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JoVE Journal Genetics
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Genetics

Eine Fluoreszenz basierende Methode, bakterielle Genregulation in infizierten Gewebe zu studieren

Published: February 19, 2019 doi: 10.3791/59055
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Georgetown University

Summary

Hier beschrieben ist eine Methode zur Analyse von bakteriellen Genexpression in tierischem Gewebe auf zellulärer Ebene. Diese Methode bietet eine Ressource für das Studium der phänotypische Vielfalt innerhalb einer Bakterienpopulation in Reaktion auf die Umwelt Gewebe während einer Infektion auftreten.

Abstract

Bakteriellen Virulenz Gene sind oft auf transkriptioneller Ebene durch mehrere Faktoren reguliert, die auf verschiedenen Umweltsignale reagieren. Einige Faktoren wirken direkt auf die Virulenz Gene; andere Steuern Pathogenese durch Anpassung der Ausdruck der nachgeschalteten Regulierungsbehörden oder die Ansammlung von Signalen, die Regler beeinflussen. Während Verordnung ausgiebig während des Wachstums in Vitro untersucht wurde, ist, relativ wenig bekannt über wie Genexpression während der Infektion angepasst wird. Solche Informationen sind wichtig, wenn ein bestimmtes Gen-Produkt ein Kandidat für eine therapeutische Intervention ist. Transkriptionelle Ansätze wie quantitative, Real-Time RT-PCR und RNA-Seq sind leistungsfähige Möglichkeiten zur Genexpression auf globaler Ebene zu untersuchen, aber leiden viele technische Herausforderungen einschließlich niedrige Fülle von bakteriellen RNA im Vergleich zu Host RNA und Probe Abbau durch RNases. Bewertung der Verordnung mit fluoreszierenden Reporter ist relativ einfach und kann mit fluoreszierenden Proteinen mit einzigartigen spektralen Eigenschaften gemultiplext werden. Die Methode ermöglicht für einzellige, räumlich-zeitliche Analyse der Genexpression in Geweben, die komplexe dreidimensionale Architektur und physiochemische Gradienten aufweisen, die bakterielle Regulationsnetzwerke beeinflussen. Diese Information geht verloren, wenn Daten über die Masse Bevölkerung gemittelt werden. Hier beschreiben wir eine Methode zur Quantifizierung der Genexpression in bakterielle Krankheitserreger in Situ. Die Methode basiert auf einfachen Gewebe Verarbeitung und direkte Beobachtung der Fluoreszenz von Reporter Proteine. Wir zeigen den Nutzen dieses System durch die Untersuchung des Ausdrucks von Staphylococcus Aureus Thermonuclease (Nuc), dessen Genprodukt für immun ausweichen und volle Virulenz ex-Vivo- und in-vivo benötigt wird. Wir zeigen, dass Nuc-Gfp äußert sich stark in renalen Abszessen und offenbaren heterogene Genexpression durch teilweise deutlich räumlicher Regulierung der Nuc Promotoraktivität in Abszessen engagiert mit der Immunantwort. Die Methode kann auf jedes Bakterium mit einem manipulierbar genetische System und jede Infektionsmodell, Bereitstellung von wertvollen Informationen für präklinische Studien und Entwicklung von Medikamenten angewendet werden.

Introduction

Bakterien reagieren auf veränderte physiologische Bedingungen und Veränderungen in der Ernährungszustand ihres Umfeldes differentiell zum Ausdruck bringen, Gene, die für Anpassung und das Überleben erforderlichen. Zum Beispiel besiedeln opportunistische Krankheitserreger Körper Oberflächen bei relativ geringer Dichte und sind oft harmlos. Jedoch sobald das Bakterium physikalische und chemische Barrieren eingedrungen ist, muss es mit Host Immunzelle Counter Abwehrkräfte und eingeschränkte Nährstoffverfügbarkeit1zu kämpfen. Als Beispiel Staphylococcus Aureus kolonisiert ungefähr ein Drittel der Bevölkerung asymptomatisch aber ist auch die Ursache des verheerenden Haut und Weichteilinfektionen, Osteomyelitis, Endokarditis und Bakteriämie2. Der Erfolg von S. Aureus als ein Pathogen ist oft seine metabolischen Flexibilität sowie ein ganzes Arsenal an Oberfläche verbunden und sekretierten Virulenzfaktoren, die es das Bakterium ermöglichen zu den Blutkreislauf zu entkommen und zu replizieren in peripheren Geweben zugeschrieben 3,4,5. Da Host Tod durch Staphylokokken Krankheit eine evolutionäre Sackgasse und Grenzen Übertragung auf neue Gastgeber6ist, muss die Verpflichtung zur Virulenz Faktor Produktion sorgfältig kontrolliert werden.

Einem komplexen regulatorischen Netzwerk von Proteinen und nicht-kodierende RNAs reagiert auf vielfältige Reize aus der Umwelt, einschließlich der Zelle Dichte, Wachstumsphase, Neutrophilen-assoziierte Faktoren und Nährstoffverfügbarkeit, um sicherzustellen, dass die Virulenz Gene exprimiert werden, bei der genaue Zeit und Ort im Host Gewebe7,8,9,10,11,12,13. Beispielsweise regelt das SaeR/S zwei-Komponentensystem (TCS) Ausdruck von mehreren Virulenzfaktoren über die Sensor-Kinase (SaeS) und der Reaktion Regler (SaeR)14. SaeS ist Autophosphorylated auf einen konservierten Histidin Überrest in Reaktion auf Host Signale (z.B., menschlichen Neutrophilen Peptide [HNPs], Calprotectin)8,15,16. Die Phosphoryl-Gruppe wird dann ein Aspartat-Rückstand auf SaeR, aktivieren es als ein DNA-bindendes Protein übertragen (SaeR ~ P)17. Die SaeR/S TCS regelt über 20 Gene, die zur Pathogenese einschließlich Fibronektin-bindende Proteine (FnBPs), Leukocidins und Coagulase14,18,19,20beitragen. Ziele lassen sich einteilen in hohe Affinität und niedrige Affinität gen Ziele, die geeignet sind, als das Niveau der SaeR induzierte ~ P steigt, wenn die Hinweise21ausgesetzt. Die SaeR/S-Aktivität erfolgt durch andere Regulatoren der Genexpression wie die Agr-Quorum-sensing-System, Repressor der Toxine Protein (Rot) und die alternative Sigma-Faktor B (SigB)22,23,24.

NUC ein Sae-abhängige Virulenz gen in Staphylococcus Aureus und kodiert Thermonuclease (Nuc), die wesentlich für die Flucht aus nEutrophilic eXtracellular tRaps (Netze) und für die Verbreitung während der Verlauf der Infektion25,26. Der Ausdruck der Nuc ist indirekt auch stark unterdrückt von CodY in Anwesenheit von verzweigtkettigen Aminosäuren und GTP27und direkt unterdrückt durch die Staphylokokken Zubehör Regler Protein SarA28,29 , deren Aktivität wird durch Sauerstoff (Redox-Zustand) und pH30beeinflusst. Angesichts der Tatsache, dass Sae und Nuc Mutanten in Mausmodellen der Infektion abgeschwächt werden, gibt es Interesse an der Entwicklung von chemischen Interventionen, die ihre entsprechende Aktivitäten26,31zu hemmen. Trotzdem gibt es keine Informationen über ihre Regulierung während der Infektion.

Fluoreszierende Reporter wurden zur Überwachung und Genexpression auf der Ebene der einzelnen Zelle zu quantifizieren. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zur Quantifizierung der S. Aureus Genexpression während der Infektion, wenn gepaart mit in-vitro-Transkriptom-Analyse und leistungsstarke bildgebende Verfahren wie Magnetresonanztomographie (MRT) und Magnetresonanz-Spektroskopie (MRS), können zeigen, wie bakterielle Physiologie ist in Vivo und die relativen Häufigkeiten von Nährstoffen in bestimmten Nischen geregelt. Die Methode kann für jede bakterielle Erreger mit einem gefügig genetische System angewendet werden.

Übersicht über das Genom integrative Vektor.

Die Genom-integrative Vektor-pRB4 enthält 500 niedrige Paare aus den vor- und nachgelagerten Regionen von S. Aureus USA300 SAUSA300_0087 Pseudogene homologe Rekombination zu erleichtern. pRB4 leitet sich aus dem temperaturempfindliche pMAD Vektor-Backbone mit Erythromycin Widerstand Kassette (ErmC) und thermostabile Beta-Galaktosidase gen BgaB für blau/weiß-Screening von Recombinants32. Veränderter Reporter Konstrukt enthält auch einen Chloramphenicol-Widerstand-Marker (Katze) für Auswahl nach Genom Integration und Plasmid Beseitigung sowie EcoRI und SmaI Sites zu Sicherung die regulatorischen Region von Interesse für Superfolder grün fluoreszierenden Proteins (sGFP) (Abbildung 1). Es ist bekannt, dass die Wahl der Ribosom Bindungsstelle (RBS) die Aktivität des Reporters beeinflusst und häufig empirische Optimierung33 erfordert. Somit wird eine RBS nicht mitgeliefert. Hier die native Ribosom Bindungsstelle wird verwendet, um ein natürliches Muster der Genexpression zur Verfügung stellen, aber andere Websites verwendet werden.

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Protocol

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Georgetown University genehmigt.

1. Generation der fluoreszierenden Reporter Belastung

  1. Den Genom integrative pRB4 Vektor sequenziell mit EcoRI und SmaI Restriktionsenzymen zu verdauen. Nach Protokoll des Herstellers, eine Übernachtung Verdauung mit SmaI mit 1 µg der pRB4 bei 25 ° C, und fahren Sie dann mit der zweiten Verdauung für 1h bei 37 ° C, indem Sie das Reaktionsgemisch EcoRI hinzufügen. Inkubation bei 65 ° C für 20 min, um die Enzyme zu inaktivieren.
  2. PCR Verstärkung die regulatorischen Region von Interesse aus genomischer DNA (in diesem Fall ein Basenpaar ~ 350 DNA-Fragment mit der Thermonuclease [Nuc]-Promotor-Region), unter Einbeziehung einer 5' EcoRI-Einschränkung-Website und einer 3' SmaI-Einschränkung-Website. Die SmaI Erkennungssequenz muss im Rahmen mit der translationalen Start-Codon. In dieser Studie die PCR erfolgte mittels eines HiFi-DNA-Polymerase gemäß den Empfehlungen des Herstellers mit forward Primer oRB015 (5'-Atcattgaattctccaaagtaaattataagttatac-3 ") und reverse Primer oRB016 () 5'-Gggcataactaacacctctttctttttag-3 "). Die Anlasstemperatur war 53 ° C. Das daraus resultierende Fragment mit einem PCR-Aufräumarbeiten-Kit nach den Anweisungen des Herstellers zu reinigen.
  3. Verdauen Sie das daraus resultierende PCR-Produkt mit EcoRI und SmaI wie in Schritt 1.1 zu und verbinden Sie das verdaute DNA-Fragment an den gleichen Stellen des pRB4 mit T4 DNA-Ligase wie vom Hersteller empfohlen, um das integrative Konstrukt zu generieren. Die Ligatur-Mischung in E. Coli einzuführen und Konstrukt Sequenz zu bestätigen.
  4. Wie zuvor beschrieben Electroporate das Konstrukt in S. Aureus -Stamm RN422034. Kurz gesagt, 1 µg Plasmid mit 70 µL Elektro-kompetente Zellen verwenden (100 Ω, 25 µF und 2,3 kV) in B2 Brühe (1 % [w/V] Casein Hydrolysat, 2,5 % [w/V] Hefeextrakt, 2,5 % [w/V] NaCl, 0,1 % [w/V] K2PO4, 0,5 % [w/V] Glucose). Wählen Sie für die Erythromycin-Resistenz (EmR) bei der freizügigen Temperatur (30 ° C) auf tryptic Soy Agar (TSA) ergänzt mit Erythromycin (5 µg mL-1) und 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal; 80 µg mL-1). Die daraus resultierende Transformanten sind blau durch Plasmid-kodierte β-Galaktosidase Aktivität.
    Hinweis: Transfer der DNA in klinischen Isolaten ist extrem schwierig, da eine starke Einschränkung-Modifikation Barriere35. So wurde S. Aureus RN4220 als Zwischenprodukt Empfänger des Fusion-Konstrukts verwendet, da es Einschränkung mangelhaft und sehr wandelbare handelt.
  5. S. Aureus USA300 Belastung mit Elektroporation oder Phagen-vermittelte Transduktion36 bei der freizügigen Temperatur übermitteln Sie Plasmid. Kurz gesagt, verbreiten Sie Φ11 Bakteriophagen Partikel auf dem Spender-Stamm mit TSA Platten mit 5 mM CaCl2 über Nacht bei 30 ° C und dann durch Filtration durch einen 0,45 µM Celluloseacetat Spritze Filter zu sterilisieren. Verwenden Sie Lysates, S. Aureus -Stamm LAC Emrtransduzieren.
    Hinweis: LAC ist eine weit verbreitete klinische isolieren, die zuvor Em sensibilisiert wurde durch serielle Passage TSB Mittel-und die Belastung des nativen Plasmid pUSA03 zu heilen, die EmR 37,38verleiht.
  6. Das Chromosom wie zuvor beschrieben32integrieren Sie das Konstrukt von zwei aufeinanderfolgenden homologe Rekombination Veranstaltungen. Die Recombinants sind Chloramphenicol-resistente (CmR) auf TSA Platten mit 5 μg mL-1 Chloramphenicol, Erythromycin-anfälligen (Erm-s) und keine längeren blau.
    Hinweis: Wenn möglich, wieder führen Sie die markierten Fusion zu USA300 über Phagen-vermittelten Signaltransduktion, die Anhäufung von Mutationen im Zusammenhang mit in-vitro-Stamm Durchgang39 und Temperatur Schichten zu vermeiden ein.

(2) Tier-Infektion: Vorbereitung des Inokulums, systemische Infektion und Gewebe Verarbeitung

  1. Vorbereitung der bakterielle Inokulum
    1. Streifen von S. Aureus -Stämme von Interesse für die Isolierung auf Blutagar Platten aus einem gefrorenen Glycerin bestand. Inkubation bei 37 ° C für 16 – 24 h, hämolytische Phänotypen, die aufgrund ihrer Fähigkeit zur lyse der roten Blutkörperchen (Erythrozyten) zu bestätigen und Form klar transparente Zonen.
    2. Initiieren Sie über Nacht Kulturen durch impfen der einzelnen Kolonien von jedem Stamm bis 4 mL tryptic Soy Bouillon (TSB) in sterilen Glasröhrchen. Drehen Sie die Röhrchen bei 37 ° C für 16 – 24 h in ein Rohr Rollensatz in etwa eine 70° Winkel und 70 Umdrehungen pro Minute [u/min].
    3. Verwenden Sie ein Spektralphotometer zur Messung der optischen Dichte bei 600 nm (OD600) der Kulturen aus Schritt 2.1.2. Verwenden Sie steriles Medium als eine optische Referenz (leer). Verdünnen Sie diese Zellen auf einem OD-600 von 0,05 in 25 mL von sterilen Tryptic Soy Bouillon (TSB) in separaten, 125 mL DeLong Flaschen (5:1 Flasche Volumen-Verhältnis) und inkubieren Sie Kulturen in einem Wasserbad (für richtige Wärmeübertragung auf die Kulturen), Zittern bei 280 u/min und auf 37 ° C.
      Hinweis: Wachstum des Inokulums kann auf verschiedene Weise durchgeführt werden; eine Methode für den Anbau von Zellen zur exponentiellen Phase wird vorgestellt. Unabhängig davon, ist es wichtig, konsequent die gleiche Methode verwenden, für die Vorbereitung der Zellen für die Impfung.
    4. Bei einer OD600 ~ 1, wieder verdünnen Sie die Zellen in frischem Medium auf einen Start OD600 von 0,05, damit die Zellen exponentielle Phase erreichen und Faktoren, die während der Inkubation über Nacht sammeln sich auf exponentielle Phase Ebenen reduziert worden sind.
    5. Ernten Sie die Zellen während der exponentiellen Phase (OD600 ~0.6–0.8) durch Zentrifugieren bei 3.000 X g für 10 min bei Raumtemperatur.
    6. Waschen Sie die Pellets zweimal in gleichwertigem Umfang von sterilen 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS; pH 7,4).
    7. Die Zellen mit 1 X PBS-Puffer (pH 7,4) zu einer Konzentration von 1 x 108 Koloniebildenden Einheiten (KBE) mL-1 auszusetzen oder entsprechend der gewünschten experimentieren.
      Hinweis: es ist wichtig, die Beziehung zwischen OD600 und KBE mL-1 für jede Belastung von Interesse zu bestimmen, weil Belastung-abhängigen Veränderungen der Form und Größe der Zellen Lichtstreuung Eigenschaften beeinflussen können und letztlich die Infektion-Dosis.
  2. Vorbereitung der Tiere und bakterielle Infektion
    1. Mäuse für 7 Tage auf gereinigten Diät AIN-93 zu akklimatisieren. Die Diät wird formuliert, um angemessene Ernährung zur Verfügung stellen und gleichzeitig Gewebe Auto-Fluoreszenz Zusammenhang mit dem Verzehr von pflanzlichen Zutaten in Standardmaus Chow40.
      Hinweis: Weibliche Mäusen C57/BL6 (6-8 Wochen alt) werden hier verwendet, aber die Maus Stamm und Geschlecht hängt von der Studiums.
    2. Vor der Infektion erweitern Sie Maus Schweif Venen mit lauwarmem Wasser.
    3. Tiere zu infizieren, durch Injektion 100 µL der bakterielle Inokulum über Heck-Adern zu eine systemische Infektion zu produzieren. Ein Aliquot des ersten Inokulums zu retten, wenn Durchflusszytometrie durchführen (siehe Abschnitt 4).
    4. Überwachen Sie Tiere täglich zu und bewerten Sie ihren Gesundheitszustand mit einem monitoring-System von den institutionellen Animal Care und Use Committee überprüft und genehmigt.
    5. Lassen Sie die Infektion an den Fortschritt für die gewünschte Dauer. Hier sind die Experimente beendet 3 Tage nach der Infektion.
      Hinweis: Unter diesen Bedingungen bestehen Abszesse einer Staphylokokken Abszess Gemeinschaft von Bakterien, umgeben von Fibrin-Ablagerungen und umgeben von konzentrischen Schichten von Immunzellen5,41.
  3. Ernte der Organe und Gewebe Verarbeitung
    1. Die Tiere von CO2 Einatmen und zervikale Dislokation als sekundäre Methode einschläfern und Autopsie durchführen.
    2. Niere (rechts) und andere lebenswichtige Organe (Herz, Leber, Lunge, Milz) zu ernten und in 15 mL Polypropylenröhrchen mit 10 % [V/V] gepuffert Formalin übertragen. Gehen Sie mit diesen Organen zu 2.3.4 unten Schritt.
    3. Übertragen Sie die linke Niere auf eine steril 2 mL schlagfest Röhrchen mit ~ 500 µL Kieselsäure-Perlen 2 mm und 1 mL sterilen 1 X PBS (pH 7,4). Fahren Sie mit diesem Organ mit Schritt 4.2.
    4. Lassen Sie Organe aus Schritt 2.3.2 im Dunkeln bei Raumtemperatur mit sanft schütteln oder Rotation für mindestens 24 Stunden, aber nicht mehr als 48 Stunden zu beheben.
    5. Betten Sie Orgeln in klare Gewebe Einfrieren Medium ein und speichern Sie das Gewebe bei-80 ° C.
    6. Unter Verwendung eines Kryostaten, Abschnitt Gewebe in Scheiben von 10 µm Dicke.
    7. Trocknen Sie die Abschnitte auf einem vorgereinigten, geladene Objektträger für 20 min in der Dunkelheit, gelten Sie harte Eindeckmittel mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Fleck, und wenden Sie Deckglas an. Gerahmte Dias bei Raumtemperatur über Nacht zu heilen, und transfer zum 4 ° C für die langfristige Lagerung.

