Summary
Это исследование подробности процесса gavaging точное количество пробиотиков для новорожденных мышей. Экспериментальная установка был оптимизирован для включают, но не ограничивается пробиотик, дозирования, методы управления и количественная оценка бактерий в кишечнике.
Abstract
Взрослый мыши модели широко используются понять механизм позади прогрессирования заболевания в организме человека. Применимость исследований, проведенных в взрослых мыши модели неонатальных заболеваний является ограниченной. Чтобы лучше понять прогрессирования заболевания, принимающей ответов и долгосрочное воздействие мероприятий у новорожденных, неонатальной мыши модель вероятно является лучше подходят. Разреженный использования моделей новорожденных мышей может частично объясняться на технические трудности работы с этих мелких животных. Определить эффекты пробиотических администрации в начале жизни и непосредственно оценить способность создать колонизации кишечного тракта новорожденных мышь была разработана новорожденных мыши модель. В частности оценить пробиотик колонизации у новорожденных мышей, Lactobacillus plantarum (LP) была осуществлена непосредственно в неонатальной мыши желудочно-кишечного тракта. С этой целью LP в ведении мышей кормления через внутри пищевода затравки (IE). Весьма воспроизводимый метод был разработан для стандартизации процесса затравки IE, которая позволяет точную отправления пробиотик дозировки при сведении к минимуму травмы, аспект особенно важно, учитывая хрупкость новорожденных мышей. Ограничения этого процесса включают возможности раздражение пищевода или повреждения и аспирации, если gavaged неправильно. Этот подход представляет улучшения текущей практики, потому что IE затравки в дистальной части esophagus уменьшает шансы аспирации. После кормления колонизации профиль пробиотика было проследить с помощью количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР) ДНК кишечной с LP конкретных грунтовки. Кейдж методы управления и настройки различных урны были использованы для оценки возможностей для колонизации распространения. Протокол подробно тонкостях кормления новорожденных мыши IE и последующей колонизации количественной оценки с LP.
Introduction
У грудных детей раннего пробиотик экспозиции была связана с иммуномодулирующих эффектов, ведущих к сокращению распространенности заболеваний как некротизирующего энтероколита, атопического дерматита и сепсис1,2,3, 4 , 5. Однако, механизм за этот ответ иммуномодулирующих является сложной задачей для изучения с учетом ограничения для выборки в новорожденных человеческих испытаний (т.е. последовательных крови ничьих и биопсии). Новорожденных мыши модели может помочь изучить механизм действий участвующих в неонатальной иммунной регуляции, связанных с использованием пробиотических и изменения в кишечную микрофлору. К сожалению большинство моделей мыши для пробиотики основном сосредоточились на взрослых мышей; Однако влияние пробиотиков может быть высоким в начале жизни, предполагая, что модели для этой возрастной группы будет полезным3,6. Кроме того неонатальной мыши модели лучше подходят для изучения заболеваний и мероприятия, предназначенные для приложения в начале жизни человеческих младенцев, как ожидается, что они более тесно имитировать развивающихся микробов и иммунной системы7,8 ,9,10. Цель заключалась в том, чтобы изучение масштабов и характера пробиотик колонизации новорожденных мышей с акцентом на механистические взаимодействия между основным приложением и его микрофлора. Подходящего описания новорожденных моделей не были найдены в литературе, и таким образом было рассмотреть необходимость разработки надежных и стандартизированных метода.
Установленные методы орального применения различных соединений для новорожденных мышей относятся материнской передача желаемых соединений через молоко, лечении источник воды для беременных плотин11 или с помощью кормления иглы для облегчения управления желаемой соединений в ротоглотки12. Эти методы полезны для экспериментов, которые не имеют точного дозирования потребности и где лечение легко попадает получателя мышью. Пробиотики являются часто осуществляется в сочетании с пребиотик, таких как galactooligosaccharide и fructooligosaccharide (ФСУ), которые служат в качестве источника питания для пробиотических бактерий; Эти добавки соединения делают решение вязкой и сложно управлять через вышеупомянутой методологии. Разработка метода обеспечивать точное количество пробиотиков и пребиотиков для новорожденных мышей, начиная уже в первый день жизни (DOL) было необходимо. В процессе разработки затравки технику, возможность распространения колонизации (как это наблюдается в других исследованиях пробиотик между лечения и управления оружия13,14,,1516) был протестирован и оценивали относительное обилие колонизированных Lactobacillus plantarum (LP) в кишечнике щенков с различными затравки расписания. Пробиотик подготовки, используемых в экспериментах состояла из 109 образуя колонии единиц (CFU) за затравки LP (ATCC-202195 штамм), смешанного с ПКС (пребиотик) и мальтодекстрин (наполнитель), как описано в последние человека суда3. Пробиотик доставки была выполнена с использованием IE затравки, и этот процесс подробно описан в протоколе ниже. Профиль колонизации пробиотика оценивали с помощью реального времени амплификации ДНК, извлеченные из всего кишечника с помощью конкретных грунтовки LP.
Protocol
Все процедуры были проведены относящихся к руководящим принципам, установленным вспомогательного персонала на объекте уход животных в университете Британской Колумбии, и все процедуры были одобрены Комитетом уход животных UBC.
1. Количественная оценка пробиотики управлением
Примечание: Этот шаг рекомендуется определить точное количество пробиотика кое что может осуществляться в одной дозе. Количество пробиотиков и транспортного средства (FOS и мальтодекстрин) определяет насыщенность условия решения. Из опыта не более, чем 30 мкл (~ 20 мл на кг) жидкости может назначаться мышей на дол 2 как любой больший объем увеличивает риск аспирации.
- С каждая трубка, содержащая 180 мкл концентрированного солевого раствора стерильную 5% декстрозы Подготовьте шесть microcentrifuge 1.5 мл пробирок для серийных разведений.
- Вес 0,2 г Алиготе пробиотик пребиотик смеси и растворяют в 1 мл физиологического раствора 5% декстрозы в стерильных манере.
- Вихрь 30 секунд и пипетки порвать пряди. Повторяйте до тех пор, пока не видны скопления наблюдаются.
Примечание: Мальтодекстрин делает решение вязкой и способствовать решение насыщения. - Выполните последовательный разрежения с помощью трубки, подготовленную на этапе 1.1. Вихрь смешивать.
- Пластина 40 мкл каждого разведения на маркированных квадрант миссис агар пластины. Тарелка каждого разведения в двух экземплярах.
- Инкубировать в анаэробных (или микроаэрофильных) условия при 37 ° C в течение 48 часов в вакуумный сосуд с помощью пакета газовых.
- Граф каждую пластину в диапазоне 20-70 колоний в квадранте. Средняя пластина графов с же разбавления и рассчитать обратно к желаемой единиц.
2. Подготовка пробиотиков и пребиотиков для затравки
Примечание: Надлежащего растворения пробиотик и пребиотик необходима для обеспечения гладкой впрыска жидкости через кормления иглы во время кормления.
- Совместить необходимое количество лиофилизированные пробиотик организма с желаемой суммы пребиотики и транспортного средства в стерильных microcentrifuge трубки.
- Добавьте соответствующее количество растворителя (5% декстрозы физиологического раствора) распустить пробиотик пребиотик смесь.
Примечание: Распада рассчитан ограничивается пребиотик и транспортного средства. Из опыта сочетание синбиотик (с ПКС и мальтодекстрин) достиг насыщения на приблизительно 0,3 г/мл при растворении в 2-мл пробирку microcentrifuge, используя 1 мл растворителя. - Вихрь смешать до тех пор, пока все твердые вещества растворяются. Использование пипетки сломать вверх шарики твердых частиц в растворителе, закупорить вверх и вниз.
- Инкубируйте раствор в ванну воды 37 ° C 20 мин.
Примечание: Этот шаг можно пропустить, если создается пробиотик пребиотик решение от живой культуры. - 5 серии пластины десятикратного разрежения на плиты агара миссис до кормления точно определить пробиотик вводят щенка. Этот шаг можно пропустить, если не требуется точное количество кое.
3. Подготовка кабинета биобезопасности
- При работе с пробиотики используйте шкаф биобезопасности поддерживать асептической техники. Установите клетка с плотины и щенков на электроодеяло (набор для приблизительно 38 ° C) на одной половине одеяло. Место чистой, пустой клетке животных на другой половине электроодеяло.
- Место, дезинфекции или стерильной, Абсорбирующие площадку на электроодеяло как правило мыши во время кормления.
- Собирать вложенности материала для щенков от верхней части существующих, плотины создан гнезда и создайте новый конические вложенности Кубок с использованием перчатках, дезинфекцию с использованием 70% этанола и сушат. Место это новое гнездо в клетке, чистый, пустой Холдинг. Это облегчает передачу запах гнезда в перчатках и таким образом уменьшает введение других ароматов на щенка во время их обработки для процедуры, снижая риск раскулачивание.
- Переместить детенышей в коническое гнездо Холдинг клетке и снимите каркас с плотины из кабинета. Это снижает стресс для плотины, предотвращая его слух щенков во время процедуры.
Примечание: Если пробиотик является известной колонизатором мышиных кишечника, условий лечения должны быть разделены клетки или даже разных биобезопасности шкафы, чтобы избежать возможности крест колонизации.
4. интра пищевода кормления новорожденных мыши
- Вскройте упаковку шприц для легкого доступа. Откройте упаковку иглы стерильные образом и прикрепить его к голове шприца. Вымойте игла с 70% этанола и автоклава до процедуры. Используйте различные наборы игл для лечения и управления группы, чтобы избежать загрязнения.
- Сделать немного больше, чем желаемое количество раствор пробиотик красителя в шприц. Возьмите шприц вверх. Затем потяните вниз еще и проведите пальцем, чтобы выбить пузыри и нажать на поршень изгнать пузыри и объем дополнительной жидкости, пока не будет достигнут желаемый объем. Это гарантирует, что нет никакого воздушного пространства в иглу. Для мыши DOL 2 объем затравки не должна превышать 30 мкл.
- Место щенка на стерильные Абсорбирующие площадку на вершине грелку. Используйте внешне кормления иглы (24, 1» длины иглы, шар диаметром 1,25 мм) для измерения длины пищевода, поместив мяч иглы чуть ниже мечевидного отростка (нижний конец грудины). Марк иглы на уровне морду отметить ограничение вставки иглы (рис. 1). Наблюдать за щенком для здоровья знаки, которые включают в себя регулярное дыхание и розовой окраской кожи.
- Погрузите кончик иглы в погружения растворителя (5% декстрозы физраствора или - средних используется для распустить пробиотика и предварительно биотические) смазывать внешних поверхностей кормления иглы. Это облегчает плавное вступление иглы в пищевод мыши.
- Поднимите щенка шиворот или нежно держа голову и тело между большим и указательным пальцем. Обеспечить головы, шеи и тела проходят в прямом положении. Не держите щенка шиворот для больше чем 60 s как там является риском обструкции трахеи, ведет к удушению. Убедитесь, что щенок может дышать. Признаки scruffing слишком сильно может включать невозможность дышать, значительные задыхаясь и язык, расширенный из уст. Следить за щенком цвет и дыхание в течение всей процедуры.
- Вставьте лампы иглы в центр рта щенка под углом 45° к плоскости туловища, пока он не достигнет в задней части горла.
- Слегка изменить угол иглы повернув на лампу иглы и перемещение шприц от gavaging лица (в сторону спины щенка) пока она параллельна плоскости щенка позвоночного столба. Scruffing щенка помогает держать иглу в месте в задней части горла, а также предотвращает мыши извиваться. Убедитесь, что мяч иглы не заранее или во время изменения угла любого давления против задней части горла.
- Если мышь пытается проглотить иглы, позволяют ему естественно слайд вниз и арестовать движение, когда маркировка на иглу выравнивает с мордой. Шприц и игла обычно достаточно тяжелым, чтобы слайд вниз должной степени тяжести. Поддержка вес иглы во все времена так иглы слайды легко вниз пищевода с не понижательное давление от лица, осуществляющего затравки.
- Если игла встречает сопротивление в задней части горла, снять затравки иглы слегка, чтобы выбить мяч иглы и повторно угол иглы в рот к левой мыши (обработчика справа) медленно в небольшой, с шагом 1 мм. Игла должна начать легко скользить вниз пищевода.
- Если игла останавливается до маркировки на игле достигает устья, не вводите решение.
- Не храните иглу для более чем 20 вставляются s. Если это происходит, медленно втягивать иглы сохраняя шприц параллельно к туловищу и пусть щенок отдых на бумажное полотенце для 30 s до 1 мин gavaging попробовать снова после смазывания внешней поверхности иглы с растворителем.
Примечание: Анестезия не используется для процедуры, как мыши ответ необходим для калибровочных успеху калийную.
- Когда маркировка на питание иглы выше морду и выровнены с кончика рыла, не позволяйте иглы переместить или любого дальнейшего продвижения. Медленно вводить желаемый объем жидкости. Если жидкость наддува или наблюдается пузырь через нос, немедленно остановите инъекции и медленно втягивать иглы.
- Поставьте щенка на бумажное полотенце на грелку для оказания помощи в ее восстановлении. Следить за продолжение дыхания или изменения цвета щенка, который указывает аспирации. Усыпить детенышей, которые придыханием немедленно.
- После кормления, аккуратно снять кормления иглы на тот же угол, что он был вставлен. Место щенка на бумажном полотенце на утепленные грелку. Подождите 10 s для щенка восстановить нормальную деятельность и дыхание. Здоровый розовый оттенок должен появиться над телом щенка и краситель должен быть видимым только в отсеке для желудка. Переместите его обратно в клетку с другой детенышей.
Примечание: Gavaging голубой пищевой краситель – отличный способ практиковать процедуру, описанную выше. Если затравка успешно, желудок мыши будут видны как голубой оттенок. Если синий краситель находится вне живота щенка (шеи, груди или подмышечной области), животное должно быть гуманно euthanized (в соответствии с правилами ухода за животными), как это указывает на разрыв пищевода или аспирации.
5. сбор intestional проб для анализа колонизации
- Во время последующего контроля или gavaging Соберите образцы фекалий микрофлора от детенышей.
Примечание: Щенок часто мочится и испражняется, когда gavaged и это время может использоваться как возможность для сбора фекальных проб для анализа микрофлора. - Для прекращения экспериментов Соберите кишечника от двенадцатиперстной кишки прямую кишку после эвтаназии детенышей. Закрепить щенка на доску хирургические и дезинфекции кожи с 70% этиловом спирте. Срезаем кожу в четырех квадрантах без повреждения перитонеальный слоя, используя инструменты стерилизуют с 70% этанола и стерилизации горячим шарик на 250 ° C.
- Используйте другой набор стерильных инструментов разрезать на четыре квадранта брюшины и движении от центра в способ, что подвергаются висцеральных органов.
- Найдите желудка и использовать зажим ущипнуть ниже привратник и в конце прямой кишки. Запуск длина кишечника с помощью тупого инструмента или щипцы для упорядочения кишечника и освободить его от соединительной ткани и брыжеечных ткани. После того, как по всей длине кишки была освобождена из соединительной ткани, разрезать на концах зажимается.
- Марк алюминиевой фольги с ориентацией кишечника, оберните безопасным образом и заморозить при температуре-80 ° C.
Примечание: Процедура извлечения ДНК может осуществляться на данный момент без замораживания. Синий краситель рассматривалось также пройти через кишечник более 24 ч и сбор образцов для колонизации анализ лучше, когда кишечник собираются по крайней мере 24 часа после последнего кормления. Сигналы могут быть усилены до этого timepoint бактериями неприкрепленных временно проходящих через смесь затравки.
6. ДНК извлечение из кишечника для колонизации анализа
Примечание: Экстракции ДНК проводится с использованием коммерческих комплект с оптимизации изменений, внесенных в протокол для кишечника экстракции ДНК. Обеспечить Отопление аппарат установлен на требуемую температуру и решения, которые нужны изменения или предварительно потепления готовятся должным образом.
- Подготовить ферментативные буфера Lysis (СОБ) следующим образом: сделать решение с 20 мм трис-Cl, ЭДТА натрия 2 мм и 1,2% Тритон X-100. Отрегулируйте пэ-аш до 8.0. Непосредственно перед использованием ELB, добавьте лизоцима в конечной концентрации 20 мг/мл.
- Предварительно весят граната шарик трубы на аналитические весы с колпачки удалены.
Примечание: Это делается таким образом, что если необходимый вес недокус, это проще, чтобы удалить кишечного содержимого. - Разрезать кишечника на небольшие сегменты с использованием стерильных одноразовых скальпель и совок желаемого сегментов в трубы предварительно взвешенный граната шарик.
Примечание: Не забудьте изменить скальпели между каждый образец ДНК повсеместно и может повлиять на результаты ПЦР. - Добавьте 1 mL ELB с лизоцим (от шага 6.1) к каждой трубе, место на vortexing било шарик и работать на максимальной скорости (14) за 5 минут.
- Как только ткани нарушается, передача трубы в ванну воды 37° C и Инкубируйте 30 минут.
Примечание: Этот шаг делается для активировать лизоцима и вызвать распад мукопептида клеточной стенки грамположительных бактерий. - Подготовка трубки с 20 мкл протеиназы K для каждого образца в концентрации МАУ 600 мл.
- Центрифуга трубы на 400 x g за 10 минут. Lysate должен выглядеть ясно, с некоторые остатки ткани на вершине бисером.
- Передача в пробирку, содержащую протеиназы K 180 мкл супернатант (Верхний этап), а затем добавить 200 мкл буфера Аль к трубе. Вихрь для 15 s смешивать.
- Место труб на блоке Отопление в 56 ° C в течение 10 минут.
- Добавить 200 мкл, 100% этанола в трубку и смешать с vortexing для 15 s.
- Добавьте примерно 600 мкл lysate столбце спин (комплект).
- Центрифуги для 1 минуту на 8000 x g. Отказаться от потока через.
- Повторите шаг 6.12 до тех пор, пока все lysate обращается через колонку.
- Место столбец в новой коллекции трубки. За 1 минуту в 8000 x g добавьте 500 мкл буфера AW1 и центрифуги.
- Слейте через поток. Добавьте 500 мкл буфера AW2 и центрифуги на 8000 x g на 3 мин.
- Отменить через поток и центрифуги столбца в пустой коллекции трубки на 8000 x g на 3 мин.
- Передать столбце ДНК элюции трубки. 60 мкл ПЦР класс ультрачистая вода непосредственно на мембрану и инкубировать в течение 2 минут при комнатной температуре.
- Используйте воду подогретым элюции при 37 ° C для элюировать. Элюирующий можно сделать дважды, используя половину объема окончательный элюции и повторяя шаг 6.15 дважды, чтобы повысить урожайность.
- Центрифуги для 1 минуту на 8000 x g элюировать ДНК.
- Измерение концентрации ДНК этого eluted с использованием метода желаемого количественной оценки. Урожайность процесса добычи находятся в диапазоне от 10-40 нг/мкл ДНК.
- Магазин eluted дна при-20 ° C.
7. ПЦР установки
- Условия PCR
- Включите машину и загрузить программу в таблице 1 в режиме реального времени машину ПЦР.
- Петля шаги 3-5 в таблице 1 для 40 циклов и удерживайте образца при температуре 4 ° C на конце реакции.
- Экспериментальная установка PCR
- Используйте грунты и температуры, в таблице 2. Используйте концентрации и условий реакции, в таблице 3. Настройка каждой реакции в трех экземплярах для контроля процедурные изменения.
- Место реакции PCR трубы/пластины в системе ПЦР и запуск программы загружаются в систему с шагом 7.1.
- Снять трубку в конце выполнения, поместить его на 4 ° C и подготовиться к гель загрузки.
8. Количественная оценка LP колонизации
- Подготовка смеси ПЦР для 10 мкл и 20 мкл реакции согласно таблице 3.
- LP геномной ДНК калибровочной кривой 107 до 10 копий 1/мкл
Примечание: Поскольку будет покрытием 4 мкл каждого разведения, 107 копий в 4 мкл или 2,5 х 106 копий за мкл требуется в начальный запас. Используйте тот же принцип для остальной части кривой.- Подготовить разбавления 1:4:107 копий за мкл в 50 мкл.
3.147 мкл LPDNA + 46.85 мкл dH2O = 2,5 х 106 копий за мкл - Серийно разбавления 10: 5 мкл 45 мкл dH2O для 1,25 x 105 копий/мкл.
- Пластина 4 мкл на разрежения в колодец.
- Подготовить разбавления 1:4:107 копий за мкл в 50 мкл.
- Визуализация ампликонов LP
- Использовать 2% агарозном геле для достижения четкого разделения ~ 197 bp LP амплифицированного фрагмента.
- Загрузите 9 мкл каждого продукта ПЦР в геле.
- Побегите гель на 30 минут в 120 V.
Representative Results
Уникальность данного метода лежит в его адаптация метода gavaging к размеру и бренности новорожденных мыши. В предыдущем разделе описаны важные шаги в осуществлении успешной затравки процедура DOL 2 мыши. Установить хороший количественной оценки шкалу, калибровочной кривой был сгенерирован с помощью чистого LP ДНК с трех технических реплицирует (рис. 2). Калибровочной кривой предоставляет динамический диапазон обнаружения LP ДНК с помощью грунтовки. Динамический диапазон был между 7 и 28 циклов, где ряд 101 до 10 копий7 LP ДНК была обнаружена. Устойчивый наклон кривой стандартного представлял эффективность и масштабируемость реакции.
Процедура кормления IE был использован в взрослых мышей с относительной легкостью. Однако верхних отделов пищеварительного тракта новорожденных мыши является хрупким и требуется калиброванные движения затравки иглы во время процедуры. Неоднократно gavages может увеличить шансы интра пищевода раздражение, травмы и сбоя или отказа, плотины из-за обработки. Таким образом два разных gavaging расписания были протестированы и колонизации кишечника был количественно с помощью ДНК от всего кишечника гомогенатах. Мышей были gavaged от DOL 2 через 8 дол с пробиотик, каждый день или раз в два дня (рис. 3). Каждый пример содержит один технический реплицировать, и каждое состояние имел по крайней мере два биологических реплицирует. Щенки gavaged каждый день с 7 доз были около 103 копии LP, тогда как щенков gavaged каждые два дня с 4 дозы около 105 копий. Согласованность результатов между реплицирует добавить кредит с точностью техники. Там было больше LP, обнаруженных в кишечнике щенков gavaged каждые два дня по сравнению с щенков, которые были gavaged каждый день. Учитывая это последующие эксперименты были созданы с графиком затравки каждый день как это также уменьшает стресс для щенков.
Важно избежать интра помета пробиотик перекрестного загрязнения при работе с пробиотиками. Ожидается, что микрофлора Однопометники быть похожими, поскольку они разделяют же мать и вложенности окружающей среды. Это доказывает проблемой для исследования пробиотик, если условия лечения и контроля присутствовали в пределах одного помета, как пробиотик организм имеет потенциал, чтобы стать частью микробиоты («колонизация распространения '). Чтобы определить, если пробиотических будет загрязнять и колонизировать необработанных однопометники, половина помет был gavaged как выше и кишечника были собраны для ПЦР. Кишечные ПЦР анализ DOL 10 мышей показало ожидается усиление LP ДНК в gavaged мышей, но и, в меньшей степени в не gavaged однопометники (рис. 4). Кишечника же DOL мышей от необработанной Кейдж показал без усиления или минимального усиления циклов больше 32. Это обеспечило доказательств для коммунальных обмен микрофлора в помете в клетке. Таким образом для экспериментов с пробиотиками группы лечения должны быть разделены клетки для контроля колебаний путем перекрестного загрязнения. Использование приемных плотин можно считать если эксперимент должен быть создан в рамках параметра помет, но смешанные эффекты как уменьшение ухода от плотины приемных и отказа должны оцениваться и оптимизирован для. Когда мышей gavaged до DOL 8 остались необработанной шесть дней и кишечные ДНК была проанализирована на 14 дол, примерно 10 копий LP были найдены (рис. 5). Таким образом колонизация LP было установлено быть временным и обнаружению население уменьшилось со временем.
Рисунок 1 . Измерение длины между мечевидного отростка (нижний конец грудины) и морда сделать максимум вставки маркировки для иглы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Калибровочной кривой с помощью LP грунты и ATCC LP ДНК. Серийный разрежения ATCC LP ДНК было принято создать динамический диапазон обнаруживаемыми для грунтовки, используемые в исследовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . LP усиления кишечной ДНК от DOL 10 щенков лечение между DOL 2 и 8 дол в запланированных gavages каждый день (7 доз) и каждый день (4 дозы). Gavaging каждый день показали выше кишечных LP по сравнению с gavaging каждый день. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . В помете 4 щенков не лечить LP усиления кишечной ДНК от DOL 10 щенков с 2 лечение и 2. Калийную был между DOL 2 и 8 дол в запланированных gavages каждый день (7 доз). Два пробиотик лечение шоу щенков ожидается усиление профиль. Неочищенные щенков шоу переменное усиление LP указанием коммунальных обмен пробиотик организма в помете. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 . LP усиления кишечной ДНК от DOL 14 щенков лечение между DOL 2 и 8 дол в запланированных gavages каждый день (7 доз) и каждый день (4 дозы). LP нагрузка падает ниже цикла 28 указанием Распродажа LP в течение 6 дней пост последние пробиотик затравки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Шаг | Температура | Время |
| 1 | 50 ° C | 2 минуты |
| 2 | 95 ° C | 3 минуты |
| 3 | 95 ° C | 30 секунд |
| 4 | 58 ° C | 30 секунд |
| 5 | 72 ° C | 30 секунд |
Таблица 1. ПЦР-амплификации условий. Температура и количество условий, цикла для реакции PCR.
| Цель | Регион intergenic прокладку 16S-23S |
| Размер ожидаемых фрагментов | 144 bp |
| Грунтовка ТМ | 58˚C |
| Грунтовка вперед (FP) | LPN-1: TGG ATC АКК TCC TTT CTA AGG AAT |
| Обратный грунт (RP) | LPN-2: TGT TCT КЭУ TTT CAT ТАТ ГАА AAA ATA |
В таблице 2. Подробная информация о компоненты реакции ПЦР. Подробная информация о грунтовки, их отжига температура и размер ожидаемых фрагментов в реакции PCR.
| Концентрация | 10 мкл реакция | 20 мкл реакция | |
| Шаблон ДНК | Промаркированные pg | 1 МКЛ | 1 МКЛ |
| SYBR Мастер микс | - | 5 МКЛ | 10 МКЛ |
| FP | 10 МКМ | 0,3 МКЛ | 0,6 МКЛ |
| RP | 10 МКМ | 0,3 МКЛ | 0,6 МКЛ |
| dH2O | - | 3.4 МКЛ | 8.8 МКЛ |
В таблице 3. В реакционных объемов и концентрации. Концентрация реагентов и томов для реакций.
Discussion
Процедура кормления IE был разработан для безопасно управлять конкретным дозы пробиотик для новорожденных мышей. Небольшое количество жидкости, доставляются в верхнем желудочно-кишечного тракта, с помощью кормления иглы для предотвращения аспирации при одновременном обеспечении доставки дозировка в конфиденциальном порядке. Кишечник мышей были собраны для колонизации анализа двух и шесть дней после затравки. Процедура для экстракции ДНК была изменена для обеспечения высокодоходных пробиотик грамположительных организма. ПЦР анализ ДНК извлечено два дня пост последние кормления показали относительно высокие колонизации LP в мышей gavaged каждые два дня по сравнению с gavaged мышей каждый день между DOL 2-8. Там был также уменьшение количества LP более шести дней, показаны этот пробиотик быть временной организма в кишечнике мыши. Результаты этих экспериментов создать условия для проведения исследований с высоким строгости в этой возрастной группе.
Соблюдать долгосрочные эффекты пробиотиков в новорожденных мышей, проводилась для новорожденных мышей на дол 2; же время начала указывают на человека суда. Ротоглотки кормления новорожденных мышей ранее описанные в литературе и осуществляется только после DOL 5-812,17 когда риск аспирации ниже благодаря развитой глотания механики. Однако ротоглотки кормления не хорошо подходит для мышей DOL 2 как более высокие темпы аспирации были замечены в экспериментальном исследовании (данные не показаны). Вязкий характер пробиотические и пребиотик раствор добавляется риск аспирации. После процедуры gavaging IE к минимуму риск аспирации в дол 2 мышей обеспечивая требуемый объем непосредственно в верхнем желудочно-кишечного тракта. Успех процедуры сначала была проверена с помощью пищевого красителя, проникнуты пробиотик затравки. Пищевой краситель выступает в качестве маркера, который виден через кожу щенка. Отрицательные эффекты не наблюдались у мышей gavaged с пищевой краситель, и рекомендуется для проверки процедуры gavaging таким образом до начала широкомасштабных экспериментов. Быстрое урегулирование задыхаясь затравки рефлекс видел пост также может использоваться в качестве дополнительного показателя для успешного кормления. Когда указатель мыши помещается на электроодеяло после затравки, задыхаясь рефлекс будет ослабевать и увеличение частоты дыхания будет соблюдаться в течение 20 секунд. Продолжение задыхаясь рефлекс для более чем 30 секунд указывает неудачного принудительного кормления. Успешного кормления зависит также соответствующие вставки кормления иглы с лампой, сидя прямо над отверстием сердца сфинктера желудка. Это может способствовать путем обеспечения того, что маркировка на иглу, измерение длины между мечевидного отростка и кончик морды, не пройти мимо морду мыши во время кормления. Это минимизирует вероятность травмы с мышью. Частота кормления может иметь значительное влияние на результаты эксперимента. Частые gavaging также можно создать больше стресса для щенков и мать из-за постоянного возмущения клетке и гнезда. Наиболее оптимальный график кормления, когда gavages не менее часты и за короткий период времени без потери ожидаемого эффекта в системе. Для обеспечения безопасности и стерильности процедуры затравки иглы должны быть простерилизованы стирки и промежуточное использование автоклавированием. Стиральная строго на извне с помощью скраба и внутрь, заставляя воду через иглу, с помощью шприца перед автоклавированием необходима как любые оставшиеся частицы можно инкрустировать иглы во время автоклавирования и может помешать с процедурой gavaging.
Выше LP колонизации было отмечено в детенышей, которые были gavaged любой другой день, когда по сравнению с щенков gavaged каждый день. Это может быть из-за снижения стресса на щенков gavaged каждый день и потенциально пробиотик, получать больше питательных веществ через сравнительно больше молока, заглатывается этих щенков. Зависимость доза пробиотик лечения ранее изучалось в мыши модели18,19 и таким образом администрация правильную дозировку имеет важное значение. Пробиотик раствор, приготовленный покрытием перед каждой затравки получить точное количество Карибский управляемый. Если организм пробиотик анаэробных, важно увидеть, если есть разница в кое когда культивированный высокоусвояемого или анаэробно. Так как LP факультативно анаэробных, был культурный, с использованием обоих методов и было отмечено никакой разницы в ГРУ.
Был проведен анализ нагрузки пост затравки кишечных LP с помощью ПЦР и высокое качество образцов ДНК. Чтобы свести к минимуму загрязнение LP ДНК между лечения и управления группами, различные кормления иглы, шкафы биологической безопасности и хирургическое оборудование были использованы для обеспечения высокого качества образцов. Точное измерение пробиотик в кишечнике требуется оптимизированный метод экстракции ДНК. Наиболее эффективные методы для извлечения ДНК из стула включает в себя несколько шарик, победив шаги20,21,22. Этот метод был принят для извлечения с использованием бисера бьющееся кишечных бактерий и наблюдается снижение представительства (< 102 копии восстановить) из LP в целом кишечника экстракции ДНК. Как LP грамм позитивные организма с значительное количество мукопептида клеточной стенки, протокол был оптимизирован с шагом распада мукопептида, используя лизоцима23,24 добавляется ферментативные литического буфера. Это представление LP в образце же кишечных увеличился более чем два раза. Лизоцим лечения обеспечивает распада наружный слой, а шарик, победив шаг облегчает lysis организма. Оптимизации количество ткани, тип гранат шарик и продолжительность нарушения с использованием бисера необходим для получения оптимального ДНК продукции для проведения ПЦР-анализа.
Недавние исследования25,26,27,28свидетельствует положительное влияние пробиотиков, как профилактика или лечение в досрочном и срок новорожденных. Создание надлежащего новорожденных мыши модели для пробиотиков является оправданным для распаковки защитный эффект пробиотики. Этот протокол, изложенные здесь представляет руководства для исследователей не знакомы с работой неонатальной мыши с использованием пробиотиков. Несмотря на проблемы с грызун микробиоты изучая человеческое здоровье и болезни этот метод может быть продлен для исследований, направленных на понимание изменений микрофлора благодаря пробиотики. Эта модель также предоставляет платформу для изучения взаимодействия хост микробов и иммунных реакций в течение различных этапов развития.
Disclosures
Нет конфликта интересов раскрыть.
Acknowledgments
Спасибо сотрудникам Фонда уход животных и UBC ветеринаров для подготовки кадров и оказания помощи в мыши работают научно-исследовательском институте до н.э. Детская больница. Благодаря Университета Британской Колумбии и экспериментальной медицины для финансирования исследования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL tuberculin syringe with slip tip | BD | 309659 | |
| 1.2% Triton X-100 | Millipore-Sigma | X100-100ML | |
| 2 mM sodium EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
| 20 mM Tris·Cl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
| 5% dextrose and 0.9% NaCl injection solution | Baxter Corp. | JB1064 | |
| Alphaimager | Alpha Innotech | N/A | Gel imaging system |
| Anaerobic jar | Millipore-Sigma | 28029-1EA-F | 2.5 L |
| BD GasPak EZ anaerobe container system sachets | BD | 260678 | |
| BD Difco Lactobacilli MRS Broth | BD | 288130 | |
| Disruptor Genie | Scientific Industries Inc. | SI-D236 | |
| Feeding/oral gavage needles for newborn mice and rats | Cadence Science Inc. | 01-290-1 | 24 Gauge, 1” needle length, 1.25 mm ball diameter |
| Fructooligosaccharides | Millipore-Sigma | F8052 | from chicory |
| Garnet bead tubes 0.70 mm | Qiagen | 13123-50 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 172-5120 | |
| Lactobacillus plantarum (Orla-Jensen) Bergey et al. | ATCC | BAA-793 | for qPCR standard curve |
| Lyophilized probiotic bacteria | N/A | N/A | |
| Lysozyme | Thermo Fisher Scientific | 89833 | |
| Maltodextrin | Millipore-Sigma | 419672 | dextrose equivalent 4.0-7.0 |
| Mini-Sub Cell GT Cell | BioRad | 1704406 | Gel chamber |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| QIAamp Blood and Tissue kit | Qiagen | 51504 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Ultrapure dH2O | Invitrogen | 10977023 |
References
- Reid, G. Probiotics and prebiotics – Progress and challenges. International Dairy Journal. 18 (10-11), 969-975 (2008).
- Lin, H. C., et al. Oral probiotics reduce the incidence and severity of necrotizing enterocolitis in very low birth weight infants. Pediatrics. 115 (1), 1-4 (2005).
- Panigrahi, P., et al. A randomized synbiotic trial to prevent sepsis among infants in rural India. Nature. 548 (7668), 407-412 (2017).
- Amenyogbe, N., Kollmann, T. R., Ben-Othman, R. Early-Life Host–Microbiome Interphase: The Key Frontier for Immune Development. Frontiers in Pediatrics. 5, 111 (2017).
- Ofek Shlomai, N., Deshpande, G., Rao, S., Patole, S. Probiotics for Preterm Neonates: What Will It Take to Change Clinical Practice? Neonatology. 105 (1), 64-70 (2014).
- Elazab, N., et al. Probiotic administration in early life, atopy, and asthma: a meta-analysis of clinical trials. Pediatrics. 132 (3), e666-e676 (2013).
- Arrieta, M. C., et al. Early infancy microbial and metabolic alterations affect risk of childhood asthma. Science Translational Medicine. 7 (307), 307ra152 (2015).
- Arrieta, M. C., Walter, J., Finlay, B. B. Human Microbiota-Associated Mice: A Model with Challenges. Cell Host and Microbe. 19 (5), 575-578 (2016).
- Qi, F., et al. Combined effect of BCG vaccination and enriched environment promote neurogenesis and spatial cognition via a shift in meningeal macrophage M2 polarization. Journal of Neuroinflammation. 14 (1), 32 (2017).
- Yang, J., et al. Neonatal BCG vaccination of mice improves neurogenesis and behavior in early life. Brain Research Bulletin. 120, 25-33 (2016).
- Deshmukh, H. S., et al. The microbiota regulates neutrophil homeostasis and host resistance to Escherichia coli K1 sepsis in neonatal mice. Nature Medicine. 20 (5), 524-530 (2014).
- Butchbach, M. E. R., Edwards, J. D., Schussler, K. R., Burghes, A. H. M. A novel method for oral delivery of drug compounds to the neonatal SMNDelta7 mouse model of spinal muscular atrophy. Journal of Neuroscience Methods. 161 (2), 285-290 (2007).
- Hickey, L., Garland, S. M., Jacobs, S. E., O’Donnell, C. P. F., Tabrizi, S. N. Cross-colonization of infants with probiotic organisms in a neonatal unit. Journal of Hospital Infection. 88 (4), 226-229 (2014).
- Costeloe, K., et al. A randomised controlled trial of the probiotic Bifidobacterium breve BBG-001 in preterm babies to prevent sepsis, necrotising enterocolitis and death: the Probiotics in Preterm infantS (PiPS) trial. Health Technology Assessment. 20 (66), 1-94 (2016).
- Kitajima, H., et al. Early administration of Bifidobacterium breve to preterm infants: randomised controlled trial. Archives of Disease In Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 76 (2), F101-F107 (1997).
- Millar, M. R., Bacon, C., Smith, S. L., Walker, V., Hall, M. A. Enteral feeding of premature infants with Lactobacillus GG. Archives of Disease In Childhood. 69 ((5 Spec No)), 483-487 (1993).
- Preidis, G. A., et al. Probiotics stimulate enterocyte migration and microbial diversity in the neonatal mouse intestine. The FASEB Journal. 26 (5), 1960-1969 (2012).
- Kirjavainen, P. V., El-Nezami, H. S., Salminen, S. J., Ahokas, J. T., Wright, P. F. A. The effect of orally administered viable probiotic and dairy lactobacilli on mouse lymphocyte proliferation. FEMS Immunology & Medical Microbiology. 26 (2), 131-135 (1999).
- Gill, H. S., Rutherfurd, K. J. Viability and dose–response studies on the effects of the immunoenhancing lactic acid bacterium Lactobacillus rhamnosus in mice. British Journal of Nutrition. 86 (2), 285-289 (2001).
- Yu, Z., Morrison, M. Improved extraction of PCR-quality community DNA from digesta and fecal samples. BioTechniques. 36 (5), 808-812 (2004).
- Holland, J. L., Louie, L., Simor, A. E., Louie, M. PCR detection of Escherichia coli O157:H7 directly from stools: evaluation of commercial extraction methods for purifying fecal DNA. Journal of Clinical Microbiology. 38 (11), 4108-4113 (2000).
- Müller, A., et al. A powerful DNA extraction method and PCR for detection of microsporidia in clinical stool specimens. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 6 (2), 243-246 (1999).
- Pitcher, D. G., Saunders, N. A., Owen, R. J. Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate. Letters in Applied Microbiology. 8 (4), 151-156 (1989).
- Bollet, C., Gevaudan, M. J., de Lamballerie, X., Zandotti, C., de Micco, P. A simple method for the isolation of chromosomal DNA from gram positive or acid-fast bacteria. Nucleic Acids Research. 19 (8), 1955 (1991).
- Thomas, C. M., Versalovic, J.
- Tancredi, D. J.
- Bernardo, W. M., et al. Effectiveness of Probiotics in the Prophylaxis of Necrotizing Enterocolitis in Preterm Neonates: A Systematic Review and Meta-analysis. Jornal de Pediatria. 89 (1), 18-24 (2013).
- Aceti, A., et al. Probiotics for prevention of necrotizing enterocolitis in preterm infants: systematic review and meta-analysis. Italian Journal of Pediatrics. 41 (1), 89 (2015).
