Kvantitativ metode er utviklet for å identifisere og forutsi Akutt toksisitet av kjemikalier ved å automatisk analysere fenotypiske profilering av Caenorhabditis elegans. Denne protokollen beskriver hvordan å behandle ormer med kjemikalier i en 384-vel plate, fange video og kvantifisere toksikologiske relaterte fenotyper.
Bruk toksisitet testing av kjemikalier i høyere orden organismer, som mus eller rotter, er tidkrevende og kostbar, deres lang levetid og vedlikeholdsproblemer. Tvert imot, Rundormer Caenorhabditis elegans (C. elegans) har fordeler å gjøre det et ideelt valg for toksisitet testing: en kort levetid, lett dyrking og effektiv gjengivelse. Her beskriver vi en protokoll for automatisk fenotypiske profilering C. elegans i en 384-vel plate. Rundormer ormer er kultivert i en 384-vel plate med flytende medium og kjemisk behandling, og videoer er tatt av hver brønn å kvantifisere kjemiske påvirkning på 33 ormen funksjoner. Eksperimentelle resultater viser at funksjonene kvantifisert fenotypen kan klassifisere og forutsi Akutt toksisitet for ulike kjemiske forbindelser og opprette en prioritet for mer tradisjonelle kjemiske giftighet vurdering tester i en gnager modell.
Sammen med den raske utviklingen av kjemiske forbindelser på industriell produksjon og folks daglige liv, er det viktig å studere toksisitet testing modeller for kjemikalier. I mange tilfeller er den gnager dyremodell ansatt å vurdere den potensielle toksisitet av ulike kjemikalier på helse. Vanligvis er bestemmelse av dødelige konsentrasjoner (dvs. assayed 50% dødelig dose [LD50] ulike kjemikalier) brukt som tradisjonelle parameteren i en gnager (rotte/mus) modell i vivo, som er tidkrevende og svært dyre. Dessuten, på grunn av redusere, avgrense eller erstatte (3R) prinsipp som er sentrale for dyrevelferd og etikk, nye metoder som tillater utskifting av dyr er verdifulle forskning1,2,3 . C. elegans er et frittlevende Rundormer som er isolert fra jord. Det har vært mye brukt som en forskning organisme i laboratoriet på grunn av sin fordelaktige egenskaper, som kort lifespan, lett dyrking og effektiv gjengivelse. I tillegg er mange grunnleggende biologiske banene, inkludert grunnleggende fysiologiske prosesser og stressresponser i C. elegans, bevart i høyere pattedyr4,5,6,7 , 8. et par sammenligninger vi og andre har gjort, det er en god samsvar mellom C. elegans giftighet og toksisitet i gnagere9. Alt dette gjør C. elegans en god modell for å teste effekten av kjemiske toksisitet i vivo.
Nylig kvantifisert noen studier fenotypiske funksjonene C.elegans. Funksjonene kan brukes å analysere toksisitet av kjemikalier2,3,10 og aldring av ormer11. Vi har også utviklet en metode som kombinerer en flytende orm dyrking og et bilde analyse systemet, der ormer er kultivert i en 384-vel plate under forskjellige kjemiske behandlinger12. Dette kvantitativ teknikk er utviklet for å automatisk analysere 33 parameterne C. elegans etter 12-24h kjemisk behandling i en 384-vel plate med flytende medium. En automatisert mikroskop scenen brukes for eksperimentelle video oppkjøpet. Videoene er behandlet av en tilpasset designet program og 33 funksjoner for ormer flytte atferd er kvantifisert. Metoden er brukt om å kvantifisere av ormen fenotyper under behandling av 10 forbindelser. Resultatene viser at ulike toksisitet kan endre av fenotyper C.elegans. Disse kvantifisert fenotyper kan brukes til å identifisere og forutsi Akutt toksisitet av ulike kjemiske forbindelser. Det overordnede målet med denne metoden er å tilrettelegge for observasjon og fenotypiske kvantifisering eksperimenter med C. elegans i en. Denne metoden er nyttig for programmet C. elegans kjemiske giftighet evalueringer og fenotypen quantifications, som hjelper forutse Akutt toksisitet av ulike kjemiske forbindelser og opprette en prioritet for mer tradisjonelle kjemiske giftighet vurdering tester i en gnager modell. I tillegg kan denne metoden brukes toksisitet screening og testing av nye kjemikalier eller sammensatte som mat additiv agent forurensning, pharmacautical forbindelser, miljømessige eksogene sammensatte og så videre.
Fordelene med C. elegans har ført til økende bruk i toksikologi9, både mekanistisk studier og høy gjennomstrømming screening tilnærminger. En øket rolle for C. elegans i utfyller andre modellsystemer i toksikologiske forskning har vært bemerkelsesverdig de siste årene, spesielt for rask toksisitet vurdering av nye kjemikalier. Denne artikkelen inneholder en ny analysen av høy gjennomstrømning og kvantitative screening av ormen fenotyper i en 384-vel plate for automatis…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker CGC for vennlige sende den C. elegans. Dette arbeidet ble støttet av National nøkkelen forskning og utvikling Program i Kina (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705); National Natural Science Foundation Capital Health Research og utvikling av spesialprosjekt i Beijing (#2011-1013-03), fondet åpningen av Beijing nøkkel Laboratory miljø toksikologi (# Kina Grant (#31401025, #81273108, #81641184) 2015HJDL03), og Natural Science Foundation i Shandong i Folkerepublikken Kina (ZR2017BF041).
2-Propanol | Sigma-Aldrich | 59300 | |
384-well plates | Throme | 142761 | |
Agar | Bacto | 214010 | |
Atropine sulfate | Sigma-Aldrich | PHL80892 | |
Bleach buffer | 0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water | ||
Cadmium chloride | Sigma-Aldrich | 202908 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 21074 | |
CCD camera | Zeiss | AxioCam HRm | Zeiss microscopy GmbH |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
Copper(II) sulfate | Sigma-Aldrich | 451657 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 24105 | |
Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
K-Medium | 3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water | ||
LB Broth | 10 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast Extract, 5 g/L NaCl | ||
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 63140 | |
NGM Plate | 3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer | ||
Peptone | Bacto | 211677 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 60130 | |
Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 795496 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 795488 | |
PPB buffer | 35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water | ||
shaker | ZHICHENG | ZWY-200D | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 71382 | |
Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | s7920 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71690 | |
Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 239305 | |
The link of program | https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate | ||
Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | |
Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | |
Zeiss automatic microscope | Zeiss | AXIO Observer.Z1 | Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera |