Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Polyomavirus מרקל זיהום וזיהוי

Published: February 7, 2019 doi: 10.3791/58950
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Microbiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Laboratory of Cellular Oncology, National Cancer Institute
* These authors contributed equally

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להדביק את ראשי פיברובלסט עורי האנושי עם MCPyV. הפרוטוקול כולל בידוד של fibroblasts עורי, הכנה של MCPyV virions, זיהום בנגיף, immunofluorescence מכתים פלורסצנטיות הכלאה באתרו. פרוטוקול זה ניתן להאריך אפיון אינטראקציות MCPyV-מארח, גילוי סוגי תאים אחרים מרישי על-ידי MCPyV.

Abstract

מרקל תא polyomavirus (MCPyV) זיהום יכול להוביל מרקל קרצינומה של תאים (MCC), טופס אגרסיבי ביותר של סרטן העור. מחקרים מכניסטית מחקירה מלאה של ביולוגיה מולקולרית MCPyV ומנגנונים oncogenic יש כבר הקשו על ידי חוסר מודלים תרבות תא נאותה. כאן, אנו מתארים את ערכה של פרוטוקולים עבור ביצוע וכן זיהוי זיהום MCPyV של תאי העור האנושי העיקרי. הפרוטוקולים לתאר את ניתוקה של האדם fibroblasts עורי, הכנת virions MCPyV רקומביננטי, וזיהוי להידבקות בווירוס על ידי צביעת (אם) immunofluorescent והן באתרו DNA-הכלאה תגובת שרשרת (HCR), אשר הוא מאוד רגיש קרינה פלואורסצנטית בגישה הכלאה (דגים) באתרו. ניתן להתאים את הפרוטוקולים במסמך זה על ידי חוקרים מעוניין לזהות סוגי תאים או שורות תאים התומכים MCPyV זיהום אחרים. הגישה דגים שתואר יכול להתאים גם לגילוי רמות נמוכות של נגיפי DNAs המצויים בעור האדם הנגוע.

Introduction

מרקל תא polyomavirus (MCPyV) הוא קטן, כפול גדילי DNA וירוס שויך סרטן העור נדירה אך אגרסיבי, מרקל תא קרצינומה (MCC)1,2. שיעור התמותה של מפקד צוות משימה, בסביבות 33%, חורג של מלנומה3,4. MCPyV יש גנום מעגלית של1,~ 5 kb5 נחצה על ידי אזור תקינה ללא קידוד (NCRR) לתוך מוקדם ולא מאוחר קידוד אזורים1. NCRR מכיל מקור ויראליות שכפול (אורי) ועל היזמים דו-כיווניים עבור שעתוק ויראלי6,7. האזור בתחילת מקודד הגידול אנטיגן חלבונים הנקראים T גדול (LT), T קטן (רח'), 57kT, ORF LT חלופי (ALTO), כמו גם של autoregulatory miRNA1,8,9,10. האזור מאוחר מקודד את החלבונים capsid VP1 ואת VP211,12,13. LT ו- sT החלבונים MCPyV ביותר למד, הוכחו תומכת שכפול ה-DNA ויראלי הנוצרות על-ידי MCPyV tumorigenesis5. שילוב המשובטים MCPyV DNA הגנום המארח, אשר נצפתה עד 80% של MCCs, הוא כנראה גורם סיבתי עבור גידול חיובי וירוס פיתוח14,15.

השכיחות של MCC שילש מעל ה-20 שנה האחרונות16. זיהום MCPyV אסימפטומטיים נפוצה גם האוכלוסייה הכללית17,18,19. עם הגדלת מספר אבחנות MCC, שכיחות גבוהה של זיהום MCPyV, יש צורך לשפר את ההבנה שלנו של הווירוס, פוטנציאל oncogenic שלו. עם זאת, היבטים רבים של ביולוגיה MCPyV ומנגנונים oncogenic נשארים ממעטים להבין20. זאת בעיקר משום MCPyV משכפל לקוי תא הוקמה קווים11,12,21,22,23 , עד לאחרונה, מסוגל לתמוך MCPyV תאי עור זיהום לא היה שהתגלו22. מחקרים מכניסטית לחקור באופן מלא MCPyV והאינטראקציה שלו עם התאים המארחים יש להיות הכבידו על ידי חוסר תא מערכת תרבות להפצת וירוסים5.

גילינו כי ראשי האדם עורי fibroblasts (HDFs) מבודד מן העורלה האנושי neonatal תמיכה איתנה MCPyV זיהום בשני במבחנה ו- ex-vivo24. ממחקר זה, הקמנו המודל זיהום התרבות התא הראשון עבור MCPyV24. בונים על מערכת זו מודל, הראנו תנאי הגיוס של מטריקס מטאלו-פרוטאינאז (MMP) גנים מאת חגיגת/β-catenin איתות לשביל וגורמים אחרים הצמיחה מגרה זיהום MCPyV. יתר על כן, מצאנו trametinib אנטגוניסט MEK שאושרו על-ידי ה-FDA מעכב ביעילות MCPyV זיהום5,25. ממחקרים אלה, גם הקמנו קבוצה של פרוטוקולים לבידוד fibroblasts עורי אנושי24,25, הכנת MCPyV virions11,12, ביצוע זיהום MCPyV על האדם fibroblasts עורי 24 , 25 וגילוי חלבונים MCPyV אם צביעת26. בנוסף, התאמנו באתרו DNA הכלאה תגובת שרשרת (HCR) טכנולוגיה27 לפתח טכניקה דגים רגישים (דגים HCR-DNA) לגילוי MCPyV DNA בתאים נגועים העור האנושי. שיטות חדשות אלה יהיה מועיל ללימוד מחזור זיהומית של MCPyV, כמו גם התגובה התאית זיהום MCPyV. התאים מאגר טבעי מארח לשמור על זיהום MCPyV והתאים להצמיח גידולים MCC נשאר לא ידוע. טכניקות שנתאר כתב יד זה יכול להיות מיושם לבחון סוגים שונים של תאים אנושיים כדי לזהות גם את המאגר התאים ואת המקור של גידולים MCC. השיטות שלנו הוקמה, כגון דגים HCR-DNA, יכול גם להיות מועסק זיהוי וירוסים גידול אחרים ה-DNA, אפיון אינטראקציות התא המארח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

