Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Uygulama gelişmiş teknoloji insan Gut Microbiota Eğitim Kültür Vitro

Published: February 15, 2019 doi: 10.3791/59054
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3, 1
1Dairy and Functional Foods Research Unit, Eastern Regional Research Center, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 2ProDigest, 3Division of Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition, Children's Hospital of Philadelphia

Summary

Burada, fizyolojik şartlarda mide bağırsak, taklit Biyoreaktörler bir dizi kullanarak gut microbiota kolon tüp bebek, kültür için bir iletişim kuralı mevcut.

Abstract

İnsan gut microbiota insan sağlığı ve hastalıkları önemli bir rol oynar. Vivo modelini kullanarak gut microbiota okuyan, karmaşık doğası ve memeli bileşenleri ile çeşitli dernek nedeniyle zordur. Bu iletişim kuralı memeli ortamın katkısını düşünün zorunda kalmadan gut microbiota dinamikleri, çalışma için sağlayan gut microbiota in vitro kültür için hedeftir. Vitro kültür teknoloji kullanarak, fizyolojik şartlarda, mide bağırsak, pH, sıcaklık, anaerobiosis ve geçiş süresi gibi parametreleri de dahil olmak üzere simüle. Kolon bağırsak yüzeyini müsin kaplı taşıyıcıları ekleme, mukozal faz oluşturma ve daha fazla boyut ekleme simüle. Gut microbiota insan dışkı malzeme ile aşı kullanılmaya başlandı. Bakteri karmaşık bu karışımı ile aşı farklı boyuna (artan düzende, enine ve azalan iki nokta üst üste) belirli mikroplar zenginleştirilmiş ve tüp bebek modeli enine (luminal ve mukozal) ortamlar. Bu sistemin içinde topluluk ve üretilen metabolitleri stabil bir kararlı duruma ulaşmak izin vermek önemlidir. Bu el yazması deneysel sonuçlar nasıl aşısını gut microbiota topluluk kararlı bir toplum içine zaman içinde gelişir göstermektedir. Kararlı duruma elde bir kez, sistem bakteriyel etkileşimleri ve topluluk işlevlerine çözümlemek veya gut microbiota, gıda, gıda bileşenleri veya ilaç gibi herhangi bir katkı maddesi etkilerini test etmek için kullanılabilir.

Introduction

Gut microbiota insan gastrointestinal sistem (GIT) bulunan mikroorganizmalar bir topluluktur.  Bu topluluk kolon, kolon ortamın1,2ile sembiyoz yaşayan 500-1000 türlerden 1013-1014 bakteri tutmak için tahmini maksimum konsantrasyon ulaşır. Kompozisyon ve gut microbiota işlevselliğini sokumunun2,3,4,5buldum çoğu çeşitliliği ile bölge özel topluluklar, şekillendirme GIT boyunca dağınık şekilde değiştirin. Anatomik her bölge için ayrı mikrobiyal topluluklar lümen ve mukozal astar6bulunur. Gibi yüzeylerde luminal yuvası7arası hareket lümen Topluluk besin daha doğrudan erişimi vardır. Buna rağmen bazı bakteriler tercihen bir enerji kaynağı1,5,8olarak iki nokta üst üste hücreleri tarafından üretilen müsin kullanan mukus katmanda yer alır. Microenvironments farkı luminal ve mukozal aşamalar arasına sapma ve geliştirme aşamasında belirli topluluklar ile sonuçlanır. Birlikte, bu toplulukların besin metabolizma ve vitaminler, üretim gibi metabolik fonksiyonları ve insan patojenleri1,3, kolonizasyon engellemek gibi immünolojik fonksiyonları sağlar 9. gut microbiota aynı zamanda işlevsel olarak konjugasyon insan kolon hücreleri3ile çalışır.

İnsan GIT önemli bir parçası gut microbiota her iki ana sağlık ve hastalık durumu3,9,10,11,12' ye katkıda bilinmektedir şaşırtıcı değil. Bağırsak mikrobiyal nüfus bir kayma gibi bağırsak bağırsak hastalığı (IBD) ve bağırsak bağırsak sendromu (IBS), aynı zamanda diğer hastalıkları, obezite, dolaşım hastalık ve Otizm gibi GIT bozukluklar da dahil olmak üzere birden çok insan hastalıkları ile ilişkili olduğu düşünülmektedir 3 , 9 , 10 , 11 , 12. gut microbiota üretilen metabolitleri gut12,13uzak mekanlar ulaşan bir küresel etkiye sahip. Örneğin, gut-beyin eksen14anksiyete ve depresyon gibi ruhsal bozukluklar ile ilişkilidir. Bu nedenle, gut microbiota eğitim araştırma birden çok alan için önemlidir ve hatta çoğu zaman GIT ile ilişkili birçok hastalık için geçerlidir.

Yaygın olarak gut microbiota eğitim önemli olduğunu kabul ederken, karmaşık bir uğraştır. Birden fazla hayvan modeli, zebra balığı, sıçanlar ve fareler, gibi küçük hayvanlardan maymunlar ve domuzlar15-19gibi büyük olanlar tarafından kullanılabilir. Ancak, bu hayvanlar çevre ve diyet dayalı gelmifltir bir benzersiz bakteriyel topluluk var bu yana uygulamanın insan gut microbiota açısından bu hayvanların değil, basittir ve anatomik olarak insanlar20 ' den farklıdır , 21. insan denekler kullanımı konu ile ilgili soru kaldırır henüz başka bir dizi zorluklar içerir. İnsan çalışmaları pahalı, zaman alıcı ve etik kısıtlanmış11. Ayrıca, Yaş veya gelişimsel sahne, çevre, diyet, ilaç ve genetik faktörler2,4,22de dahil olmak üzere insan çalışmalarda gut microbiota karıştırıcı faktörler etkiler.  Ayrıca ne insanlarda test edilebilir ve örnekleri ne tür ne4hasat edilebilir kısıtlamalar vardır.

Gut microbiota çalışmaya bir vivo içinde sistem kullanarak bir kritik dezavantaj memeli bileşenleri varlığıdır. Gut microbiota ve insan hücreleri birbirleriyle etkileşim ve ayarlama bir in vivo , bu iki ayırt etmek mümkün değildir. Böylece hassas ölçümler hesaplanamaz gut microbiota tarafından üretilen metabolitleri iki nokta üst üste hücreleri tarafından alınır. Bu nedenle, herhangi bir mekanik çalışma noktalardan ölçümleri11' e sınırlı olmalıdır. Örnekleri GIT farklı bölgelerinden boyuna hasat yetersizlik içinde vivo çalışmalar için başka bir büyük dezavantajı ise23. Bu saat12üzerinde iki nokta üst üste microenvironments içinde oluşabilecek değişikliklerin değerlendirilmesi için izin vermez.  İnsan çalışmaları da dahil olmak üzere birçok in vivo çalışmalar analiz gut microbiota12değişiklikleri algılamak için dışkı örnekleri güveniyor. Bu bilgilendirici olsa da, veri gut microbiota arasında GIT sağlamaz ve luminal ve mukozal topluluklar5,6,7,8arasında ayrım yapmaz.

Gut microbiota için bir vitro yöntemi uygulama olmaksızın memeli bileşenlerinden bakteriyel topluluk dinamiklerini incelemek için gereklidir. Vitro yöntemini kullanarak çevre koşulları10, aynı anda birden çok parametreleri sınama ve boyuna örnek yeteneği ve geniş hacimli11sıkı kontrol sağlar. Mekanik bir aygıt ve bir misafir edemeyeceğiniz bir tüp bebek yöntemi kullanır beri hiçbir dikkat edilecek noktalar yaş, çevre, diyet ya da genetik geçmişi için ihtiyaç vardır. Bu sistemleri tüm gut microbiota topluluk sınamak için kullanılan, yalnızca seçili organizmalar veya hatta tek suşları. Önemlisi, tüp bebek sonuçları tekrarlanabilir, henüz çeşitlilik içinde vivo çalışmalar11,22' ye benzer bir düzeyde tutmak.

Söz konusu hipotez ve istenen sonuçları bağlı olarak benn in vitro çalışmalar çeşitli şekillerde yapılabilir.  Tek-gemi sistemleri ve tek toplu iş iş kültürleri 24-48 h25boyunca gerçekleştirmek veya fekal homogenate24 örnekleriyle kuluçka gibi basit yöntemler kullanabilir. Onlar da tek gemi sistemleri ve istikrarlı bağırsak mikrobiyal topluluk11üretmek için bir chemostat sistemi kullanmak gibi daha karmaşık yöntemleri kullanarak yapılabilir. Sadece iki nokta üst üste, bir bölümünü temsil ettiği iki nokta üst üste, enine, artan ve azalan bölgelerinde oluşan olsa bile ancak, tek bir reaktör kullanımı microbiota12 aşırı basitleştirebilirsiniz.

İki nokta üst üste (, enine, artan ve azalan bölgeler) farklı bölgelerinde geliştirir gut microbiota toplum eğitim için karmaşık, çok aşamalı bir sistem istihdam edilebilir. Bu sistem, birden fazla gemileri, enine, artan ve azalan bölgelerin gut microbiota yani ekili bağımsız olarak iki nokta üst üste, farklı bölgelerinde taklit etmek için ayarlanır. Bu gemiler, bağlı inen kolon bölgelere enine için artan üzerinden sırayla yüzeylerde taşımak pompaları kullanarak, GIT yoluyla besin akışının taklit.

Bu çalışmanın amacı nasıl 5 kademeli tüp bebek kültür sistemi ( Tablo malzemelerigörmek) gut microbiota toplum yetiştirmek ve istikrar ve kompozisyon açısından topluluk dinamikleri göstermek için kullanılabilir göstermekti. Bu sistemde bir gemi mide temsil eder ve ince bağırsak temsil eder. İki nokta üst üste (artan, enine, azalan), üç bölgeye her bölge26temsil eden bir gemi ile ayrılmıştır. Bu deneysel kurulumunda iki komple sistemler paralel olarak çalıştırılan, birim 1 ile müsin taşıyıcılara içeren mukozal yüzeyinde ve birim yok müsin taşıyıcıları içeren 2 temsil eder. Her bölge luminal ve mukozal aşamalarında geliştirilen topluluklar 16S rRNA gen sıralama ve SCFA çözümlemesi kullanarak zamanla birbirlerine ve fekal inoculum karşılaştırıldı. Sonuçları sunulan topluluk, kompozisyon ve bu tüp sistemi türünden üretilen işlevsellik açısından hem de türünü gösterir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. malzeme ve ürünleri

Not: Tanımlanmış orta bir toz olarak satın alınır ( Tablo malzemelerigörmek). G/M tanımlanmış ortamda kompozisyon şudur: Arabinogalactan (1,2), pektin (2.0), Xylan (0.5), glikoz (0,4), maya özü (3.0), özel pepton (1.0), müsin (2.0), L-sistein-HCl (0,2).

  1. Tanımlanmış orta hazırlamak
    1. 4 L şişe 2 litre çift kişilik distile, deiyonize su ile doldurun.
    2. 29.2 g tanımlanmış orta tozu suya ekleyin ve birim tam homojenize karıştırın.
    3. Manyetik karıştırıcı ekleyin ve gevşek vida kapağı üzerinde.
    4. Otoklav 30 dk için 121 ° C'de.
    5. Soğutma sonra hazırlanan tanımlanmış orta bir buzdolabı sürekli ajitasyon (manyetik karıştırıcı) ile 4 ° C'de depolayın.
  2. Pankreas suyu hazırlamak
    1. Otoklav bir 5L gemi karıştırıcı çubuk ile distile, deiyonize su 2L eklendi, 121 ° c 30 dk için.
    2. Isıyla sonra su oda sıcaklığında soğutmak izin.
    3. 12.5 g NaHCO3, 6 g safra ve 0.9 g Pankreatin ekleyin. Karıştırmak için manyetik karıştırıcı yerleştirin.
      Not: Pankreas suyu taze her 2-3 gün hazırladı ve ajitasyon sonra o-den yapılmış ile buzdolabında.
  3. Fosfat tampon
    1. Manyetik karıştırıcı bulunan manyetik karıştırıcı çubuk içeren bir 1 L şişeye koyun. 0,5 L distile, deiyonize su ekleyin ve ajitasyon üzerinde açın.
    2. Sonra 6.8 g KH2PO4, 8,8 g K2HPO4ve 0.1 g sodyum thioglycolate ekleyin. Son hacmi 1 L. su ile kapalı üst
    3. Bileşenleri tamamen çözülmüş sonra 7.0 kullanarak NaOH pH ayarlayın.
    4. Arabellek gevşek ve değil sıkıca kapalı bir vidalı kapak kapağı ve kapağı üzerinde mahvoldu otoklav 30 dk. sağlamak için 121 ° C'de 2 L kap içine dökün.
    5. Otoklav çıkardıktan sonra çözüm oda sıcaklığına kadar soğutmak izin verin. Arabellek, oda sıcaklığında 2 hafta için saklayın.
  4. Müsin agar taşıyıcıları hazırlamak
    1. Basınçlı kap plastik müsin taşıyıcıları ( Tablo malzemelerigörmek), forseps, plastik kafes (borulu şekli) ve ZIP kravat 131 ° C'de 30 dk için.
    2. Otoklav çift 300 mL distile, 131 ° c 30 dk. mağaza oda sıcaklığında su kullanımı kadar de-iyonize.
    3. Bir Biyogüvenlik laminar akış ile kabine, steril Petri yemekler steril forseps kullanarak plastik müsin gemileri ile doldurun.
      Not: Müsin taşıyıcıları müsin agar ile dolu boş plastik daireler vardır. Dolu bir kez kapak üstüne yerleştirilebilir ve bunlar bir kenara koyun.
    4. Müsin agar hazırlamak için 300 mL autoclaved su 3 g bakteriyel agar ve domuz müsin 15 g ekleyin.
    5. Bir duman başlıklı bu çözüm kaynatın, ısı kaynağından çıkarın ve 1 dk. tekrarlamak için kaynar ve toplam 3 kez soğutma soğumasını bekleyin.
    6. Müsin agar solüsyon içeren cam kap dokunmak serin olduğunda, hareket Biyogüvenlik laminar akış ile kabin içine.
    7. Biyogüvenlik laminar akış ile kabine, sıvı müsin agar kabında yerleştirildi plastik müsin taşıyıcıları üzerine dökün. Tüm taşıyıcılar müsin agar ile tamamen dolu olun.
    8. Kapağı üzerinde geri Petri kabına yerleştirin ve laminar akış altında soğumasını bekleyin.
    9. Müsin taşıyıcıları bir araya getirmek için autoclaved plastik kafes bezi al ve müsin taşıyıcıları Petri kabına steril forseps kullanarak üzerinden katılaşmış müsin agar içeren eklemek.
    10. ZIP bağları mesh uçlarını kapatmak için kullanın. Bu şekilde müsin taşıyıcıları içerecek şekilde net işlevleri müsin agar ile dolu. 4 ° C'de kullanmak kadar saklamak.

2. set up, aşılama ve sistemin çalışmasını

  1. Kodlamayla sistemi kurmak
    Not:     insan bağırsak mikrobiyal ekosistem ikiz simülatörü bu çalışma için kullanıldı.
    1. Manyetik karıştırıcı karıştırıcı çubuklarını içeren 10 Biyoreaktörler yerleştirin ve ajitasyon üzerinde açın.
      Not: 2 adet 10 Biyoreaktörler gerektirir böylece her birim 5 Biyoreaktörler oluşacaktır.
    2. 5 Biyoreaktörler birbirlerine silikon tüp yoluyla peristaltik pompa (Şekil 1) sırayla kullanarak bağlayın. Enine için pompalar sıvı içeriği sonraki bir biyoreaktör kullanın.
    3. Aşağıdaki sırayla Biyoreaktörler etiket: mide, ince bağırsak, artan kolon enine kolon, kolon gastrointestinal sistem sırasını göstermek için azalan.
      Not: Biyoreaktörler tüm özdeş olabilir, ya da onlar daha az hacim tutmak beri mide ve ince bağırsak Biyoreaktörler daha küçük iki nokta üst üste Biyoreaktörler için karşılaştırılabilir. Bu şekilde Biyoreaktörler kurma anlamına gelir artan kolon bölge besin ince bağırsak alır, enine kolon bölge besin artan kolon bölgesinden alır ve besin inen kolon bölge alır enine bölge. Bu şekilde, sistem sindirim sistemi yoluyla besin sıralı hareketi taklit.
    4. Tanımlanmış orta ve pankreas suyu bir buzdolabı 4 ° C'de sabit ajitasyon manyetik karıştırıcı kullanarak yerleştirin. Silikon tüp kullanarak, mide biyoreaktör peristaltik pompa ile tanımlanmış orta bağlanmak ve pankreas suyu bağırsağın peristaltik pompa yoluyla bağlanın.
    5. Tanrıları Ajan bir idrar drenajı Ekle. İnen kolon peristaltik pompa yoluyla idrar drenajı çanta bağlayın. Katılaşmış imha deneme sırasında biyolojik atık olarak.
    6. Silikon tüp kullanarak, sırayla her geminin su ceketi bağlayın ve her iki ucu dolaşımdaki su banyosu bağlayın. Dolaşımdaki su banyosu ile distile su (Bu tutar kullanılan su banyosu dolaşan türüne bağlı olarak değişir) ve koymak 37 ° C'ye doldurun
    7. Silikon tüp kullanarak, asit ve baz kapağını her geminin Peristaltik pompalar yoluyla bağlanın. Önerilen konsantrasyonu 0.5 M HCl ve 0.5 M NaOH dir.
    8. Belirtilen bağlantı noktası üzerinden her araç için pH Probe prob kapağı takın. Bu bağlantı noktası pH probu ve vidalı kapak (Şekil 1) içine tutmak için tasarlanmıştır. Her bölge için pH aşağıdaki gibi ayarlayın: mide, pH = 2; İnce bağırsak, pH 6.7-6,9; = Artan kolon, pH = 5.6-5,9; Enine kolon, pH = 6.15-6.4; İnen kolon, pH 6,9 6,6 =.
      Not: Başlangıç aşamasında topluluk bağlı olarak bölge pH değerleri arasındaki farkı ayırt etmek. Besleme döngüleri başladığınızda, ancak, topluluklar daha fazla besin giriş farklılıkları dayalı olgun.
    9. Belirtilen bağlantı noktası kullanarak her araç kapak için silikon tüp kullanarak bir azot hattı bağlayın. Azot satırı aşağıdaki sırayla akışı gerekir: mide, ince bağırsak, artan kolon enine kolon, kolon azalan. Her birim kendi floş çapraz bulaşma kaçınmak için olduğundan emin olun.
      Not: Azot sistemden kaldırılan oksijen kullanılır ve anaerobiosis deneme sırasında korur.
    10. Belirtilen bağlantı noktası kullanarak her biyoreaktör kapağını bir metal örnek tüp takın. Metal boru aşağı biyoreaktör uzanır ve sıvı örnekleri toplamak için kullanılır.
    11. Silikon tüp küçük bir parça örnek tüp üst kısmına ekleyin ve bir şırınga için örnekleme sırasında kullanılmasına izin veren bir radarı kilit bağlamanıza.
  2. Aşılama sistemi
    1. İki nokta üst üste bölgeler aşağıdaki birimler kullanılarak tanımlanmış orta ile doldurun: 500 mL artan kolon, enine kolon 800 mL ve inen kolon 600 mL.
    2. Müsin agar taşıyıcı kolon bölgelerde reaktör hacmi orantılı bir tutar ekleyin. Bu deneme için reaktörün başına 60 taşıyıcıları kullanılmıştır.
    3. Taşıyıcılar ekleme biyoreaktör sıvı seviyesini yükseltir bu yana örnek tüp ve bir şırınga kullanarak herhangi bir aşırı tanımlanmış orta kaldırın.
    4. Bilgisayarı kullanan her reaktör pH ayarlamak için pH Probe prob açın.
    5. Azot flush 20 dk için açın.
      Not: Aşılama için kullanılan fekal homogenate % 10 dışkı içinde %10 gliserol çözelti homojen olarak satın alınır ( Tablo malzemelerigörmek). Dışkı örneği aşağıdaki ölçütleri ile bağış bir havuzdan rasgele seçilir: tipik bir Batılı Diyet (vegan veya vejetaryen değil) en az 1 yıl, ortalama beden kitle indeksi (18,5-24,9) ile 21-45 yaşları arasında antibiyotik ücretsiz tüketen bir Amerikan . Bu iletişim kuralı için yalnızca tek bir verici kullanılır. Ancak, bu deneysel tasarım nedeniyle değiştirilebilir.
    6. Aşılama öncesi, üreticinin yönergeleri izleyerek fekal homogenate çözülme.
    7. Her iki nokta üst üste reaktör fekal homogenate bir miktar eşit bir 60 mL şırınga (artan kolon enine kolon, inen kolon için 30 mL için 40 mL için 25 mL) kullanarak örnek bağlantı noktası üzerinden reaktör hacmi %5 ekleyerek aşılamak.
    8. Gecede pH kontrolü ile Biyoreaktörler kültürlerde büyümek.
    9. Sonra gece büyüme, her kolon bölgesinden Bölüm 3 ayrıntılı olarak luminal sıvı örnekleri hasat. Örnekleme tamamlandıktan sonra besleme başlamak için bilgisayar programı açın.
  3. Günlük döngüleri besleme
    Not:     günlük beslenme çevrimleri otomatik bilgisayar vardır.
    1. Günde üç kez tanımlanmış orta 140 mL mide biyoreaktör pompa ve 1 h için kuluçkaya için izin.
    2. 1 h kuluçka sonra mide içeriğini bağırsağın pompa. Aynı zamanda, pankreas suyu 60 mL bağırsağın pompa.
    3. İnce bağırsak pH 6.7-6,9, pH ayarı etkinleştirin ve 90 dakika için kuluçkaya karışım izin verin. Kuluçka sırasında azot flush 10 min Toplam için her sistem için açın.
    4. 90 dk kuluçka sonra ince bağırsak pompalar artan kolon, kolon enine, enine kolon inen kolon ve atık inen kolon için artan kolon için aynı anda açın.
  4. Deneysel zaman çizelgesi
    Not:     tüp bebek sistemi burada kullanılan uzunluğu yaklaşık 8 hafta boyunca sürekli bir biçimde işletilmektedir. Aşağıda önerilen deneysel zaman çizelgesi, ancak, bu denemenin amacı ve gereksinimleri bağlı olarak değiştirilebilir.
    1. Aşağıdaki adım adım 2.1 listelenen sistem kurmak.
    2. Gecede büyüme aşağıdaki protokol sonrası hasat örnekleri. Günde üç kez yukarıdaki protokol sonrası beslenme günlük döngüsü başlar.
    3. Toplam bakteri stabilize etmek izin vermek için 2 hafta denemenin çalıştırın.
      Not: Sistem çalıştırıyor pH korunur, günlük beslenme çevrimleri üç kere a gün takip edilmektedir ve mukozal taşıyıcıları her 2 - 3 kez değiştirilir hafta.
    4. Sabitleme sonra 2 hafta deneme kontrol dönemi çalıştırın.
    5. Kontrol dönemi sonra sistem farklı bileşenleri veya tedavi dönemi olarak bilinen değişkenleri sınamak için kullanın.
    6. Tedavi süresinden sonra bileşenleri veya değişken eklemeyi durdurma ve şartlar normale döner. Bu wash-out dönemi olarak kabul edilir ve topluluk kalıcı değişiklikler olup olmadığını belirlemek için kullanılır.

3. hasat sistem örnekleri

Not: Deneme sırasında örnekleri, herhangi bir zamanda herhangi bir bölgesinin luminal veya mukozal aşamasından takip hasat edilebilir yönergeler aşağıda.

  1. Luminal örnekleri hasat
    1. Kültür sıvı orta uzanır örnek bağlantı noktası üzerinden luminal sıvı örneklerini hasat. Radarı kilit ile % 70 etanol ya da küçük alkol yüzeyini örnek noktasında temizleyerek başlar ve kurumasını sağlar.
    2. Tüm hava 30 mL şırıngadan kaldırıldığından emin olmak ve örnek bağlantı noktasına bağlayın. Yukarı ve aşağı için 3 - 5 kez çizmek uygun gemi bileşenlerinin karıştırma sağlamak. Sonra kültür 30 mL toplam çizin.
    3. Aliquot steril şahin tüpler ve buz üzerinde mağaza içine luminal örnek olarak gerekli. Örnekleme tamamlandıktan sonra bunları bir-80 ° C dondurucu aktarın.
    4. SCFA analiz için 15 mL luminal örnek 4 ° c, 5000 x g 10 min için dönmeye başladı. Süpernatant PES 0,2 mikron filtre kullanarak filtre uygulanmış şırınga var. Filtre uygulanmış süpernatant-80 ° C'de depolayın
      1. DNA analizi, spin luminal sıvı 4 ° C'de 1 mL, 5000 x g 10 dakika süreyle süpernatant atmak ve-80 ° C'de Pelet saklarız
      2. Yedek olarak, 10 mL luminal sıvı çoğu deneyleri için-80 ° C'de depolayın.
  2. Mukozal örnekleri hasat
    Not:     2-3 günde mukozal taşıyıcıları değiştirmek.
    1. Kaldırmak ve buzdolabı hazırlanan müsin taşıyıcıları ortaya çıkarmak.
    2. Azot floş açın ve hızlı bir şekilde reaktör kapağını açın. Müsin taşıyıcıları % 50'si kaldırıp yenilerini eklemek.
    3. Hızlı bir şekilde kapağı mühür ve nitrojen floş için başka bir 20 dakika tutun.
    4. DNA ekstraksiyon, aliquot 0,25-0,5 g 2 mL tüp içine agar ve-80 ° gerekinceye kadar C'de depolanan.

4. DNA ekstraksiyon, sıralama ve Analizi

Not: DNA'ın bir duman hood29fiziksel homojenizasyon ile CTAB DNA ekstraksiyon yöntemi kullanarak elde edilir. Ayıklama bir spektrofotometre her örnek DNA miktarını ölçmek için kullanılır.

  1. CTAB arabellek hazırlamak
    1. 4.2 g K2HPO4 boyutu ve 4,09 NaCl 200 mL deiyonize, distile su, daha sonra 30 dk için 121 ° C'de otoklav geçiyoruz.
    2. Oda sıcaklığında soğumaya çözüm izin verin.
    3. Ajitasyon ile 60 ° c Hexadecyltrimethylammonium bromür (CTAB) ve ısı 10 g ekleyin.
    4. Sonra tüm CTAB çözülür, çözüm oda sıcaklığında ısı ve serin çıkarın.
  2. PEG-6000 çözüm hazırlamak
    1. Polietilen glikol 6.000 ve 93.5 g NaCl 1 litre deiyonize distile su içinde 300 g geçiyoruz.
    2. Tüm parçacıklar sonra çözünmüş otoklav 30 dk için 121 ° C'de çözüm.
    3. Isıyla sonra oda sıcaklığında kullanmadan önce çözüm serin.
  3. DNA ekstraksiyon gerçekleştirmek
    1. CTAB arabellek 500 μL ve fenol kloroform izoamil alkol 500 μL 2 mL örnek tüp ve girdap homojenize ekleyin.
    2. Örnek tüp tüm içeriğini bir 0,1 mm fiziksel homojenizasyon tüp ( Tablo malzemelerigörmek) aktarın.
    3. Tüpler 20 homojenize en yüksek iki zaman arasında fiziksel bir homogenizer kullanarak bir 20 s duraklama ile ayarlama, s ( Tablo malzemelerigörmek).
    4. 3000 x g 5 dakika için de homojenize tüpler santrifüj kapasitesi.
    5. 300 μL süpernatant, bir temiz, 1.7 mL tüp transferi ve özgün tüp CTAB arabelleği 500 μL ekleyin.
    6. Yine de 3000 x g 5 min için adımları 4.3.2-4.3.3 ve santrifüj yöntemleri kullanarak bu tüp lunaparkçı.
    7. Santrifüjü sonra başka bir 300 μL süpernatant, şimdi 600 μL içeren yeni tüp aktarın.
    8. Toplam 600 μL kloroform izoamil alkol süpernatant ile 600 μL içeren tüp ekleyin.
    9. Mix ve kısa bir süre sonra santrifüj kapasitesi tüplere tersine çevirin. Üst aşaması 500 μL temiz 1.7 mL tüp aktarın. Sadece üst aşama almak için emin olun.
    10. Daha sonra 1000 μL Peg-6000 çözüm ekleyin, karıştırın ve 2 h için oda sıcaklığında kuluçkaya tüplere ters çevir.
    11. Kuluçka sonra 18,200 x g, 10 min için 4 ° C de tüpler santrifüj kapasitesi.
    12. Süpernatant atın ve Pelet buz soğuk % 70 etanol ile temiz.
    13. 10 dk. süpernatant atmak ve Biyogüvenlik kabini laminar akış altında kurumasını Pelet izin 18,200 x g, 4 ° C, yine de tüpler santrifüj kapasitesi.
    14. Pelet kuru sonra RNAse free, ücretsiz DNaz, steril su 75 μL her tüp için ekleyin.
    15. Resuspended DNA tarafından spektrofotometre ölçmek ve sonra onu 16S rRNA gen sıralama için yolluyorum.

5. kısa zincir yağ asidi (SCFA) algılama ve Analizi

  1. Donmuş numuneler için 30 dk 40 ° C'de erimek ve kısa zincirli yağ asitleri bir 2:1 (v: v) oranı dietil eter kullanarak ayıklayın.
  2. Bir sütun, 30 m, 0,25 mm donatılmış Organik faz bir GC/MS (bkz. Tablo reçetesi) için aktarım kimliği, 0.25 µm ( Tablo malzemelerigörmek) nerede 10 µL enjekte edilir.
  3. Enjeksiyon bağlantı noktası sıcaklığı ve ilk sütun sıcaklık 260 ° C ve 125 ° C için sırasıyla ayarlayın. 1 dk. için ilk sıcaklığı tutun ve ardından bu 250 ° c, 11.5 min 1 mL/dak bir sütun debi ile artırın.
    Not: MS İyon kaynağı için 220 ° C ve arabirim için 250 ° C sıcaklığıdır.
  4. Standart eğrileri ve 2-methylhexanoic asit iç standart olarak kullanarak her SCFA miktarını ölçmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Yukarıdaki Protokolü kurmak, aşılama ve gut microbiota kolon çalışmaya 5 kademeli tüp bebek sisteminin çalışmasını açıklar. DNA ekstraksiyon, takip altındaki, sunulan verileri oluşturmak için 16S rRNA marker gen DNA sıralama V1V2 bölgesinin (örneğin, MiSeq Illumina platformu) çocuk hastanesinde Microbiome merkezine göre sıralama yüksek üretilen iş kullanarak gerçekleştirildi Philadelphia27. QIIME (nicel içgörü mikrobiyal ekoloji) sürüm 1.928 sıralama verileri işlemek için kullanılan ve istatistiksel analiz R çevre istatistiksel bilgi işlem29tarihinde gerçekleştirildi. Taksonomik atamaları Greengenes 16S başvuru veritabanı30,31kullanarak oluşturulan. OTU göreli bolluk değerleri bölerek OTU okuma sayısı okuma örnekteki toplam sayısına göre hesaplanmıştır. SCFA düzeyleri açıklanan protokolünü kullanarak sayısal.

vitro topluluklar kararlı duruma denge elde

Gut microbiota ve bir çok aşamalı sistemi ile kısa zincir yağ asidi (SCFA) üretim vitro çalışma mikrobiyal topluluklar kararlı bir duruma ulaşmak gerekir. Bu aşı sonra takson kendi niş içinde kurulan olmak ve toplum ve onların metabolitleri kompozisyonu dalgalanıyor artık ortaya çıkar. Bir sabit durumda toplum ve ürünleri aynı zaman içinde kalır. Tüp bebek gut microbiota çalışmaları için istikrar önemli bir gereksinimdir; istikrar gözlenen değişiklikler olup olmadığını deneysel koşullar nedeniyle ortaya çıkan veya değişim nedeniyle olup olmadığını belirlemek mümkün değildir. Zaman zaman puan32arasında % 80 benzerlik ne literatürde göre teklif edildi, bir topluluk istikrarlı kabul edilebilir.

16S rRNA marker gen sıralama sonuçlarını kullanarak, anapara Coordinates analiz (PCoA) araziler üzerinde unweighted ve ağırlıklı UniFrac mesafeler dayalı sistem her bölgede zaman içinde (Şekil 2) geliştirilmiş olan topluluk üretildi. Unweighted bir analiz türlerin varlığı/yokluğu açısından topluluklar karşılaştırır. Ağırlıklı analiz sadece varlığı/yokluğu üzerinde tür göre karşılaştırır ancak aynı zamanda kendi bereket dikkate alır. Birim 1 için bu her iki luminal ve mukozal aşamaları, dahil ve birim 2 sadece luminal faz. Bu çözümleme bağlı olarak, topluluk kayda değer 1 ile 7 gün arasında değişen gözlendi. Ancak, deneme sonuna kadar gün 11 sonrası aşılama örnekleri PCoA alanı küçük bir bölgenin işgal etti. Bu OTU varlığı-yokluğu (Şekil 2A) veya OTU bereket (Şekil 2B) temel örnek örnek mesafe puanları için doğruydu. Böylece, 11 gün sonra bereket ve bakteri türleri için ileri bir örnek noktasından kararlı olduğunu, gözlendi. Bu desen her iki luminal ve mukozal aşamaları tüm üç kolon bölgelerinde birim 1 ve birim 2 luminal aşaması için gözlendi. Bu sonuçlar resimli luminal ve mukozal aşamaları istikrar ulaşmak ve bu aynı zamanda oluştu.

Sistem kararlılığını da kısa zincirli yağ asitleri (SCFAs) üretim zaman içinde analiz ederek probed. Üç en önemli SCFAs (propiyonik asit, butanoic asit ve asetik asit)38 gaz kromatografi GC/MS kullanarak deney boyunca her örnekte ölçülen. Bu ölçümler propiyonik asit, butanoic asit ve asetik asit deneme başından itibaren gün 15 sonrası aşılama (Şekil 3A-C) kadar dalgalanma saptandı. 15 gün sonra bu SCFAs miktarda kaldı sadece deneme (Şekil 3A-C) sonuna kadar en az değişimleri ile sürekli, her iki nokta üst üste bölgede üretilen. Zaman puan arasındaki farkı ortalama %6,8 propiyonik asit, asetik asit % 7,2 ve %8,02 butanoic asit için yapıldı. Bu topluluk kompozisyon benzer, metabolik özellikleri toplumun kararlı bir duruma girdiğinizi istikrarlı SCFAs miktarda üretim zaman içinde gösterildiği gibi göstermektedir. Birim 1 ve birim 2 üretilen SCFAs, benzer miktarda ile iki arasında önemli bir fark yoktur (p > 0.05). Bu SCFAs üretimini varlığı ya da yokluğu mukozal toplum tarafından etkilenen değil olduğunu belirtti. Bu deneyde belirlenen istikrar daha önce rapor benzer noktasıdır, hangi o topluluk sabitleme bir 5 kademeli tüp bebek sisteminde yaklaşık oluştuğunu ifade edildi olarak 2 hafta sonrası aşılama33unutulmamalıdır, 34,35.

Topluluklar geliştirilen vitro sistem için inoculum benzer

İkinci öğe bir tüp bebek gut microbiota deney için geliştirilen modelde topluluk fekal inoculum mikrobiyal çeşitliliği korur gerekli. Bu deneyde kullanılan sistemi üç farklı kolon bölgeler için sağladığı herhangi bir bölgeyle tam olarak fekal inoculum aynı olması beklenemez. Ancak, her topluluk üyeleri fekal inoculum türetilmiştir ve hep birlikte çeşitlilik inoculum olarak benzer bir düzeyde korumak bekleniyor.

16S rRNA marker gen sıralama sonuçlarına göre her iki nokta üst üste bölge luminal ve mukozal aşaması için Ortalama, istikrarlı topluluk kararlı (gün 15-28 sonrası aşılama) yapıldı ve fekal inoculum (Şekil 4A) topluma göre. Bu sonuçlar tüp sistemi, bireysel kolon bölgelerinde geliştirilen olan topluluk bileşiminde fekal inoculum benzer olduğunu göstermektedir. Reaktör, Clostridiales ve Bacteroidales, en önemli iki sırada bu inoculum içinde gözlenen eşleştirdi. Ancak, iki nokta üst üste bölgelerde birden fazla düşük-bereket bakteriyel sipariş sipariş Burkholderiales ve Synergistales (Şekil 4A) arasındaki en belirgin farkları ile inoculum farklı.

Tüp bebek sistemi için alfa çeşitlilik sabitleme sonra toplum yapısının başka bir ölçü birimi olarak inoculum için karşılaştırıldı. Zaman içinde her bölge için hesaplanan Shannon dizin olarak luminal örnekleri artan bölge (şekil. 4B) hariç tüm bölgelerin inoculum çeşitliliğinin benzer bir seviyeye ulaştı. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar tüp bebek kültür sistemi bir topluluk fekal inoculum, kompozisyon ve çeşitlilik (Şekil 4A-B) açısından karşılaştırılabilir üretmek mümkün olduğunu göstermek.

Kullanarak bir vitro sistem için bölge ve faz belirli toplulukları geliştirme sağlar

Bu sistemde temsil üç kolon bölgeleri farklı pH değerlerinde korunur ve farklı besin malzemeleri almak. (Bu protokolü bölümünde belirtilmiştir). Buna göre bu bölgelerde topluluklar 33ayırt bekleniyor. İstikrarlı (15-28 gün) luminal topluluklar birim 1 ve birim 2 aile düzeyinde belirlenmesine ve göreli bereket (Şekil 5) göre çizilen. Belirli takson zenginliği açısından üç kolon bölgeler arasındaki sapma gösterir her bölgenin benzersiz bir topluluk geliştirir. Bu da Şekil 2 ve Şekil 4Asonuçlarını tarafından desteklenir. Şekil 2' de, PCoA grafik farklı yerlerdeki her bölgede geliştirilen olgun topluluklar küme. Şekil 4A, baskın sipariş üyeleri yüzde olarak her iki nokta üst üste bölge toplumlarında farklıydı.

Ünite 2 hiçbir müsin taşıyıcıları varken bu deneme için birim 1 mukozal gemileri ile sağlandı. Bu deneysel tasarım dayalı, mukozal yüzey katkı muayene. Karşılaştırma amacıyla, istikrarlı (15-28 gün) luminal ve mukozal topluluklar için birim 1, Aile düzeyinde birlikte göreli bereket (Şekil 6) göre çizildi. Bu kompozisyon tüm üç iki nokta üst üste için luminal ve mukozal toplulukların bazı özellikleri, en önemli varlık Lachnospiraceae bolluk içinde farklı açıktır ve Bacteroidaceae. Bu sonuçlar da üç bölgeye mukozal topluluklarda birbirinden farklı olduğunu göstermektedir. Örneğin, Clostridiaceae azalan ve enine bölgeleri mukozal topluluklarda zenginleştirilmiş ve artan kolon ama enine veya iki nokta üst üste bölgelerde azalan değil, mukozal faz Veillonellaceae yüksektir. Birlikte ele alındığında, bu rakamlar içinde sunulan sonuçlar topluluklar her aşamasında ve her bölge için kompozisyon bölgeleri arasında benzer ve bir fark olduğunu gösteren bazı özellikleri arasında açık bir fark olduğunu göstermek bereket.

Ne kadar DNA sıralama Analizi bir bölge-özgül topluluk gelişimi ortaya çıkarır, bölgeler arasındaki SCFAs üretiminde belirgin hiçbir fark yoktur. Asetik asit ortalama oranı: Propionik asit: Butanoic asit istikrarlı toplum (15-28 gün) için her bölge (Şekil 7A) olarak hesaplanır. Farklı SCFA oranları oldukça benzer kaldı ise SCFAs (Şekil 7B) azalan bölgede bulunan en üst düzey, enine artan ve azalan bölgeler arasında üretilen toplam miktarda bir artış. Bu birim 1 ve birim 2 için de geçerlidir.

Figure 1
Şekil 1: 5 aşamalı, tüp bebek deneysel tasarım Illustration. Komple sistem aşağıdaki bileşenlerden oluşur: elden ele dolaşan bir su banyosu, azot akışı, cam Biyoreaktörler kümesi, birtakım manyetik karıştırıcı barlar ve manyetik karıştırıcı, pH Probe prob, 40 Peristaltik pompalar, içeren bir bilgisayar kontrollü konsol bir Bilgisayar monitörünüzün ve bir buzdolabı. Ana sistem Biyoreaktörler mide, ince bağırsak ve artan, enine ve inen kolon bölgelerinin taklit eden bir dizi oluşur. İki tam birimleri paralel olarak çalıştırmak için bir deney ve kontrol grubu için sağlayan ayarlanır. Bu 10 Biyoreaktörler, 10 pH Probe prob ve 10 manyetik karıştırıcı bu deneme için gerekli olduğu anlamına gelir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: tüp bebek topluluk gün 11 sonrası aşılama tarafından stabilize. (A)Unweighted ve (B) ağırlıklı Unifrac mesafeler üzerinde birim 1 ve birim 2 luminal aşaması her bölge luminal ve mukozal aşaması zamanla tabanlı PCoA analizi. Arsa bileşenlerine yönlü PCoA eksenleri hesaplama sonra. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: SCFAs üretim tüp sistemi tarafından gün 15 sonrası aşılama tarafından stabilize. Propiyonik asit, Butanoic asit ve asetik asit(a)artan kolon (B) enine kolon ve (C) için zaman içinde iki nokta üst üste azalan ölçümleri. Deneme nüsha gerçekleştirildi. Sonuçları üç bağımsız ölçümlerin ortalama standart sapma gösteren hata çubukları ile temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: Fekal inoculum istikrarlı topluluklarına tüp sisteminden karşılaştırılması. (A) istikrarlı topluluklar (D15-28), sipariş düzeyinde ortalama ve pasta grafiklerde ve fekal inoculum her iki nokta üst üste bölge mukozal ve luminal aşaması için biçimlendirilmiş. (B) Shannon çeşitlilik fekal inoculum (Siyah noktalı çizgi) karşılaştırıldığında her iki nokta üst üste bölge mukozal ve luminal aşaması için. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: her iki nokta üst üste bölge luminal ve mukozal aşamasında teşvik farklı topluluklar büyüme. Ortalama göreli bolluk, Aile düzeyinde, luminal ve mukozal faz ve inoculum için kararlı olan topluluk (D15-28) hesaplanır ve birlikte her iki nokta üst üste bölge için çizilen. Hata çubukları timepoints arasında standart sapmayı temsil eder. AC1 kolon birim 1; artan = TC1 transvers kolon birim 1; = DC1 inen kolon birim 1; = AC2 kolon ünite 2; artan = Tc2 transvers kolon ünite 2; = DC2 inen kolon ünite 2 =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: her iki nokta üst üste bölge tüp bebek sisteminin benzersiz bir topluluk geliştirir. Ortalama göreli bolluk, her iki nokta üst üste bölgesi ve fekal inoculum istikrarlı topluluklar (D15-28) için aile düzeyinde hesaplanır ve birlikte çizilen. Deneme nüsha gerçekleştirildi. Sonuçları üç bağımsız ölçümlerin ortalama standart sapma gösteren hata çubukları ile temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: asetik asit oranı: Propionik asit: Butanoic asit her iki nokta üst üste bölge için benzer. (A), asetik asit, propiyonik asit, butanoic asit, her iki nokta üst üste bölgesinin kararlı olan topluluk (D15-28) tutarların hesaplanır ve bir oranı için dönüştürülür. (B) oranları yüzde her iki nokta üst üste bölge olarak çizildi. Hata çubukları timepoints arasında standart sapmayı temsil eder. AC1 kolon birim 1; artan = TC1 transvers kolon birim 1; = DC1 inen kolon birim 1; = AC2 kolon ünite 2; artan = Tc2 transvers kolon ünite 2; = DC2 inen kolon ünite 2 =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

İn vitro kodlamayla sistemleri kalın bağırsak gut microbiota incelemek için geliştirilmiştir. İki nokta üst üste33her bölge için bir olgun bağırsak mikrobiyal topluluğun büyüme teşvik mide bağırsak, fizyolojik şartlarda benzetimini yapmak için tasarlanmış çizgisel kullanıyorlar. Mantıklı ve anlaşılır bir kavramdır, gut microbiota çalışmaya tüp bebek kodlamayla sistemlerinin gerçek çalışan hassas ve ne gerekli ve güvenilir sonuçlar üretmek için beklenen bir anlayış gerektirir.

Bir tüp bebek gut microbiota deney için gerekli öğeler topluluk aşı sonra istikrar ulaşmalıdır ve fekal inoculum mikrobiyal çeşitliliği korumak gerekir vardır. Deneme düzgün çalışırsa, bu iki gerekli öğeleri kolayca ve tahmin edilebileceği gibi elde edilir. Sistem kararlılık ve çeşitlilik etkiler protokolünde önemli adımlar şunlardır: tanımlanmış orta ve pankreas suyu hazırlanması doğru olmalıdır ve bu yüzeylerde teslimini tutarlı olması gerekir. Anaerobik deneme sırasında muhafaza edilmelidir. Bağırsak her bölge pH doğru bir şekilde zaman içinde muhafaza edilmelidir. Deney sırasında bu üç parametre değişiklikleri nüfus dalgalanmalar ve değişken metaboliti üretim sonuçlanabilir.

Çok aşamalı tüp bebek sistem bu tür kullanmanın birçok avantajı vardır. Özellikle, onlar farklı bölgelerde kolon simülasyonu. Ayrıca tüp bebek sindirim tükürük ve ayrıca Pankreatin ve safra enzimatik bileşenleri de dahil olmak üzere üst GIT yiyecek benzetimini yapmak için tasarlanabilir. Mukozal bir aşama daha fazla karmaşıklık8ekleme her iki nokta üst üste reaktör dahil edilebilir. Bu bölge ve ayrı ayrı analiz ve karşılaştırıldığında faz belirli mikrobiyal toplulukları geliştirme olur. Bu tür sistemler kolayca yönetilebilir, deneysel tasarım ile fiziksel yeniden yapılandırılması, pH, sıcaklık veya yoldaki süre, gibi fizyolojik parametrelerinin değişikliklere bağlı olarak veya aşı ile özel dışkı örnekleri26 . Önemlisi, araştırma bu tüp bebek sistemlerinde gelişmiş toplumların bağırsak mikrobiyal topluluk11,26,34temsil resimli.

Çok aşamalı tüp bebek sistemlerinin kullanımı mechanistically gut microbiota eğitim için kullanılan süre kısıtlamaları bulunmaktadır. İlk olarak, fizyolojik şartlarda programlanabilir olmakla birlikte, onlar böylece ortalama kişi temsil eden belirli ortalama değerleri kullanarak sabitlenir. Bir basitleştirme önemli arası bireysel variatiability12,23olduğundan bu. İkinci olarak, memeli bileşenleri eksikliği bir tüp sistemi kullanmak için bir neden olsa da, bir sınırlama da düşünülmelidir. Bağışıklık sistemi gibi memeli belirli bileşenleri eksikliği tüp bebek modeli ve karşılık gelen içinde vivo microenvironment12,23arasındaki farklar neden olabilir. Ancak, bu sınırlamaların mechanistically gut microbiota çalışmaya tüp bebek sistemleri kullanılarak elde olması içgörü ve değerini düşürmek değil. Son olarak, kültürleri yok emilimini su veya metabolitleri ile cam Biyoreaktörler yetiştirilen. Bu önemli bir fark ve SCFAs nerede SCFAs toplam tutarlar için iki nokta üst üste bölgeleri (Şekil 7) azalan enine için artan üzerinden artmaktadır ölçüm etkisi görülebilir. Bu ters, ne nerede SCFAs en yüksek konsantrasyonları uzağından, artan bölgede bulunur ve en düşük konsantrasyonlarda bulundu klemple36vivo, görülmektedir. Ne zaman SCFAs net üretimini her bölge için olarak, ancak, o zaman bu çoğu SCFA üretim yükselen üste meydana gelen belirlenebilir. O da burada bu bakteri yükü bu deneyde ölçüldü değil belirtilmelidir. Bakteriyel yük bu sistemdeki bölgeler arasındaki farkları SCFAs üretilen toplam tutarlar üzerinde bir etkisi olabilir.

Sonuç olarak, iyi gut microbiota insan sağlığı ve hastalık bir rol oynar ve bu diyet ve metabolizma sağlık37,38arasında bir arabulucu olarak çalışmaya kabul olduğu bilinmektedir. Burada, gut microbiota çalışmaya uygulama vitro sistemin tartışılmış ve istikrarlı bir topluluk gelişimini gösteren bir deney sonuçlarından sunuldu. Bir tüp bebek sistemi pek çok avantajı vardır ve tarif denemeye resimli bir karmaşık ve dinamik topluluk gelişimini teşvik etmektedir. Sistem bu tür en iyi etkileşimleri ve gut microbiota topluluk Gıda bileşenleri ve ilaçlar gibi dış faktörler cevaben içindeki değişikliklerini incelemek için kullanılır. Tüp bebek bu çalışmaların sonuçları daha sonra işlev derin bir anlayış ve sağlık ve hastalık için gut microbiota katkısını kazanmak için içinde vivo çalışmalar ile takıma girebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali ilgi alanlarına sahip. Ticari adlar veya ticari ürünler bu yayındaki söz yalnızca belirli bilgileri sağlamak amacıyla ve tavsiye veya ABD Tarım Bakanlığı tarafından onaylandığı anlamına gelmez. USDA bir fırsat eşitliği sağlayıcı ve işveren olduğunu.

Acknowledgments

Bayan Audrey Thomas-Gahring için onun GC/MS iş kabul edilmektedir. Biz de Massimo Marzorati el yazması düzenleme için teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TWINSHIME Prodigest NA
Defined medium (Adult M-SHIME growth medium with starch) Prodigest NA
Masterflex tubing cole Parmer NA
Urine Drainage bag Bard NA
Labsorb Sigma-Aldrich NA
Fecal sample Openbiome NA
Syringes Becton Dickson NA
Defined medium Prodigest NA
Oxgall Bile Becton Dickson NA
Pancreatin Sigma-Aldrich NA
Glass ware Ace Glass NA
Porcine mucin Sigma-Aldrich NA
Bacteriological agar Sigma-Aldrich NA
Sterilization pouches VWR NA
BeadBug Benchmark Scientific NA
Triple-Pure High Impact Zirconium 0.1 mm Bead beater tube Benchmark Scientific NA
RNAse free, DNAse free, sterile water Roche NA
Shimadzu QP2010 Ultra GC/MS Shimadzu NA
Stabilwax-DA column, 30 m, 0.25 mm ID, 0.25 µm Restek NA
plastic mucin carriers Prodigest NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Johansson, M., Larsson, J., Hansson, G. The two mucus layers of colon are organized by the MUC2 mucin, whereas the outer layer is a legislator of host-microbial interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (1), 4659-4665 (2011).
  2. Xu, J., Gordon, J. Honor thy symbionts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10452-10459 (2003).
  3. Jandhyala, S., Talukdar, R., Subramanyam, C., Vuyyuru, H., Sasikala, M., Reddy, D. Role of the normal gut microbiota. World Journal of Gastroenterology. 21 (29), 8787-8803 (2015).
  4. Macfarlane, G., Macfarlane, S. Models for intestinal fermentation: association between food components, delivery systems, bioavailability and functional interactions in the gut. Current Opinion in Biotechnology. 18 (2), (2007).
  5. McDonald, J., et al. Simulating distal gut mucosal and luminal communities using packed-column biofilm reactors and an in vitro chemostat model. Journal of Microbiological Methods. 108, 36-44 (2015).
  6. Van den Abbeele, P., et al. Arabinoxylans, inulin and Lactobacillus reuteri 1063 repress the adherent-invasive Escherichia coli from mucus in a mucosa-comprising gut model. NPJ Biofilms and Microbiomes. 27 (2), 16016 (2016).
  7. Van den Abbeele, P., Van de Wiele, T., Verstraete, W., Possemiers, S. The host selects mucosal and luminal associations of coevolved gut microorganisms: a novel concept. FEMS Microbiology Reviews. 35 (4), 681-704 (2011).
  8. Van den Abbeele, P., et al. Incorporating a mucosal environment in a dynamic gut model results in a more representative colonization by lactobacilli. Microbial Biotechnology. 5 (1), 106-115 (2012).
  9. Kinross, J., Darzi, A., Nicholson, J. Gut microbiome-host interactions in health and disease. Genome Medicine. 3 (3), 14 (2011).
  10. Wissenbach, D., et al. Optimization of metabolomics of defined in vitro gut microbial ecosystems. International Journal of Medical Microbiology. 306 (5), 280-289 (2016).
  11. McDonald, J., et al. Evaluation of microbial community reproducibility, stability and composition in a human distal gut chemostat model. Journal of Microbiological Methods. 95 (2), 167-174 (2013).
  12. Venema, K., van den Abbeele, P. Experimental models of the gut microbiome. Best Practice and Research. Clinical Gastroenterology. 27 (1), 115-126 (2013).
  13. Krishnan, S., Alden, N., Lee, K. Pathways and functions of gut microbiota metabolism impacting host physiology. Current Opinion in Biotechnology. 36, 137-145 (2015).
  14. Lach, G., Schellekens, H., Dinan, T., Cryan, J. Anxiety, Depression, and the Microbiome: A Role for Gut Peptides. Neurotherapeutics. 15 (1), 36-59 (2018).
  15. Arias-Jayo, N., Alonso-Saez, L., Ramirez-Garcia, A., Pardo, M. Zebrafish Axenic Larvae Colonization with Human Intestinal Microbiota. Zebrafish. 00 (00), (2017).
  16. Zhu, W., Lin, K., Li, K., Deng, X., Li, C. Reshaped fecal gut microbiota composition by the intake of high molecular weight persimmon tannin in normal and high-cholesterol diet-fed rats. Food and Function. 9 (1), 541-551 (2018).
  17. Nguyen, T., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Model Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
  18. Hale, V., et al. Diet Versus Phylogeny: a Comparison of Gut Microbiota in Captive Colobine Monkey Species. Microbial Ecology. 75 (2), 515-527 (2018).
  19. Lu, D., et al. Host contributes to longitudinal diversity of fecal microbiota in swine selected for lean growth. Microbiome. 6 (1), 4 (2018).
  20. Payne, A., Zihler, A., Chassard, C., Lacroix, C. Advances and perspectives in in vitro human gut fermentation modeling. Trends in Biotechnology. 30 (1), 17-25 (2012).
  21. Muegge, B., et al. Diet drives convergence in gut microbiome functions across mammalian phylogeny and within humans. Science. 332 (6032), 970-974 (2011).
  22. Santiago-Rodriguez, T., et al. Chemostat culture systems support diverse bacteriophage communities from human feces. Microbiome. 9 (3), 58 (2015).
  23. Sousa, T., Paterson, R., Moore, V., Carlsson, A., Abrahamsson, B., Basit, A. The gastrointestinal microbiota as a site for the biotransformation of drugs. International Journal of Pharmaceutics. 363 (1-2), 1-25 (2008).
  24. Pferschy-Wenzig, E., Koskinen, K., Moissl-Eichinger, C., Bauer, R. A Combined LC-MS Metabolomics- and 16S rRNA Sequencing Platform to Assess Interactions between Herbal Medicinal Products and Human Gut Bacteria in Vitro: a Pilot Study on Willow Bark Extract. Frontiers in Pharmacology. 8 (893), (2017).
  25. Cueva, C., et al. In vitro fermentation of grape seed flavan-3-ol fractions by human faecal microbiota: changes in microbial groups and phenolic metabolites. FEMS Microbiology Ecology. 83 (3), 792-805 (2013).
  26. Molly, K., Van de Woestyne, M., Verstraete, W. Development of a 5-step multi-chamber reactor as a simulation of the human intestinal microbial ecosystem. Applied Microbiology and Biotechnology. 39 (2), 254-258 (1993).
  27. Wang, M., et al. Apigenin Impacts the Growth of the Gut Microbiota and Alters the Gene Expression of Enterococcus. Molecules. 22 (8), (2017).
  28. Caporaso, J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
  29. Edgar, R. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
  30. Cole, J., et al. Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 42 (database issue), 633-642 (2014).
  31. McDonald, D., et al. An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea. The ISME Journal. 6 (3), 610-618 (2012).
  32. Liu, L. S., et al. Establishing a mucosal gut microbial community in vitro using an artificial simulator. PLoS ONE. 13 (7), e0197692 (2018).
  33. Van de Wiele, T., Van den Abbeele, P., Ossieur, W., Possemiers, S., Marzorati, M. Chapter 27: The Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem (SHIME ®). The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health. Verhoeckx, K., et al. , Springer Link. (2015).
  34. Van den Abbeele, P., et al. Butyrate-producing Clostridium cluster XIVa species specifically colonize mucins in an in vitro gut model. The ISME Journal. 7 (5), 949-961 (2013).
  35. Possemiers, S., Verthé, K., Uyttendaele, S., Verstraete, W. PCR-DGGE-based quantification of stability of the microbial community in a simulator of the human intestinal microbial ecosystem. FEMS Microbiology Ecology. 49 (3), 495-507 (2004).
  36. Tan, J., McKenzie, C., Potamitis, M., Thorburn, A., Mackay, C., Macia, L. The role of short-chain fatty acids in health and disease. Advances in Immunology. 121, 91-119 (2014).
  37. Yang, J., Kweon, M. The gut microbiota: a key regulator of metabolic diseases. BMB Reports. 49 (10), 536-541 (2016).
  38. Sonnenburg, J., Bäckhed, F. Diet-microbiota interactions as moderators of human metabolism. Nature. 535 (7610), 56-64 (2016).

Tags

Biyomühendislik sayı: 144 Gut microbiota vitro bakteri kültürü artan iki nokta üst üste enine iki nokta üst üste inen kolon kısa zincirli yağ asitleri bakteriyel topluluk biyoinformatik
Uygulama gelişmiş teknoloji insan Gut Microbiota Eğitim Kültür Vitro
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Firrman, J., Liu, L., Van den… More

Firrman, J., Liu, L., Van den Abbeele, P., Tanes, C., Bittinger, K., Tomasula, P. Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota. J. Vis. Exp. (144), e59054, doi:10.3791/59054 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter