Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Anvende avancerede In Vitro dyrkning teknologi for at studere den menneskelige Gut mikrobiota

Published: February 15, 2019 doi: 10.3791/59054
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3, 1
1Dairy and Functional Foods Research Unit, Eastern Regional Research Center, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 2ProDigest, 3Division of Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition, Children's Hospital of Philadelphia

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for dyrkning den gut mikrobiota af tyktarmen in vitro-, ved hjælp af en serie af bioreaktorer, som simulerer de fysiologiske tilstande i mave-tarmkanalen.

Abstract

Den menneskelige gut mikrobiota spiller en afgørende rolle for både menneskers sundhed og sygdom. At studere den gut mikrobiota ved hjælp af en i vivo model, er vanskelig på grund af dens komplekse karakter, og dens forskellige association med pattedyr komponenter. Målet med denne protokol er at kultur den gut mikrobiota in vitro, som giver mulighed for undersøgelse af gut mikrobiota dynamikken, uden at skulle overveje bidrag af de pattedyr milieu. Bruger i vitro dyrkning teknologi, er de fysiologiske tilstande i mave-tarmkanalen simuleret, herunder parametre såsom pH, temperatur, anaerobiosis og transittid. Tarm overfladen af tyktarmen er simuleret ved at tilføje mucin-belagt luftfartsselskaber, at skabe en slimhinde fase og tilføje endnu en dimension. Gut mikrobiota er indført ved at vaccinere med det menneskelige fækal materiale. Efter podning med dette kompleks blanding af bakterier, specifikke mikrober er beriget med de forskellige længderetningen (opstigende, tværgående og faldende kolon) og tværgående (luminale og slimhinde) miljøer af in vitro-modellen. Det er afgørende, at systemet skal nå et steady state, hvor Fællesskabet og metabolitter produceret forbliver stabil. De eksperimentelle resultater i dette manuskript demonstrere, hvordan podede gut mikrobiota Fællesskabet udvikler sig til et stabilt samfund over tid. Når stabil tilstand er opnået, kan systemet bruges til at analysere bakteriel interaktioner og Fællesskabets funktioner eller at afprøve virkningerne af eventuelle tilsætningsstoffer på gut mikrobiota som mad, mad komponenter eller farmaceutiske produkter.

Introduction

Gut mikrobiota er et fællesskab af mikroorganismer, der findes i den menneskelige mave-tarmkanalen (GIT).  Dette fællesskab når maksimale koncentration i colon, der er anslået til at holde 1013-1014 bakterier, fra 500-1.000 arter, der lever i symbiose med kolon milieu1,2. Sammensætning og funktionalitet af gut mikrobiota ændre rumligt langs GIT, danner regionen specifikke samfund, med de mest forskelligartede fundet distalt2,3,4,5. For hver anatomiske region bor separat mikrobielle samfund i lumen og på slimhindebelægning6. Lumen Fællesskabet har mere direkte adgang til næringsstoffer som substrater bevæger sig gennem den luminale rum7. På trods af dette findes nogle bakterier fortrinsvis i mukuslagets, udnytte mucin produceret af kolon celler som en energi kilde1,5,8. Forskellen i microenvironments mellem de luminale og slimhinde faser resulterer i afvigelse og udviklingen af fase specifikke samfund. Sammen, giver disse samfund metaboliske funktioner, såsom næringsstof stofskifte og produktionen af vitaminer, og immunologiske funktioner, såsom forebyggelse kolonisering af menneskelige patogener1,3, 9. gut mikrobiota ligeledes anlæg funktionelt i konjugation med menneskelige kolon celler3.

Som en vigtig del af den menneskelige GIT er det ikke overraskende, at gut mikrobiota er kendt for at bidrage til både vært sundhed og sygdom status3,9,10,11,12. Et skift i den gut mikrobielle population har været forbundet med flere sygdomme hos mennesker, herunder GIT lidelser som intestinal tarmsygdom (IBD) og tarm tyktarm (IBS), men også andre sygdomme som fedme, kredsløbs sygdomme og autisme 3 , 9 , 10 , 11 , 12. metabolitter produceret fra gut mikrobiota har en global virkning, at nå steder langt fra gut12,13. For eksempel, er gut-hjerne akse forbundet med mentale lidelser som angst og depression14. Derfor, at studere gut mikrobiota er vigtigt at flere forskningsområder, og gælder for mange sygdomme, selv dem, der ikke ofte er forbundet med GIT.

Mens det er almindeligt anerkendt, at studere gut mikrobiota er vigtigt, er det en kompliceret affære. Flere dyremodeller er til rådighed, fra små dyr som zebrafisk, rotter og mus, til større virksomheder som aber og svin15-19. Men anvendelsen af disse dyr med hensyn til den menneskelige gut mikrobiota er ikke ligetil, da disse dyr har en unik bakterielle samfund, der har udviklet sig baseret på miljø og kost, og de er anatomisk adskilte fra mennesker20 , 21. brug af forsøgspersoner fjerner spørgsmål af relevans endnu introducerer et nyt sæt af udfordringer. Humane undersøgelser er dyrt, tidskrævende, og etisk begrænsede11. Endvidere, forstyrrende faktorer påvirke gut mikrobiota i humane undersøgelser, herunder alder eller udviklingsstadiet, miljø, kost, medicin og genetiske faktorer2,4,22.  Der er også begrænsninger på hvad kan testes i mennesker, og hvilken type prøver kan høstes på hvad gange4.

En kritisk ulempe ved hjælp af en in vivo -system til at studere gut mikrobiota er tilstedeværelsen af pattedyr komponenter. Den gut mikrobiota og humane celler interagere med hinanden, og i et i vivo indstilling, er det umuligt at skelne de to. Metabolitter produceret af gut mikrobiota er taget af kolon celler, så målinger ikke kan beregnes med præcision. Derfor skal enhver Mekanismestudier begrænses til end-point målinger11. En anden stor ulempe for in vivo-undersøgelser er den manglende evne til at høste prøver fra de forskellige regioner i GIT på langs23. Dette giver ikke mulighed for vurdering af ændringer, der kan forekomme i microenvironments af tyktarmen over tid12.  Mange i vivo undersøgelser, herunder undersøgelser, stole på analyse af fækal prøver at opdage ændringer til gut mikrobiota12. Mens dette er informative, det giver ikke data på gut mikrobiota på tværs af GIT og skelner ikke mellem den luminale og slimhinde Fællesskaber5,6,7,8.

For gut mikrobiota, er anvendelsen af en in vitro- metode forpligtet til at studere dynamikken i den bakterielle samfund, uden indblanding fra pattedyr komponenter. Ved hjælp af en in vitro- metode giver mulighed for den stramme kontrol af miljøforhold10, afprøvning af flere parametre samtidigt og evnen til at smage på langs, og i store mængder11. Da en in vitro-metode udnytter en mekanisk anordning og ikke en vært, er ingen overvejelser nødvendig for alder, miljø, kost eller genetiske baggrund. Disse systemer kan bruges til at teste enten hele tarmen mikrobiota Fællesskabet, kun udvalgte organismer, eller endda enkelt stammer. Vigtigere, in vitro-resultaterne er reproducerbare, men bevare en grad af mangfoldighed sammenlignes med in vivo-undersøgelser11,22.