. אל תדאג neonatal האנושי התקבלו ממרכז המחקר של מחלת העור פן. למבוגרים fibroblasts אנושי, התקבלו שהושלכו עור רגיל לאחר הניתוח. כל הפרוטוקולים אושרו על ידי אוניברסיטת פנסילבניה מוסדיים המנהלים.

1. בידוד של האדם fibroblasts עורי

  1. השתמש זוג מספריים כדי לקצץ את רקמת שומן ו התת-עורית מן הערלה neonatal אנושי. ולחתוך את דגימת עור חצאים או רבעים.
  2. דגירה הרקמה ב 5 מ של 10 מ"ג/מ"ל dispase II ב- PBS בתוספת אנטיביוטיקה-antimycotic-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  3. בקערה סטרילי 10 ס מ, הפרד בזהירות את האפידרמיס מהשכבות עורי באמצעות מלקחיים microdissection.
  4. העברת רקמות עורי שייווצר צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 5 מ של 2 מ"ג/מ"ל collagenase הקלד הרביעי במדיום נטול FBS בתוספת אנטיביוטיקה-antimycotic.
  5. דגירה המדגם-37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2 עבור 4-6 h ברעידות תקופתיות עד כמה רקמות מאקרוסקופית אגרגטים להישאר.
  6. שחרור תאים בודדים של הדרמיס על-ידי pipetting למעלה ולמטה (triturating) נמרצות 10 פעמים עם פיפטה 10 מ"ל.
  7. צנטריפוגה ב x 180 גרם במשך 5 דקות, ולמחוק את תגובת שיקוע.
  8. צלחת התאים dissociated בינוני DMEM בתוספת סרום עגל עוברית 10%, 1% שאינם חיוניים חומצות אמינו ו- 1%-גלוטמין ב 37 ° C 5% CO2.