(3) Laser-Scanning-konfokalen Mikroskopie und Bildverarbeitung

  1. Untersuchen Sie gerahmte Dias um Läsionen mit Hilfe von Lasern für die fluoreszierenden Reporter verwendet wird zu suchen. In diesem Fall, die grünen (GFP), rot (TdTomato) und blau (DAPI) Fluoreszenz sind Signale verwendet.
  2. Das Bild mit dem entsprechenden Ziel zur Visualisierung von Einzelzellen zu erwerben (z. B. in der Regel 20 X oder 40 X Ziele verwendet werden).
  3. Die Fluoreszenz-Intensitäten in der konfokalen Bilder zu messen.
    1. Öffnen Sie das konfokale Bild in Bild J und Helligkeit/Kontrast um richtig das Fluoreszenzsignal der Läsion zu visualisieren.
    2. Definieren Sie die Region von Interesse und mithilfe der Option Schwellwerte , stellen Sie die untere und obere Fluoreszenz Grenzen je nach Bedarf.
    3. Definieren Sie den Schwerpunkt durch Auswahl Bereich → mittlere Grauwert → Zentroid → beschränken auf Schwelle unter der Registerkarte " Analyze " in Bild J.
    4. Zentroid Fluoreszenz Intensitätswert extrahieren oder der mittlere Fluoreszenzintensität in einer bestimmten Läsion pro Flächeneinheit (mittlere Fluoreszenzintensität, MFI) für GLP und TdTomato zu messen. Hier wurden die Bereiche von 1 µm2 verwendet.
      Hinweis: Eine verblindete zweite Analyse minimiert Voreingenommenheit, wenn die Identität der Probe bekannt ist.
    5. Plot-Daten und führen die entsprechenden statistischen Analysen für jeden Vergleich.

(4) Flow Cytometry Analysis

  1. (Optional) Fusion-Aktivität des Inokulums am Tag der Infektion (aus Abschnitt 2.2.3) zu bestimmen
    1. Sterile PBS (pH 7,4) hinzufügen 899 µL 1 x 100 µL jeder Inokulum und 1 µL der Membran permeationsfähigen Nukleinsäure Flecken (siehe Tabelle der Materialien). Als Kontrolle unbedingt eine Probe fehlt Nukleinsäure-Fleck enthalten.
    2. Durchführen Sie Durchflusszytometrie auf alle Proben.
      Hinweis: Für den ersten Versuch ist es sinnvoll, eine einzige Vektorregelung zur Fusion von Interesse festzustellen, die richtige Spannung zu verwenden sind. Eine klare Trennung zwischen positiven und negativen Proben ist unerlässlich für die Datenanalyse, weit über Hintergrundsignal ist unter Angabe der Reporters.
    3. Ermittlung der Bakterienpopulation, plot-Ereignisse mithilfe von Nukleinsäure-Fleck (y-Achse) und forward Scatter (x-Achse).
    4. Zeichnen Sie ein Aufnahme-Tor um Ereignisse, die sind beide Nukleinsäure Fleck positiv und die korrekte Größe des Bakteriums basierend auf der forward Scatter (zwischen 0,5 bis 2,0 µm für S. Aureus).
      Hinweis: Bei dieser Population zu identifizieren, da es wichtig ist, die Ereignisse enthalten, die eindeutig innerhalb dieser Parameter sind streng sein. Achten Sie darauf, dass dieses Tor schließt alle Ereignisse für den Negativkontrollen unter anderen Bedingungen. In dieser Studie, rund 70 % die Zellpopulation erfüllt diese Anforderungen in der Analyse.
  2. Analyse von Gewebeproben nach Opfer:
    1. Die Tiere einschläfern, Ernte der linken Niere (siehe Punkt 2.3) und Transfer in die Wulst-schlagende Röhrchen mit 1 mL 1 x sterile PBS (pH 7,4) und 250 µL Borosilikat-Perlen 2 mm.
    2. Gewebe zur Freigabe der bakterieller Zellen zu stören. Verwenden Sie für Nieren ein Homogenisator, um Zellen zu stören. Hier wurden drei 30 s platzt bei 6800 u/min mit 1 min kühlen Perioden auf nassem Eis zwischen den Zyklen zur Heizung Proben zu minimieren.
    3. Pellets, die größeren Gewebe Trümmer durch Zentrifugieren bei 250 X g für 3 min. auf eine Tischplatte Microcentrifuge auf 4 ° c abgekühlt
      Hinweis: In der Regel gibt es ein Zelle Pellet an der Unterseite des Rohres und einer Schicht aus Treibgut auf der Oberseite. Die mittlere wässrige Schicht enthält die Bakterienzellen.
    4. 10 µL aus der wässrigen Schicht zu einem sauberen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit 1 µL der Nukleinsäure-Fleck in 989 µL PBS zu übertragen (Gesamtvolumen 1 mL).
    5. Durchführen Sie Durchflusszytometrie verwenden die gleichen Daten Aufnahmeparameter und gating wie für die ursprüngliche Impfkulturen.
      Hinweis: Bakterienzelle zählt werden sehr gering sein, da die Probe hauptsächlich Gewebe Schutt enthält. Die Option "Live Tor" kann auch verwendet werden, wenn die Zellen sind Nukleinsäure-Fleck positive und Größe-gated, wenn Daten in die Anwendung geladen werden. Dies hilft auch um mehrere Ziel-Ereignisse zu analysieren und die Dateigröße verringern. Fast 1 Million Ereignisse pro Probe werden gezählt, aber mehr Event zählt möglicherweise erforderlich, je nach der Schwere der Infektion und Größe des Gewebes analysiert.
    6. Datenanalyse: Bestimmen meine Fluoreszenz Intensität (MFI) für jede Fluorophor in einer Probe mit der Aufnahme-Gatter in Abschnitt 4.1.4 bestimmt. Proben in Flow-Analyse-Software zur Veranstaltung zählt zu normalisieren. 10.000 zählt, sind in der Regel ausreichend in der Analyse.
      Hinweis: Es ist nicht ungewöhnlich, Proben zu finden, die weniger als diese Anzahl von Veranstaltungen enthalten, da dies Abszess-Bildung und Infektion schwere abhängig ist. Mit diesem Ansatz, 500-40.000 sind Veranstaltungen in der Regel im infizierten Gewebe gefunden.

