Summary
De hier ingevoerde protocol kunnen karakterisering van de homing longcapaciteit van primaire menselijke lymfocyten in vivo inflammatoire voorwaarden. Pulmonaire infiltratie van adoptively overgedragen menselijke immune cellen in een muismodel van allergische ontsteking kan worden beeld en gekwantificeerd door licht vel fluorescentie microscopie van chemisch gewiste longweefsel.
Abstract
Overweldigend weefsel accumulatie van zeer geactiveerde immune cellen vertegenwoordigt van een kenmerk van verschillende chronische ontstekingsziekten en naar voren gekomen als een aantrekkelijke therapeutisch doel in de klinische behandeling van de betrokken patiënten. Om strategieën die gericht zijn op therapeutische regulering van pathologisch onevenwichtige weefsel infiltratie van pro-inflammatoire immune cellen verder te optimaliseren, zal het van bijzonder belang voor het bereiken van betere inzichten in de ziekte - en orgel-specifieke homing eigenschappen van perifere lymfocyten. Het hier beschreven experimentele protocol kunt controleren Long accumulatie van fluorescently geëtiketteerde en adoptively overgedragen menselijke lymfocyten in het kader van papaïne-geïnduceerde pulmonaire ontsteking. In tegenstelling tot de standaard in-vitrotests vaak gebruikt bij de analyse van immuun cel migratie en chemotaxis, de nu geïntroduceerde in vivo instelling rekening wordt gehouden met Long-specifieke aspecten van weefsel organisatie en de invloed van de inflammatoire complex scenario plaatsvinden in de lymfkliertest levend organisme. Bovendien, driedimensionale transversale licht vel fluorescentie microscopische beeldvorming voorziet niet alleen kwantitatieve gegevens over infiltreren immune cellen, maar ook ziet u het patroon van immuun cel localisatie binnen de ontstoken Long. We kunnen over het algemeen om een innovatieve techniek van grote waarde voor immunologische onderzoek op het gebied van chronische inflammatoire longziekten, die gemakkelijk kunnen worden toegepast door het volgen van het verstrekte stapsgewijze protocol.
Introduction
Klassieke inflammatoire aandoeningen van de longen, zoals allergische astma en chronische obstructieve longziekte (COPD), zijn bekend om te worden aangedreven door een toegenomen rekrutering van geactiveerde lymfocyten in het Long weefsel1,2. Lymfocyt-vrijgegeven cytokines (b.v., IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-gamma en TNF-α) chemotaxis van aangeboren en aanpassings immune cellen verder te bevorderen, veroorzaken fibrotische airway remodelleren of direct beschadigen de longen parenchym2. Tot nu toe zijn de onderliggende mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de pathologische accumulatie van lymfocyten in longweefsel nog niet volledig begrepen. In analogie met weefsel-selectieve T cel inprenting beschreven voor gut en huid homing, pulmonale dendritische cellen (DC's) kunnen uiteraard prime perifere T-cellen voor preferentiële Long infiltratie, ten minste gedeeltelijk via de inductie van CCR4 expressie op de oppervlak van lymfocyten3. Naast CCR4, worden luchtweg-infiltreren T-cellen ook gekenmerkt door een bijzonder verhoogde expressie van de chemokine receptoren CCR5- en CXCR3 in vergelijking met de T-cellen in het perifere bloed1,4,5. Algemene, bestaande gegevens in overeenstemming zijn met het idee dat Long homing van T lymfocyten onder fysiologische of inflammatoire voorwaarden een aantal verschillende chemokine receptoren en hun respectieve liganden omvat en cruciaal dus hangt een nauw samenwerking tussen aangeboren en aanpassings immune cellen1gecontroleerd. Vooral tijdens de eerste fase van pathogenen of allergeen blootstelling reageren cellen van het aangeboren immuunsysteem TLR stimulatie of IgE-bemiddelde cross-linking door de onmiddellijke vrijlating van verschillende chemoattractants, zoals LTB4, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 en PGD21,6,7. Als een schoolvoorbeeld, de interactie tussen PGD2 en de chemoattractant receptor CRTh2 is bekend om zijn van bijzonder belang voor chemotaxis Th2 cellen en zodoende verschenen zo veelbelovend therapeutisch doel in de klinische behandeling van astma. Inderdaad, patiënten met matige astma bleek een verbetering van de symptomen en een aanzienlijke stijging van het geforceerde expiratoire volume in één seconde (FEV1) na de behandeling met een selectieve antagonist van de CRTh2 ten opzichte van de placebo groep8 ,9. In een meer gevorderde staat van de inflammatoire respons kunnen reeds aangeworven T cellen pulmonaire lymfocyt accumulatie via de release van de IL-4 en IL-13 als krachtige prikkels voor pulmonaire DCs verder te versterken. Vervolgens reguleren deze myeloïde afkomstige aangeboren cellen up-de uitdrukking van CCL17 en CCL22 in een STAT6-afhankelijke wijze1,10,11. Hoewel de complexiteit van het beschreven scenario nog een compleet begrip van de T cel Long homing belemmert, biedt het een overvloed aan moleculaire targets voor een potentieel geoptimaliseerde therapeutische controle van inflammatoire of allergische longziekten. Daarom is er een dringende behoefte aan innoverende experimentele technieken, die kunnen verder verdiepen en onze kennis op het gebied van de T cel chemotaxis en longkanker homing aan te vullen.
Wijten aan het feit dat de Long homing van lymfocyten in het menselijk lichaam wordt beïnvloed door meerdere cellulaire en humorale fysieke parameters1, kunnen allermeest naar de bestaande experimentele methoden niet de gehele complexiteit van deze immunologische proces model. In plaats daarvan, vele standaardprotocollen voor de analyse van Long homing selectief richten op een specifiek aspect betrokken in de opeenvolging van lymfocyt aantrekken, hechting, migratie en behouden. Naast een zuiver beschrijvende bepaling van het mRNA of eiwit-expressiepatroon van verschijnsel en chemokinereceptoren op perifere of Long-infiltreren lymfocyten en de aanvullende meting voor respectieve chemokine levels in bloed, bronchoalveolar lavage (BAL) of pulmonaire weefsel12,13,14,15, gevestigde in vitro cel cultuur assays toestaan een functionele karakterisering van lymfocyt hechting of chemotaxis gedefinieerd op experimentele omstandigheden16,17,18. In principe controleren statische hechting van in vitro testen de bindingscapaciteit van gekweekte lymfocyten een endothelial enkelgelaagde of glas dia's bedekt met recombinant endothelial celadhesie-moleculen (bijv. MAdCAM-1, VCAM-1), terwijl de standaard in-vitro chemotaxis tests worden gewoonlijk toegepast om het vermogen van lymfocyten te migreren langs een chemokine verloop in een transwell systeem19kwantificeren. Zowel in vitro instellingen inschakelen een gecontroleerde aanpassing en modulatie van de experimentele omstandigheden, maar aan de andere kant geen belangrijke variabelen bekend aan kritisch gevolgen voor in vivo chemotaxis en hechting van lymfocyten. Voornamelijk statische cel cultuur testen negeren de invloed van shear krachten veroorzaakt door de permanente bloed stroom19 en de betrokkenheid van de omliggende immunologische milieu en interactie niet-lymfocyt immune cellen, potentieel te verwaarlozen beiden aanwezig in een levend organisme. Om deze beperkingen te overwinnen, de interpretatie van de resultaten verkregen in statische in-vitrotests voor chemotaxis of naleving moeten verdere validatie in dynamische wrijvingscoëfficiënt experimenten onder stroom voorwaarden20,21 en met in vivo modellen van inflammatoire orgel pathologie19. Inderdaad, belangrijke conclusies over de regulering van de T cel Long homing bij inflammatoire of allergische konden worden getrokken uit dierstudies analyseren genetisch gemodificeerde muizen in gedefinieerde modellen voor verschillende longziekten3, 22 , 23. kwantitatieve vergelijking van longkanker infiltreren lymfocyten tussen wildtype muizen en muizen met een tekort voor een specifiek gen van belang een gevestigde en in het algemeen gebruikte instrument is voor het bepalen van het effect van bijzondere cellulaire trajecten of receptoren van het ziekte-gedreven patroon van T cel distributie. Echter, in tegenstelling tot voordat besproken in vitro cel cultuur testen, een ontwerp van de studie op basis van klassieke diermodellen ontbreekt de mogelijkheid om analyseren en controleren van primaire menselijke T cellen rechtstreeks afgeleid van het bloed of de BAL van patiënten met een inflammatoire Long ziekte. Dus, het is nog steeds uitdagende functioneel valideren of een diagnostisch opgegeven longziekte vermag Impressum menselijke lymfocyten voor preferentiële Long tropisme en hoe ver klinische parameters kunnen van invloed zijn op dit scenario. Onlangs, een zeer elegante in vivo benadering werd geïntroduceerd in het kader van inflammatoire darmziekten (IBD), die was in staat om de meeste van deze beperkingen te overwinnen en opende nieuwe wegen voor geavanceerde translationeel onderzoek naar intestinale lymfocyt homing24 . Profiteren van protocollen voor op basis van oplosmiddel weefsel clearing gevolgd door transversale licht vel fluorescentie microscopie als een krachtige imaging tool, bleek het mogelijk om te visualiseren de infiltratie en de distributie van adoptively overgedragen menselijke T cellen in de darm van colitic immunodeficiëntie muizen24. In het bijzonder, deze experimentele instelling twee belangrijkste innovaties uitgevoerd: (1) primaire menselijke immune cellen kunnen worden geanalyseerd onder experimenteel gedefinieerde omstandigheden in een in vivo; (2) een eerder groot gebied van de zieke orgel (ongeveer 1,5 x 1,5 cm) kan worden beeld in hoge resolutie kwaliteit, gevolgd door 3D-reconstructie. Bovendien vastgesteld verscheidene recente studies met succes het gebruik van op basis van oplosmiddel weefsel clearing en licht vel fluorescentie microscopie als belangrijke instrumenten voor geavanceerde Long imaging25,26. Om te kunnen profiteren van deze technologische vooruitgang op het gebied van pulmonaire immunologie, we nu het systeem voor de analyse van longkanker homing aangenomen.
Het hier gepresenteerde protocol bestaat uit een stapsgewijze inleiding hoe te zuiveren en fluorescently label primaire menselijke T cellen voor overdracht in muizen met geïnduceerde pulmonaire ontsteking en, bovendien, beschrijft in detail het daaropvolgende proces van licht-blad fluorescentie microscopische beeldvorming, met inbegrip van de voorbereiding van het orgel en de beeldverwerking. Wij hopen over het geheel genomen ter ondersteuning van toekomstige translationeel studies op het gebied van inflammatoire of allergische longziekten door de invoering van een verfijnd, maar toch haalbaar, experimenteel model voor het toezicht op menselijke lymfocyt Long homing op omstandigheden in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimenten met dieren werden verricht overeenkomstig de protocollen die zijn goedgekeurd door de bevoegde plaatselijke autoriteiten in Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Duitsland). Muizen werden gehuisvest onder voorwaarden van specifieke pathogenen vrije. De collectie van menselijk bloed werd goedgekeurd door de lokale ethische Commissie en de institutionele review board van de University of Erlangen-Nuremberg. Elke patiënt gaf schriftelijke geïnformeerde toestemming.
1. het induceren van allergische Long ontsteking in muizen
Opmerking: Zoals beschreven in eerdere studies27, de volgende experimentele procedure kunt inducerende allergische luchtweg ontsteking in muizen en, dienovereenkomstig, activeert de accumulatie van aangeboren en adaptieve immuuncellen in het veld BAL. Het beschreven protocol is opgericht in C57BL/6J muizen, maar goedkeuring aan andere standaard ingeteelde stammen moet mogelijk zijn.
Zie Figuur 1A voor een overzicht van de in vivo experimentele procedure.
-
Anesthetize muizen door intraperitoneale injectie van ketamine/xylazine.
Opmerking: alleen gebruik maken van C57BL/6J muizen ouder dan 6 weken en met een lichaamsgewicht van ten minste 16 g.- Ketamine/xylazine oplossing in PBS (12 mg/mL ketamine; 1,6 mg/mL xylazine) voorbereiden en bepalen van het exacte lichaamsgewicht van muizen.
- Injecteer de eerste muis met 8 µL/g lichaamsgewicht van ketamine/xylazine oplossing intraperitoneally en diepe verdoving via het ontbreken van de poot snuifje reflex bevestigen voordat u stap 1.3.
- Vers bereiden 5 mg/mL papaïne in PBS. Langzaam Pipetteer 10 µL (50 µg) van de papaïne-oplossing in het neusgat. Zorgvuldig toezicht houden op de muis tot ontwaken.
- Herhaal stap 1.1 en 1.2 voor alle muizen opgenomen in het experiment. Stappen 1.1-1.3 op drie opeenvolgende dagen.
2. het zuiveren en Fluorescently label menselijke perifere bloed CD4+ T cellen
Opmerking: Proces cellen onder steriele omstandigheden.
-
18 mL volledig menselijk bloed van een perifere veneuze verzamelen. Densiteitgradiënt-Hypaque kleurovergang centrifugeren om te selecteren van de Fractie van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) uitvoeren
Opmerking: Verzameling en analyse van primaire menselijk materiaal moeten worden goedgekeurd door de lokale ethische instanties. Slechts een persoon met een adequate medische kwalificatie is toegestaan voor het verzamelen van bloed uit een perifere veneuze.- Verzamelen van bloed in ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA)-met monovettes (1,6 mg EDTA/mL bloed) om te voorkomen dat coagulatie.
Optioneel: Gebruik de buffy coat bloed, een bijproduct van bloeddonatie verrijkt met leukocyten, in plaats van volledige veneuze bloed. - Pipetteer bloed in een conische 50 mL-buis en verdunnen 1:2 in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Voeg voorzichtig 10 mL densiteitgradiënt-medium (dichtheid 1.077 g/mL) als een onderlaag onder het verdunde bloed. Centrifugeer het monster (800 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur zonder rem).
- Zorgvuldig verwijderen van de buis van de centrifuge en breng de interfase PBMC-bevattende in een nieuwe conische 50 mL-buis. Gooi de bovenste en de onderste laag. Vul de PBMC-bevattende buis met PBS en centrifuge (300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C). Verwijder het supernatant.
Opmerking: Optioneel, indien nodig, uitvoeren lysis van resterende erytrocyten. Voeg 3 mL lysisbuffermengsel van ammonium-chloride-kalium (ACS) (155 mM ammoniumchloride; 19 mM kalium waterstof carbonaat en 0.68 mM EDTA pH 7.27) aan de cel van de geresuspendeerde pellet en vortex het monster. Schud de buizen voor 3 min. Als u wilt verwijderen de ACS lysis-buffermengsel, voeg 40 mL PBS en centrifuge (300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C). Vloeistof wordt weggeworpen.
- Verzamelen van bloed in ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA)-met monovettes (1,6 mg EDTA/mL bloed) om te voorkomen dat coagulatie.
-
Zuiveren van CD4+ T cellen via CD4 microbeads.
Opmerking: In het algemeen, zijn er verschillende verdelers van magnetische microbeads voor zuivering van menselijke CD4+ cellen, die leiden vergelijkbare niveaus van zuiverheid van de cel tot moeten. Productkeuze moet worden gebaseerd op individuele voorkeuren. De volgende stappen van het protocol (2.2.2–2.2.7) zijn aangepast aan een gedefinieerde CD4 microbead product en scheiding van de respectieve kolommen zoals nader aangegeven in de Tabel van materialen. Enkele wijzigingen van het protocol kunnen nodig zijn in het geval dat een alternatieve CD4 microbead product is geselecteerd.- Resuspendeer de pellet PBMC in een minimum van 80 µL PBS met 0,5% foetale runderserum (FBS) en 2 mM EDTA (PBS/FBS/EDTA-buffer) per 107 PBMC. Gebruik een startende bevolking van ongeveer 30 x 106 PBMC om eind-up met ongeveer 3 x 106 tot en met 6 x 106 gezuiverde menselijke CD4+ T cellen.
- Voeg 20 µL van CD4 microbeads per 107 PBMC, meng zachtjes en incubeer gedurende 20 min bij 4 ° C. Vul de buis met PBS/FBS/EDTA-buffer (gekoeld tot 4 ° C) en centrifuge (300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C). Verwijder de bovendrijvende vloeistof.
- Plaats een scheiding-kolom in een magnetisch veld. Spoel de kolom met 3 mL PBS/FBS/EDTA-buffer. Resuspendeer de pellet cel in 500 µL van PBS/FBS/EDTA-buffer (gekoeld tot 4 ° C) en breng de celsuspensie op de gespoeld scheiding kolom geplaatst binnen een magnetisch veld.
- Spoel de scheiding kolom drie keer met 3 mL PBS/FBS/EDTA-buffer (gekoeld tot 4 ° C) en gooi het effluent.
- Verwijder de scheiding kolom uit het magnetisch veld en plaats het in een tube van 15 mL. Elueer CD4+ cel breuk in 5 mL PBS/FBS/EDTA-buffer met behulp van de zuiger.
- Vul de buis met PBS en centrifuge (300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C). Verwijder de bovendrijvende vloeistof. Herhaal deze stap wassen tweemaal.
- Bepaal het aantal leverde cellen door een standaard methode van keuze (bijvoorbeeld Neubauer kamer).
-
Label CD4+ T cellen met een fluorescerende cel proliferatie kleurstof.
- Resuspendeer CD4+ T cellen in PBS (maximaal 107 cellen/mL; gebruik geen minder dan 500 µL van PBS).
- Bereid een 6 µM-oplossing van een rood licht-prikkelbaar celproliferatie kleurstof (Zie Tabel van materialen) in PBS (vooraf opgewarmd tot kamertemperatuur). Meng deze oplossing 1:2 met de vóór grondig voorbereid celsuspensie en vortex (eindconcentratie is 3 µM).
- Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C (beschermd tegen licht). Daarna, Voeg vijf delen van RPMI medium met 10% FBS en incubeer gedurende 5 min op ijs (beschermd tegen licht).
- Wash label cellen drie keer in RPMI medium met 10% FBS (centrifuge op 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C). Resuspendeer gelabelde cellen in PBS, slaan op ijs en beschermen tegen licht tot gebruik.
Opmerking: Langdurige opslag van cellen (> 60 min) kunnen een negatieve invloed hebben op de overleving van de cel.
Optioneel: Bepalen van de zuiverheid van de CD4+ cel breuk en de werkzaamheid van de labeling procedure door stroom cytometry. Resuspendeer 0,5 x 106 tot en met 1 x 106 CD4+ cellen in 100 µL van de buffer (1% FBS, 2 mM EDTA in PBS) en het toevoegen van een anti-menselijke CD4 antilichaam gekoppeld met een fluorescente kleurstof van keuze. Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Voeg 1 mL buffer en centrifuge (300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C). Vloeistof wordt weggeworpen. Doorgaan met stroommeting cytometrische van het monster (representatief resultaat is afgebeeld in Figuur 1B, C).
3. adoptively overdracht menselijke CD4+ T cellen in de ontvangende Mmice papaïne-blootgesteld
Opmerking: Zie Figuur 1A voor een overzicht van de in vivo uitgevoerd experimentele procedure. Overdraagt cel één dag na de laatste intranasale toediening van papaïne.
- Aanpassen van de opschorting van fluorescently geëtiketteerde menselijke CD4+ T cellen (stap 2.3.4) tot een concentratie van 1 x 107 cellen/mL in PBS. Vul 100 µL van de celsuspensie in een 1 mL/30 G-spuit.
- Zorgvuldig plaatst de eerste papaïne-blootgesteld C57BL/6J muis (stappen 1.1-1.3) in een terughoudendheid apparaat voor staart-veneuze injectie. De bereid spuit (stap 3.1) gebruiken om het doorprikken van de ader van de staart en langzaam injecteren 100 µL van de celsuspensie met 1 x 106 label menselijke CD4+ cellen. Trek niet aan onmiddellijk de naald uit na injectie, maar wachten voor extra 5 seconden om te voorkomen dat de kwijting van de celsuspensie.
- Laat de muisknop los van het apparaat van terughoudendheid en ga verder met het volgende dier. Houd ten minste één papaïne-blootgesteld dier, dat geen overdracht met fluorescently geëtiketteerde cellen om te dienen als negatieve controle voor licht vel fluorescentie microscopie ondergaan.
4. Prepareer longweefsel licht vel fluorescentie microscopie
Opmerking: De volgende stappen worden uitgevoerd 3 h na overdracht van fluorescently label menselijke cellen (stap 3.2). De beschreven experimentele procedures, met inbegrip van oogsten van longweefsel, waren fixatie en op basis van oplosmiddel weefsel clearing aangepast momenteel beschreven protocollen24,€28.
- Offeren de muis kooldioxide (C02) inademing.
-
Perfuse de Long in situ met PBS met 5 mM EDTA.
- Open de thorax via snijden langs het borstbeen het hart bloot te stellen. Punctate het rechterventrikel met een 21 G canule verbonden met een katheter.
- Open het linkerventrikel door te snijden en daarbij laat de vloeistof van het bloed en perfusie om af te sluiten. Langzaam perfuse de longen met 20 mL ijskoud PBS met 5 mM EDTA via de katheter.
- Om uit te voeren in situ fixatie van de longen, kan niet de katheter verwijderen van het rechterventrikel. Langzaam perfuse de longen met 2 mL ijskoud 4% paraformaldehyde (PFA) opgelost in PBS. Het verwijderen van de katheter en de canule.
Opmerking: PFA gebaseerde in situ fixatie van longweefsel vertegenwoordigt een gevestigde techniek voor te bereiden op lymfkliertest longweefsel latere microscopische analyse29,30.
Let op: PFA is giftig en heeft onder een motorkap met zorg worden behandeld. -
Vul de Long met 0,75% agarose in situ.
- Bereiden van 0,75% agarose in PBS en het solide houden bij 50 ° C in een thermo-shaker tot gebruik. Verwijderen van de speekselklieren van de muis, knip de sternohyoid spier en bloot de luchtpijp door het glijden van een verlostang onder.
- Accentueren van de blootgestelde luchtpijp met een 30 G naald en vervang deze door een botte 30 G katheter ter voorkoming van verdere schade van de luchtpijp resulterend in ongewenste lekkage van agarose. Het zegel van de kruising tussen de ingevoegde katheter en de luchtpijp met behulp van een naald houder.
Optioneel: Combineer de hier beschreven procedure met BAL collectie geïnfiltreerde menselijke cellen in BAL zo onlangs beschreven in detail31 analyseren (Zie Figuur 2E voor representatieve resultaten). - Zorgvuldig vullen de luchtwegen met 0,75% agarose (afgekoeld tot lichaamstemperatuur) via de katheter tot volledige ontplooiing van de Long; wachten tot volledige stollen van het agarose. Verwijderen van de katheter en oogst zorgvuldig de Long in een verduisterde 2 mL-buis gevuld met 4% PFA.
- Voor extra fixatie Incubeer het monster in 4% PFA in PBS gedurende 2 uur bij 4 ° C onder continue rotatie (31 rpm opgelost).
- Uitdrogen van weefsel door het monster onder continue rotatie (31 rpm) vervolgens aan het broeden bij 4 ° C in 50% ethanol (pH 9), 70% ethanol (pH 9) en 100% ethanol; elke stap gedurende ten minste 4 uur. Aan het eind, uitvoeren van een tweede incubatie in vers 100% ethanol voor 4 uur.
- Uitvoeren op basis van oplosmiddel clearing van het weefsel met behulp van Ethylcinnamaat (ECi). Daarom, breng het monster in de ECi. Incubeer overnachting op kamertemperatuur (onder constante rotatie) totdat het weefsel verschijnt doorschijnend (Zie Figuur 1D voor representatieve beelden).
Opmerking: Monsters bewaard in ECi bij kamertemperatuur (beschermd tegen licht) zijn stabiele over enkele weken tot maanden.
5. Voer licht vel fluorescentie microscopie van Wwhole RattenUitrustingen Long kwab
Opmerking: Raadpleeg de Tabel van materialen voor meer informatie over de licht vel fluorescentie Microscoop en de bijbehorende software, waarop de volgende stappen zijn gebaseerd. Vergelijkbare systemen door andere fabrikanten, kunnen echter worden gebruikt alsmede met ontwikkelaar-specifieke wijzigingen van het volgende protocol. Voordat u begint, vertrouwd raken met de Microscoop-specifieke handleiding en de technische voorschriften door de verantwoordelijke persoon op site volgen.
-
De licht-blad Microscoop opgericht.
- Inschakelen van de licht-blad Microscoop en open de bijbehorende denkbaar software op de computer. Vul de monsterkamer met gefilterde ECi (100 µm filter) en zet het neer tussen de laserstralen.
- Gebruik een kleine daling van organisch oplosmiddel-stable lijm te houden van de longen naar de monsterhouder. Om de vereiste indringingsdiepte van de licht-bladen zo klein mogelijk, stel de Long kwab rechtop. Plaats vervolgens de monsterhouder in zijn kamer.
- Stel de brekingsindex van de doelstelling op 3.5 bij gebruik van ECi als reagens wissen.
-
Instellingen aanpassen op de licht-blad Microscoop om te detecteren van menselijke cellen in het kader van het gehele orgaan.
- Selecteer vereist lasers (filter voor meting > activeren checkboxes van vereiste lasers) en kies passende intensiteiten in de controle-software (laser transmissie control > intensiteit van gebruik van de schuifregelaar om te stellen laser > toepassing). Gebruik een golflengte van de excitatie van 488 nm (525/50 filter) te detecteren autofluorescent longweefsel en 640 nm (680/30 filter) te prikkelen van menselijke cellen aangeduid met een fluorophore die in het rode spectrum.
- Focus op het monster opgewonden op 488 nm en aan te passen de focus via de tool 'chromatische correctie' bij de golflengte van de excitatie van 640 nm (gebruikt u de schuifregelaar in te stellen van chromatische correctie > toepassen).
- Kies een passende zoomfactor; een lage vergroting-overzicht gebruiken (bijvoorbeeld 6.3 x) om te bepalen van de totale verdeling van gelabelde cellen binnen het longweefsel en vergrote afbeeldingen (b.v., 32 x) voor gedetailleerde lokalisatie.
- Selecteer de breedte van een blad gelijkmatig het ophelderen van het gehele orgaan of een specifieke sectie van belang (optica > gebruik de schuifregelaar breedte van het blad wilt instellen; meestal tussen 20-40%). Definiëren van het blad numerieke diafragma (nvt) met hogere nb scherpere beelden maken (optica > gebruik de schuifregelaar om het blad nb; voor een lymfkliertest Long kwab uitgebreid tot de fysiologische grootte een nb van 0,025% kan vaak worden gebruikt).
- Selecteer het aantal licht-bladen om te worden gebruikt onder 'geavanceerde meetbenadering instellingen'. In geval van bidirectionele verlichting, samenvoegen linker- en licht-bladen als een homogeen verlicht image wilt maken (Geavanceerde > samenvoegen lightsheets > Selecteer overvloeimodus > gebruik de schuifregelaars om te bepalen van de overlapping tussen beide licht-bladen).
Opmerking: Het wordt aanbevolen om te profiteren van de bidirectionele verlichting van het monster met drie licht-bladen elke.
Optioneel: Verder om afbeeldingskwaliteit te verhogen, gebruikt u de dynamische focus-bewerking. Hierdoor wordt de focus verplaatst in x-richting tijdens Beeldacquisitie. - Definiëren van start- en eindposities van de z-stack te worden getoetst en de stap-grootte ingesteld op 5 µm (xyz-tabel Z > scan bereik).
Opmerking: Begin- en eindposities van een z-stack, is afhankelijk van grootte en plaatsing van de Long kwab binnen de monsterkamer. Ongeveer 300 tot 800 z-stacks worden echter meestal verworven voor een één Long kwab (5 µm stap-grootte). - Sla bestanden met behulp van 'autosave instellingen' en begin de meting om te fotograferen. Na afwerking data-acquisitie, reinigen van de ECi-besmet monsterhouder en de kamer onder stromend water.
Opmerking: Dezelfde instellingen worden gebruikt om het imago van verschillende Long lobben die moeten achteraf worden vergeleken.
6. na image Processing en kwantificering van menselijke cellen longkanker-verzameld
Opmerking: Raadpleeg Tabel van materialen voor meer informatie over de post imaging-software voor 3D analyse, waarop de volgende stappen zijn gebaseerd. Alternatief na imaging software kan echter ook worden gebruikt.
- Laden van de eerste afbeelding van een z-stack (activeren de knop surpass, bestand > openen > Selecteer afbeelding) om te starten opening van alle andere beelden van de gekozen z-stack en hun automatische 3D-reconstructie.
- Om ervoor te zorgen de juiste weergave van x, y en z-afmetingen, controleren voxel maten en pas ze zo nodig (Bewerken > Eigenschappen afbeelding > grootte voxel handmatig invoeren). Voor de voxel grootte van z, voert u de gekozen stap-grootte tussen twee afbeeldingen (hier 5 µm).
- Elk kanaal in een afzonderlijke kleur weergeven (Bewerken > weergave aanpassing). Klik op elk kanaal een na de andere om een kleur van keuze te definiëren ( Figuur 2A, B, C, D het autofluorescence signaal is weergegeven in het grijs en label menselijke CD4+ cellen in het rood).
- Intensiteit, zwartniveau en contrast voor elk kanaal aanpassen (Bewerken > weergave aanpassing) met behulp van de driehoeken in de bars van het kanaal of exacte getallen invoeren in de montages van het kanaal. Gebruiken voor aanpassing van de intensiteit, de rechthoekige driehoek. Voor zwarte niveau aanpassing, gebruik van het linker driehoekje en voor de aanpassing van contrast, gebruik de middelste driehoek.
Opmerking: Gebruik de Long is afgeleid van de controle muis zonder cel overdracht (stap 3.3) om te differentiëren tussen specifieke menselijke cel-afgeleide signalen en aspecifieke achtergrond. -
Te kwantificeren gelabelde cellen binnen het pulmonaire weefsel gebruiken 'toevoegen nieuwe spots' in de knoppenbalk en kies 'automatische creatie overslaan, handmatig bewerken' voor de handmatige cel tellen.
Opmerking: alternatief, gebruiken de automatische cel tellen hulpmiddel onder 'spots'. Handmatig tellen maakt echter onderscheid maken tussen specifieke en aspecifieke signalen nauwkeuriger.- Om de accumulatie van menselijke cellen van verschillende monsters met elkaar vergelijken, een Long kubus te definiëren met een specifieke volume met behulp van de 3D snijgereedschap (Bewerken > Uitsnijden 3D) (hier 813 μm x 813 μm x 1,000 μm).
- Tellen geaccumuleerde cellen selecteren het 640 nm-kanaal en het definiëren van een 'RADIUS-schaal' van 10 µm. Klik op 'bewerken', controleren 'Selecteer' in het menu van de aanwijzer en Markeer elke cel met een stip via shift + klikken met de linker mouse button. Het totale aantal getelde cellen worden weergegeven in de statistieken te vinden.
Opmerking: Het is sterk aanbevolen om het tellen van verschillende kubussen per Long kwab (hier vijf) voor de betrouwbaarheid van de resultaten waarborgen en compenseren voor de selectie van de wetenschapper-afhankelijk van het volume van de getelde Long (kwantificering strategie en vertegenwoordiger resultaten afgebeeld in Figuur 2D).
- Vastleggen van een beeld met behulp van het gereedschap 'momentopname' en/of nemen van een video met behulp van het hulpprogramma 'animatie'. Aangepast bestanden als .ims-bestanden opslaan (bestand > exporteren).
Opmerking: Voor representatieve doeleinden, weergeven of verbergen van het frame door te controleren of het vinkje van het frame in de werkbalk. Daarnaast weergave beelden als maximale intensiteit projectie (MIP) (werkbalk > volume > modus > MIP controleren) of gebruik de 'oppervlakte mode' (werkbalk > toevoegen van nieuwe oppervlakken). De 'oppervlakte mode' moet afzonderlijk worden geactiveerd voor elk kanaal wil weefsel architectuur en/of cel organen (representatieve beelden worden weergegeven in Figuur 2C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het gepresenteerde protocol beschrijft een experimentele muismodel, waarmee toezicht en kwantificeren van de accumulatie van adoptively overgedragen menselijke T lymfocyten in de longen via licht-blad fluorescentie microscopie. Figuur 1 A biedt een schematisch overzicht van de in vivo stappen van het experimentele schema. Met het oog op een betrouwbare resultaten, het is van wezenlijk belang om een goede kwaliteit van de afgelegen en fluorescently label menselijke CD4+ T cellen, die daarna worden overgebracht in muizen. Als representatief afgebeeld in Figuur 1B, C, de hierboven beschreven procedure voor microbead gebaseerde cel verrijking en latere fluorescentie-labeling meestal resultaten in een stroom cytometrically bepaald CD4+ T cel zuiverheid > 95% en succesvolle fluorescentie-labelling van alle CD4+ T cellen. De diepte van het kwaliteits- en penetratie van licht vel fluorescentie microscopie is kritisch afhankelijk van een juiste rang clearing-weefsel. Zoals aangetoond in Figuur 1D, kon de hier toegepaste protocol voor ECi gebaseerde weefsel wissen garanderen een hoge mate van transparantie van de orgel, die aangeeft dat een succesvolle brekingsindex overeenkomende. Tot slot blijkt een representatief eindresultaat van het beschreven experimentele protocol in de vorm van volledig verwerkte licht vel fluorescentie microscopie afbeeldingen in Figuur 2B, C, D en de Aanvullende Video. Het signaal van de autofluorescent (weergegeven in het grijs) biedt een nuttig hulpmiddel voor imaging-de anatomische structuur van de longen. Het rood signaal vertegenwoordigt Long geaccumuleerde menselijke CD4+ T cellen. Kwantificering van licht vel fluorescentie microscopie imaging kunt bepalen van het totale aantal Long geaccumuleerde menselijke CD4+ T cellen per afgebakende gebied van ontstoken longweefsel. Een strategie voor de kwantificering van menselijke cel infiltratie wordt geïllustreerd in Figuur 2E. De detectie van de cytometrische (optioneel) stroom van fluorescently label cellen binnen de BAL van geadresseerden muizen, zoals afgebeeld in Figuur 2F, kan worden gebruikt als een aanvullende techniek ter bevestiging van de succesvolle weefsel migratie van adoptively overgedragen CD4+ T cellen. Bovendien, de voorkeur van overgedragen menselijke T-cellen voor selectieve accumulatie in ontstoken longweefsel in het hier experimentele instelling beschreven werd verder ondersteund door het feit dat menselijke CD4+ T cellen kon niet worden opgehaald in de intestinale mucosa van geadresseerden dieren als afgebeeld in Figuur 2B (rechtervenster).
Figuur 1 : Schematisch overzicht van de in vivo experimentele workflow. (A) allergische Long ontsteking was geïnduceerd in muizen C57BL/6J inademing van papaïne (50 µg/muis) op drie opeenvolgende dagen (d0, d1 en d2). De volgende dag (d3), vers geïsoleerd en fluorescently label menselijke CD4+ T cellen werden adoptively overgedragen in muizen via staart veneuze injectie. Na nog eens drie uur, werden muizen opgeofferd, gevolgd door ter plaatse perfusie en fixatie van de longen. Ten slotte, longen werden transplanteren en verder geanalyseerd ex vivo door licht vel fluorescentie microscopie. BAL kan desgewenst worden verzameld voordat Long explantatie uitvoeren uitgebreid ex vivo analyses van succesvol extravasated en gemigreerde menselijke cellen. (B) vertegenwoordiger histogram bevestiging van de zuiverheid van de geïsoleerde CD4+ T cel breuk zoals bepaald door de stroom cytometry. Cellen gekleurd door een anti-menselijke CD4 antilichaam of isotype-besturingselement worden weergegeven in zwart en grijs, respectievelijk. (C) vertegenwoordiger histogram bevestiging van de werkzaamheid van de fluorescentie-etikettering van menselijke CD4+ cellen vóór adoptief overdracht. (D) representatieve beelden van een geperfundeerd lymfkliertest Long kwab vóór en na verrekening met de ECi. FI, intensiteit van de fluorescentie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Representatieve analyse van de pulmonaire accumulatie van menselijke CD4+ cellen in het kader van Long ontsteking in vivo. Menselijke CD4+ cellen werden geïsoleerd uit perifere bloed met behulp van dichtheid kleurovergang centrifugeren, gevolgd door een magnetische microbead gebaseerde zuivering. Menselijke CD4+ cellen werden aangeduid met behulp van een rood licht-prikkelbaar cel proliferatie kleurstof en intraveneus geïnjecteerd in C57BL/6J muizen papaïne-blootgesteld. Na drie uur, werden muizen opgeofferd om te verzamelen en het longweefsel via licht-blad fluorescentie microscopie verder te analyseren. (A) representatieve overzicht van een 3D reconstructie van lymfkliertest, papaïne-blootgesteld longweefsel (grijs) drie uur na intraveneuze injectie van gelabelde menselijke CD4+ cellen (rood) zoals geregistreerd door licht vel fluorescentie microscopie. (B) longweefsel van een geadresseerde muis drie uur na overdracht van de cel weergegeven als overzicht of hoge vergroting segment (linkerdeel). Ontvangen van menselijke CD4+ cellen kunnen worden gevisualiseerd als rode signalen en werden ofwel afgebeeld in overlay met het signaal van de autofluorescence van longweefsel of als één-kanaals afbeelding. Om te bevestigen de specificiteit van het ontdekte signaal, controle longweefsel zonder intraveneuze cel overdracht diende als negatieve controle (middelste deelvenster). In tegenstelling tot het longweefsel, geen gelabelde menselijke CD4+ cellen (rood) kon worden opgespoord in het ileum van de dezelfde geadresseerde muis (rechtervenster). (C) Post beeldverwerking analyse van enkele segmenten van longweefsel evenals generatie 3D-reconstructies van het hele orgel segment kunt dat kan worden hetzij vertegenwoordigd als maximale intensiteit projectie (MIP) of in oppervlakte-modus. Representatieve beelden worden afgebeeld. (D) kwantificering strategie wordt geïllustreerd exemplarisch in de dezelfde Long zoals reeds afgebeeld in Figuur 2. Gedefinieerde kubussen van het geanalyseerde Long segment werden geselecteerd en het aantal menselijke CD4+ cellen (rood) werd gekwantificeerd voor elke kubus. Resultaten van een later uitgevoerde kwantificering (evenementen/813 µm x 813 µm x 1,000 µm kubus) worden aangeduid als gemiddelde ± SEM. (E) als extra optie, stroom cytometrische detectie van fluorescently geëtiketteerde menselijke T-cellen in de BAL van geadresseerden dieren kan worden uitgevoerd ter bevestiging van de succesvolle weefsel migratie van geaccumuleerde menselijke CD4+ T cellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende Video: Vertegenwoordiger videofragment weergegeven: geaccumuleerde menselijke CD4+ cellen binnen de lymfkliertest longweefsel. 3D reconstructie van het weergeven van de lymfkliertest Long geaccumuleerde menselijke CD4+ cellen (rood) binnen de context van het pulmonaire weefsel (grijs) drie uur na intraveneuze injectie in de ader van de staart. Afbeeldingen worden weergegeven als MIP, in het begin en in de oppervlakte modus in het einde. Beelden werden verworven via licht-blad fluorescentie microscopie en verwerkt door na imaging software voor 3D analyse. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven experimentele instelling biedt de mogelijkheid om te controleren de homing longcapaciteit van primaire menselijke immune cellen onder omstandigheden van in vivo inflammatoire en daardoor relevantly aanvulling klassiek uitgevoerd in vitro hechting en chemotaxis testen. Om te houden met de kenmerken van de specifieke anatomische orgel van de longen, belangrijke aspecten van immuun cel homing (inclusief chemotaxis en cel distributie binnen de doelgroep orgel) evenals de klinische relevantie en de overdraagbaarheid van verworven data, namen we voordeel van de drie technische aspecten: (1) de analyse van primaire menselijke cellen binnen een levend lymfkliertest organisme; (2) de papaïne-gemedieerde inductie van pulmonaire ontsteking; en (3) licht vel fluorescentie microscopie van gewiste longweefsel.
Hoewel functionele studies van adoptively menselijke overgedragen kunnen immune cellen binnen een lymfkliertest levend organisme worden beperkt in sommige aspecten als gevolg van potentieel relevante onverenigbaarheden in receptor-ligand-interacties tussen muizen en mannen, het algemene concept van gehumaniseerd Muismodellen is opgezet met succes als een experimentele belangrijk instrument op het gebied van translationeel geneeskunde tijdens de laatste decennia24,32,33,34,35 . In vergelijking met klassieke diermodellen, bieden studies in gehumaniseerd muizen het voordeel rechtstreeks analyseren patiënt afkomstige immuuncellen in een in vivo scenario en daardoor te identificeren van functionele wijzigingen bedrukt door de ziekte32, 36,,37. Met betrekking tot de relevantie van mogelijke incongruenties tussen receptoren op het oppervlak van menselijke immune cellen en hun respectieve lymfkliertest liganden gedefinieerd of vice versa, voormalige studies al aangegeven dat de mens CD4+ T cellen zijn in staat om efficiënt te communiceren met de lymfkliertest celadhesie-moleculen MAdCAM-1 en VCAM-1, die cruciale liganden voor integrine-gemedieerde lymfocyt homing32vertegenwoordigen. Dienovereenkomstig, migratie van intravascularly overgedragen menselijke immune cellen in lymfkliertest gut weefsel kan met succes worden geblokkeerd in vivo door behandeling met de klinisch gebruikte α4β7 integrine antilichaam vedolizumab32. Echter, zelfs in geval dat een compleet mens/RattenUitrustingen mismatch, kan worden weergegeven door een specifieke receptor-ligand-interactie van belang het vermoedelijk zullen kunnen deze beperking ondervangen door genetische manipulatie en, bijvoorbeeld, transgene overexpressie van het respectieve menselijke ligand, groeifactor, cytokine of receptor binnen de lymfkliertest organisme33,35.
Als een significante invloed van chronische ontsteking op de lokale secretie van chemokines, is het endotheel uitdrukking van celadhesie-moleculen en de daaropvolgende accumulatie van lymfocyten beschreven in talloze publicaties38,39 ,40, de keuze van een geschikte experimentele model van pulmonaire ontsteking vertegenwoordigd een kritieke stap terwijl tot oprichting van de bovenstaande beschreven protocol en kan worden aangepast afhankelijk van de klinische context van elke afzonderlijke studie. De hier geselecteerde instelling van papaïne-geïnduceerde allergische Long ontsteking een goed beschreven experimentele model, dat gebaseerd is op de capaciteit van het lokaal beheerde cysteïne protease papaïne te irriteren het epitheel van de luchtwegen en de trigger vertegenwoordigt de latere vrijlating van alarmins27,41,42. Interessant, is toevallige expositie aan papaïne bekend dat het veroorzaken van astma ontwikkeling bij de mens als goed43. Afhankelijk van de geïnhaleerde dosis papaïne, blootgestelde muizen Toon een accumulatie van aangeboren en aanpassings immune cellen en verhoogde niveaus van type 2 cytokines in de Long-27. Terwijl de dosis escalatie bleek te leiden tot een uitbreiding van het luchtruim (klassieke histologische verschijnsel van COPD) en een vernietiging van het bloedvat muren met latere bloeding, ging matige dosering schema's samen met een prominente pulmonale eosinofilie en dus een belangrijk histologische kenmerk van menselijke astma27geïmiteerd. Als ons doel was om dit experimenteel model gebruiken voor het genereren van een inflammatoire context voor de analyse van pulmonaire immuun cel homing, we zorgvuldig geprobeerd om papaïne-veroorzaakte schade van bloedvaten, die anders zouden kunnen in een unphysiological resulteren te voorkomen extravasation van menselijke immune cellen als gevolg van verstoorde endothelial integriteit. Dienovereenkomstig, we een intermediaire dosis van 50 µg papaïne per muis per dag in het hierboven beschreven protocol geselecteerd. Hoewel ontwikkeling van papaïne-geïnduceerde luchtweg ontsteking treedt ook op bij gebrek aan B en T-lymfocyten, Long infiltreren adaptieve immuuncellen is bekend dat ze sterk van invloed op het verloop van de ziekte27,42. Bijvoorbeeld, kon regulatoire T-cellen worden geïdentificeerd als krachtige regulatoren van papaïne-geïnduceerde airway eosinofilie27. In perspectief, de actieve betrokkenheid van pulmonaire lymfocyten in de inflammatoire pathogenese van muizen papaïne-blootgesteld impliceert dat het hierboven beschreven protocol bovendien inschakelen kan voor het analyseren van de functionele capaciteit van adoptively overgebracht en succesvol Long-geaccumuleerde menselijke immune cellen te moduleren Long pathologie (bijvoorbeeld via stroom cytometrische acquisitie van eosinofiele graven in BAL). Bovendien, een bovendien uitgevoerd intranasale toediening van geselecteerde ziekte-relevante menselijke chemokines net vóór intravasculaire cel overdracht mogelijk voor het analyseren van de impact van deze humorale bemiddelaars op de Long homing proces van verschillende menselijke immuun cel populaties in een in vivo setting. Ook kan het effect van remmers op de Long homing proces en vervolgens op inflammatoire Long pathologie worden bestudeerd.
Een bijzonder voordeel voor het hier geïntroduceerde experimentele procedure is het nauwkeurige volgen en lokalisatie van longkanker infiltreren menselijke immune cellen door de high-end grafische kwaliteit van licht vel fluorescentie microscopie. Recente studies al aangetoond dat de techniek van licht vel fluorescentie microscopie vertegenwoordigt een waardevol experimentele instrument voor analyse van intestinale immuun cel homing in translationeel onderzoek van IBD en vermag de belangrijkste beperkingen van conventionele immunofluorescentie microscopie en stroom cytometry24,32. Terwijl analyses op basis van conventionele microscopie meestal beperkt tot een zeer klein zijn en mogelijk niet representatief gedeelte van het orgel en stroom cytometry geen rekening de aspect van weefsel organisatie helemaal, licht vel neemt fluorescentie microscopie van chemisch gewiste weefsel kan een verhoogde indringingsdiepte zonder groot verlies van resolutie en dus kan een 3D reconstructie van vrij grote orgel secties (max. 1,5 x 1,5 cm)24,28,44. Zeker, afhankelijk de kwaliteit en de geldigheid van verworven 3D-reconstructies kritisch van de prestaties van weefsel klaring. De instelling van de hier beschreven, we een enigszins goedgekeurde versie van het onlangs gepubliceerde protocol voor ECi gebaseerde weefsel clearing44opgenomen. In vergelijking met andere gevestigde strategieën voor op basis van oplosmiddel weefsel clearing26,combineert45,46, de ECi-gebaseerd protocol de voordelen van uitstekende clearing eigenschappen, lage toxiciteit met gebruikte reagentia en een matige tijd vereiste44. Als de capaciteit van de standaard licht vel fluorescentie microscopie te lossen mooiste weefsel structuren zoals alveolaire haarvaten is nog steeds beperkt, zelfs onder optimale voorwaarden28, clearing een of andere manier mogelijk moeilijk om betrouwbaar onderscheid te tussen intravasculaire en al extravasated immuuncellen. De opneming van een extra standaard fluorescentie gebaseerde bloedvat vlekken in de hier beschreven protocol zou hoogstwaarschijnlijk niet zitten kundig voor volledig deze beperking ondervangen. Dus, studies met een nadruk op het gedrag van immuun cellen binnen de pulmonaire microcirculatie of hun diapedesis kunnen bij voorkeur rekening houden met een onlangs gepubliceerde en zeer elegante protocol voor intravital Long beeldvorming op basis van 2-foton microscopie47. In deze experimentele setting, een thoracale venster werd ingeplant narcose en geventileerde muizen, waardoor de gestabiliseerde Long kan worden gecontroleerd door een resonante-scannen 2-foton microscopie module, waardoor hoge resolutie imaging gedurende de respiratoire cyclus op bewaarde ventilatie en perfusie47,48. Deze techniek is met succes toegepast in diverse studies en was in staat om te visualiseren bijvoorbeeld intrapulmonary bloedplaatjes biogenese en de ingang van de Long van circulerende tumor cellen49,50. Echter, naast de eis van de geavanceerde instrumentale apparatuur (bijvoorbeeld muis-ventilatiesysteem) en de noodzaak van uitgebreide invasieve manipulaties in levende dieren (implantatie van de thoracale venster en intravital microscopie), de belangrijkste beperking van deze live long is microscopie systeem de penetratie beperkt z-as. De uitgevoerde Long oppervlakte beeldvorming kunt u alleen de buitenste 100 µm van subpleural Long weefsel47,48analyseren. Afhankelijk van de wetenschappelijke context, zou het een waardevolle optie 2-foton microscopie van de transplanteren longen als een aanvullende procedure om in te voeren het hierboven beschreven protocol. Analyseren van de dezelfde Long eerst door 2-foton microscopie en daarna licht vel fluorescentie microscopie kan vertegenwoordigen een strategie om een kwantitatief overzicht van de distributie en lokalisatie van menselijke immune cellen binnen de lymfkliertest Long (te verkrijgen licht vel fluorescentie microscopie) en, tegelijkertijd, krijgen meer gedetailleerde inzicht in cellulaire of microvasculaire processen (2-foton microscopie). Inderdaad, 2-foton microscopie van lymfkliertest tracheale explantaten vertegenwoordigt een gevestigde imaging gereedschap voor het analyseren van immuun cel gedrag in het kader van experimenteel geïnduceerde Long ontsteking51,52. In plaats van het visualiseren van kleine pulmonaire capillairen, kan de succesvolle extravasation en Long weefsel infiltratie van de overgedragen menselijke T cellen in ons experimenteel model ook worden bewezen door opsporen van fluorescently geëtiketteerde menselijke cellen binnen de BAL van ontvanger dieren via stroom cytometry als exemplarisch afgebeeld in Figuur 2E. In het algemeen, vertegenwoordigen analyses van de cellulaire BAL compartiment een gevestigde methode te karakteriseren de pulmonaire immuun cel instroom in het kader van inflammatoire aandoeningen van de luchtwegen31. Tenslotte een andere strategie van de cytometrische van de stroom voor het kwantificeren van de extravasation van adoptively overgedragen immune cellen binnen longweefsel werd beschreven door Galkina et al. (2005)53 en potentieel kan worden gecombineerd met de hier beschreven protocol. In de studie door Galkina et al., een enkele intraveneuze injectie van een anti-CD8 fluorescentie-geconjugeerde antilichaam kort voordat resectie van de Long resulteerde in een exclusieve, complete etikettering van vóór overgedragen CD8+ T cellen in de longen vasculaire compartiment, terwijl al extravasated CD8+ T cellen binnen de longen interstitium onbevlekt bleef. Latere analyses van in vivo gelabelde pulmonaire immune cellen werden uitgevoerd stroom cytometrically na ex vivo vertering van Long weefsel53. Het proces van weefsel spijsvertering betekent natuurlijk dat de anatomische scheiding tussen de intra- en extravascular Long compartiment wordt ingetrokken, en er is dus sprake van een algemene risico van vals-positieve etikettering van interstitiële immune cellen als gevolg van lekkage van het antilichaam tussen de beide compartimenten. Dit risico kan alleen geminimaliseerd worden door het uitvoeren van de vertering van weefsel in het bijzijn van het verzadigen van de bedragen van labelloze antilichaam53 of, potentieel, door vervanging van flow cytometrische analyse door licht vel fluorescentie microscopie, die het mogelijk maakt om volledig te voorkomen dat de vernietiging van weefsel structuur.
Kortom, het hier geïntroduceerd combinatie van in vivo homing van fluorescently geëtiketteerde primaire immune cellen en latere licht vel fluorescentie microscopie is kundig voor betrouwbaar te identificeren, te kwantificeren en te lokaliseren Long geaccumuleerde menselijke immune cellen in een experimentele muismodel van de pulmonaire ontsteking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
M.F. Neurath heeft gediend als adviseur voor Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda en Boehringer. De resterende auteurs geven niet tegenstrijdigheid.
Acknowledgments
De auteurs erkennen dankbaar financiering door de DFG Collaborative Research centra SFB 1181 en TRR 241. De optische Imaging centrum Erlangen (OICE) en in bepaalde Ralf Palmisano, Philipp Tripal en Tina Fraaß (Project Z2 van de DFG CRC-1181) worden erkend voor deskundige technische ondersteuning voor de microscopische beeldvorming licht vel fluorescentie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose NEEO Ultra | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 2267.4 | |
| AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody | BioLegend, San Diego, USA | 304060 | |
| Ammonium chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | K2981 | |
| Cannula 21 G | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 301300 | |
| Cell proliferation dye eflour670 | eBioscience Inc., San Diego, USA | 65-0840-85 | |
| CD4 MicroBeads, human | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-045-101 | |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 8043.1 | |
| Potassium-EDTA blood collection tube, 9 mL | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 21066001 | |
| Ethly cinnamate (ECi) | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | 112372-100G | |
| Ethanol ≥ 99.5% (EtOH) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 5054.3 | |
| FBS (fetal bovine serum) Good Forte | PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany | P40-47500 | |
| Filter 100 µm | VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany | 732-2758 | |
| Imaris Image Analysis Software 9.0.2 | Bitplane AG, Zurich, Switzerland | n.a. | |
| ImspectorPro software | Abberior Instruments GmbH, Göttingen, Germany | n.a. | |
| Ketamin | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany | 3617KET-V | |
| LaVision UltraMicroscope II | LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany | n.a. | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-042-303 | |
| Multifly cannula 20 G | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 851638035 | |
| 30 G needle | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany | 9161502 | |
| Neubauer counting chamber | neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany | C-1003 | |
| Pattex Glue | Henkel AG & Co, Düsseldorf, Germany | PSK1C | |
| LS column | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
| Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/mL) | anprotec | AC-AF-0018 | |
| Papain | Merck | 1,071,440,025 | |
| PBS Dulbecco (phosphate buffered saline) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | L182-10 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-human CD4 | BioLegend, San Diego, USA | 317428 | |
| PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, κ isotype Ctrl | BioLegend, San Diego, USA | 400337 | |
| PFA (paraformaldehyde) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 0335.1 | |
| Potassium hydrogen carbonate | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | P7481 | |
| Serological pipette 10 mL | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 86.1254.001 | |
| Syringe 1 mL | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany | 9166017V | |
| Syringe 5 mL | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 260067 | |
| Syringe 20 mL | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 260069 | |
| Tube 1.5 mL | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72,706,400 | |
| Tube 2 mL | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72.695.400 | |
| Tube 2 mL, brown | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72,695,001 | |
| Tube 15 mL | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62.554.502 | |
| Tube 50 mL | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62.547.254 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-090-976 | |
| Xylazin (Rompun 2%) | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | KPOBD32 |
References
- Medoff, B. D., Thomas, S. Y., Luster, A. D. T cell trafficking in allergic asthma: the ins and outs. Annual Review of Immunology. 26, 205-232 (2008).
- Baraldo, S., Lokar Oliani, K., Turato, G., Zuin, R., Saetta, M. The Role of Lymphocytes in the Pathogenesis of Asthma and COPD. Current Medicinal Chemistry. 14 (21), 2250-2256 (2007).
- Mikhak, Z., Strassner, J. P., Luster, A. D. Lung dendritic cells imprint T cell lung homing and promote lung immunity through the chemokine receptor CCR4. Journal of Experimental Medicine. 210 (9), 1855-1869 (2013).
- Thomas, S. Y., Banerji, A., Medoff, B. D., Lilly, C. M., Luster, A. D. Multiple chemokine receptors, including CCR6 and CXCR3, regulate antigen-induced T cell homing to the human asthmatic airway. Journal of Immunology. 179 (3), 1901-1912 (2007).
- Katchar, K., Eklund, A., Grunewald, J. Expression of Th1 markers by lung accumulated T cells in pulmonary sarcoidosis. Journal of Internal Medicine. 254 (6), 564-571 (2003).
- Wu, Z., et al. Mast cell FcepsilonRI-induced early growth response 2 regulates CC chemokine ligand 1-dependent CD4+ T cell migration. Journal of Immunology. 190 (9), 4500-4507 (2013).
- Hart, P. H. Regulation of the inflammatory response in asthma by mast cell products. Immunology, Cell Biology. 79 (2), 149-153 (2001).
- Bice, J. B., Leechawengwongs, E., Montanaro, A. Biologic targeted therapy in allergic asthma. Annals of Allergy & Asthma & Immunology. 112 (2), 108-115 (2014).
- Barnes, N., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled study of the CRTH2 antagonist OC000459 in moderate persistent asthma. Clinical & Experimental Allergy. 42 (1), 38-48 (2012).
- Medoff, B. D., et al. CD11b+ myeloid cells are the key mediators of Th2 cell homing into the airway in allergic inflammation. Journal of Immunology. 182 (1), 623-635 (2009).
- Oeser, K., Maxeiner, J., Symowski, C., Stassen, M., Voehringer, D. T. T cells are the critical source of IL-4/IL-13 in a mouse model of allergic asthma. Allergy. 70 (11), 1440-1449 (2015).
- Freeman, C. M., Curtis, J. L., Chensue, S. W. CC chemokine receptor 5 and CXC chemokine receptor 6 expression by lung CD8+ cells correlates with chronic obstructive pulmonary disease severity. The American Journal of Pathology. 171 (3), 767-776 (2007).
- Kallinich, T., et al. Chemokine-receptor expression on T cells in lung compartments of challenged asthmatic patients. Clinical & Experimental Allergy. 35 (1), 26-33 (2005).
- Vasakova, M., et al. Bronchoalveolar lavage fluid cellular characteristics, functional parameters and cytokine and chemokine levels in interstitial lung diseases. Scandinavian Journal of Immunology. 69 (3), 268-274 (2009).
- Campbell, J. J., et al. Expression of chemokine receptors by lung T cells from normal and asthmatic subjects. Journal of Immunology. 166 (4), 2842-2848 (2001).
- Halwani, R., et al. IL-17 Enhances Chemotaxis of Primary Human B Cells during Asthma. PLoS One. 9 (12), 114604 (2014).
- Agostini, C., et al. Cxcr3 and its ligand CXCL10 are expressed by inflammatory cells infiltrating lung allografts and mediate chemotaxis of T cells at sites of rejection. The American Journal of Pathology. 158 (5), 1703-1711 (2001).
- Ainslie, M. P., McNulty, C. A., Huynh, T., Symon, F. A., Wardlaw, A. J. Characterisation of adhesion receptors mediating lymphocyte adhesion to bronchial endothelium provides evidence for a distinct lung homing pathway. Thorax. 57 (12), 1054-1059 (2002).
- Radeke, H. H., Ludwig, R. J., Boehncke, W. H. Experimental approaches to lymphocyte migration in dermatology in vitro and in vivo. Experimental Dermatology. 14 (9), 641-666 (2005).
- Miles, A., Liaskou, E., Eksteen, B., Lalor, P. F., Adams, D. H. CCL25 and CCL28 promote alpha4 beta7-integrin-dependent adhesion of lymphocytes to MAdCAM-1 under shear flow. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 294 (5), 1257-1267 (2008).
- Zundler, S., et al. The alpha4beta1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn's Disease Effector T Cells In vivo. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).
- Verbist, K. C., Cole, C. J., Field, M. B., Klonowski, K. D. A role for IL-15 in the migration of effector CD8 T cells to the lung airways following influenza infection. Journal of Immunology. 186 (1), 174-182 (2011).
- Kopf, M., Abel, B., Gallimore, A., Carroll, M., Bachmann, M. F. Complement component C3 promotes T-cell priming and lung migration to control acute influenza virus infection. Nature Medicine. 8 (4), 373-378 (2002).
- Zundler, S., et al. Three-Dimensional Cross-Sectional Light-Sheet Microscopy Imaging of the Inflamed Mouse Gut. Gastroenterology. 153 (4), 898-900 (2017).
- Mzinza, D. T., et al. Application of light sheet microscopy for qualitative and quantitative analysis of bronchus-associated lymphoid tissue in mice. Cellular & Molecular Immunology. , (2018).
- Erturk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments. (89), 51382 (2014).
- Morita, H., et al. An Interleukin-33-Mast Cell-Interleukin-2 Axis Suppresses Papain-Induced Allergic Inflammation by Promoting Regulatory T Cell Numbers. Immunity. 43 (1), 175-186 (2015).
- Mann, L., Klingberg, A., Gunzer, M., Hasenberg, M. Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (123), 55450 (2017).
- Mercer, R. R., et al. Extrapulmonary transport of MWCNT following inhalation exposure. Particle and Fibre Toxicology. 10, 38 (2013).
- Minton, C., et al. Demonstration of microvessel networks and endothelial cell phenotypes in the normal murine lung. Journal of Nippon Medical School. 72 (6), 314-315 (2005).
- Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), 55398 (2017).
- Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).
- Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).
- Wege, A. K. Humanized Mouse Models for the Preclinical Assessment of Cancer Immunotherapy. BioDrugs. , (2018).
- Jespersen, H., et al. Clinical responses to adoptive T-cell transfer can be modeled in an autologous immune-humanized mouse model. Nature Communications. 8 (1), 707 (2017).
- Schloder, J., Berges, C., Luessi, F., Jonuleit, H. Dimethyl Fumarate Therapy Significantly Improves the Responsiveness of T Cells in Multiple Sclerosis Patients for Immunoregulation by Regulatory T Cells. International Journal of Molecular Sciences. 18 (2), (2017).
- Murdoch, C., Finn, A. Chemokine receptors and their role in inflammation and infectious diseases. Blood. 95 (10), 3032-3043 (2000).
- Rivera-Nieves, J., Gorfu, G., Ley, K. Leukocyte adhesion molecules in animal models of inflammatory bowel disease. Inflammatory Bowel Diseases. 14 (12), 1715-1735 (2008).
- Zundler, S., Neurath, M. F. Novel Insights into the Mechanisms of Gut Homing and Antiadhesion Therapies in Inflammatory Bowel Diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (4), 617-627 (2017).
- Halim, T. Y., Krauss, R. H., Sun, A. C., Takei, F. Lung natural helper cells are a critical source of Th2 cell-type cytokines in protease allergen-induced airway inflammation. Immunity. 36 (3), 451-463 (2012).
- Kamijo, S., et al. IL-33-mediated innate response and adaptive immune cells contribute to maximum responses of protease allergen-induced allergic airway inflammation. Journal of Immunology. 190 (9), 4489-4499 (2013).
- Milne, J., Brand, S. Occupational asthma after inhalation of dust of the proteolytic enzyme, papain. British Journal of Industrial Medicine. 32 (4), 302-307 (1975).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry, Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
- Looney, M. R., Bhattacharya, J.
- Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
- Headley, M. B., et al. Visualization of immediate immune responses to pioneer metastatic cells in the lung. Nature. 531 (7595), 513-517 (2016).
- Hammad, H., et al. House dust mite allergen induces asthma via Toll-like receptor 4 triggering of airway structural cells. Nature Medicine. 15 (4), 410-416 (2009).
- Bose, O., et al. Mast cells present protrusions into blood vessels upon tracheal allergen challenge in mice. PLoS One. 10 (3), 0118513 (2015).
- Galkina, E., et al. Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).