2. רקומביננטי הכנה virion MCPyV

  1. µG 50 תקציר של פלסמיד pR17b (נושא הגנום MCPyV) עם 250 U של BamHI-HF באמצעי אחסון 200 µL (4 h ב 37 מעלות צלזיוס) כדי להפריד בין הגנום הנגיפי לבין עמוד השידרה וקטור (איור 2).
  2. להוסיף 1200 µL של המאגר PB (בתוספת 10 µL של 3 מ' NaAc, pH 5.2) ה-DNA מתעכל ולטהר miniprep-2 ספין עמודות (קיבולת DNA µg 20). Elute את פלסמיד מתעכל pR17b של כל עמודה עם 200 µL טה מאגר (10 מ"מ טריס-HCl, pH8.0, 1 מ"מ EDTA).
  3. להכין את התגובה מצדו של שפופרת צנטרפוגה 50 מ. הוסף µL 400 של מטוהרים פלסמיד ה-DNA מ שלב 2.2, mL 8.6 1.05 מאגר ליגאז x T4 ו- µL 6 של ריכוז גבוה T4 ליגאז. דגירה ב 16 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  4. 45 מ של מאגר PB (בתוספת 10 µL של 3 מ' NaAc, pH 5.2) להוסיף מצדו ולהשתמש יריעה ואקום לטעון בין 2 עמודות ספין miniprep. Elute כל עמודה עם 50 µL טה המאגר. לצפות תשואה כ- 30 µg של ה-DNA.
  5. בשעות הערב/אחר הצהריים המאוחרות, זרע 6 x 106 293TT28 תאים לתוך 10 ס מ צלחת בינונית DMEM המכיל בתוספת 10% עגל עוברית סרום חומצות אמינו שאינן הכרחיות 1%, 1%-גלוטמין ללא hygromycin B.
  6. למחרת בבוקר, ודא כי התאים נמצאים כ-50% confluent. Transfect באמצעות µL 66 של תרביות תאים ריאגנט (1.1 µL/cm2), µg 12 של MCPyV מחוברים מחדש לבודד דנ א R17b מ שלב 2.4, µg 8.4 של ST הביטוי פלסמיד pMtB ו- 9.6 µg זה ביטוי פלסמיד pADL *29.
  7. כאשר התאים transfected הם כמעט confluent, למחרת היום, trypsinize את התאים ומעבירים אותם אל צלחת 15 ס מ עבור המשך הרחבתה.
  8. אם תרצה לקחת מספר קטן של תאים 293TT על הרחבת ולבצע אם צביעת עבור זה MCPyV (CM2B4) ואת VP1 (MCV VP1 ארנב30) כדי לקבוע יעילות תרביות תאים. בשלב זה, גרעיני אות זה עשויים להיות גלויים אך הביטוי VP1 כנראה לא יהיה לזיהוי.
  9. כאשר המנה 15 ס מ הופך כמעט confluent (בדרך כלל 5-6 ימים לאחר תקנים הראשוני), להעביר את התאים לתוך שלוש מנות 15 ס מ. קציר תאים מן המנות 15 ס מ כאשר הם הופכים כמעט confluent, לפי התקנון הקציר וירוס להלן.
    הערה: לחלופין לבצע בקרת איכות אם כפי שמתואר בשלב 2.8. רוב התאים צריך להיות MCPyV זה והן VP1 חיובי בשלב זה.
  10. כדי לקצור את הווירוס, trypsinize תאים, ספין-x 180 גרם עבור 5 דקות ב RT ולהסיר את תגובת שיקוע. הוסף אמצעי אחסון צניפה תא אחד של DPBS-מ ג (DPBS עם 9.5 מ מ MgCl2 ו- 1 x אנטיביוטיקה-antimycotic). לאחר מכן להוסיף 25 מ מ. אמוניום סולפט (מתוך פתרון pH 9 1 מ' מניות) ואחריו 0.5% X-100 טריטון (מ 10% מניות פתרון), 0.1% Benzonase ו 0.1% של DNase תלוי-ATP. מערבבים היטב, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  11. דגירה את התערובת למשך 15 דקות על קרח ולאחר מכן להוסיף נפח 0.17 5 M NaCl. לערבב, דגירה על קרח בשביל עוד 15 דקות ספין 10 דקות ב 12,000 x g ומפרידה 4 ° C. אם תגובת שיקוע אינו ברור, בעדינות היפוך הצינור, חזור על השלב ספינינג. להעביר את תגובת שיקוע צינור חדש.
  12. Resuspend בגדר שימוש באמצעי אחד של DPBS בתוספת 0.8 M NaCl, ומסתובב שוב, כפי שמתואר בשלב 2.11.
  13. לשלב את supernatants מהשלב 2.11 ו- 2.12, ספין פעם נוספת כפי שמתואר בשלב 2.11.
  14. יוצקים מעברי צבע של iodixanol קיר דק 5 מ"ל polyallomer צינורות מאת underlaying (27%, 33%, ואז 39%) ~0.7 mL השלבים באמצעות מזרק 3 מ ל מצויד עם מחט ארוכה או פיפטה של p1000.
  15. לטעון 3 מ"ל של מובהר תגובת המכיל וירוס שיקוע על המילוי ההדרגתי iodixanol מוכן.
  16. ספין על 3.5 h ב 234,000 x g ו- 16 מעלות צלזיוס רוטור SW55ti. הגדר את האצה והאטה להאט.
  17. לאחר ultracentrifugation, לאסוף את השברים 12 siliconized צינורות (כל שבר הוא µL ~ 400).
  18. לנתח את השברים לנוכחות של וירוס ריאגנט dsDNA ו/או תספיג עבור VP1 (MCV VP1 ארנב30). בריכה שברים מעבר צבע עם שיא dsDNA ו/או תוכן VP1 ולאפיין את המניה על-ידי PCR כמותי כדי לחשב גנום ויראלי המקביל31. חנות MCPyV virion מניות ב- 80 ° c

3. זיהום

  1. לשמור על ראשי fibroblasts עורי האנושי ב- DMEM עם סרום עגל עוברית 10%, 1% חומצות אמינו שאינן הכרחיות, 1%-גלוטמין. כשמגיעים הנהרות, לפצל fibroblasts 1:4 ללא ספינינג למטה.
    הערה: MCPyV זיהום להשגת יעילות מרבית, השתמש fibroblasts העיקרי בין קטעים 5 ו- 12 כי הם פעיל חלוקת הזמן של ציפוי.
  2. כדי להדביק את האדם fibroblasts עורי, תשאף המדיום ולשטוף את התאים עם DPBS.
  3. להוסיף 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA למנה דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות.
  4. בדוק מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא כי התאים יורדות המנה.
  5. להוסיף 10 מ ל DMEM/F12 בינוני המכיל 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF ומיקרומטר 3 CHIR99021, אשר כולם לעורר MCPyV זיהום24, למנה ולהעביר את הפתרון תא לתוך צינור 15 מ"ל.
  6. ספין למטה התאים ב x 180 גרם למשך 2 דקות, ולמחוק את תגובת שיקוע. Resuspend התאים DMEM/F12 בינוני המכיל 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF ו 3µM CHIR99021 ב 2-4 x 10 תאי4 מ"ל.
  7. זרע µL 200 של התליה תא בתוספת 1 מ"ג/מ"ל collagenase סוג IV לבאר כל צלחת 96-ובכן. הפשרת MCPyV מניות virion על הקרח. הוסף מקבילות גנום ויראלי9 10 MCPyV virions (שלב מחושבים ב- 2.18) לכל 1 µL של iodixanol עבור כל התאים 2,500 ל- 5000 נגועה.   הקש על הצד של הצלחת בעדינות ומניחים את הצלחת בחממה.
  8. לאחר דגירה ב 37 ° C ב- 5% CO2 עבור 48-72 שעות, להוסיף 20% FBS כדי מכל קידוח.
  9. לאפשר את הזיהום להמשיך ב- 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2 h 72-96.

4. immunofluorescent מכתים

  1. לתקן תאים שהושג בשלב 3.9 עם paraformaldehyde 3% ב- PBS כעשרים דקות.
  2. לשטוף את התאים עם PBS פעמיים.
  3. דגירה התאים במאגר חוסם/permeabilization (0.5% טריטון X-100, 3% BSA ב- PBS מסונן דרך מסנן מיקרומטר 0.22) ב RT לשעה.
  4. דגירה התאים עם נוגדנים העיקריים הבאים: העכבר LT monoclonal אנטי-MCPyV (CM2B4) (1:1000), ארנב polyclonal אנטי-MCPyV VP1 נוגדנים (1:2000), ב- RT במשך 3 שעות.
  5. לשטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים.
  6. דגירה התאים עם נוגדנים משניים: 594 עבור חיל הים העז אנטי עכבר IgG (1:1000) וארנבת עבור חיל הים 488 עז אנטי איג (שבערך) ב RT לשעה.
  7. רחץ תאים עם PBS שלוש פעמים.
  8. Counterstain התאים עם 0.5 µg/mL דאפי (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride).
  9. הר coverslips על זכוכית שקופיות ולנתח תוך שימוש במיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה.

5. אין סיטו DNA-HCR

הערה: טכניקה זו דורשת כי התאים להיות נזרע על coverslips. למטרה זו, זיהום בתנאים המתוארים לעיל (שלב 3) עשוי להיות יורה לתבנית 24-ובכן צלחת.

  1. לתקן תאים בתרבית על coverslips עם 4% מחברים ב- PBS במשך 10 דקות לשטוף coverslips פעמיים עם PBS, ואחר כך להתייחס אליהם עם 70% אתנול כדי permeabilize את התאים ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    הערה: דגימות קבוע יכול להישאר במצב זה במשך מספר ימים.
  2. מראש hybridize דוגמאות על ידי החלפת האתנול עם בדיקה הכלאה מאגר המקננת עבור 60 דקות ב- RT.
  3. לדלל את probe(s) (1 מיקרומטר) (טבלה 1) בבדיקה הכלאה מאגר פתרון-דילול שבערך 30 דקות לפני סוף השלב הקדם הכלאה, דגירה ב 45 º C.
  4. בסוף incubations, פיפטה ~ 10 μL של המיקס מדולל בדיקה לכל coverslip על שקופיות מיקרוסקופ. המקום coverslips, תא-בצד למטה, על טיפות שלהם בהתאמה הכלאה בדיקה מערבבים. לאטום את הקצוות ואת גב coverslips על השקופיות עם כמות הליברלית של דבק גומי.
  5. מחממים את השקופיות עם הגששים נוספה ב 94 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות על ידי הגדרת את השקופיות על הצד השטוח של גוש חום. להעביר את השקופיות תא humidified, דגירה ב 45 מעלות צלזיוס למשך הלילה. כדי להפוך תא humidified פשוטים, לחלח מגבות נייר סטרילי עם dH2O והמקום בתחתית מיכל פלסטיק שמשמר עם אטם גומי.
    הערה: במהלך חימום הבטון גומי יכול בועה בקצרה. עם זאת, ודא כי החותם לא לשבור.
  6. בזהירות הקילוף הבטון גומי עם מלקחיים ומניחים coverslips התא-הצד לאחור לתוך בארות של צלחת 24-. טוב. לשטוף את coverslips עם מאגר רחיצת רכב הגישוש-RT שלוש פעמים.
  7. דגירה של coverslip במאגר הגברה (200 µL ב- 24-ובכן צלחות) ב RT 30-60 דקות.
  8. בינתיים, anneal כל אחד סיכות oligonucleotide שכותרתו שני לזהות את הגששים (טבלה 1) בנפרד המבחנות על ידי חימום עד 94 ° C עבור 90 s וקירור כדי RT למשך 30 דקות, תוך הגנה על האור. מערבבים את שתי סיכות במאגר הגברה, כל אחד בלדילול של 1:50.
  9. לבצע משטח עבור התגובה הגברה על ידי מתיחת פרפין סרט על הפנים פתוח של מכסה צלחת 24-. טוב. Pipette µL 50-100 טיפות התערובת מאגר הגברה/סיכת ראש על הסרט פרפין עבור כל coverslip. להשתמש מלקחיים כדי להסיר בקפידה על coverslips הפתרון קדם הגברה. יבש את coverslip על-ידי נגיעה לקצה מחיקה חד פעמית נקבובי, ומניחים בצד תא למטה על גבי ה-droplet הגברה.
  10. מקם את המכסה צלחת מחזיק את coverslips לתא humidified, דגירה ללון במלון RT בחושך.
  11. להחזיר את coverslips בארות פעם נוספת. דגירה בדגימות עם 5 x SSCT [5 x נתרן כלוריד סודיום ציטרט (האס) 0.1% Tween 20 מסונן דרך מסנן מיקרומטר 0.22] המכילה 0.5 µg/mL דאפי עבור 1 h RT. לרחוץ את הדגימות פעמיים עם 5 x SSCT-RT.
  12. הר על coverslips על שקופיות מיקרוסקופ. לנתח את התאים, תמונה הדגימות באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה מותר בידוד של אוכלוסיה הומוגנית כמעט של HDFs (איור 1). כפי שמתואר על ידי צביעת immunofluorescent, כמעט 100% של תאים אנושיים עורי מבודדים באמצעות התנאים המתוארים פרוטוקול זה היו באופן חיובי צבעונית פיברובלסט עורי סמנים, vimentin של קולגן אני24, אבל שלילי על האדם העורלה תקין סמן K14 (איור 1). איור 2 מציג את התהליך של יצירת virions MCPyV באמצעות recombinant הגנום MCPyV מדגם virion לאחר ריכוז ultracentrifuge. לאחר להמחיש את הלהקה של virions MCPyV מרוכז הליבה של מעבר הצבע (מסומן על ידי חץ באיור 2B), נאספו 500 שברים µL, MCPyV qPCR בוצע לזהות שברים שיא. דוגמה qPCR ניתוח הנתונים מוצג באיור 2C. בניסויים אחרים, הדגימות נותחו גם עם המערב סופג באמצעות נוגדן האח מים של ארנב-נגד-MCPyV (משלימה איור 1). איור 3 מראה תמונות מוכתמים immunofluorescent של HDFs עם MCPyV. כדי לכמת באופן ידני תאים חיוביים, ספרנו לפחות שלוש תצוגות אקראי של תאים כ-300. אנו רואים תאים כי זה חיובי, VP1 חיובי, או הן LT VP1 חיובית להיות חיובי על זיהום MCPyV. בניסויים בתרשים 3, מעל 30% של תאים זה חיובי והם יותר מ-10% VP1 חיובי. הגנום MCPyV משוכפלת בתאים נגועים אותרו באמצעות נציבות האו ם לפליטים-DNA דגים (איור 4א) והן Immunofluorescent-HCR-DNA דגים (איור 4B). בעוד הדג HCR-DNA חושף הלוקליזציה של DNA MCPyV נוכח מפעל השכפול (foci) איור 4א, השיטות דגים Immunofluorescent-HCR-DNA מאפשר זיהוי סימולטני של MCPyV DNA וגם זה חלבון משותפת לוקליזציה -השכפול מרכזי (איור 4B). תמונות מן הדגים immunofluorescent-HCR-DNA הוכיח כי ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לחשוף את שיתוף לוקליזציה של ה-DNA הנגיפי ואת החלבון הנגיפי המשויך.

Figure 1
איור 1 . האדם fibroblasts עורי מבודד מן העורלה האנושי neonatal. תאים אנושיים עורי תרבותי בינוני DMEM/F12 בתוספת 10% FBS היו מוכתמים באמצעות נוגדנים נגד vimentin, קולגן, או קרטין 14 (K14). התאים היו counterstained גם עם דאפי. בר, 50 מיקרומטר. איור זה היה ממאמרו של S2 איור של ליו et al., 201624. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 . הפקה של virion MCPyV באמצעות recombinant גנום ויראלי. (א) א פלסמיד מפה של pR17b (MCPyV הגנום פלסמיד). (B) א תמונה ייצוגית של דוגמה virion MCPyV שנקטפו וטיהרו מעבר הדרגתי. החץ מסמן את הלהקה של virions MCPyV מרוכז הליבה של מעבר הצבע. (ג) העותק גנום ויראלי במספר כל שבר הדרגתיות הייתה לכמת באמצעות qPCR. ליבה של שברים הדרגתי (מספרים, ספירת מהחלק העליון של מעבר הצבע, יצוינו בתחתית הגרף). קווי שגיאה מייצגים שגיאת התקן של הממוצע (S.E.M.) של שלושה חזרה טכנית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 . האדם fibroblasts עורי תומכים חזקים MCPyV זיהום, שעתוק, שכפול. עורי fibroblasts מבודד מן העור האנושי טופלו על-MCPyV virions DMEM F12 בינוני המכיל EGF, bFGF, CHIR99021 ו- collagenase הרביעי במשך יומיים. לאחר שינוי לבינונית DMEM/F12 טריים המכיל 20% FBS לעוד שלושה ימים, תאים היו באמצעות נוגדנים המצוין שהוכתמו חיסונית, counterstained עם דאפי. רבים של תאים לא רק מאוד הביעו LT ו- VP1 אלא גם להראות foci שכפול MCPyV חזקים. איור זה הותאמה איור 3 של ליו ואח ', 201624. קנה המידה של בר, 50 מ' אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 . זיהוי של MCPyV תאים נגועים בטכניקות דגים. (א) תאי עורי אדם תרבותי ב DMEM/F12 המכיל סוג EGF, bFGF, CHIR99021 ו- collagenase הרביעי שטופלו MCPyV במשך יומיים. לאחר שינוי טריים DMEM/F12 המכיל FBS עוד 3 ימים, התאים היו נתונים ניתוח HCR-DNA דגים. התאים היו counterstained גם עם דאפי. (B) עורי תאים אנושיים תרבותי ב- EGF המכילות בינוני, bFGF, ו CHIR99021 היו גם ללא טיפול (מעושה) או שטופלו (נגוע) MCPyV כמתואר ב- (א). התאים היו נתונים חיסונית-דג באמצעות LT DNA נוגדן, MCPyV ספציפיים רגשים לפני counterstaining עם דאפי. הגששים HPV16 שימשו כפקד שלילי. סולם בר, 10 מ'. איור זה הותאמה איור 4 של ליו ואח ', 201624. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