Afhængigt af den pågældende hypotese og de ønskede resultater, jegn vitro undersøgelser kan udføres på mange måder.  De kan udnytte single-fartøj systemer og enkle metoder, såsom inkubere prøver med fækal homogenatet24 eller udfører enkelt batch kulturer i løbet af 24-48 h25. De kan også opnås ved hjælp af single-fartøj systemer og mere komplicerede metoder, som ved hjælp af et chemostat system til at producere en stabil gut mikrobielle samfund11. Men brugen af en enkelt reaktor kan over forenkle mikrobiota12 da det kun repræsenterer en del af tyktarmen, selv om kolonet er sammensat af regionerne opstigende, tværgående og faldende.

For at studere den gut mikrobiota samfund, der udvikler sig i de forskellige regioner af tyktarmen (regionerne opstigende, tværgående og faldende), kan en kompleks, Multi-trins system anvendes. I disse systemer oprettes flere fartøjer til at efterligne de forskellige regioner i tyktarmen, så gut mikrobiota af regionerne opstigende, tværgående og faldende dyrkes uafhængigt. Disse fartøjer er tilsluttet, ved hjælp af pumper til at flytte substrater i rækkefølge, fra stigende til tværgående de faldende kolon regioner, efterligne strømmen af næringsstoffer gennem GIT.

Formålet med denne undersøgelse var at vise, hvordan en 5-trins in vitro kultur system (Se Tabel af materialer) kan bruges til at dyrke gut mikrobiota Fællesskabet og demonstrere Fællesskabet dynamics stabilitet og sammensætning. I dette system, et fartøj repræsenterer maven mens en tyndtarmen. Tyktarmen er opdelt i tre regioner (opstigende, tværgående, faldende), med et fartøj, der repræsenterer hver region26. I denne eksperimentelle opsætning, to komplette systemer blev kørt sideløbende, med enhed 1 indeholdende mucin luftfartsselskaber at repræsenterer slimhinden og enhed 2 indeholder ingen mucin luftfartsselskaber. De Fællesskaber, der udvikles i de luminale og slimhinde faser af hver region var i forhold til hinanden, og at den fækal inokulum over tid ved hjælp af 16S rRNA gen sekventering og SCFA analyse. Resultaterne præsenteres viser typen samfund, både med hensyn til sammensætning og funktionalitet, som kan være fremstillet af denne type af in vitro-system.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. materialer og præparater

Bemærk: Den definerede medium er købt som et pulver (Se Tabel af materialer). Sammensætningen af den definerede medium i g/L er følgende: Arabinogalactan (1,2), pektin (2,0), Xylan (0,5), glukose (0,4), gærekstrakt (3,0), særlige pepton (1,0), Mucin (2,0), L-Cystein-HCl (0,2).

  1. Forberede den definerede medium
    1. Fyld en 4 L målekolbe med 2 L dobbelt destilleret, deioniseret vand.
    2. Tilføje 29,2 g definerede medium pulver til vandet og bland enhed komplet homogeniseret.
    3. Tilføje en magnetomrører og løst skrue på låget.
    4. Autoklavering ved 121 ° C i 30 min.
    5. Efter afkøling, skal du gemme den forberedte definerede medium i køleskab ved 4 ° C med konstant agitation (magnetomrører).
  2. Forberede bugspyt
    1. Autoklave 2L destilleret, deioniseret vand i en 5L beholder med en omrører bar tilføjet, ved 121 ° C i 30 min.
    2. Efter autoklavering, så vandet afkøles til stuetemperatur.
    3. Tilføje 12,5 g NaHCO3, 6 g galde og 0,9 g pancreatin. Sted på magnetomrører at blande.
      Bemærk: Bugspyt bør forberedt friske hver 2-3 dage og nedkølet med ophidselse efter det lavet.
  3. Fosfat buffer
    1. Placer en 1 L målekolbe indeholdende en magnetisk omrører bar på en magnetomrører. Tilsæt 0,5 L destilleret, deioniseret vand og tænde agitation.
    2. Næste, Tilføj 0,1 g natrium thioglycolate 6,8 g KH2PO4og 8.8 g K2HPO4. Hinden med vand til en endelige mængden af 1 L.
    3. Når komponenterne er helt opløst, justere pH 7.0 ved hjælp af NaOH.
    4. Hæld bufferen i en 2 L beholder med skruelåg låg og autoklaver ved 121 ° C i 30 min. at sikre, at låget er skruet på løst og ikke lukket stramt.
    5. Efter fjernelse fra autoklave, tillade løsning afkøle til stuetemperatur. Gemme buffer ved stuetemperatur i op til 2 uger.
  4. Forberede Mucin agar luftfartsselskaber
    1. Autoklave plast mucin hangarskibe (Se Tabel af materialer), pincet, plast mesh (rørformede form) og zip bånd på 131 ° C i 30 min.
    2. Autoklave 300 mL af dobbelt destilleret, de-Ioniseret vand ved 131 ° C i 30 min. butik ved stuetemperatur indtil brug.
    3. I et kabinet med laminar flow biosikkerhed fylde sterile petriskåle med plast mucin luftfartsselskaberne ved hjælp af steril pincet.
      Bemærk: Mucin luftfartsselskaber er hule plast cirkler, der er fyldt med mucin agar. Når fyldt, låget kan placeres på toppen og disse kan sættes til side.
    4. For at forberede mucin agar, tilsættes 3 g af bakteriel agar og 15 g af svin mucin autoklaveres vand 300 mL.
    5. I et stinkskab, kog denne løsning, derefter fjerne fra varmekilde og afkøles for 1 min. Gentag kogning og afkøling for i alt 3 gange.
    6. Når glas fartøj indeholdende mucin agar løsning er cool nok til at røre, flytte det ind i biosikkerhed kabinet med laminar flow.
    7. I biosikkerhed kabinet med laminar flow, hæld den flydende mucin agar over plast mucin luftfartsselskaber, der var placeret i petriskålen. Sikre, at alle luftfartsselskaber fyldes helt med mucin agar.
    8. Låget lægges tilbage på en petriskål og lad det køle under laminar flow.
    9. At samle mucin luftfartsselskaber, tage de autoklaveres plast netting og indsætte mucin luftfartsselskaber indeholdende størknet mucin agar fra petriskål ved hjælp af steril pincet.
    10. Brug kabelbindere til at lukke enderne af trådnet. På denne måde de netto funktioner indeholder mucin luftfartsselskaber fyldt med mucin agar. Opbevares ved 4 ° C indtil brug.

