخرى غير bleomycin في مجرى الهواء، من أجل توليد نماذج مختلفة من أمراض الرئة التجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل بمنحة RF-2011-02352331 من Ministero Italiano della Salute (إلى أرماندو غابرييلي).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Charles River | Jax Mice Stock n. 000664 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Barraquer Micro Needle Holder | Lawton | 62-3755 | |
| Bleomycin sulfate | Sigma-Aldrich | B1141000 | |
| Bürker chamber | Brand | 718905 | |
| Culture Flasks | EuroClone | ET7076 | |
| Disposable razors | Unigloves | 4080 | |
| Dissecting Forceps | Aesculap Surgical Instruments | BD311R | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Heating pad | 2Biological Instruments | 557023 | |
| Isoflurane Vet | Merial Italia | N01AB06 | |
| Operating Microscope | Carl Zeiss | Model OPM 16 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | 12563-029 | |
| Vannas Micro Scissors | Aesculap Surgical Instruments | OC498R | |
| Vicryl Plus 4/0 Absorbable Suture, FS-2 needle 19 mm | Ethicon | VCP392ZH |
References
- Iudici, M., et al. Where are we going in the management of interstitial lung disease in patients with systemic sclerosis? Autoimmunity Reviews. 14 (7), 575-578 (2015).
- Moore, B. B., Hogaboam, C. M.
- Mouratis, M. A., Aidinis, V. Modeling pulmonary fibrosis with bleomycin. Current Opinion in Pulmonary Medicine. 17 (5), 355-361 (2011).
- Moeller, A., Ask, K., Warburton, D., Gauldie, J., Kolb, M. The bleomycin animal model: a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis? International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 40 (3), 362-382 (2008).
- Moore, B. B., et al. Animal models of fibrotic lung disease. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 167-179 (2013).
- Schrier, D. J., Kunkel, R. G., Phan, S. H. The role of strain variation in murine bleomycin-induced pulmonary fibrosis. American Review of Respiratory Disease. 127 (1), 63-66 (1983).
- Phan, S. H., Kunkel, S. L. Lung cytokine production in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Experimental Lung Research. 18 (1), 29-43 (1992).
- Capelli, C., et al. Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate. Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).
- Beeravolu, N., et al. Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta. Journal of Visualized Experiments. (122), e55224 (2017).
- Moroncini, G., et al. Mesenchymal stromal cells from human umbilical cord prevent the development of lung fibrosis in immunocompetent mice. PLoS One. 13 (6), e0196048 (2018).
- Shahzeidi, S., Jeffery, P. K., Laurent, G. J., McAnulty, R. J. Increased type I procollagen mRNA transcripts in the lungs of mice during the development of bleomycin-induced fibrosis. European Respiratory Journal. 7 (11), 1938-1943 (1994).
- Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
- Scotton, C. J., Chambers, R. C. Bleomycin revisited: towards a more representative model of IPF? American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (4), L439-L441 (2010).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
- Thomas, J. L., et al. Endotracheal intubation in mice via direct laryngoscopy using an otoscope. Journal of Visualized Experiments. (86), e50269 (2014).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
- Dutta, S., Sengupta, P. Men and mice: Relating their ages. Life Sciences. 152, 244-248 (2016).
- Sueblinvong, V., et al. Predisposition for disrepair in the aged lung. American Journal of Medical Sciences. 344 (1), 41-51 (2012).
- Moodley, Y., et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cells reduce fibrosis of bleomycin-induced lung injury. American Journal of Pathology. 175 (1), 303-313 (2009).
- How, C. K., et al. Induced pluripotent stem cells mediate the release of interferon gamma-induced protein 10 and alleviate bleomycin-induced lung inflammation and fibrosis. Shock. 39 (3), 261-270 (2013).
- Lee, R. H., et al. TSG-6 as a biomarker to predict efficacy of human mesenchymal stem/progenitor cells (hMSCs) in modulating sterile inflammation in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (47), 16766-16771 (2014).