בדיקה שם רצפים
MCPyV בדיקה 1 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA tgagctacctcactaaggagtggtttttatactgcagtttcccgcccttg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV בדיקה 2 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agaggcctcggaggctaggagccccaagcctctgccaacttgaaaaaaaa ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV בדיקה 3 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cattgactcatttcctggagaggcggagtttgactgataaacaaaacttt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
בדיקה MCPyV 4 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gatactgccttttttgctaattaagcctcttaagcctcagagtcctctct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
בדיקה MCPyV 5 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA aagcttctcctgtaagaatagcttccaaagttactcctgtggtggcactt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
בדיקה MCPyV 6 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ggatgttgccataacaattaggagcaatctccaaaagcttgcacagagcc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
בדיקה MCPyV 7 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gctcaggggaggaaagtgattcatcgcagaagagatcctcccaggtgcca ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
בדיקה MCPyV 8 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA aagcctgggacgctgagaaggacccatacccagaggaagagctctggctg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
בדיקה MCPyV 9 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agcttcgggaccccccaaattttcgctttcttgagaatggaggaggggtc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
בדיקה MCPyV 10 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cttttggctagaacagtgtctgcggcttgttggcaaatggttttctgaga ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV בדיקה 1 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cagctctgtgcataactgtggtaactttctgggtcgctcctgtgggtcct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV בדיקה 2 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA acaatattgtaatgggctctgtccggttctgcttgtccagctggaccatc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV בדיקה 3 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gtcagctatactgggtgtaagtccaaatgcagcaatacaccaatcgcaac ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
בדיקת HPV 4 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ctttggtatgggtcgcggcggggtggttggccaagtgctgcctaataatt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
בדיקת HPV 5 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ccatccattacatcccgtaccctcttccccattggtacctgcaggatcag ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC

טבלה 1: הגששים השתמשו במחקר.

Supplemental Figure 1
משלימה איור 1. הקרנת Iodixanol שברים הדרגתיות עבור MCPyV VP1. תאים הנגועים MCPyV היו lysed, נתון fractionation צבע Iodixanol. הליבה הדרגתיות שברים (מספרים, לספור מהתחתית של המילוי ההדרגתי בניסוי זה, יצוינו בחלק העליון של האיור) היו נתונים תספיג ניתוח כדי לזהות VP1. µL 10, דוגמאות כל שבר היו להתאים ל- 1 x עומס לצבוע עם 5% ריכוז סופי מרקפטואתנול, בקצרה מחומם ל 65 ° C. הדגימות היו מופרדים על ג'ל bis-טריס 4-12%, מחק על גבי ניטרוצלולוזה. סופג המערבי נערך ב- TBST עם חלב דל שומן יבש באמצעות 1:5000 בנסיוב מדולל האח מים של ארנב-נגד-MCPyV. נסיוב החיסון הינו זמין על פי בקשה. 50 kDa סטנדרטי (אשר מעביר באופן דומה kDa 47 MCPyV VP1 מונומר) מסומן בכוכבית. בתמונה המוצגת, הפחתת דגימה לא היה שלם, מקושר דיסולפידי VP1 multimers ניכרים. השימוש dithiothreitol ו/או דנטורציה שהטמפרטורות עלולה לגרום להפחתת בנוסף המינים מונומר VP1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטות המתוארות לעיל, לרבות בידוד של עורי fibroblasts מרקמות העור האנושי, הכנת virions MCPyV רקומביננטי, זיהום של תאים בתרבית, צביעת immunofluorescent, שיטה דגים רגישים הותאם מהטכנולוגיה נציבות האו ם לפליטים, אשר צריך לאפשר לחוקרים לנתח זיהום MCPyV27. אחד השלבים הקריטיים ביותר להשגת MCPyV זיהום במבחנה הוא הייצור של ההכנות כייל גבוה virion. באמצעות הפרוטוקול עבור הכנת רקומביננטי virions MCPyV המתוארים כאן, אנו להשיג titers ויראלי של 10 עותקים הגנום12 בכל מיליליטר הממס11,idoxanol12. כייל גבוה MCPyV בהכנות אלה אפשרה לנו לזהות HDFs כסוג תא עור רק ראשי עד כה שמופיע כדי לתמוך את הזיהום MCPyV מלאה מחזור24.

בידוד טריים fibroblasts עורי האנושי באמצעות פרוטוקול המתואר בכתב יד זה איפשר לנו לבקרת האיכות של התאים המשמשים MCPyV זיהום ניסוי על אחידות ממצאים על-פני תאים מבודדים מדגימות החולה שונים. כל אדם fibroblasts עורי מבודד מן העור neonatal וצריך להעריך נוכחות של ה-DNA MCPyV על ידי qPCR בהבטחת היעדר זיהום MCPyV לפני הטיפול עם virions MCPyV רקומביננטי. על מנת לקבל את יעילות מקסימלית של זיהום MCPyV, חיוני לשימוש אנושי fibroblasts עורי מבודד טריים מן העורלה האנושי neonatal כתמיכה fibroblasts מעבר גבוה יותר יעילות נמוכה יותר של זיהום MCPyV. עוד יותר, כאשר מבודדים במקביל מ דגימות עור מבוגר, fibroblasts מדגימות העור neonatal תמיכה הרבה יותר גבוה MCPyV זיהום יעילות24. לא בדקנו כל התאים זמינים מסחרית עבור זיהום MCPyV. עם זאת, אנו רואים שום סיבה ספציפית מסחרית שבודדו fibroblasts צריך להיות נחותים אחרים מאשר אם הם מעבר גבוה יותר בנקודת הקיפאון.

גם השתמשנו הפרוטוקול המתואר כאן כדי לבודד את עורי fibroblasts מבעלי חיים אחרים. לדוגמה, השתמשנו הפרוטוקול לבודד בהצלחה fibroblasts עורי העכבר (ס. מאסכאלאס), עכברוש (Rattus norvegicus), עץ הסוררת (Tupaia Belangeri), רזוס מקוק (מאכאכה mulatta)25. כפי שנצפתה תאים אנושיים, fibroblasts מבודד שימפנזים צעירים מותר זיהום MCPyV יעיל בהרבה בהשוואה חיות מבוגר25.

לעומת דגים מסורתיות, HCR-DNA הדג הוא פשוט, אך רגישה מאוד שיטה לגילוי הגנום הנגיפי24,27. מרכזי של שכפול MCPyV ניתן להבחין בקלות כמו מוקדים punctate ספציפי מאוד, עם מעט מאוד לא אותר בדגימות באותו שטופלו בדיקה ספציפית (איור 4) HPV24אות רקע ב הגרעינים של תאים נגועים. בעתיד, הגישה יכולה להיחקר לכן לזהות נמוך-שפע MCPyV דנ א מתנת עור אדם נגוע. זה גם יכול להיות מותאם כדי לפקח על וירוסים אחרים, ה-DNA. בשילוב עם immunofluorescent מכתים, חיסונית-הדגים מספק שיטה חזקה בו זמנית זיהוי ה-DNA הנגיפי מקודד חלבון נגיפי או מארח חלבונים המצויים לאותם התאים (איור 4). להשגת התוצאות אופטימום באמצעות פרוטוקולים המתוארת כאן, עדיף להשתמש דגימות טריות קבוע עבור צביעת immunofluorescent וניתוח HCR-DNA דגים. לניתוח HCR-DNA דגים, המחקרים וכל מגבר יש לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס ב aliquots קטן כדי להימנע חוזרות הקפאה והפשרה.

באמצעות תרבית תאים HDF פרוטוקול זיהום MCPyV, חרשנו את תנאי הגידול תא הכי תומכים כניסה, שעתוק ושכפול, MCPyV ב HDFs. גילינו כי טיפול HDFs עם גורמי גדילה, כגון EGF, bFGF, גירוי של מסלול איתות ונ ט לקדם באופן משמעותי זיהום MCPyV. יצירת פרופיל ביטוי גנטי מגלה כי, על גירוי עם אלה גורמי גדילה והפעלה של חגיגת איתות, מספר הגנים של משפחת מטריקס מטאלו-פרוטאינאז (MMP), כולל MMP1, 3, 7, 9, 10, 11 ו- 13, היו robustly המושרה. כי אנזימי MMP אלה מסוגלים משפילים חלבונים מטריצה חוץ-תאית, נדבר בהגיון כי הם עשויים לעורר זיהום MCPyV באמצעות שיבוש של מטריצה חוץ-תאית של התאים מארח. אכן, מטפלים HDFs עם collagenase סוג IV, חבר של משפחת MMP, robustly מעוררת MCPyV זיהום (איור 3)24. הוקרנו גם מערך של תרכובות, כולל מספר מעכבי קינאז שאושרו על-ידי ה-FDA, על ההשפעה המעכבת על זיהום MCPyV. גילינו את trametinib, מעכב MEK1 ו- MEK2, מעכב באופן דרמטי זיהום MCPyV24. אחרים עשויים להשתמש או לשנות את המערכת זיהום כפלטפורמה לגילוי סמים עבור מעכבי MCPyV להפחית את המטען הנגיפי MCPyV בחולים immunocompromised.

לסיכום, פרוטוקולים אלה להשגת זיהום MCPyV יעילים ביותר מספקים פלטפורמה התירי את הבנת מחזור זיהומיות MCPyV ו- MCPyV-induced מנגנונים oncogenic בהקשר של זיהום ויראלי. זו קבוצה של פרוטוקולים יכול להיות מיושם במחקרים עתידיים לחקור נוספים MCPyV-ולקוד האנושי סוגי תאים, התאים המקוריים של מפקד צוות משימה, באילו נזקים מקריים MCPyV זיהום עלולה להוביל להתפתחות הגידול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים רוצה להודות ד ר Meenhard Herlyn (מכון Wistar), ד ר מ. סלסט סימון (אוניברסיטת פנסילבניה) לאספקת ריאגנטים ותמיכה טכנית. אנו מודים גם אנשי מעבדות שלנו לדיון מועיל. עבודה זו נתמכה על ידי המענקים הלאומית המכונים לבריאות (NIH) (R01CA187718, R01CA148768 ו- R01CA142723), המענק תמיכה במרכז לסרטן (NCI P30 CA016520) NCI, ופרס וכפר פן (P30 AI 045008).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal calf serum HyClone SH30071.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X Thermo Fisher Scientific 11140050
GLUTAMAX I, 100X Thermo Fisher Scientific 35050061 L-Glutamine
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190136
0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25300-054
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11330-032
Recombinant Human EGF Protein, CF R&D systems 236-EG-200 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Cayman Chemical 13122 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Sigma SML1046 Store at -80 degree celsius
Collagenase type IV Thermo Fisher Scientific 17104019
Dispase II Roche 4942078001
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240-062 Protect from light
DMEM medium Thermo Fisher Scientific 11965084
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG Thermo Fisher Scientific A11032 Protect from light
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific A11034 Protect from light
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556 Protect from light
Paraformaldehyde Sigma P6148
anti-MCPyV LT (CM2B4) Santa Cruz sc-136172 Lot # B2717
MCV VP1 rabbit Rabbit polyclonal serum #10965 https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm
Hygromycin Roche 10843555001
Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant Corning 354060 Store at -80 degree celsius
Benzonase Nuclease Sigma E8263
Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase EPICENTRE E3101K
Probe hybridization buffer Molecular technologies
Probe wash buffer Molecular technologies
Amplification buffer Molecular technologies
Alexa 594-labeled hairpins Molecular technologies B4 Protect from light
Triton X-100 Sigma X100
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent Thermo Fisher Scientific P7581
BamHI-HF NEB R3136
Buffer PB Qiagen 19066
blue miniprep spin column Qiagen 27104
50mL Conical Centrifuge Tubes Corning 352070
T4 ligase NEB M0202T
MagicMark XP Thermo Fisher Scientific LC5602

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gjoerup, O., Chang, Y. Advances in Cancer Research. Vande Woude, G., Klein, G. 106, Academic Press. 1-51 (2010).
  2. Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science. 319, 1096-1100 (2008).
  3. Lemos, B., Nghiem, P. Merkel cell carcinoma: more deaths but still no pathway to blame. Journal of Investigative Dermatology. 127 (9), 2100-2103 (2007).
  4. Agelli, M., Clegg, L. X. Epidemiology of primary Merkel cell carcinoma in the United States. Journal of the American Academy of Dermatology. 49 (5), 832-841 (2003).
  5. Liu, W., MacDonald, M., You, J. Merkel cell polyomavirus infection and Merkel cell carcinoma. Current Opinion in Virology. 20, 20-27 (2016).
  6. Harrison, C. J., et al. Asymmetric Assembly of Merkel Cell Polyomavirus Large T-Antigen Origin Binding Domains at the Viral Origin. Journal of Molecular Biology. 409 (4), 529-542 (2011).
  7. Kwun, H. J., et al. The Minimum Replication Origin of Merkel Cell Polyomavirus Has a Unique Large T-Antigen Loading Architecture and Requires Small T-Antigen Expression for Optimal Replication. Journal of Virology. 83 (23), 12118-12128 (2009).
  8. Carter, J. J., et al. Identification of an overprinting gene in Merkel cell polyomavirus provides evolutionary insight into the birth of viral genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12744-12749 (2013).
  9. Seo, G. J., Chen, C. J., Sullivan, C. S. Merkel cell polyomavirus encodes a microRNA with the ability to autoregulate viral gene expression. Virology. 383 (2), 183-187 (2009).
  10. Theiss, J. M., et al. A Comprehensive Analysis of Replicating Merkel Cell Polyomavirus Genomes Delineates the Viral Transcription Program and Suggests a Role for mcv-miR-M1 in Episomal Persistence. PLOS Pathogens. 11 (7), 1004974 (2015).
  11. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Buck, C. B. Glycosaminoglycans and sialylated glycans sequentially facilitate Merkel cell polyomavirus infectious entry. PLOS Pathogens. 7 (7), 1002161 (2011).
  12. Schowalter, R. M., Reinhold, W. C., Buck, C. B. Entry Tropism of BK and Merkel Cell Polyomaviruses in Cell Culture. PLoS One. 7 (7), 42181 (2012).
  13. Schowalter, R. M., Buck, C. B. The Merkel cell polyomavirus minor capsid protein. PLOS Pathogens. 9 (8), 1003558 (2013).
  14. Houben, R., Schrama, D., Becker, J. C. Molecular pathogenesis of Merkel cell carcinoma. Experimental Dermatology. 18 (3), 193-198 (2009).
  15. Chang, Y., Moore, P. S. Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer. Annual Review of Pathology. 7, 123-144 (2012).
  16. Hodgson, N. C. Merkel cell carcinoma: Changing incidence trends. Journal of Surgical Oncology. 89 (1), 1-4 (2005).
  17. Tolstov, Y. L., et al. Human Merkel cell polyomavirus infection II. MCV is a common human infection that can be detected by conformational capsid epitope immunoassays. International Journal of Cancer. 125 (6), 1250-1256 (2009).
  18. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Pumphrey, K. A., Moyer, A. L., Buck, C. B. Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin. Cell Host & Microbe. 7 (6), 509-515 (2010).
  19. Foulongne, V., et al. Human Skin Microbiota: High Diversity of DNA Viruses Identified on the Human Skin by High Throughput Sequencing. PLoS One. 7 (6), 38499 (2012).
  20. Hopcraft, S. E., Damania, B. Tumour viruses and innate immunity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 372 (1732), (2017).
  21. Feng, H., et al. Cellular and viral factors regulating Merkel cell polyomavirus replication. PLoS One. 6 (7), 22468 (2011).
  22. Neumann, F., et al. Gene Expression and Particle Production by a Consensus Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) Genome. PLoS One. 6 (12), 29112 (2011).
  23. Tsang, S. H., Wang, X., Li, J., Buck, C. B., You, J. Host DNA damage response factors localize to merkel cell polyomavirus DNA replication sites to support efficient viral DNA replication. Journal of Virology. 88 (6), 3285-3297 (2014).
  24. Liu, W., et al. Identifying the Target Cells and Mechanisms of Merkel Cell Polyomavirus Infection. Cell Host & Microbe. 19 (6), 775-787 (2016).
  25. Liu, W., Krump, N. A., MacDonald, M., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts. Journal of Virology. 92 (4), (2018).
  26. Liu, W., et al. BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos. Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).
  27. Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
  28. Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R., Schiller, J. T. Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors. Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).
  29. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm (2018).
  30. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm (2018).
  31. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm (2018).

Tags

אימונולוגיה זיהום גיליון 144 מרקל תא polyomavirus בידוד fibroblasts עורי דלקת collagenase הרביעי CHIR99021 immunofluorescent מכתים זריחה הכלאה באתרו תגובת שרשרת DNA-הכלאה באתרו תמלול שכפול
Polyomavirus מרקל זיהום וזיהוי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, W., Krump, N. A., Buck, C. B.,… More

Liu, W., Krump, N. A., Buck, C. B., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection. J. Vis. Exp. (144), e58950, doi:10.3791/58950 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter