Summary
Det nuvarande protokollet beskriver en integrerad metod undersöka cancer cellmigration och invasion på en enda plattform i realtid, vilket ger ett enkelt reproducerbar och tidseffektivt alternativ att studera cell rörlighet och morfologi.
Abstract
Cancer cell rörlighet är avgörande för inledandet av metastaser. Utredning av cellers rörelser och invasiv kapacitet är därför av stor betydelse. Migration-analyser ger grundläggande insikt av cellers rörelser på 2D nivå, medan invasion analyser är mer fysiologiskt relevanta, härma invivo cancer cell dislodgment från originalwebbplatsen och invaderar genom extracellulärmatrix. Det nuvarande protokollet ger ett enskilt arbetsflöde för migration och invasion analyser. Tillsammans med den inbyggda automatisera mikroskopiska kameran för realtid HD-bilder och inbyggd analys modul ger forskare en tidseffektiv, enkel och reproducerbara experimentella alternativet. Detta protokoll innehåller också substitutioner för förbrukningsartiklar och alternativa analysmetoder för förbrukaren till välja från.
Introduction
Cellmigration och invasion är viktiga biologiska processer som möjliggör normala funktioner i människokroppen, såsom sårslutning, invasionen av moderkakan in i livmodern och bröstkörteln morfogenes1,2,3. Den mänskliga kroppen har exakta och strikt kontroll av dessa biologiska händelser; Det finns dock vissa undantag. Maligna tumörer, är exempelvis kunna undkomma detta skydd, uppvisar onormal spridning och invadera i närliggande vävnad, som kallas metastaser. Metastaser är den största orsaken till cancer-relaterad mortalitet4.
Bröstcancer är mest vanligen diagnostiseras cancer hos kvinnor, och är den näst högsta orsaken till cancerrelaterad död bland kvinnor i utvecklade länder över hela världen5. Bröstcancer har sitt ursprung från kabelrör eller lobules som består av ett eller flera lager av epitelceller. I det normala bröstet följa epitelceller varandra och basalmembranet genom membranproteiner såsom E-cadherin och integriner6. Dock invasiv bröstcancer cancerceller har förlorat sina polaritet och cell-cell adhesion, och klassiskt genomgå epitelial mesenkymala övergången (EMT) och få möjligheten att flytta. Efter extravasering, dessa celler flytta över den extracellulär matrixen (ECM) och ange blodkärlen eller lymfsystemet, följt sedan av intravasation och metastaserande tillväxt7. Förstå de mekanismer genom vilka detta inträffar är av stor betydelse, eftersom metastaser är den vanligaste orsaken till cancerrelaterad dödlighet och är nära besläktad med cancer cell migration/invasion. För att visualisera förflyttning av cancerceller, finns migration och invasion analyser perfekta modeller att studera 2D och 3D cell rörelse, respektive. Migrationen bedömer direkt förflyttning av cellerna medan invasion innebär interaktion med närmiljön och förmågan att försämra biologiska hinder. De två processerna är inte helt oberoende av varandra, eftersom migration är ett krav i invasionen.
Flera metoder har utvecklats för att studera migration och invasion. Som granskats av Kramer et al., migration analyser såsom sårläkning, genererar staket och mikro-carrier analyser en cellfria området för att tillåta celler att flytta in, bedömning av ändringen av området. transwell och kapillär analyser är baserade på antalet celler som rör sig mot ett lockmedel8. För invasionen analyser, en ECM-miljö har inrättas med ECM gel eller kollagen för anföra som exempel, och 3D-rörelse kan bedömas genom att övervaka invasion område, avstånd och cell räkningarna (e.g. transwell assay, näbbdjuret assay)8. En annan typ av invasion-analysen är att kombinera invasiva cellerna med icke-invasiv celler och bedöma uppförandet av invasiva cellerna (t.ex. sfäroid analyser). Ovanstående metoder har sina fördelar och nackdelar, och ett sätt som är lätt att tillvägagångssätt, lätt att upprepa, och att kombinera migration analysen och invasion analysen i ett liknande arbetsflöde är förmånliga i experimentell design.
Det här protokollet beskriver mätning av cellmigration och invasion med en live-cell imager. Det är en realtid cell övervakningssystem installeras i en vanlig cell kultur inkubator. Det tar högupplösta bilder enligt den inställda skanning intervaller och mätningar genom att tillämpa lämpliga masker de celler eller fluorescerande mål. Modulen för migration/invasion assay innehåller med hjälp av en 96-pin skrapverktyg, som är lämplig för att göra homogen skrap sår på en cell enskiktslager i en plattan med 96 brunnar. Mekanismen är baserat på in vitro-wound healing analyser, övervakning 2D cell rörelse på en plast eller belagda ytan. Invasion eller 3D-rörelse över en ytterligare ECM inom scratch sår kan också bedömas. Ett kort arbetsflöde illustreras i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Två cellinjer bör hanteras separat. Följande förfaranden skall tillämpas på en enda cell linje om de inte anges.
1. optimera Cell densiteten före såra
- Kultur vidhäftande celler i T75 cm2 vävnadsodling kolvar till ca 80% sammanflödet i fenol-röd Gratis Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS), 200 mM L-glutamin och 2 µg/mL insulin vid 37 ° C med 5% CO2 ( standard inkubationsförhållanden för de flesta cancer cellinjer, kultur formuleringar är cell linje-beroende).
- Ta bort kultur media genom pipettering av in i en avfallsbehållare. Överför med pipett 2 mL av pre värmde 0,1% trypsin-EDTA till kort skölj den cell enskiktslager och Pipettera. Lägg till ytterligare 2 mL 0,1% trypsin-EDTA och Placera kolven villkor som standard inkubation vid 37 ° C i 5 min.
- Knacka försiktigt på kolven för att säkerställa avlossning av cellerna och tillsätt sedan 10 mL före värmde kultur media att stoppa proteolytiska reaktionen.
- Överföra cellsuspensionen i en 15 mL centrifugrör och varva ner på 200 x g under 5 minuter i rumstemperatur (RT). Försiktigt bort supernatanten utan omskakning cellpelleten och blandas med en annan 10 mL före värmde kultur media.
2. räkna antalet celler med hjälp av en automatiserad Cell räknare (eller räkna metoder)
- Späd 200 µL återsuspenderad cellsuspension med 800 µL av 1 x Dulbeccos fosfat buffrad koksaltlösning (DPBS) i ett 1,5 mL centrifugrör.
- Bifoga en 60 µm cell count sensor till räknaren cell, nedtryckt växla och samköra cellsuspensionen spetsen. Långsamt släppa växla tills cellsuspensionen dras framgångsrikt in sensorn. Cellkoncentrationen visas i celler/mL.
- Beräkna antalet cell i 10 mL cellsuspension.
3. cell plätering
- Platta celler på en rad cell tätheter (40 000-90 000 celler per brunn) i tre exemplar i en plattan med 96 brunnar.
-
Placera plattan i kameran live-cell, och Schemalägg skanning varje 2 h för 24 h.
- Till programvaran, klicka på schema File från aktivitetslistan. I fönstret låda installationsprogrammet bestämma positionen för plattan, klicka på Lägg till fartyget och välj den platta typ. I fönstret Skanna installationsprogrammet välja eller redigera scan mönstret enligt inställningen för experimentell plattan och Ställ Skanningstyp som Standard.
- Högerklicka på tidslinjen och välj Ange intervaller. Ange Lägga File varje 2 h på ett 24-h-schema. Klicka på tillämpa.
4. Bestäm cellen Optimal Seeding densitet för Migration analysen
- Stop skanning efter 24 h, tillämpa sammanflödet bearbetning analysverktyget till HD-fas kontrast bilderna automatiskt insamlad och generera en cell spridning kurva mot tiden.
- Bestämma 3-6 representativa bilder och placera dem i en ny Bildsamling.
- Fastställa en ordentlig mask som Bearbetning Definition.
- Starta en analys jobb.
- Bestämma optimerad cell densiteten enligt sammanflödet mot tiden (cirka 100% sammanflödet inom 6-18 h beroende på när migreringen analysen påbörjas).
Obs: Hur lång tid det tar för att odla cellerna till sammanflödet varierar beroende på sådd utspädning.
5. dag 1 och 2: förberedelser för Migration och Invasion analyser
-
Dag 1, coat plattan för invasionen assay.
Obs: ECM gel ska alltid hanteras på is och med tips som har placerats i kylen över natten.- Späd ECM gel med iskall kultur media till 100 µg/mL och tillsätt 50 µL utspädda ECM gel/media i utvalda brunnar.
- Plats på plattan på standard inkubationsförhållanden över natten.
- Dag 2, aspirera försiktigt överskottet media. Platta celler med optimerad cell tätheter i 2 96 brunnar plattor designerat för migration analysen (obestruket) och invasion analysen (belagda) i exemplar efter avsnitten 1-3 på eftermiddagen (i det nuvarande protokollet, optimerad sådd densiteter för ZR75-1 och MDA-MB-231 var 90.000 per brunn och 50.000 per brunn, respektive).
- Placera tallrikar standard inkubationsförhållanden över natten.
6. dag 3: Såret Scratch
- Spraya och torka skrapverktyg och 2 tvätta båtar med 70% etanol innan du placerar dem i biosäkerhet skåp. Fyll tvätt båten 1 och 2 med exakt 45 mL steril (Ånghärdad) destillerat vatten och 70% etanol respektive.
- För sterilisering, placera den skrapverktyg pin kvarteret (överst) på tvätta båt 1 och 2 för 5 min varje.
-
Börja med migration assay plattan.
- Flytta plattan som innehåller celler från inkubatorn och kontrollera att inga brunnen är torr för att undvika skador av verktyget scratch. Ta bort plattan locket och sätt i bottenplattan hållaren av verktyget scratch och noggrant placera den övre delen på den bas del genom att styra dymlingar. Håll den svarta spaken, och under tiden lyft försiktigt den pin kvarteret. Luckor i varje brunn är vanligtvis synliga med blotta ögat och under mikroskopet.
- Snabbt blöt stiften i vatten; är tillräckligt för att rengöra verktyget scratch före repa invasion assay plattan om plattan setup är identisk. Annars, upprepa stegen sterilisering med sterilt destillerat vatten och sedan 70% etanol för 5 min varje.
- Tvätta de platta 1 eller 2 gånger med pre värmde kultur media att undvika fristående celler eller cell ark återansluta till brunnen.
- Tillsätt 100 µL av färska varma media i utsedda brunnar med eller utan behandlingar.
-
Ytterligare steg för invasionen assay.
- Placera invasion assay plattan vid 4 ° C i 5 min till temperera och sug noga ut kallt media.
- Späd ECM gel med iskall kultur media till 5 mg/mL, tillsätt 50 µL utspädda ECM gel i utsedda brunnar och placera under standard inkubation i 30 min.
- Tillsätt 100 µL av varmkörd media med eller utan provning föreningar.
- Placera plattan i live-cell imager och låt jämvikta i 5 min. Välj Typ av farkost som imagelock plåt. Ställa in Skanningstyp som Repa sår, välja eller redigera Skanna mönster enligt experimentella plattan installationen (1 bild per brunn och Bredbildsläge) och schemalägga 24-h upprepa genomsökning varje 1-2 h för 72 h tills såren har läkt.
- För att rengöra skrapverktyg, satte den övre pin kvarteret i varje av de följande lösningarna (45 mL tvätta båtar) för 5 min: 0,5% tvättmedel 1 (se Tabell för material), 1% tvättmedel 2 (se Tabell för material), sterilt destillerat vatten och 70% etanol. Placera verktyget scratch rygg onto dess basplatta och store i en dammfri miljö.
7. dataanalys
- Stoppa skanning utsedda plattan efter alla såren har läkt genom att välja experimentella plattan på Låda Setup och klicka på Ta bort fartyget.
- Samla 3-6 representativa bilder som spänner över en rad ljud procentsatser, inklusive bilder direkt efter att såret har gjorts, sår stängning av 10% och 50%.
- Att fastställa en korrekt bearbetning definition, Använd Segmentering justering, lämpliga rensning och filter för att tillämpa Scratch sår Mask och Sammanflödet Mask. Använda förhandsvisning ström/all för att Visa riktigheten av masker.
- Starta analys jobbet.
- Data kan analyseras inom programvaran eller exporteras för vidare analys. Tre mätvärden som tillhandahålls av programvaran kan användas för att utvärdera HD-fas bilderna: sår bredd (µm), sår sammanflödet (%) och relativa såret densitet (%). Jämförelser kommer att diskuteras i följande avsnitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna migration/invasion analys baseras på såret helande analysen, som utvärderar graden av de celler som flyttar in i en cell-fritt område skapad av de 96-pin skrapverktyg. Skillnaden mellan migration och invasion analyserna är att migration analyser åtgärd celler flytta på vävnad-kultur behandlas plast yta och invasion åtgärder cellerna rör sig över ECM gel.
Verktyget scratch är utformad för att göra konsekvent skrap sår i utsedda plattan och live-cell kameran är utformad för att ta realtid högupplösta bilder med scratch såren i mitten. De två breast cancercell linjer används i det nuvarande protokollet är ZR75-1 och MDA-MB-231, kategoriseras som luminal B och trippel negativ undertyper respektive9. De scratch sår som genereras av verktyget 96-pin scratch är vanligen mellan 700-900 µm men kan variera mellan olika cellinjer (figur 2).
För migration analysen, tre mätvärden finns: (1) såret bredd (µm) är den genomsnittliga avståndet mellan cell ark bredvid såret (figur 3). (2) såret sammanflödet (%) är sammanflödet inom det skadade området (figur 3). Perfekt första såret sammanflödet bör vara nära 0%. (3) relativ såret densitet (%) är en bakgrund-subtraheras algoritm [% relativ sår densitet = 100 * (w(t) - w(0)) / (c(t) - w(0)), t = vid tiden t, w = densiteten av såret regionen c = densitet cell regionen], mäta tätheten av såret regionen i förhållande till tätheten av regionen cell.
Tre stödberättigande mätvärden kan uppnås utifrån behov. Den relativa såret densitet och såret sammanflödet innebär hastigheten på cellerna upptar scratch sårområdet, och de överlappar varandra nästan i både cellinjer. Men de två cellinjer visade mycket olika wound healing förmågor, där avslutats (cirka 50 h) såret läkningsprocessen av MDA-MB-231 celler, ZR75-1 celler hade lindat om 50% täckning (de två mätvärdena ovan) och över 400 µm återstående sår bredd, indikerar en lägre migration förmåga av ZR75-1 celler (figur 4).
Migrera beteenden av de två celltyper var annorlunda och kan jämföras utifrån de inspelade bilderna. Lamellipodia (blebbing utskjutande delar) observerades i MDA-MB-231 celler framtill migration i början av migration, som var ett typiskt tecken på cytoskelettet ombildning, styra cell rörelse mot det cell-free region10 (figur 5 ). ZR75-1 celler visade inga tecken på cellmigration vid samma tid-punkt (figur 5).
Den metriska relativa sår densiteten rekommenderas av tillverkaren för cell invasion, eftersom det är en 3D analys och confluence-baserad analys inte är tillämplig. Inom 50 h var den relativa sår tätheten av MDA-MB-231 celler mättad (100%), medan den relativa sår tätheten av ZR75-1 celler inte förändrades över tiden, som visar mycket invasiva fenotypen av MDA-MB-231 celler och icke-invasivitet av ZR75-1 celler ( (Se figur 6).
MDA-MB-231 celler också agerat annorlunda medan invaderar genom ECM gel (figur 7). Jämfört med celler med blåsa framtill migration, visade invaderar celler en långsträckt morfologi med ledande utbuktningar.
Figur 1 : Arbetsflöde för migration och invasion analysen i det nuvarande protokollet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Prestanda av verktyget scratch på breast cancercell linjer ZR75-1 och MDA-MB-231 (övre panel) med uppmätta ursprungliga såret bredd och inledande såret sammanflödet (nedre panel). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Migration assay illustreras av bilder HD fas kontrast och blandat läge med masker i MDA-MB-231. Blå, scratch sår. gul, celler kring scratch sår. Rosa, celler som flyttade in i sår på 24 h efter scratch scratch. Skala barer = 300 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 : Jämförelse av tre algoritmer (såret bredd, relativa såret densitet och såret sammanflödet av bröst cancer cellinjer ZR75-1 (vänster) och MDA-MB-231 (höger). Alla experiment representerar medelvärdet av tre oberoende experiment, ± S.D. skala barer = 300 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5 : Migration framsidan av ZR75-1 och MDA-MB-231 celler 4 h efter scratch. Pilar, lamellipodia framtill migration. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Kvantifiering av invasion använder metriska sår Släktingtäthet (%) av bröst cancer cellinje ZR75-1 (vänster) och MDA-MB-231 (höger). Alla experiment representerar medelvärdet av tre oberoende experiment, ± S.D. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 7 : Olika cellulära egenskaper av MDA-MB-231 celler i migration (vänster) och invasion (höger). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8 : Ett exempel på en repa sår som inte kan analyseras av modulen integrerad migrering från en plattan med 96 brunnar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Migration och invasion är viktiga parametrar att bedöma rörligheten för cancerceller. Genom att använda verktyget 96-pin scratch, är det möjligt att genomföra sårläkning analyser i 2D och 3D samtidigt. Förutom att underlätta automatisk skanning, vilket ger en stabil cell kultur miljö med minsta avbrott, scratch analysen genomfördes med verktyget 96-pin scratch ger konsekvent skrap sår, möjliggör experiment som är mer robust och reproducerbara. Plattan med 96 brunnar formatet ger ytterligare alternativ antingen öka antalet cellinjer eller olika läkemedelsbehandlingar. Dessutom kan cellförändringar morfologi och dynamisk rörelse registreras för vidare analys.
Migration/invasion analysen är utformad för att vara lätt tillämpliga med några förutsättningar. En konfluenta cell enskiktslager är kritisk före sårande för att säkerställa en riktad cell rörelse mot klyftan. Det rekommenderas därför att optimera cell sådd densitet och en tidsram mellan 6-18 h är vanligtvis perfekt. Möjligheten för experimentell cellerna fästa till ytan och spridning kommer att påverka denna tidsram. Förlängd inkubation tid kan leda till stark cell-cell adhesion och generera krokiga bilateral cell fronter på grund av borttagning av cell ark. En biomatrix beläggning kommer att vara till hjälp med mindre självhäftande cellinjer, att minska väntetiden. Celler kan vara svalt innan såra. Svält timing är liknande skrapa timing, vilket är när sammanflödet når nästan 100%, och svält media och varaktighet är celltyp beroende. Kan också vara transfekterade celler, men sådd densitet har skall fastställas för en längre tid innan såra, med tanke på inkubationstid av transfection processen. Skadade kan uppnås inom några sekunder med hjälp av verktyget 96-pin scratch. Definierade medelstora pins garanterar en exakt migration/invasion startlinjen och avstånd. Ännu viktigare, måste de övre och nedre delarna väl överens att slutföra en fullständig repa över brunnar, så att de live-cell-avbildningar inte omfattar antingen terminal av scratch såren. Skrap sår lätt kan observeras genom blotta ögon på den konfluenta cell enskiktslager och snabbt kan kontrolleras i ljusa fält Mikroskop. Tvättning av brunnarna bör utföras omedelbart och försiktigt att undvika återfastsättning av av lossnar celler och borttagning av bilaterala celler. Om en tvätt räcker det att rensa upp önskad cell-fri zon, finns det inget behov av en ytterligare tvätta.
Migration-analyser kan slutföras genom att lägga till kultur media med eller utan behandlingar och är redo att skanna, medan några ytterligare steg för att beaktas för en invasion assay. Till skillnad från cellmigration tränger invaderande celler igenom ECM, som nära återspeglar i vivo cellers rörelser bättre. Rektorn för det nuvarande protokollet är att generera en ECM-omgiven miljö med hjälp av ECM gel. Celler är seedade på ECM gel-belagd brunnar och efter såra, ECM gel är skiktad på cellerna och scratch såret. När du hanterar ECM gel, är det bättre att hålla allting kallt att undvika gelation. Ojämnt fördelad ECM gel kan orsaka problem när fokusera mikroskopet. Trögflytande pågrund av ECM gel, är det möjligt att generera bubblor, men bubblorna kan lätt avlägsnas genom att aspirera 70% etanol genom en sprayflaska. För att generera fina men inte överdriven spray, helt enkelt skruva av locket av en sprayflaska och spraya bort överflödigt 70% etanol inom stråna pekar någon annanstans. Genom att spraya på ett avstånd ovanför och horisontella till plattan, är fina 70% etanol sprayen tillräcklig för att eliminera bubblorna.
Den första sökningen bör påbörjas så snart som möjligt efter sårbildning, för att fånga initiala cellen-gratis sår område, och detta är viktigt för att fastställa kriterierna för analys. Scan intervallen beror på celltyp av, som mer invasiva cellinjer har en snabbare såret stängning.
Denna migration/invasion ansökan är relativt enkelt, och med hjälp av modulen inbyggd analys, cellers rörelser kan visas i diagram kinetically med 3 mått: såret bredd, såret sammanflödet och relativa såret densiteten (figur 3). Alla tre kan användas för att bedöma migration. Såret bredd beskriver den genomsnittliga avståndet i µm när bilaterala cell arken flyttar relativt parallellt och är oberoende av den ursprungliga sår gränsen. Såret sammanflödet relativa såret densitet, tvärtom kräver initiala såret gränsen i beräkningen och beskriva sammanflödet inom sårområdet och cell densiteten i förhållande till området oskadad, respektive. För invasionen analysen rekommenderas relativa såret densitet, eftersom det beräknar sårområdet med hänvisning till de bilaterala cell arken. Läsare kan välja en som bäst motsvarar deras behov.
Denna skraplott såret migration/invasion analys kan vara bekvämt, men det kräver den 96-pin skrapverktyg, utsedda tallrikar och live-cell kameran med modulen integrerad migration/invasion att reproducera de typiska resultat som presenteras i detta protokoll, och dessa kan vara dyra. Kostnadseffektiv substitutioner som en platt botten 96 brunnar rundbottnade plattan kan användas och kan generera anständig skrap sår (inga data anges). Utförandet av verktyget scratch var dock inte lika bra som när den utsedda plattan användes, och vissa sår kunde inte plockas upp av genomsökningsläget (figur 8), således inte att korrekt definiera det ursprungliga sårområdet. Verktyget scratch kan dessutom användas för att skapa skrap sår, med analys antingen manuellt, genom bild bearbetningsprogram, eller använda andra slutpunkten visualisering och analysverktyg. De ger mer flexibilitet för att leta upp de ursprungliga sår, och därför är inte begränsade till de utsedda plattorna. Däremot, är migration/invasion analysen kombinerat med live-cell imaging i det nuvarande protokollet mindre tidskrävande och mindre fel-benägen. Detta kan vara särskilt användbart för experimentell konsekvens och ökad effektivitet.
Avslutningsvis är denna migration/invasion-analysen snabb, enkel och robust. Användare kan välja från vårt protokoll och andra utifrån deras behov och budget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Vi vill uppmärksamma våra finansieringsstöd av stiftelsen Bloomfield gruppen genom den Hunter Medical Research Institute (HMRI 13-02). X.Z stöds av en APA stipendium genom University of Newcastle och HCRA biomarkörer flaggskepp PhD stipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | Dilute to 2x in DPBS |
| Countess II FL Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Detergent 1 (Alconox) | Sigma-Aldrich | 242985 | 0.5% working concentration |
| Detergent 2 (Virkon S) | VetProduct DIRECT | 1% working concentration | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplimented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 μg/ml insulin |
| ECM Gel (matrigel) | Sigma-Aldrich | E6909 | Growth-factor reduced, phenol red free |
| Essen ImageLock 96-well plate, flat bottom | Essen | 4379 | |
| EVE Counting slides | BioTools | EVS-50 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| IncuCyte 96-well scratch wound cell invasion accessories | Essen | 4444 | Including CoolBox, 2x CoolSink |
| IncuCyte Cell migration kit | Essen | 4493 | Including the 96-well pin block, 2x wash boats and the software |
| IncuCyte ZOOM | Essen | Live cell analysis system | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | 19278-5ML | |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-091 | |
| Tissue culture flask, 75 cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 |
References
- Graham, C. H., Lala, P. K. Mechanisms of placental invasion of the uterus and their control. Biochemistry and Cell Biology. 70, 867-874 (1992).
- Affolter, M., Zeller, R., Caussinus, E. Tissue remodelling through branching morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 831-842 (2009).
- Brugues, A., et al. Forces driving epithelial wound healing. Nature Physics. 10, 683-690 (2014).
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van't Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5, 591-602 (2005).
- Breast Cancer: Estimated Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide in 2012. GLOBOCAN. , Available from: http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx (2012).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A.
- Scully, O. J., Bay, B. H., Yip, G., Yu, Y.
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752, 10-24 (2013).
- Holliday, D. L., Speirs, V. Choosing the right cell line for breast cancer research. Breast Cancer Research. 13, 215 (2011).
- Clark, A. G., Vignjevic, D. M. Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment. Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).