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Representative Results

Wir entwickelten ein Plasmid abgeleitet pMAD32 , die jeder Reporter liefern kann Fusion Konstrukt in das Chromosom durch doppelte Crossover homologe Rekombination (Abbildung 1). Diese Konstruktion ermöglicht Quantitative Analyse aller regulatorischen Regionen, die die Produktion von GFP-Protein und Fluoreszenzsignal über Hintergrund unterstützt. Das Plasmid verleiht die Ampicillin-Resistenz (Ap-f) für die Pflege und Vermehrung in E. Coli und verleiht Erythromycin-Resistenz (EmR) in S. Aureus. Das Konstrukt verleiht auch Chloramphenicol Resistenz (CmR), ermöglicht eine einfache Übertragung von der integrierten Reporter Fusion zwischen verschiedenen mutierte Stämme für anspruchsvolle genetische Analyse in S. Aureus.

Als Nachweis des Prinzips, verschmolzen wir Nuc regulatorischen Region Gfp. Nuc wurde gewählt, weil seine Genprodukt erforderlich für volle Virulenz ist und erforderlich ist für die Einschränkung der Makrophagen von S. Aureus -induzierte Abszesse42, 43. Das Konstrukt wurde in das Chromosom wie 1,4-1,6 des Protokolls beschrieben integriert. Die integrierte Fusion wurde dann auf AH3926 übertragen, das eine PsarAP1- TdTomato Fusion enthält. Die SarA P1 Promoter hat bisher gezeigt, dass konstitutiv aktiv44 werden und somit Etiketten aller Zellen.

Wir überprüft zunächst, dass der Reporter Fusionen aktiv beim in-vitro- shake Flask Wachstum in Tryptic Soy Bouillon (TSB, eine reiche, komplexe Medium) und die Fluoreszenz über dem zellulären Auto-fluoreszierende Hintergrund (Abbildung 2) lagen. Um festzustellen, wie die fluoreszierenden Reporter in-vivo Verhalten, war ein veränderter renal Abszess Modell verwendeten5. Gruppen von weiblichen C57BL/6 Mäusen wurden intravenös mit 1 x 107 KBE pro von S. Aureus LAC fehlt Reporter Fusionen oder LAC Zellen tragen die Nuc-sGFP und sarAp1-TdTomato Fusionen in Frage gestellt. Die Tiere waren geopferten drei Tage Post Infektion. Dann geernteten Organe wurden in 10 % [V/V] gepuffert Formalin fixiert, Cryo-geschnitten und abgebildeten konfokalen Mikroskopie nach DAPI Färbung wie beschrieben in die Schritte 2 und 3 (Bild 3A, B). Die Bilder wurden mit Bild J analysiert und Fluoreszenz pro Flächeneinheit in den Nieren Läsionen wurde gemessen. Wie in Abbildung 3Cdargestellt, war Nuc-Gfp Fusion Fluoreszenz im Durchschnitt fast 9fache höher in den Zellen, die Durchführung der Fusion als in Zellen, die nicht die Durchführung der Reporter Fusion; Das letztere Signal stellt der Nachweisgrenze (Auto-Fluoreszenz) (Vergleiche Nuc-sGFP Lac). In ähnlicher Weise war PsarAP1- Tdtomato Fusion Fluoreszenz ~ 6-fach höher als die keine Reporter-Kontrolle (Abbildung 3E, vgl. sarAP1- TdT Vs LAC). Mit Durchflusszytometrie, das Muster der Reporter Aktivitäten bestätigte mit Niere Homogenates und flow Cytometry wie in Schritt 4 beschrieben, obwohl die Falte in Fluoreszenz Unterschiede waren (Abbildung 3D, F) zu senken.

Interessanterweise schien die Fluoreszenz-Daten von Läsionen, die durch Zellen mit fluoreszierenden Reporter Fusionen gebildet höhere Variabilität als die nicht über die Reporter zeigen. Wir fragten uns, ob die Variation in den Fluoreszenz-Messungen beobachtet durch heterogene Ausdruck der Reporter (d. h. des biologischen Ursprung). In der Tat ~ 100 µm erreichen ergab, dass einige Läsionen eines oder beider Reporter (Abbildung 4) ausgedrückt. Wichtig ist, untersuchen Reporter Aktivität mit einer Einzelzelle Auflösung in Staphylokokken Abszess Gemeinden (SACs) offenbart räumliche Verordnung Meinungsäußerung Nuc in Abszessen umschrieben mit starken DAPI beflecken, wahrscheinlich verbunden mit der Bildung und Freisetzung von Neutrophilen extrazelluläre fallen (Abbildung 5A-C)45. Zum Beispiel haben wir deutlich höhere Nuc-sGFP Fusion Fluoreszenz in den inneren Kern des SAC gegenüber, die an der Peripherie (Abb. 5B, E) gemessen. In der gleichen Abszess, das Muster für sarAp1-TdTomato Fusion Fluoreszenz zu sein schien invertiert (Abbildung 5D). Das Muster war jedoch nicht statistisch signifikant mit der gleichen Anzahl von Tieren (Abbildung 5F).

Figure 1
Abbildung 1 : Schematische Darstellung des Genoms integrative Reporter Plasmid pRB4. Plasmid pRB4 ist ein Derivat des pMAD mit einer Temperatur empfindliche Herkunft der Replikation in S. Aureus (Ori pE194ts). Es gibt drei Medikament Antibiotikaresistenz-Markern: (i) Bla, verleiht Resistenz gegen Ampicillin in Escherichia coli; (Ii) ErmC, konferieren Erythromycin-Resistenz in S. Aureus; und (Iii) Katze, verleiht Resistenz gegen Chloramphenicol in S. Aureus. Das Reporter-Konstrukt ist flankiert von ~ 500 bp jeden aus dem vor- und nachgelagerten Sequenzen von Pseudogene SAUSA300_0087 (Genom zu verweisen: FPR3757) für doppelte Crossover homologe Rekombination und Genom-Integration. sGFP, grün fluoreszierendes Protein-gen; CS, Klonen Website; TT, starke bidirektionale transkriptionelle Terminator. Abbildung ist nicht maßstabsgetreu. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Ich ntegrated NUC-sGFP und sarAp1-tdTomato Reporter werden während des in-vitro-Wachstums ausgedrückt . S. Aureus LAC Zellen (Wildtyp-[WT]), mit und ohne (A) Nuc -sGFP oder (B) sarAp1-TdTomato Reporter) wurden auf exponentielle Phase TSB angewachsen und wieder in das gleiche Medium verdünnt. Optische Dichte (OD) und Fluoreszenz wurden an die angegebene optische Dichte-Werte gemessen. Hintergrund-subtrahiert Fluoreszenz Intensitätswerte (Anregung/Emission: sGFP, 485/535 nm; TdTomato [TdT], 535/590 nm) wurden geteilt durch die optische Dichte-Werte, relativen Fluoreszenz-Einheiten zu generieren. Die Daten sind die Mittel + / SEM aus zwei unabhängigen Experimenten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Fluoreszierende Reporter sind in renal Gewebe sichtbar. Gruppen von 13 C57BL/6 Mäusen wurden intravenös mit LAC oder LAC Zellen tragen Nuc-sGFP und sarAp1-TdTomato (TdT)in Frage gestellt, und die Infektion durfte drei Tage lang fortgesetzt. Mäuse wurden eingeschläfert, und Organe wurden verarbeitet, wie in den Schritten 2 und 3 des Protokolls beschrieben. Repräsentative Niere Abschnitt zeigt multiple Läsionen und die damit verbundenen Fluoreszenz für (A) Nuc-sGFP und (B) sarAp1-TdTomato. Skalieren von Balken = 250 µm (10 X-Objektiv). Die Relative Fluoreszenz Einheiten pro Flächeneinheit (RFU [μm2]-1) renal Läsionen zugeordnet wurden gemessen mit Bildanalyse, wie unter Punkt 3.3 beschrieben und wurden für dargestellt (C) Nuc-sGFP und (E) sarAp1-TdTomato; Jeder Punkt steht für eine Läsion und Balken zeigen den Median; 3-5 Läsionen per Mausklick analysiert. Flow Cytometry Analyse (D) Nuc-sGFP und (F) sarAp1-TdTomato Fusion Fluoreszenz in Bakterienpopulationen isoliert von infizierten Homogenates drei Tage Post Nierenentzündung. Meine Fluoreszenz Intensität (MFI) wird durch die solide Bar, und jeder Punkt ist eine Niere. LAC reporterless Wildtyp Stamm. Statistik: Mann-Whitney-Test; p < 0,05. Die Daten sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente. Die Erregung Wellenlängen für die Fluoreszenz-Kanäle sind wie folgt: DAPI, 405 nm; GFP, 488 nm; TdTomato, 561 nm. Emittierte Fluoreszenz Daten über einen Bereich von Wellenlängen: DAPI, 419-481 nm; sGFP, 505-551 nm; TdTomato, 575-630 nm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Abszesse zeigen Variable Expressivität der Reporter in renal Geweben. Gruppen von 13 C57BL/6 Mäusen wurden mit 1 x 107 KBE von S. Aureus Zellen über die Heck-Vene in Frage gestellt. Die Tiere waren euthanasierten drei Tage Post Infektion. Nieren wurden geerntet, festen und geschnittenen für Fluoreszenz-Mikroskopie (40 X Objektiv) wie in Schritt 2 des Protokolls beschrieben. Gezeigt werden drei Läsionen in unmittelbarer Nähe mit Variablen (A) Nuc-sGFP und (B) sarAp1-TdTomato Fluoreszenz. (C) Nukleinsäure von Staphylokokken und Host Zellen wird angezeigt durch die DAPI-Färbung. Die grünen und roten Kanäle sind in (D) zusammengeführt. Ähnliche Ergebnisse wurden in anderen Abschnitten gesehen. Die Bilder wurden mit einem 40 X Objektiv erworben; Maßstabsleiste = 25 µm. Die Erregung Wellenlängen für die Fluoreszenz-Kanäle sind wie folgt: DAPI, 405 nm; GFP, 488 nm; TdTomato, 561 nm. Emittierte Fluoreszenz Daten über einen Bereich von Wellenlängen: DAPI, 419-481 nm; sGFP, 505-551 nm; TdTomato, 575-630 nm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : NUC-sGFP räumlich in der Mikroumgebung Staphylokokken Abszess geregelt ist. Konfokale Laser-scanning-Mikroskopie (CLSM) Bilder einer Staphylokokken Abszess Gemeinschaft (SAC) Läsion von S. Aureus -Stamm LAC tragenden Nuc-sGFP und sarAp1-TdTomato Reporter Fusionen produziert. Gezeigt werden (A) zusammengeführt Kanäle für Nuc-sGFP und sarAp1-Tdtomato, (B) Nuc-sGFP Fluoreszenz (grün), (C) DAPI-Färbung von Nukleinsäuren (blau) und (D) sarAp1-TdTomato Fluoreszenz (rot). Sternchen geben Zellen im Kern (Schwerpunkt) und Pfeile zeigen die Zellen an der Peripherie. Die Fluoreszenz-Intensitäten für (E) Nuc -sGFP und (F) sarAp1-TdTomato für Zellen in den Kern und Peripherie des SAC angezeigt. Die Erregung Wellenlängen für die Fluoreszenz-Kanäle sind wie folgt: DAPI, 405 nm; GFP, 488 nm; TdTomato, 561 nm. Emittierte Fluoreszenz Daten über einen Bereich von Wellenlängen: DAPI, 419-481 nm; sGFP, 505-551 nm; TdTomato, 575-630 nm. Die Daten stammen aus 8 Nieren (einer pro Maus) und 1-2 Läsionen wurden von jeder Niere abgebildet. Balken zeigen Median. Gestrichelte Linie, der Nachweisgrenze. Statistik: Normalverteilung der Daten, der Student t-Test (ungepaarten), ***p < 0,05. (Maßstabsleiste = 20 µm; gilt für alle Bilder.) Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Bakterielle Infektionskrankheiten sind eine wachsende Gesundheitsproblem weltweit durch den Erwerb von Antibiotikaresistenz Determinanten46. Denn Anpassung an Hostumgebungen wichtig für Wachstum und Überleben während der Infektion, können Strategien zielen gen-Ausdruck-Programme, die Erreger Fitness steigern therapeutisch nützlich erweisen. Ein solches Programm ist der Satz von Genen von SaeR/S zwei Komponentensystem (TCS), zuvor gezeigt, dass eine wichtige Rolle im Immunsystem Steuerhinterziehung47kontrolliert. SaeR/S wird durch eine Vielzahl von Faktoren ab, vor allem solche mit Neutrophilen8,20induziert. Während der Infektion entlockt S. Aureus eine starke entzündliche Reaktion in der Neutrophilen und andere Fresszellen an den Ort der Infektion2rekrutiert werden. Verflüssigung Nekrose und Fibrin Ablagerung folgen, bilden einen Abszess um weitere Gewebe Schaden48zu verhindern. Innerhalb dieser immun privilegierte Seiten verwenden S. Aureus Zellen eine Reihe von Sae-abhängige Genprodukte reprogram den Abszess um bakterielle Vermehrung5,48zu erleichtern. Ein Sae-abhängige gen, Nuc, codes für Nuklease und metabolisiert Netze um 2'-Deoxyadenosine Makrophagen43töten zu produzieren. Nuc ist also ein wichtiger sekretierten Enzym, das ist wichtig für volle Virulenz42 und ist ausgedrückt in Vivo (Abbildung 3, Abbildung 4und Abbildung 5).

Obwohl die Virulenzfaktoren von S. Aureus ausgiebig untersucht worden, ist wie das Bakterium wächst in der Host ein erforschten Bereich, wie zu verstehen ist wie seine Physiologie während der Infektion reguliert wird. Hier beschreiben wir eine Methode zum sondieren bakterielle Genexpression und Verhalten auf die einzelne Zellenebene mit eine modifizierte integrative Vektor, der Sorge um Plasmid Verlust bei fehlender Auswahl mildert. Unsere Methodik ermöglicht eine direkte Visualisierung der Genexpression in Abszessen ohne Zellwände permeabilize und ohne die Notwendigkeit für Antikörper und Beschriftung. Wir haben starken Ausdruck der Nuc-sGFP Fusion sowie die sarAp1-TdTomato -Fusion in renal Abszess, die Säcke, die drei Tage von Wildtyp Zellen gebildet Infektion in eine akute systemische Infektionsmodell veröffentlichen festgestellt. Das experimentelle Design kann Antwort bezüglich Genexpression an anderen Standorten angepasst werden. In der Tat, da C57BL/6 Mäusen nicht in der Lage, S. Aureus aus ihrem Gewebe zu löschen sind, dringen die Bakterien diverse anatomische Websites einschließlich des Skelettsystems (Knochen und Gelenke) und das Gehirn, Herz, Milz und Leber, die alle mit unterschiedlichen Physiologie sind und nutritiven Eigenschaften5,49. So kann viel erlernt werden, mithilfe von S. Aureus , um die Art der Gastgeber Gewebe zu erforschen. Es ist wichtig zu beachten, dass es bekannt ist, dass bestimmte Host-Nischen Hypoxie in der Natur sind oder sonst einen starken Sauerstoff gradient50 zeigen. Fluoreszierende Proteine benötigen molekularen Sauerstoff für Aktivität, und einige sind empfindlicher als andere Sauerstoff-Partialdruck51. Während wir Fluoreszenz sehen tief in den Abszess zu signalisieren, die Größen möglicherweise eine Unterschätzung. Mit fluoreszierenden Proteinen Codon-optimiert für den Einsatz in Clostridium Difficile entwickelt könnte verwendet werden, um dieses Anliegen52zu mildern. Ein zweiter Punkt zu beachten ist, dass die fluoreszierende Proteine (sGFP und TdTomato) produziert durch die Reporter-Stämme, die in dieser Studie verwendeten stabil. Daher spiegeln die fluoreszierenden Daten Anhäufung im Laufe des Experiments, anstatt eine neue Antwort. Ein Konstrukt mit einer instabilen sGFP oder TdTomato gen generieren würde das Dienstprogramm des Systems für dynamische Versuche erheblich steigern.

Das hier beschriebene Reporter-System ist ein leistungsstarkes Tool, um quantitativ gen Verordnung in Vitro und in Vivozu untersuchen. Da die Reporter in einfacher Ausfertigung auf dem Chromosom beibehalten wird, ist das System geeignet für stark exprimierten Gene (das hohe Promotoraktivität hat). Biosynthetische Gene oder anderen gering exprimierten Genen möglicherweise nicht sichtbar, da das Niveau der Fluoreszenz Ausdruck unter dem Grenzwert der Erkennung oder Hintergrund Auto-Fluoreszenz fallen könnte. Es ist bekannt, dass die Ribosom Bindungsstelle (RBS) die Aktivität der Reporter Fusionen33 beeinflusst. Eine mögliche Lösung für dieses Problem ist eine stärkere RBS wie die Übersetzung Einleitung Region (TIR)53 verwenden oder Tandem-Kopien der Förderer von Interesse in das Chromosom integrieren. Alternativ könnte stabile Multi-Copy-Plasmide verwendet54.

Eine Einschränkung des beschriebenen Verfahrens ist, dass im Gegensatz zu einer cDNA-Zubereitung von RNA aus Gewebe extrahiert, eine relativ kleine Anzahl von Genen gleichzeitig abgefragt werden kann (begrenzt durch fluoreszierende Kanälen ohne spektrale Überlappung). Jedoch kann was gewonnen potenziell mehr informativ sein. qRT-PCR und andere anzeigen, die die Masse der Bevölkerung durchschnittlich sind nicht in der Lage, Heterogenität der Bevölkerung am Ort der Infektion zu erfassen. In der Tat, wir beobachteten Heterogenität in der Ebene der Nuc-sGFP und sarAp1-TdTomato Ausdruck zwischen Abszess Läsionen in unmittelbarer Nähe (Abbildung 4). Dies ist vergleichbar mit was von Cassat Et Al. vor kurzem berichtet wurde 55 zu diesem Zeitpunkt ist der Ursprung der diese Heterogenität nicht bekannt. Jedoch könnte die Nährstoffverfügbarkeit, Variable Induktion der Nährstoff Datenerfassungssystemen oder anderem Host möglicherweise das Phänomen erklären. Darüber hinaus tritt die Wirt-Pathogen Interaktionen innerhalb Mikroumgebungen von Organen oder Abszesse, die komplexe dreidimensionale Struktur und verschiedenen Zelltypen. Innerhalb dieser Strukturen können Gewebe in Bezug auf die pH, Osmolarität, Sauerstoffversorgung und Nährstoffverfügbarkeit, ein Phänomen bekannt als metabolischen Zonierung56,57unterschiedlich sein. Wir entdeckt serendipitously, entsteht eine Muster einer räumlichen Verordnung in Wildtyp Zellen mit Wohnsitz in den Abszess (Abbildung 5). Dies ist unseres Wissens die erste Beobachtung dieser Art in einem gram-positive Erreger während der Infektion. Die räumliche Verordnung berichtet hier ist ähnlich zu denen, die von Davis Et al. in Milz Gewebe enthält Mikrokolonien gramnegative Erreger Yersinia Pseudotuberculosis58. In diesem Fall produziert Host Stickstoffmonoxid (NO *) stimuliert die Produktion von Stickoxid-Dioxygenase (Hmp) in den Zellen an der Peripherie der am nächsten an die diffundierende NO *, schonende Innenraum Microcolony Zellen die Notwendigkeit, die Expression von induzieren Hmp. In Staphylokokken Abszesse ist Nuc Ausdruck an den Kern des SAC, und schwächste entlang der Peripherie am stärksten. Weil eine Manschette der Neutrophilen Abszesse umgeben sind, ist es verlockend zu spekulieren, dass Neutrophilen stammenden Signale das Verhalten der Staphylokokken, polarisieren die Zellen in zwei phänotypisch unterschiedliche Populationen erinnert an morphogenen leiten Regulierung der Differenzierung während der Entwicklung im höheren Leben59. Die mechanistische Untermauerung dieses Musters ist unbekannt und ist ein Thema der intensiven Studie in unserem Labor.

Wir glauben, dass unsere Methode bietet ein wirksames Instrument für die feinen Details der Genexpression in einzelnen Zellen während der Infektion zu studieren. Die Methode bietet eine einzigartige Gelegenheit, zu beobachten und schließlich die physiologische Ursprünge der Heterogenität und räumliche Muster der Genexpression in Geweben zu verstehen. Dieses heterogene Verhalten muss berücksichtigt werden bei der Entwicklung von neuen Behandlungsmethoden, wie nur eine Subpopulation von Zellen (d. h., die mit dem Ausdruck der Gene) die therapeutische Ziel sein kann.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Wir danken Alexander Horswill für das Geschenk der PsarAP1- TdTomato Fusion, und Karen Creswell für Hilfe mit Flow-Zytometrie-Analyse. Wir danken auch Alyssa King für eine Beratung zur statistischen Analyse. Diese Arbeit wurde zum Teil durch ein NIH unsystematisch/Developmental Research Award (Grant AI123708) und Fakultät Start Fonds SRB finanziert. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, Datenerfassung und Auslegung oder die Entscheidung, das Werk zur Veröffentlichung einreichen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5% sheep blood Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA) A10
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) ThermoScientific R0402
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-25
C57Bl/6 Mice Charles River NA
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C-0378
confocal laser scanning microscope Zeiss NA
cryostat microtome Thermo Scientific NA
Culture, Cap VWR International 2005-02512
D+2:25NA Oligo Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) NA
DNA Ligase New England Biolabs M0202S
Erythromycin Sigma-Aldrich E5389
Flow Analyzer Becton Dickinson NA
glass beads Sigma Z273627
Miniprep, plasmid Promega A1220
orbital shaking water bath New Brunswick Innova NA
PCR purification QIagen 28106
Phosphate Buffer Saline (PBS) Cellgrow 46-013-CM
Plate reader Tecan NA
Precellys 24 homogenizer Bertin Laboratories NA
pUC57-Kan GenScript (Piscataway, NJ) NA
Q5 Taq DNA Polymerase New England Biolabs (Ipswich, MA) M0491S
Restriction Enzymes New England Biolabs (Ipswich, MA) R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).
Reverse transcriptase New England BioLabs E6300L
Sanger Sequencing Genewiz (Germantown, MD) NA
Sub Xero clear tissue freezing medium Mercedes Medical MER5000
Superfrost Plus microscope slides Fisher Scientific 12-550-15
superloop GE Lifesciences 18111382
Syringe, Filter VWR International 28145-481
Syto 40 Thermo Fisher Scientific S11351 Membrane permeant nucleic acid stain
Tetracycline Sigma-Aldrich T7660
Tryptic Soy Broth VWR 90000-376
UV-visible spectrophotometer Beckman Coulter-DU350 NA
Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1500

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