2. sæt op, podning, og driften af systemet

  1. Oprettet af de dyrkningsbaserede system
    Bemærk:     Twin Simulator af den menneskelige Intestinal mikrobielle økosystem blev brugt til denne undersøgelse.
    1. Placer 10 bioreaktorer indeholdende omrører barer på magnetisk omrørere og tænde agitation.
      Bemærk: Hver enhed vil bestå af 5 bioreaktorer, så 2 enheder vil kræve 10 bioreaktorer.
    2. Slut 5 bioreaktorer til hinanden ved hjælp af silikone slanger i sekvens som den peristaltiske pumpe (figur 1). Bruge pumper til tværgående væske indholdet fra en bioreaktor til næste.
    3. Label bioreaktorer i følgende rækkefølge: maven, tyndtarmen, opstigende kolon, tværgående tyktarm, faldende colon repræsenterer rækkefølgen af mave-tarmkanalen.
      Bemærk: Bioreaktorer kan alle være identiske, eller maven og tyndtarmen bioreaktorer mindre kan sammenlignes med kolon bioreaktorer, da de vil holde mindre volumen. Opsætning af bioreaktorer på denne måde betyder, at regionen opstigende tyktarmen modtager næringsstoffer fra tyndtarmen, den tværgående tyktarm region modtager næringsstoffer fra regionen opstigende kolon og den faldende kolon region modtager næringsstoffer fra de tværgående region. På denne måde, er systemet efterligne den sekventielle bevægelse af næringsstoffer gennem mave-tarmkanalen.
    4. Sted den definerede medium og bugspyt i køleskab ved 4 ° C med konstant agitation ved hjælp af magnetiske omrørere. Bruger silicium slanger, Tilslut den definerede medium til maven bioreaktor via en peristaltisk pumpe og Tilslut bugspyt til tyndtarmen via en peristaltisk pumpe.
    5. Tilføje solidifying agent til en urin dræning taske. Tilslut den faldende kolon til dræning urinpose som den peristaltiske pumpe. Bortskaffe det størknede som biologisk affald under eksperimentet.
    6. Bruger silikoneslanger, Forbind vandet jakke for hvert fartøj i rækkefølge, og forbind hver ende til cirkulerende vandbad. Fyld det cirkulerende vandbad med destilleret vand (dette beløb vil variere afhængigt af typen af cirkulerende vandbad bruges) og sat til 37 ° C.
    7. Bruger silicium slanger, tilsluttes syren og basen af låget på hvert enkelt fartøj ved peristaltiske pumper. Den anbefalede koncentration er 0,5 M HCl og 0,5 M NaOH.
    8. Indsæt pH-sonder til hvert fartøj gennem en udpeget havn i låget. Denne port er designet til at holde pH-sonde og skrue i låg (figur 1). Indstille pH for hver region som følger: mave, pH = 2; Tyndtarmen, pH = 6,7-6,9; Opstigende kolon, pH = 5,6-5.9; Tværgående tyktarm, pH = 6.15-6.4; Faldende colon, pH = 6.6-6.9.
      Bemærk: I den indledende fase, vil Fællesskabet differentiere baseret på forskellen i regionen pH værdier. Men når fodring cyklusser begynder, vil Fællesskaberne yderligere modne baseret på forskelle i næringsstof input.
    9. Tilslut en nitrogen linje ved hjælp af silikone slanger til låget på hvert enkelt fartøj ved hjælp af den angivne port. Linjen kvælstof skal flyde i følgende rækkefølge: maven, tyndtarmen, opstigende kolon, tværgående tyktarm, faldende colon. Sikre, at hver enhed har sin egen flush til at undgå krydskontaminering.
      Bemærk: Nitrogen bruges til fjernet ilt fra systemet og vedligeholder anaerobiosis under eksperimentet.
    10. Indsæt en metal prøveglas gennem låget af hver bioreaktor ved hjælp af den angivne port. Den metal tube strækker sig ned i bioreaktor og bruges til at indsamle flydende prøver.
    11. Tilføje et lille stykke silikone slange til den øverste ende af prøveglas og forbinde en Luer Lock til at tillade brugen af en sprøjte under prøvetagningen.
  2. Podning af systemet
    1. Fyld kolon regioner med den definerede medium ved hjælp af følgende rumfang: 500 mL i den opstigende kolon, 800 mL i den tværgående tyktarm og 600 mL i den faldende kolon.
    2. Tilføje mucin agar luftfartsselskaber til colon regioner, med et beløb, der er proportional med mængden af reaktoren. For dette eksperiment anvendtes 60 luftfartsselskaber pr. reaktor.
    3. Fjern eventuelle overskydende definerede medium ved hjælp af prøveglas og en sprøjte da tilføje luftfartsselskaberne hæver niveauet for væske i bioreaktor.
    4. Drej på pH-sonder til at justere pH-værdien i hver reaktor, der bruger computeren.
    5. Drej på kvælstof flush i 20 min.
      Bemærk: Fækal homogenatet anvendes til podning er købt som 10% afføring homogeniseret i 10% glycerol løsning (Se Tabel af materialer). Fækal prøven er tilfældigt udvalgt fra en pulje af donorer med følgende kriterier: en amerikansk indtager en typisk vestlige kost (ikke veganer eller vegetar), mellem 21-45 år gammel, antibiotisk gratis for mindst 1 år, med en gennemsnitlig Body Mass Index (18,5-24,9) . Denne protokol bruges kun en enkelt donor. Men dette kan ændres på grund af eksperimentelle design.
    6. Før podning, tø den fækal homogenatet efter producentens retningslinjer.
    7. Podes hver kolon reaktor ved at tilføje den fækal homogenatet i et beløb svarende til 5% af reaktoren volumen gennem prøven port, ved hjælp af en 60 mL sprøjte (25 mL for den opstigende kolon, 40 mL for den tværgående tyktarm, 30 mL for den faldende kolon).
    8. Vokse kulturer i bioreaktorer natten med pH kontrol.
    9. Efter de natten vækst, høst prøver af den luminale væske fra hver kolon region som beskrevet nedenfor i afsnit 3. Efter prøvetagning er afsluttet, drej på edb-program til at begynde fodring.
  3. Daglige fodring cykler
    Bemærk:     de daglige fodring cyklusser er computer automatiseret.
    1. Tre gange om dagen, pumpe 140 mL af den definerede medium i maven bioreaktor og tilladt for at Inkuber i 1 time.
    2. Efter 1 h inkubation, pumpe indholdet af mavesækken ind i tyndtarmen. På samme tid, pumpe 60 mL af bugspyt ind i tyndtarmen.
    3. I tyndtarmen, slå justering af pH pH 6.7-6,9, og tillade blanding at udruge i 90 minutter. Under inkubation, tænde kvælstof flush for hvert system i alt i 10 min.
    4. Efter 90 min inkubation, drej på pumper fra tyndtarmen til opstigende tyktarmen, den opstigende kolon til den tværgående tyktarm, den tværgående tyktarm til den faldende colon, og den faldende kolon affaldet samtidigt.
  4. Eksperimentelle tidslinje
    Bemærk:     den in vitro-systemet bruges her drives i en kontinuerlig mode for ca 8 uger i længden. Nedenfor er en anbefalede eksperimentelle tidslinje, men dette kan ændres afhængigt af de krav og mål for eksperimentet.
    1. Konfigurere systemet følgende trin listet taktfast 2.1.
    2. Høst prøver fra overnight vækst efter protokollen nedenfor. Begynd de daglige cyklusser, fodring tre gange om dagen efter den ovennævnte protokol.
    3. Eksperiment i alt 2 uger til at tillade bakterier at stabilisere.
      Bemærk: Kører systemet betyder, at pH opretholdes, de daglige fodring cyklusser er fulgt tre gange om dagen, og de slimhinde luftfartsselskaber er ændret 2 - 3 gange hver uge.
    4. Efter stabilisering, køre eksperiment for 2 uger som kontrolperiode.
    5. Efter perioden kontrol bruge systemet til at teste forskellige komponenter eller variabler, kendt som behandlingsperiode.
    6. Efter behandlingsperioden, stop tilføje komponenter eller variabler og vende tilbage i forhold til normal. Dette anses den wash-out periode og anvendes til at afgøre, om ændringer i Fællesskabet er permanent.

3. høst prøver fra systemet

Bemærk: Under eksperimentet, prøver kan høstes fra den luminale eller slimhinde fase i nogen region når som helst efter den nedenstående retningslinjer.

  1. Høst luminale prøver
    1. Høste luminale væske prøver gennem prøven port, der strækker sig ind i midten af kultur væske. Begynder ved at rense Luer Lock på prøven port med 70% ethanol eller den lille alkoholserviet og lad tørre.
    2. Sikre, at al luft er fjernet fra en 30 mL sprøjte og Tilslut det til prøven port. Trække op og ned 3 - 5 gange til at sikre korrekt blanding af fartøjet komponenter. Efter, trække i alt 30 mL af kultur.
    3. Alikvot de luminale prøver som nødvendig i sterile falcon rør og opbevares på is. Efter prøvetagning er afsluttet overføre disse til en-80 ° C fryser.
    4. For SCFA analyse, er 15 mL af den luminale prøve spundet på 4 ° C, 5000 x g i 10 min. Supernatanten er sprøjten filtreres ved hjælp af en PES 0,2 μM filter. Gemme den filtrerede supernatanten ved-80 ° C.
      1. For DNA-analyse, spin 1 mL luminale væske ved 4 ° C, 5000 x g i 10 min. supernatanten og gemme pellet ved-80 ° C.
      2. Som en sikkerhedskopi, skal du gemme 10 mL af luminale væske ved-80 ° C for de fleste eksperimenter.
  2. Høst slimhinde prøver
    Bemærk:     ændre slimhinden luftfartsselskaber hver 2-3 dage.
    1. Fjerne og bringe de forberedte mucin luftfartsselskaber fra køleskabet.
    2. Tænd kvælstof flush og åbne reaktor låget hurtigt. Fjerne 50% af mucin luftfartsselskaber og tilføje nye.
    3. Forsegle låget hurtigt og holder kvælstof flush på for en anden 20 min.
    4. For DNA-ekstraktion, alikvot 0,25-0,5 g agar ind i et 2 mL rør og opbevares ved-80 ° C indtil det skal bruges.

4. DNA-ekstraktion, sekventering og analyse

Bemærk: DNA er udvundet ved hjælp af metoden CTAB DNA-ekstraktion med fysiske homogenisering i et aftræk hood29. Efter ekstraktion, et spektrofotometer er bruges til at kvantificere mængden af DNA i hver prøve.

  1. Forberede CTAB buffer
    1. Opløse 4,2 g K2HPO4 og 4.09 g NaCl i 200 mL deioniseret vand, destilleret vand, så autoklavering ved 121 ° C i 30 min.
    2. Tillade løsning afkøle til stuetemperatur.
    3. Tilsættes 10 g af Hexadecyltrimethylammonium bromid (CTAB) og varme til 60 ° C med agitation.
    4. Efter at alle CTAB er opløst, fjerne løsningen fra varmen og afkøles til stuetemperatur.
  2. Forberede PIND-6000 løsning
    1. 300 g Polyethylenglycol 6000 og 93,5 g NaCl i 1 L deioniseret vand, destilleret vand opløses.
    2. Efter alle partikler er opløst, autoklave løsning ved 121 ° C i 30 min.
    3. Efter autoklavering, cool løsning til stuetemperatur før anvendelse.
  3. Udføre DNA-ekstraktion
    1. Tilsæt 500 μL CTAB buffer og 500 μl af Phenol-Chloroform-Isoamyl alkohol til 2 mL prøveglas og vortex at homogenisere.
    2. Overføre hele indholdet af prøveglas til en 0,1 mm fysiske homogenisering tube (Se Tabel af materialer).
    3. Homogeniseres rør til 20 s på den højeste indstilling to gange, med en 20 s pause ind imellem, ved hjælp af en fysisk homogeniseringsapparat (Se Tabel af materialer).
    4. Der centrifugeres homogeniseret rør på 3.000 x g i 5 minutter.
    5. 300 μL supernatant overføres til en ren, 1,7 mL tube og tilsæt 500 μL CTAB buffer til det oprindelige rør.
    6. Homogeniseres dette rør igen ved hjælp af metoderne i trin 4.3.2-4.3.3 og centrifugeres ved 3.000 x g i 5 min.
    7. Efter centrifugering, en anden 300 μL af supernatanten overføres til de nye rør, der nu indeholder 600 μl.
    8. Tilføje ialt 600 μl Chloroform-Isoamyl alkohol til rør indeholdende 600 μl af supernatanten.
    9. Invertere rør for at blande og derefter centrifugeres kort. Overføre 500 μl af den øverste fase til en ren 1,7 mL tube. Sikre kun for at tage den øverste fase.
    10. Næste, tilføje 1000 μL af Peg-6000 løsning, invertere rør for at blande og derefter inkuberes ved stuetemperatur i 2 timer.
    11. Efter inkubationen centrifugeres rør på 18,200 x g, 4 ° C i 10 min.
    12. Supernatanten og rense pellet med is kold 70% ethanol.
    13. Der centrifugeres rør igen på 18,200 x g, 4 ° C, 10 min. supernatanten og tillade pellet tørre i biosikkerhed kabinettet under laminar flow.
    14. Efter pelleten er tør, tilsættes 75 μl gratis RNAse, DNAse gratis, sterilt vand hver tube.
    15. Kvantificere den resuspenderede DNA af et spektrofotometer og derefter sende det for 16S rRNA gen sekventering.

5. korte kæde fedtsyrer (SCFA) detektion og analyse

  1. Optø frosne prøver ved 40° C i 30 min og udtrække kortkædede fedtsyrer ved hjælp af diethylether i forholdet 2:1 (v: v).
  2. Overføre den organiske fase til en GC/MS (Se Tabel af materialer) udstyret med en kolonne, 30 m, 0,25 mm ID, 0,25 µm, (Se Tabel af materialer) hvor 10 µL sprøjtes.
  3. Indstil injektion port temperatur og første kolonne temperatur til 260 ° C og 125 ° C. Hold begyndelsestemperatur for 1 min, og derefter øge dette til 250 ° C, over 11,5 min med en kolonne strømningshastigheden af 1 mL/min.
    Bemærk: MS temperatur for ion kilde er 220° C og 250° C for grænsefladen.
  4. Kvantificere mængden af hver SCFA ved hjælp af standard kurver og 2-methylhexanoic acid som intern standard.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den ovennævnte protokol beskriver sæt op, podning, og afvikling af en 5-trins in vitro-system til at studere gut mikrobiota af tyktarmen. For at generere de data præsenteres nedenfor, efter DNA-ekstraktion, blev 16S rRNA markør gen DNA-sekventering af regionen V1V2 udført ved brug af den høje overførselshastighed sekventering (f.eks., MiSeq Illumina platform) af Microbiome Center på children's Hospital Philadelphia27. QIIME (kvantitative indsigt i mikrobiel økologi) version 1.928 blev brugt til at behandle sequencing data og statistiske analyser blev udført på R miljø for statistisk databehandling29. Taksonomiske opgaver blev genereret ved hjælp af Greengenes 16S reference database30,31. OTU relativ overflod værdier blev beregnet ved at dividere OTU læse tælle det samlede antal læsninger i stikprøven. SCFA niveauer var kvantificeres ved hjælp af protokollen beskrevet.

Den in vitro- Fællesskaber opnå en stabil balance

Evnen til at studere den gut mikrobiota og kortkædede fedtsyrer (SCFA) produktionen i vitro med en etapevis system kræver, at de mikrobielle samfund nå et steady state. Dette sker efter podning, når taxa har blive etableret i deres nicher, og sammensætningen af Fællesskabet og deres metabolitter ikke længere svingende. I et steady state forbliver Fællesskabet og dets produkter de samme over tid. For in vitro-gut mikrobiota undersøgelser er stabilitet et centralt krav; uden stabilitet er det umuligt at afgøre hvorvidt observerede ændringer sker på grund af de eksperimentelle betingelser, eller hvis de er på grund af variation. Efter det er blevet foreslået i litteraturen, kan et fællesskab betragtes som stabil når der er 80% lighed mellem tid point32.

Brug af resultaterne af 16S rRNA markør gen sekventering, blev Principal Coordinates analyse (PCoA) plots baseret på oejeblikkelige og vejede UniFrac afstande genereret for de samfund, der udviklede i hver region i systemet over tid (figur 2). En oejeblikkelige analyse sammenligner Fællesskaber i form af arter findes eller mangler. Den vejede analyse sammenligner dem baseret ikke kun på arter findes eller mangler men også finder deres overflod. Til enhed 1, Dette omfattede både de luminale og slimhinde faser, og enhed 2 kun den luminale fase. Baseret på denne analyse, blev det observeret, at Fællesskabet ændres mærkbart mellem dage 1 og 7. Men fra dag 11 indlæg podning i slutningen af forsøget, prøverne besatte en lille region i PCoA rum. Dette var sandt for prøve-prøve afstand score baseret på OTU tilstedeværelse-mangel (figur 2A) eller OTU overflod (figur 2B). Således, blev det observeret, at efter 11 dage, overflod og typer af bakterier var stabil fra én prøve punkt til næste. Dette mønster blev observeret for både de luminale og slimhinde faser af alle tre kolon regioner af enhed 1 og enhed 2 luminale fase. Disse resultater illustreret, både de luminale og slimhinde faser nå stabilitet og at dette skete på samme tid.

Systemets stabilitet var også aftestede ved at analysere produktionen af kortkædede fedtsyrer (SCFAs) over tid. De tre mest fremtrædende SCFAs (propionsyre, Butansyrer syre og eddikesyre)38 blev målt i hver prøve i løbet af eksperimentet ved hjælp af gaskromatografi GC/MS. Disse målinger viste, at propionsyre, Butansyrer syre og eddikesyre svingede fra starten af forsøget indtil dag 15 indlæg podning (Fig. 3A-C). Efter dag 15 produceret mængder af disse SCFAs i hver kolon region forblev konstant, med kun minimale ændringer forekommer i slutningen af forsøget (figur 3A-C). Forskellen mellem tidspunkter var et gennemsnit på 6,8% for propionsyre, 7,2% for eddikesyre og 8.02% for Butansyrer syre. Dette tyder på at svarende til Fællesskabets sammensætning, de metaboliske egenskaber af Fællesskabet indtastet et steady state, som angivet af produktionen af stabil mængder af SCFAs over tid. Både enhed 1 og enhed 2 produceres tilsvarende mængder af SCFAs, med ingen væsentlige forskelle mellem to (p > 0,05). Det angivet, at produktionen af SCFAs ikke var påvirket af tilstedeværelse eller fravær af Fællesskabets slimhinde. Det skal bemærkes, at stabilitet bestemmes i dette eksperiment er lig den, rapporterede tidligere, som det blev sagt, at Fællesskabet stabilisering i en 5-trins in vitro-system fandt sted ca 2 uger til at bogføre podning33, 34,35.

Samfund udviklet i den in vitro- systemet ligner inokulat

For det andet påkrævet element for en in vitro-gut mikrobiota eksperiment er, at Fællesskabet udviklede i modellens bevarer den mikrobiel diversitet af fækal inokulum. Da systemet anvendes i dette eksperiment giver for tre særskilte kolon regioner ikke kan det forventes, at enhver én region være nøjagtig den samme som den fækal inokulum. Det forventes dog, at medlemmer af hvert samfund er afledt af den fækal inokulum, og alle sammen opretholde et tilsvarende niveau for mangfoldighed som inokulat.

Baseret på resultaterne af 16S rRNA markør gen sekventering, Fællesskabets gennemsnit, stabil for den luminale og slimhinde fase af hver kolon region var bestemt (dage 15-28 indlæg podning) og i forhold til Fællesskabet af fækal inokulum (figur 4A). Disse resultater viser, at de Fællesskaber, der udvikles i de enkelte kolon regioner af in vitro-systemet var magen til den fækal inokulum i sammensætning. De to mest prominente ordrer i reaktoren, Clostridiales og Bacteroidales, matchede dem, bemærkede i inokulat. Flere lav-overflod bakteriel ordrer i regionerne kolon var imidlertid forskellig fra inokulum, med de mest fremtrædende forskelle mellem ordrer Burkholderiales og Synergistales (figur 4A).

Alpha mangfoldighed for in vitro-systemet blev sammenlignet med inokulum, som et andet mål for Fællesskabets struktur efter stabilisering. Shannon indeks, beregnet for hver region over tid, nået en lignende grad af mangfoldighed som inokulat for alle regioner undtagen luminale prøver fra den opstigende region (figur. 4B). Taget sammen, viser disse resultater, at in vitro-kultur-systemet var i stand til at producere et fællesskab sammenlignes med den fækal inokulum, både med hensyn til sammensætning og mangfoldighed (figur 4A-B).

Ved hjælp af en in vitro- systemet giver mulighed for udvikling af regionen og de specifikke samfund, fase

De tre kolon regioner er repræsenteret i dette system vedligeholdes på forskellige pH-værdier og modtage forskellige næringsstoffer forsyninger. (Det blev nævnt i afsnittet protokol). Baseret på dette, forventes det, at samfund i disse regioner vil differentiere 33. De stabile (dage 15-28) luminale Fællesskaber i både enhed 1 og enhed 2 var bestemt på det familiemæssige plan og afbildet efter relativ overflod (figur 5). Divergens mellem de tre kolon regioner i form af overfloden af specifikke taxa, viser, at hver region udvikler et unikt fællesskab. Dette understøttes også af resultaterne af figur 2 og figur 4A. I figur 2, de modne samfund, der er udviklet i hver region klynge på forskellige steder i PCoA-diagrammet. I figur 4Aafveg Fællesskaber i hver region, kolon i procentdele af de dominerende orden medlemmer.

For dette eksperiment, var enhed 1 forsynet med slimhinde luftfartsselskaber, mens enhed 2 havde ingen mucin luftfartsselskaber. Baseret på denne eksperimentelle design, kan bidrag af slimhinden undersøges. Til sammenligningsformål, var de stabile (dage 15-28) luminale og slimhinde Fællesskaber til enhed 1 på niveauet familie afbildet sammen efter relativ overflod (figur 6). Det er klart, at sammensætningen af de luminale og slimhinde Fællesskaber for alle tre koloner varierer i overflod af nogle taxa, den mest fremtrædende er Lachnospiraceae og Bacteroidaceae. Disse resultater viser også, at de slimhinde samfund i de tre regioner er forskellige fra hinanden. For eksempel, Clostridiaceae er beriget med de slimhinde Fællesskaber af de faldende og tværgående områder, og Veillonellaceae er højere i den slimhinde fase af den opstigende kolon, men ikke i tværgående og faldende colon regioner. Tilsammen viser resultaterne præsenteres i disse tal, at der er en klar forskel mellem Fællesskaber i hver fase og hver region for nogle taxa, illustrerer at sammensætningen mellem regionerne er ens og at der er en forskel i overflod.

Selv om analyse af DNA-sekventering afslører udviklingen af en region-specifikke samfund, er der ingen synlige forskel i produktionen af SCFAs mellem regioner. Eddikesyre middelforhold: propionsyre: Butansyrer syre for stabilitetsfællesskab (dag 15-28) blev beregnet for hver region (figur 7A). Mens forholdet mellem de forskellige SCFA forblev nogenlunde ens, er der en stigning i det samlede beløb af SCFAs produceret mellem de opstigende, tværgående og faldende regioner med de højeste niveauer fundet i regionen faldende (figur 7B). Dette var sandt for både enhed 1 og enhed 2.

Figure 1
Fig. 1: Illustration af den 5-trins, in vitro-eksperimentelle design. Det komplette system består af følgende komponenter: en cirkulerende vand bad, kvælstof flow, et sæt af glas bioreaktorer, et sæt magnetomrører barer og magnetiske omrørere, pH-sonder, en computer-styrede konsol, der indeholder 40 peristaltiske pumper, en computerskærm og et køleskab. Den vigtigste system består af et sæt af bioreaktorer efterligne mave, tyndtarmen og de opstigende, tværgående og faldende colon regioner. To komplette enheder er konfigureret til at køre i parallel, til et eksperimenterende og en kontrolgruppe. Det betyder, at 10 bioreaktorer, 10 pH-sonder og 10 magnetiske omrørere er påkrævet til dette eksperiment. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Fællesskabets in vitro-stabiliserer ved dag 11 indlæg podning. PCoA analyse baseret på (A) Unweighted og (B) vægtet Unifrac afstande til den luminale og slimhinde fase i hver region over tid for enhed 1 og enhed 2 luminale fase. Plottet er facetteret i komponenterne efter beregning af PCoA akser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: produktion af SCFAs af in vitro-systemet stabiliseres af dag 15 indlæg podning. Målinger af propionsyre, Butansyrer syre og eddikesyre over tid for (A) stigende kolon (B) tværgående tyktarm og (C) faldende colon. Eksperimentet blev udført i tre eksemplarer. Resultaterne repræsenterer et gennemsnit af tre uafhængige målinger, med fejllinjer skildrer standardafvigelsen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Fig. 4: sammenligning af de stabile samfund fra in vitro-systemet til fækal inokulum. (A) stabilt Fællesskaber (D15-28), på niveauet ordre var i gennemsnit og formateret i pie diagrammer for begge slimhinde og luminale fase af hver kolon region, og for den fækal inokulum. (B) Shannon mangfoldighed i slimhinden og luminale fase af hver kolon regionen i forhold til den fækal inokulum (sort stiplede linje). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: den luminale og slimhinde fase i hver region, kolon fremme væksten af forskellige Fællesskaber. Den gennemsnitlige relative overflod på familie-plan for de stabile Fællesskaber (D15-28) for den luminale og slimhinde fase og inokulum, blev beregnet og afbildet sammen for hver region, kolon. Fejllinjer udgør standardafvigelse mellem timepoints. AC1 = stigende kolon enhed 1; TC1 = tværgående kolon enhed 1; DC1 = faldende colon enhed 1; AC2 = stigende kolon enhed 2; TC2 = tværgående kolon enhed 2; DC2 = faldende colon enhed 2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: hver kolon region af in vitro-systemet udvikler en unik EF. Den gennemsnitlige relative overflod på familie-plan for de stabile samfund (D15-28) i hver kolon region og den fækal inokulum, blev beregnet og afbildet sammen. Eksperimentet blev udført i tre eksemplarer. Resultaterne repræsenterer et gennemsnit af tre uafhængige målinger, med fejllinjer skildrer standardafvigelsen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: forholdet mellem eddikesyre: propionsyre: Butansyrer syre er ens for hver kolon region. (A) mængder eddikesyre, propionsyre og Butansyrer syre til de stabile Fællesskaber (D15-28) af hver kolon region blev beregnet og konverteret til en ratio. (B) nøgletal blev afbildet som procentsatser for hver region, kolon. Fejllinjer udgør standardafvigelse mellem timepoints. AC1 = stigende kolon enhed 1; TC1 = tværgående kolon enhed 1; DC1 = faldende colon enhed 1; AC2 = stigende kolon enhed 2; TC2 = tværgående kolon enhed 2; DC2 = faldende colon enhed 2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In vitro dyrkning systemer er blevet udviklet for at studere gut mikrobiota af tyktarmen. De bruger apparater beregnet til at simulere de fysiologiske tilstande af mave og tarmkanal, fremme vækst af en ældre gut mikrobielle samfund for hver region af kolon33. Mens konceptet er logisk og forståelig, kræver den faktiske drift af in vitro-dyrkningsbaserede systemer til at studere gut mikrobiota præcision og en forståelse af hvad der kræves og forventes at producere pålidelige resultater.

De obligatoriske elementer til et in vitro-gut mikrobiota eksperiment er at Fællesskabet skal være stabilitet efter podning og at det skal bevare den mikrobiel diversitet af fækal inokulum. Hvis eksperimentet køres korrekt, opnås disse to obligatoriske elementer let og forudsigeligt. Kritiske trin i protokollen, som vil påvirke systemets stabilitet og mangfoldighed er følgende: forberedelse af definerede medium og bugspyt skal være nøjagtige, og levering af disse substrater skal stemme overens. Anaerobe forhold skal holdes under eksperimentet. PH-værdien af hver tarm regionen skal opretholdes præcist over tid. Ændringer i disse tre parametre under eksperimentet kan resultere i befolkning udsving og variable metabolit produktion.

Ved hjælp af denne type etapevis in vitro-system har flere fordele. Især simulere de de forskellige regioner i tyktarmen. De kan også være designet til at simulere in vitro-fordøjelsen af mad i den øverste GIT, herunder de enzymatiske bestanddele fra spyt, og tilføjelsen af pancreatin og galde. En slimhinde fase kan indarbejdes i hver kolon reaktor, tilføjer yderligere kompleksitet8. Dette resulterer i udvikling af regionen og de fase specifikke mikrobielle samfund, der kan være individuelt analyseret og sammenlignet. Disse typer af systemer kan let manipuleres, afhængig af eksperimentelle design gennem fysiske omkonfiguration, ændringer af de fysiologiske parametre såsom pH, temperatur eller transittid, eller podning med specifikke fækal prøver26 . Vigtigere, har forskning illustreret, at Fællesskaberne udviklet i disse in vitro-systemer repræsenterer gut mikrobielle samfund11,26,34.

Mens brugen af etapevis in vitro-systemer kan anvendes til mekanisk studere gut mikrobiota, har de begrænsninger. Først, mens de fysiologiske tilstande er programmerbare, de er faste, ved hjælp af specifikke gennemsnitlige værdier, der således repræsenterer den gennemsnitlige person. Dette er en forenkling, da der er betydelige indbyrdes individuelle variatiability12,23. For det andet, selv om manglen på pattedyr komponenter er en af grundene til at bruge en in vitro-system, det også skal betragtes som en begrænsning. Manglen på visse pattedyr komponenter, som immunsystemet, kan resultere i forskelle mellem in vitro-modellen og den tilsvarende in vivo mikromiljø12,23. Disse begrænsninger dog ikke aflede opmærksomheden fra den værdi og indsigt, der kan opnås ved hjælp af in vitro-systemer til mekanisk studere gut mikrobiota. Endelig dyrkes kulturer i glas bioreaktorer med ingen absorption af vand eller metabolitter. Dette er en vigtig forskel, og effekten kan ses i måling af SCFAs, hvor den samlede mængde af SCFAs er stigende fra stigende til tværgående til faldende colon regioner (figur 7). Dette er modsat af hvad er observeret i vivo, hvor de højeste koncentrationer af SCFAs er fundet proksimalt, i regionen opstigende og de laveste koncentrationer fundet distalt36. Men når den nettoværdien af produktionen af SCFAs anses for hver region, derefter det kan bestemmes at de fleste SCFA produktionen finder sted i den opstigende kolon. Det bør også nævnes her at bakteriemængde ikke blev målt i dette eksperiment. Forskelle i bakteriemængde mellem regioner i dette system kan have en effekt på de samlede mængder af SCFAs produceret.

Sammenfattende er det velkendt, at gut mikrobiota spiller en rolle i både menneskers sundhed og sygdom, og det anses for at fungere som mægler mellem kost og metabolisk sundhed37,38. Her, anvendelse af en in vitro- system til at studere gut mikrobiota blev drøftet, og resultater fra et eksperiment viser udviklingen af et stabilt samfund blev præsenteret. En in vitro-system har mange fordele og fremmer udviklingen af et komplekst og dynamisk samfund, som er illustreret i de beskrevne eksperiment. Denne type system er bedst bruges til at undersøge interaktioner og ændringer inden for Fællesskabets gut mikrobiota som svar på eksterne faktorer, såsom LEVNEDSMIDDELBESTANDDELE og medicin. Resultaterne af disse in vitro-undersøgelser kan derefter suppleres med in vivo-undersøgelser, at få en dyb forståelse af funktionen og bidrag af gut mikrobiota til både sundhed og sygdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser. Omtale af handelsnavne eller kommercielle produkter i denne publikation er udelukkende til brug for specifikke oplysninger og indebærer ikke anbefaling eller godkendelse af US Department of Agriculture. USDA er en udbyder af lige muligheder og arbejdsgiver.

Acknowledgments

Ms. Audrey Thomas-Gahring er anerkendt for sin GC/MS arbejde. Vi vil også gerne takke Massimo Marzorati til redigering af håndskriftet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TWINSHIME Prodigest NA
Defined medium (Adult M-SHIME growth medium with starch) Prodigest NA
Masterflex tubing cole Parmer NA
Urine Drainage bag Bard NA
Labsorb Sigma-Aldrich NA
Fecal sample Openbiome NA
Syringes Becton Dickson NA
Defined medium Prodigest NA
Oxgall Bile Becton Dickson NA
Pancreatin Sigma-Aldrich NA
Glass ware Ace Glass NA
Porcine mucin Sigma-Aldrich NA
Bacteriological agar Sigma-Aldrich NA
Sterilization pouches VWR NA
BeadBug Benchmark Scientific NA
Triple-Pure High Impact Zirconium 0.1 mm Bead beater tube Benchmark Scientific NA
RNAse free, DNAse free, sterile water Roche NA
Shimadzu QP2010 Ultra GC/MS Shimadzu NA
Stabilwax-DA column, 30 m, 0.25 mm ID, 0.25 µm Restek NA
plastic mucin carriers Prodigest NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Johansson, M., Larsson, J., Hansson, G. The two mucus layers of colon are organized by the MUC2 mucin, whereas the outer layer is a legislator of host-microbial interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (1), 4659-4665 (2011).
  2. Xu, J., Gordon, J. Honor thy symbionts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10452-10459 (2003).
  3. Jandhyala, S., Talukdar, R., Subramanyam, C., Vuyyuru, H., Sasikala, M., Reddy, D. Role of the normal gut microbiota. World Journal of Gastroenterology. 21 (29), 8787-8803 (2015).
  4. Macfarlane, G., Macfarlane, S. Models for intestinal fermentation: association between food components, delivery systems, bioavailability and functional interactions in the gut. Current Opinion in Biotechnology. 18 (2), (2007).
  5. McDonald, J., et al. Simulating distal gut mucosal and luminal communities using packed-column biofilm reactors and an in vitro chemostat model. Journal of Microbiological Methods. 108, 36-44 (2015).
  6. Van den Abbeele, P., et al. Arabinoxylans, inulin and Lactobacillus reuteri 1063 repress the adherent-invasive Escherichia coli from mucus in a mucosa-comprising gut model. NPJ Biofilms and Microbiomes. 27 (2), 16016 (2016).
  7. Van den Abbeele, P., Van de Wiele, T., Verstraete, W., Possemiers, S. The host selects mucosal and luminal associations of coevolved gut microorganisms: a novel concept. FEMS Microbiology Reviews. 35 (4), 681-704 (2011).
  8. Van den Abbeele, P., et al. Incorporating a mucosal environment in a dynamic gut model results in a more representative colonization by lactobacilli. Microbial Biotechnology. 5 (1), 106-115 (2012).
  9. Kinross, J., Darzi, A., Nicholson, J. Gut microbiome-host interactions in health and disease. Genome Medicine. 3 (3), 14 (2011).
  10. Wissenbach, D., et al. Optimization of metabolomics of defined in vitro gut microbial ecosystems. International Journal of Medical Microbiology. 306 (5), 280-289 (2016).
  11. McDonald, J., et al. Evaluation of microbial community reproducibility, stability and composition in a human distal gut chemostat model. Journal of Microbiological Methods. 95 (2), 167-174 (2013).
  12. Venema, K., van den Abbeele, P. Experimental models of the gut microbiome. Best Practice and Research. Clinical Gastroenterology. 27 (1), 115-126 (2013).
  13. Krishnan, S., Alden, N., Lee, K. Pathways and functions of gut microbiota metabolism impacting host physiology. Current Opinion in Biotechnology. 36, 137-145 (2015).
  14. Lach, G., Schellekens, H., Dinan, T., Cryan, J. Anxiety, Depression, and the Microbiome: A Role for Gut Peptides. Neurotherapeutics. 15 (1), 36-59 (2018).
  15. Arias-Jayo, N., Alonso-Saez, L., Ramirez-Garcia, A., Pardo, M. Zebrafish Axenic Larvae Colonization with Human Intestinal Microbiota. Zebrafish. 00 (00), (2017).
  16. Zhu, W., Lin, K., Li, K., Deng, X., Li, C. Reshaped fecal gut microbiota composition by the intake of high molecular weight persimmon tannin in normal and high-cholesterol diet-fed rats. Food and Function. 9 (1), 541-551 (2018).
  17. Nguyen, T., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Model Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
  18. Hale, V., et al. Diet Versus Phylogeny: a Comparison of Gut Microbiota in Captive Colobine Monkey Species. Microbial Ecology. 75 (2), 515-527 (2018).
  19. Lu, D., et al. Host contributes to longitudinal diversity of fecal microbiota in swine selected for lean growth. Microbiome. 6 (1), 4 (2018).
  20. Payne, A., Zihler, A., Chassard, C., Lacroix, C. Advances and perspectives in in vitro human gut fermentation modeling. Trends in Biotechnology. 30 (1), 17-25 (2012).
  21. Muegge, B., et al. Diet drives convergence in gut microbiome functions across mammalian phylogeny and within humans. Science. 332 (6032), 970-974 (2011).
  22. Santiago-Rodriguez, T., et al. Chemostat culture systems support diverse bacteriophage communities from human feces. Microbiome. 9 (3), 58 (2015).
  23. Sousa, T., Paterson, R., Moore, V., Carlsson, A., Abrahamsson, B., Basit, A. The gastrointestinal microbiota as a site for the biotransformation of drugs. International Journal of Pharmaceutics. 363 (1-2), 1-25 (2008).
  24. Pferschy-Wenzig, E., Koskinen, K., Moissl-Eichinger, C., Bauer, R. A Combined LC-MS Metabolomics- and 16S rRNA Sequencing Platform to Assess Interactions between Herbal Medicinal Products and Human Gut Bacteria in Vitro: a Pilot Study on Willow Bark Extract. Frontiers in Pharmacology. 8 (893), (2017).
  25. Cueva, C., et al. In vitro fermentation of grape seed flavan-3-ol fractions by human faecal microbiota: changes in microbial groups and phenolic metabolites. FEMS Microbiology Ecology. 83 (3), 792-805 (2013).
  26. Molly, K., Van de Woestyne, M., Verstraete, W. Development of a 5-step multi-chamber reactor as a simulation of the human intestinal microbial ecosystem. Applied Microbiology and Biotechnology. 39 (2), 254-258 (1993).
  27. Wang, M., et al. Apigenin Impacts the Growth of the Gut Microbiota and Alters the Gene Expression of Enterococcus. Molecules. 22 (8), (2017).
  28. Caporaso, J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
  29. Edgar, R. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
  30. Cole, J., et al. Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 42 (database issue), 633-642 (2014).
  31. McDonald, D., et al. An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea. The ISME Journal. 6 (3), 610-618 (2012).
  32. Liu, L. S., et al. Establishing a mucosal gut microbial community in vitro using an artificial simulator. PLoS ONE. 13 (7), e0197692 (2018).
  33. Van de Wiele, T., Van den Abbeele, P., Ossieur, W., Possemiers, S., Marzorati, M. Chapter 27: The Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem (SHIME ®). The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health. Verhoeckx, K., et al. , Springer Link. (2015).
  34. Van den Abbeele, P., et al. Butyrate-producing Clostridium cluster XIVa species specifically colonize mucins in an in vitro gut model. The ISME Journal. 7 (5), 949-961 (2013).
  35. Possemiers, S., Verthé, K., Uyttendaele, S., Verstraete, W. PCR-DGGE-based quantification of stability of the microbial community in a simulator of the human intestinal microbial ecosystem. FEMS Microbiology Ecology. 49 (3), 495-507 (2004).
  36. Tan, J., McKenzie, C., Potamitis, M., Thorburn, A., Mackay, C., Macia, L. The role of short-chain fatty acids in health and disease. Advances in Immunology. 121, 91-119 (2014).
  37. Yang, J., Kweon, M. The gut microbiota: a key regulator of metabolic diseases. BMB Reports. 49 (10), 536-541 (2016).
  38. Sonnenburg, J., Bäckhed, F. Diet-microbiota interactions as moderators of human metabolism. Nature. 535 (7610), 56-64 (2016).

Tags

Bioteknologi spørgsmålet 144 Gut mikrobiota in vitro- bakteriel dyrkning opstigende kolon tværgående tyktarm faldende colon kortkædede fedtsyrer bakteriel Fællesskabet Bioinformatik
Anvende avancerede In Vitro dyrkning teknologi for at studere den menneskelige Gut mikrobiota
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Firrman, J., Liu, L., Van den… More

Firrman, J., Liu, L., Van den Abbeele, P., Tanes, C., Bittinger, K., Tomasula, P. Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota. J. Vis. Exp. (144), e59054, doi:10.3791/59054 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter