Summary
Burada, bir tahlil transposase erişilebilir Kromatin (ataç-seq) aktif CD4 + insan lenfositler üzerinde sıralama için gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Protokol % 50 mitokondrial DNA okuma yeni bir lizis arabellek başlanarak % 3 bulaşıcı en aza indirmek için değiştirildi.
Abstract
ATAÇ-seq epigenetik genom genelinde erişilebilir Kromatin eşleme için hızlı ve basit yaklaşımı nedeniyle çalışmada yaygın olarak kullanılan bir yöntem haline gelmiştir. Bu yazıda biz mitokondrial DNA okuma kirletici azaltır geliştirilmiş bir ataç-seq Protokolü mevcut. Önceki ataç-seq protokolleri ile mücadele var ise ortalama % 50 oranında mitokondrial DNA kirletici okur, bu protokol için sunulan en iyi duruma getirilmiş lizis arabellek % 3 ortalama mitokondrial DNA kirlenme azaltır. Bu gelişmiş ataç-seq iletişim kuralı sıralaması maliyet bir çevre % 50 azalma sağlar. Bu yüksek kaliteli ataç-seq kütüphanelerin aktif CD4 + lenfositlerinin, hazır nasıl CD4 + lenfosit izolasyonu tam kan veri analizi ile kimden adım adım yönergeler sağlama göstermektedir. Bu gelişmiş ataç-seq Protokolü hücre tipleri geniş bir doğrulanır ve Kromatin erişilebilirlik eğitim araştırmacılar için acele kullanma olacaktır.
Introduction
Tahlil transposase erişilebilir Kromatin (ataç-seq) sıralama için hızla Kromatin mimari sorguya için önde gelen yöntem haline gelmiştir. ATAÇ-seq tagmentation, parçalanan ve DNA'ın hangi ile karşıdan karşıya tüm bir genom Kromatin erişilebilirlik sıralama belirleyebilirsiniz kitaplıkları üretmek için aynı enzim tarafından etiketleme işlemi boyunca erişilebilir Kromatin bölgeleri tanımlayabilirsiniz. Bu tagmentation işlem yalnızca Kromatin nucleosomic steric engel nedeniyle açık bölgelerinde keser hiperaktif Tn5 transposase tarafından aracılık ettiği. Bu kesim, Tn5 transposase da hızlı Kütüphane İnşaat tarafından PCR ve yeni nesil sıralama genom genelinde erişilebilir Kromatin1,2için izin sıralaması bağdaştırıcısı ekler.
ATAÇ-seq Kromatin erişilebilirlik nispeten basit ve hızlı iletişim kuralı, kalite ve onun sonuçları ve az miktarda malzeme gerekli başlangıç belirlenebilir bilgi yelpazesi nedeniyle bölgelerinde belirlemek için tercih edilen yöntem haline gelmiştir. (Hangi Ayrıca genom çapında Kromatin erişilebilirlik) Dnaz seq3 , MNase-seq4 (hangi açık genom nucleosome tüfekleriyle belirler) karşılaştırıldığında ve formaldehit aracılı FAIRE-seq5, ATAÇ-seq hızlıdır, daha ucuz ve daha tekrarlanabilir1. Dnaz seq3için gerekli 50 milyon çekirdeği göre 500 çekirdeği olarak az malzeme ile başlayan çalışma daha hassas da. ATAÇ-seq da transkripsiyon faktörü bağlama, nucleosome konumlandırma ve açık Kromatin bölgeleri1de dahil olmak üzere diğer yöntemlere göre Kromatin mimarisi hakkında daha fazla bilgi sağlama yeteneği vardır. Etkili, tek hücreli ataç-seq protokolleri doğrulandıktan, tek hücreli seviye6,7, Kromatin mimarisi hakkında bilgi sağlarsınız.
ATAÇ-seq Kromatin Mimarlık araştırma ve hücre türleri, bitkiler8, insanlar9ve birçok diğer organizmalar da dahil olmak üzere geniş bir spektrum üzerinde tanımlamak için kullanılmıştır. Ayrıca hastalık Birleşik7epigenetik Yönetmeliği teşhis etmek için kritik olmuştur. Ancak, en yaygın kullanılan ataç-seq Protokolü önemli dezavantajı kirlenme sıralama okunma mitokondrial DNA içerir. Bazı veri kümeleri bu kontaminasyon düzeyi olarak sıralama sonuçlar%160 yüksek olabilir. ATAÇ-seq7,10,11daha verimli kullanma için izin vermek için bu bulaşıcı mitokondrial okuma azaltmak üzere alana bir çaba olduğunu. Burada yaklaşık % 50 azalma sıralama maliyeti10dakika sonra izin mitokondrial DNA kirlenme oranı sadece % 3, azaltır geliştirilmiş bir ataç-seq Protokolü mevcut. Bu aerodinamik sürecin CD4 + lenfosit yalıtım ve harekete geçirmek ve mitokondriyal DNA kirlenme minimize kritik bir geliştirilmiş lizis arabellek mümkün olmaktadır.
Bu modifiedATAC-seq Protokolü Primer hücre, insan birincil periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs)10, insan birincil monosit ve fare dendritik hücreler (yayınlanmamış) de dahil olmak üzere geniş bir doğrulandı. Bu da başarıyla melanoma hücre hatlarında kümelenmiş bir düzenli olarak interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) ekran öğeleri11kodlamayan sorguya çekmek için kullanılmıştır. Ayrıca, bu protokol için açıklanan ve GitHub üzerinde sağlanan veri çözümleme paketi ataç-seq verileri çözümlemek için yeni ve deneyimli araştırmacılar araçları sağlar. ATAÇ-seq Kromatin erişilebilirlik tüm bir genom eşlemek için en etkili tahlil olduğunu ve burada sunulan değişiklikler mevcut protokol için araştırmacılar yüksek kaliteli veri düşük mitokondrial DNA kirlenme ile üretmek için izin verir, sıralama maliyeti azaltır ve ataç-seq üretilen iş.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu geliştirilmiş iletişim kuralı veri analizi (şekil 1) ile tam kan başlangıç malzemesinden ataç-seq CD4 + lenfosit, gerçekleştirmek için adım adım yönergeler sağlar.
1. yalıtım CD4 + T hücre tam kan
Not: Başlangıç bu iletişim kuralı için seçilecek başlangıç materyali kaynağıdır araştırma gereksinimleri temel alarak izin veren standart prosedürler kullanarak toplanan taze tam kan 15 mL malzemedir. Protokol gerektiği şekilde ölçeklendirin. Önceden sıcak fosfat tamponlu tuz (PBS) + %2 fetal buzağı serum (FCS) oda sıcaklığında (RT) için ve CD4 + T hücre zenginleştirme yordamına başlamadan önce santrifüj RT için ayarlayın.
- Tam kan 50 mL konik tüp içinde 15 mL 750 µL insan CD4 + T hücre kendilerini zenginleştirmek kokteyl ekleyin ve karışımı yavaşça INVERSION tarafından. RT 20 dk için kuluçkaya. Kuluçka tamamlandığında, PBS + % 2 FCS 15 mL tüp ekleyin ve karışımı yavaşça INVERSION tarafından.
- Yoğunluk orta 15 mL ile taze 50 mL konik tüp hazırlayın. Dikkatle seyreltilmiş kan örneği oluşturur yoğunluk orta/kan arabirimi bozmaya değil emin olmak yoğunluk orta üst üzerine katman. Santrifüj, 1200 x g ve RT küme 1 ve azalan fren OFF ivme ile 20 dk için.
Not: Bu ivme 1 ve fren kapalı hücre katmanı yoğunluk orta bozulma önlemek için santrifüj azalan şekilde ayarlamak için önemlidir. - Zenginleştirilmiş CD4 + T hücreleri dar kök transfer pipet kullanarak yoğunluk orta/plazma arabiriminden toplamak. Kendine hakim hücre taze 50 mL konik tüp aktarın. Kendine hakim CD4 + T hücre 423 x g ve RT., 8 dk santrifüj kapasitesi
Not: Adım 1.3 ve tüm aşağıdaki adımları için on 9 ve azalan fren santrifüj ivme dönmek emin olun. - Süpernatant atmak ve hücre Pelet iki kez PBS + % 2 FCS 50 mL ile yıkayın, 8 dk 423 x g ve RT. atmak için son süpernatant centrifuging yıkama ve yıkanmış hücre Pelet 2 mL PBS + % 2 FCS askıya alma.
- Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. ATAÇ-seq ile devam etmek için 2,3 adıma geçin. Daha sonra işlenmek için hücreleri dondurmak için 1,6 adım geçin.
- 1 mL taze dondurma orta (% 90 FCS + % 10 Dimetil sülfoksit) 1 milyon hücre başına ekleyin. Kriyojenik güvenli tüpler ortamda dondurma hücrelerinin aliquot 1 mL. Tüpler-80 ° C'de gecede yavaş dondurma konteyner yerleştirin. Ertesi gün, uzun süreli depolama için sıvı nitrojen tüpleri aktarın.
Not: 1 milyon CD4 + T hücre orijinal tam kan hacmi 2 mL izole olacak. 1 mL aliquots dondurucu orta 500.000 hücrelerde dondur. Taze dondurma orta her kullanımı olun.
2. etkinleştirmek ve CD4 + T hücreleri arındırmak
Not: Etkinleştirmek ve CD4 + T hücreleri sadece arındırıcı hızlı bu protokolü 48 h ve sonuçları % 95 uygun, CD4 + T hücreleri aktive gerektirir. 4 ° c santrifüj protokol başlamadan önce serin.
- Buz sadece erimiş kadar 1 flakon (500.000) CD4 + T hücre 37 ° C su banyosu içinde çözülme. Yavaşça 15 mL konik tüp 9 mL % 10 FCS, bundan sonra tam RPMI anılacaktır ile takıma Önceden ısıtılmış Roswell Park Memorial Enstitüsü-1640 (RPMI-1640) medya içeren hücreleri aktarın.
Not: hücreleri tamamen DMSO maruz önlemek için çözülme izin vermeyin. - 1500 x g ve 4 ° c, 6 dk santrifüj Süpernatant atın ve yavaşça Pelet komple RPMI 2 mL askıya alma. Spin aşağı tekrar süpernatant atın ve yavaşça tam RPMI 0.5 mL hücrelerde askıya alma.
- Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. Tam RPMI bir 96-şey yuvarlak alt plaka kuyu başına 200 µL 50.000 hücreleri plaka ile hücre süspansiyon yoğunluğunu ayarlayın.
Not: 500 K CD4 + T hücreleri, plaka 10 wells bir şey başına 200 µL 50.000 CD4 + T hücre bir donmuş tüp sizden. -
Manyetik boncuklar insan T-harekete geçirmek anti-CD3 ve anti-CD28 antikorları ile Birleşik hazırlayın.
- Aliquot 12.5 µL insan T-harekete geçirmek CD3/CD28 boncuk ataç-seq örnek bir 1,5 mL tüp için başına. Boncuk 1 mL 1 x PBS ile yıkama ve 1 dk. için bir mıknatıs tüp yerleştirin.
- Dikkatle kaldırmak ve açık süpernatant atmak, tüp mıknatıs kaldır ve boncuk 13'te askıya µL tamamlamak RPMI ataç-seq örnek.
Not: işlenmekte olan ataç-seq örnekleri sayısına göre boncuk gerekli miktarını hesaplamak. Bu iletişim kuralı bir ataç-seq örnek oluşturan 12.5 µL CD3/CD28 boncuk 500.000 hücreleri, ücret gerektirir.
- CD4 + T hücreleri aktif hale getirin. 15 mL konik tüp içinde tam RPMI orta 2.1 ml 500.000 hücreleri toplamak ve 12.5 µL önceden yıkanmış insan T-harekete geçirmek boncuk ekleyin. Karışımı yavaşça tüp ters çevirme.
- Yavaşça boncuk hücrelerle boncuk yuvarlak alt 96-şey plaka bir çok kanallı pipet kullanarak kuyu başı içeren hücrelerin steril bir rezervuar ve plaka 200 µL aktarın. 48 h bir 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka için kuluçkaya.
- Kuluçka sonrası, 96-şey plaka 423 x g ve RT. kaldırmak 100 µL orta bir konik tüp boncuk kaybı olmaz emin olmak için atılmadan önce toplama 96-şey plaka kuyudan başı itibariyle 8 dk santrifüj kapasitesi. Hücre Pelet kalan 100 µL resuspend ve her bir 1,5 mL tüp içinde toplamak.
Not: aktive T hücrelerinin 10 kuyu 1 mL hacminde toplanacaktır. - CD4 + yalıtım gerçekleştirin. Önceden yıkanmış Birleşik CD4 boncuk 50 µL tam RPMI 1 ml 500.000 hücreleri ekleyin. Boncuk ve hücreleri tarafından pipet birleştirir. Buzdolabında 4 ° C'de 20 dk için kuluçkaya. Boncuk ve hücre karışımı her 6 dk kışkırtmak.
Not: 500.000 hücreleri bir örneği için kullanılan protokoldür. 500.000 iki veya daha fazla örnek için gerektiği şekilde ayarlayın. - Kuluçka tamamlandığında, 2 dk. kaldırmak ve süpernatant temiz zaman atmak için tüp üzerinde mıknatıs yerleştirin. Boncuk bağlı hücreler tüp mıknatıs--dan kaldırma, PBS + % 2 FCS 1 mL boncuk bağlı hücrelerde askıya alma, 1 dk. için mıknatıs tüp değiştirme ve açık süpernatant atarak yıkayın. Toplam 3 yıkama için bu işlemi yineleyin.
Not: Yıkama sırasında herhangi bir boncuk atmak değil dikkatli olun. - Son yıkama sonra tüp 1 dk. Kaldır mıknatıs yerleştirin ve süpernatant atmak ve Pelet Buza koyun. Bölüm 3 (ataç-seq) devam etmek.
3. ataç-seq
Not: Bu adımda, izole çekirdeği harekete geçirmek CD4 + T hücreleri için ataç-devamı. Bu protokol için lizis arabelleği daha verimli sindirim ve yüksek kaliteli sonuçlar ile sonuçlanan çekirdeklerin üzerindeki nazik olmak için geliştirilmiştir. Tüm Santrifüjü adımlar bölümünde 3 4 ° C'de tutulan bir sabit açılı santrifüj ile gerçekleştirilir Santrifüj Protokolü başlamadan önce serin.
- Çekirdeklerin yalıtım gerçekleştirin. Boncuk ve soğuk lizis arabellek (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, % 0.03 polysorbate 20) içeren hücreleri resuspend. Hemen vasıl 500 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi Kaldırmak ve süpernatant atın.
- Transposase reaksiyon gerçekleştirin. Tn5 transposase mix (Tablo 1) 50 µL ile izole çekirdeği Pelet askıya alma. Bir thermocycler 4 ° C'de tamamlandığında tutan bir 40 ° C kapaklı 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya.
- Thermocycling sonra hemen aşağı hızlı benchtop santrifüj spin gerçekleştirmek ve tüp boncuk ürün kaldırmak 1 dk için mıknatıs yerleştirin.
- Açık süpernatant tüp sizden bir DNA arıtma sütun üzerinde mıknatıs aktarın. Sütun bir arabellek PE 750 µL iki kez ve bir kez arabellek PB 250 µL ile yıkayın. 10 µL elüsyon arabelleği örnekte elute. Doğrudan 3.5 adıma geçin.
Not: Bu adım burada ataç-seq kitaplık olarak adlandırılan ve birleştirilmiş adaptörler ile DNA parçalarının güçlendirir. Bir NGS lane üzerinde çalışmak üzere birkaç ataç-seq kitaplıkları multiplex için tüm örnekleri ve bireysel örnekleri (Tablo 2) için farklı bir dizin oluşturulmuş astar 2 Sıralanmayan astar 1 kullanın. Astar 1,25 µM konsantrasyonları çalışma konusunda kullanılır. - İlk PCR güçlendirme tepki nükleaz ücretsiz PCR tüp, düzen ve belirtilen birim parçaları birleştirme içinde kurmak Tablo 3. PCR tüp thermocycler yerleştirin ve Tablo 4belirtildiği gibi Bisiklete binme koşullarla PCR güçlendirme programı çalıştırmak.
-
Reaksiyon qPCR tarafından izlemek. QPCR reaksiyon nükleaz ücretsiz PCR tüp, düzen ve tablo 5'te belirtilen tutarı parçaları birleştirme içinde ayarlayın. QPCR makine ve döngüsü içinde belirtilen tablo 6 olarak yer.
- Ek amplifikasyon en uygun sayısı için kalan 45 µL tepki döngüleri belirlemek için x ekseni ve y ekseni üzerinde göreli floresan (RFU) üzerinde döngü numarası ile bir çizim oluşturma. Ek amplifikasyon döngüleri en uygun sayısı üçte biri Yaylası ulaşmak qPCR reaksiyon için alır devir sayısıdır.
Not: tepki qPCR tarafından izlenmesi en iyi kütüphane parçası amplifikasyon GC içerik ve boyutu önyargı en aza indirirken elde etmek için istenen PCR döngüleri en uygun sayısı tespiti için izin verir.
- Ek amplifikasyon en uygun sayısı için kalan 45 µL tepki döngüleri belirlemek için x ekseni ve y ekseni üzerinde göreli floresan (RFU) üzerinde döngü numarası ile bir çizim oluşturma. Ek amplifikasyon döngüleri en uygun sayısı üçte biri Yaylası ulaşmak qPCR reaksiyon için alır devir sayısıdır.
- Kalan 45 µL PCR reaksiyon son PCR amplifikasyon tamamlayın. PCR tüp amplifikasyon tepki adım 3.5 ile thermocycler geri yerleştirin ve Tablo 7' de açıklandığı gibi çalıştırın.
Not: Bu protokol için açıklandığı gibi işlenmiş örnekler için PCR güçlendirme döngüleri en iyi toplam sayısını 12 olduğu tespit edilmiştir. - Yükseltme tamamlandıktan sonra elüsyon arabellek 25 µL içinde eluting üreticinin protokolüne bir PCR Temizleme kiti kullanma kitaplıkları arındırmak.
Not: Güçlendirilmiş kitaplıkları en fazla 48 saat için 4 ° C'de depolanan veya uzun süreli depolama için-20 ° C arasında dondurulup.
4. ataç-seq Kütüphane kalitesi analizi
Not: Kalite ve miktar gelecek nesil sıralama önce ataç-seq kütüphanelerin doğrulanması önemlidir. Kalite ve miktar kütüphanelerin piyasada kitleri ( Tablo malzemelerigörmek) kullanarak değerlendirilmesi.
- Boyutlandırma, miktar ve kalite kontrol DNA'ın havacilik tabanlı platformu kullanarak ataç-seq kütüphanelerin miktar ve kalitesini değerlendirmek. Temsilci kalite değerlendirme sonuçları için bkz: Şekil 2 .
Not: ATAÇ-seq kütüphanelerin konsantrasyon olması gerekir > 1 ng/µL kalite sıralama sonuçları elde etmek için. Ortalama, 30 nM içinde 25 µL elde.
5. sıralama ve veri analizi
Not: Bu analiz boru hattı yordamı eşleme okuma kalite kontrol, deneysel tasarım koordinatlarını ayarlamak ve tepeler aşağı akım analizi için çağrı kullanıcılara izin verir. Aşağıdaki komut satırlarını ve yürütme açıklaması vardır. Veri çözümleme paketi (https://github.com/s18692001/bulk_ATAC_seq) kullanılabilir.
- Bir sonraki nesil sequencer 42 milyon okuma örnek başına ortalama okuma derinliği için hazırlanan arşivini sıra.
- Sıralama okuma kalitesini komutunu kullanarak FastQC12 yazılım paketi tarafından oluşturulan dosyaları kontrol ederek tahmin:
fastqc -o < output_directory >< fastq_file > - Okuma üsleri Trimmomatic13 yazılımların gerekirse, istimal belgili tanımlık buyurmak FastQC kalite kontrol tarafından belirlenen döşeme (için çift uçlu):
Java-jar trimmomatic jar dosyasına < yol > PE < input1 >< input2 >< eşleştirilmiş output1 >< unpaired output1 >< eşleştirilmiş output2 >< unpaired output2 > HEADCROP: < kırpma üsleri > - Okuyan insan başvuru genom (hg38) Bowtie214 yazılımların Hizala:
bowtie2 - x < genom referans > < giriş çift 1 >< -1 giriş çift 2 > -S < çıktı SAM dosyası >
Not: Bağımsız değişken - x dizini için başvuru genom basename için ve -S için SAM biçimi çıktı. - Thequality Samtools15 flagstat paketi kullanarak eşlenen okur kontrol edin:
samtools flagstat < BAM Dosya > - Eşlenen okuma dosya sıralamak ve Picard16 aracını kullanarak Yinelenenleri kaldırmak:
Java-picard.jar SortSam giriş kavanoz = < giriş SAM dosya adı > çıkış = < sıralı çıktı BAM dosya adı > SORT_ORDER koordinat = "ve" java-picard.jar MarkDuplicates giriş kavanoz = < sıralanmış BAM Dosya > çıkış = < çıkış BAM dosya yinelenen olmadan > REMOVE_DUPLICATES = TRUE - Dizin BAM dosya, kullanılmayan kromozom okuma trim ve koordinatları ataç-seq17deneysel nedeni kayması:
Java-jar picard.jar BuildBamIndex giriş < BAM Dosya > =
samtools idxstats < giriş BAM Dosya > | -f 1 kesmek | GREP - v chrY | GREP - v chrM | GREP - v chrUn | xargs samtools göster -b < giriş BAM Dosya >>< çıkış kesilmiş BAM Dosya >
bedtools bamtobed -i < giriş kesilmiş BAM Dosya >>< çıkış kesilmiş yatak Dosya >
awk ' başlamak {OFS = "\t"}; {Eğer (6 $ == "+") $1, $2 + 4, $3 + 4, 4 $, 5 $, $6 Yazdır; baskı başka $1, $2-5, $3-5, 4 $, 5 $, $6}' < giriş kesilmiş yatak Dosya >< Trimmed kayar yatak Dosya > - Negatif koordinasyon kaydırılacağı okuma silin:
'{($2 > 0) $1 "\t" $2 "\t" 3 "\t" $4 "\t" 5 $ "\t" 6 $yazdırırsanız}' awk < giriş yatak Dosya >< çıkış negatif koordinasyon yatak Dosya >. - BAM dosyasına aşağıdaki DiffBind18 analizi için yatak dosya dönüştürmek:
bedtools bedtobam -i < giriş yatak Dosya > -g < başvuru genom >< çıkış BAM Dosya > - Tepe arama gerçekleştirmek DiffBind18 yazılım paketi tarafından:
macs2 callpeak -t < giriş BAM Dosya > -f BAM -g hs - nomodel--nolambda--tutmak-dup tüm--arama-zirve--outdir < çıktı dizin yolu > - n < çıktı adı > -B - q 0,01--bdg--üst karakter -100 - extsize 200
Not: Süzme sonra medyan örnek başına 37 milyon okuma bekliyoruz. Mitokondrial DNA kirlenme--dan %0.30 – %5,39 (%1,96 ortalama) aralığı olacaktır. Orada-ecek var olmak çarpma eşlenen okur (ortalama % 6.7-% 56, %19) oranı düşük ve nispeten yüksek oranda kullanılabilir nükleer (% 60-% 92, ortalama olarak % 79) okur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Taze tam kan 15 mL, bu protokol ortalama 1 milyon CD4 + T hücreleri oluşturur. Bunlar daha sonra işlenmek için dondurulmuş ya da hemen kullanılabilir. CD4 + T hücreleri, taze veya çözülmüş, canlılık olduğunu sürekli > % 95. Bu yöntem CD4 + T hücre izolasyon kaynak malzeme ve toplama zamanında için esneklik sağlar. Bu gelişmiş ataç-seq Protokolü 1 ng/µL sıralama için daha büyük bir final Kütüphanesi üretir. Kalite kontrol ticari olarak mevcut sistemleri kullanılarak yapılır DNA parçalarının arasında 200 ve 1000 bp (Şekil 2) göstermelidir. Sıralama yalnızca yüksek kaliteli kütüphaneleri ile gerçekleştirilmelidir.
Tüm kitaplıkları için ortalama derinliği 40 milyon örnek okumak daha büyük sıralı. Yaygın şekilde kullanılan ataç-seq protokolleri % 50-% 60 dan okuma1 sıralama toplam değişebilir mitokondrial DNA sıralama okunma kirletici tarafından itiraz edildi ise bu gelişmiş protokol sorunu ortadan kaldırır. Bu protokol sonrası hazırlanan kitaplıkları ortalama olarak sadece % 3 mitokondrial okuma (şekil 3A) içerir. Kullanılabilir okuma oranı yüksek biyolojik çoğaltır (şekil 3B) arasında yeterince sabittir. Protokol biyolojik çoğaltır (şekil 4 c, D) yanı sıra teknik çoğaltır (şekil 4A, B) arasında son derece tekrarlanabilir sonuçlar sağlamak mümkün. Ayrıca, sunulan CD4 + T hücre aktivasyonu için protokol 48 h yerine bir hafta veya daha fazla alan ve tekrarlanabilir sıralama sonuçlarına göre (şekil 4A, B) gösterildiği gibi tutarlı ve verimli harekete geçirmek içinde sonuçlanır. Tahmin edilen ataç-seq doruklarına doğru bir şekilde (şekil 4E) analiz boru hattı adı verilir. Sıralama sonuçlarının analizi net değişiklikleri Kromatin devlet insan T hücre aktivasyonu sırasında tespit edilmiştir. Açık Kromatin differentially erişilebilir bölgeleri arasında altı örnekleri önce ve etkinleştirme (şekil 5) 48 saat sonra tespit edilmiştir.
Şekil 1: değiştirilmiş ataç-seq Protokolü deneysel bakış. (A)örnek alma ve işleme, CD4 + T aracılığıyla hasta tam kan 15 mL den yalıtım, kaplama ve T hücreleri ve hücre çekirdeği yalıtım ile geliştirilmiş lizis arabellek aktivasyonu hücre. (B) transposase reaksiyon ve PCR güçlendirme sıralama kitaplığı. (C) kalite analizi, sıralama ve veri analizi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: bir havacilik tabanlı platform boyutlandırma, miktar ve kalite kontrol DNA'ın temsilcisi yüksek kaliteli ataç-seq kitaplıklardan. (A)elektronik jel 200 ve 1000 baz çifti arasında gösterilmeyen örnekleri B1 ve D1 görüntüsünü. (B ve C) Electropherogram izleme sonucu (B) örnekleri B1 ve D1 (C), 200 ve 1000 baz çifti arasındaki zirveleri ile. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Gelişmiş ataç-seq Protokolü sonuçlar kullanılabilir DNA sıralama okuma bir artış ile mitokondrial DNA kirlenme azaldı. (A)karşılaştırılması kullanılabilir okur (mor), yinelenen okur (yeşil) ve mitokondrial okunma (kırmızı) CD4 + T hücre ataç-seq literatürde profil oluşturma. Kullanılabilir karşılaştırılması (B) okur (mor), yinelenen okur (yeşil), mitokondriyal (kırmızı) okur ve eşlenmemiş okuma (mavi) CD4 + T hücre ataç-seq birden çok sağlıklı bireylerin profil oluşturma (n = 22). Bu rakam Cheng ve ark.10değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Gelişmiş ataç-seq Protokolü tekrarlanabilirlik ve doğruluk. İki unstimulated, deneyler çoğaltmak için araziler Kromatin erişilebilirlik (ataç-seq sinyal, x ve y-Axes) dağılım (A; 36,486 Th tepeler) veya etkin (B; 52,154 Thstim tepeler) T hücreleri gösterir teknik tekrarlanabilirlik. Bireylerin IGTB1191 aktive T hücreleri için Kromatin erişilebilirlik (y ekseni) ve IGTB1190 (x ekseni) (C) ve 52,154 Thstim tepeler (D) için bireylerin her çiftleri arasındaki korelasyon histogramını gösterir tekrarlanabilirlik bireyler arasında. (E) ataç-seq kromozom, bizim gelişmiş ataç-seq protokolü ile 19 Q13.12 denilen doruklarına. Bu rakam Cheng ve ark.10değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: Kromatin devlet CD4 + T hücre aktivasyonu sonra değişiklikleri sonuçlarını temsilcisi ataç-seq. (A)deneysel genel bakış (solda) ve adlandırma (sağda). (B) Differentially erişilebilir bölgelerinde açık Kromatin (sütunlar) önce (üst, inci) altı örnekte (satırlar) ve sonra (alt, ThSTIM) birincil CD4 + T hücre aktivasyonu 48 h. Bu rakam Cheng ve ark.10değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| 2 x TD arabellek | 25 ΜL |
| TN5 enzim | 5 ΜL |
| Nükleaz ücretsiz su | 20 ΜL |
| Toplam hacim | 50 ΜL |
Tablo 1: Adım 3.2 transposase reaksiyon bileşenleri.
| Ad1_noMX: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG |
| AD2.1_TAAGGCGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.2_CGTACTAG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAGTACGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.3_AGGCAGAA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTGCCTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.4_TCCTGAGC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCAGGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.5_GGACTCCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAGTCCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.6_TAGGCATG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATGCCTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.7_CTCTCTAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGAGAGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.8_CAGAGAGG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCTCTCTGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.9_GCTACGCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCGTAGCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.10_CGAGGCTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCCTCGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.11_AAGAGGCA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGCCTCTTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.12_GTAGAGGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCCTCTACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.13_GTCGTGAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCACGACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.14_ACCACTGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACAGTGGTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.15_TGGATCTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGATCCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.16_CCGTTTGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACAAACGGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.17_TGCTGGGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACCCAGCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.18_GAGGGGTT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAACCCCTCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.19_AGGTTGGG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCCAACCTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.20_GTGTGGTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACCACACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.21_TGGGTTTC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGAAACCCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.22_TGGTCACA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTGACCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.23_TTGACCCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGGTCAAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.24_CCACTCCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAGTGGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
Tablo 2: Ataç-seq oligos tasarımlar PCR için kullanılır.
| Nükleaz ücretsiz su | 11.9 ΜL |
| 100 µM özel Nextera astar 1 (Tablo 2) | 0.6 ΜL |
| NEBNext yüksek-sadakat 2 x PCR Master Mix | 25 ΜL |
| ATAÇ-Seq Kütüphane | 10 ΜL |
| 25 µM özel Nextera astar 2 (Tablo 2) | 2.5 ΜL |
| Toplam hacim | 50 ΜL |
Tablo 3: Adım 3.5 ilk PCR reaksiyon karışıma.
| DÖNGÜSÜ ADIM | SICAKLIK | ZAMAN | DÖNGÜLERİ |
| Uzantısı | 72 ° C | 5 dk | 1 |
| İlk denatürasyon | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Denatürasyon | 98 ° C | 10 s | 10 |
| Tavlama | 63 ° C | 30 s | |
| Uzantısı | 72 ° C | 1 dk. | |
| Basılı tutun | 4 ° C | Sonsuzluk | 1 |
Tablo 4: Adım 3.5 başlangıç PCR güçlendirme Bisiklete binme programı.
| PCR reaksiyon Aliquot | 5 ΜL |
| PCR kokteyl Tablo 3 0.6 x Syber yeşil | 10 ΜL |
Tablo 5: Adım 3.6 qPCR reaksiyon mix.
| DÖNGÜSÜ ADIM | SICAKLIK | ZAMAN | DÖNGÜLERİ |
| İlk denatürasyon | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Denatürasyon | 98 ° C | 10 s | 20 |
| Tavlama | 63 ° C | 30 s | |
| Uzantısı | 72 ° C | 1 dk. | |
| Basılı tutun | 4 ° C | Sonsuzluk | 1 |
Tablo 6: Adım 3.6 qPCR Bisiklete binme programı.
| DÖNGÜSÜ ADIM | SICAKLIK | ZAMAN | DÖNGÜLERİ |
| İlk denatürasyon | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Denatürasyon | 98 ° C | 10 s | Belirlenen |
| Tavlama | 63 ° C | 30 s | |
| Uzantısı | 72 ° C | 1 dk. | |
| Basılı tutun | 4 ° C | Sonsuzluk | 1 |
Tablo 7: Son PCR güçlendirme için adım 3.7 PCR Bisiklete binme programı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede sunulan değiştirilmiş ataç-seq protokolü en az mitokondrial DNA kirlenme ile tekrarlanabilir sonuçlar sağlar. Protokol başarıyla Kromatin mimari insan birincil PBMCs10, insan monosit, fare dendritik hücreler (yayınlanmamış) karakterize ve kültürlü melanoma hücre11hatları için kullanılmıştır. Biz bu geliştirilmiş lizis tahmin durumu diğer hücre türleri için de iş potansiyeline sahiptir. Ayrıca bu çekirdeklerin yalıtım iletişim kuralı tek çekirdek ataç-seq protokolleri, sıralama sonuçlarını iyileştirmek için mitokondrial DNA kirlenme en aza indirilmesi ile uyumlu olacak tahmin edilmektedir.
Bu değiştirilmiş protokol ek bir yararı hasta numuneleri kullanılabilirliğini bağlı olarak farklı zamanlarda gruplar halinde izole CD4 + T hücre PBMCs dondurmak için yeteneğidir. ATAÇ-seq sonra tüm örnekleri üzerinde aynı anda gerçekleştirilebilecek gibi potansiyel toplu etkisi önyargı transposase reaksiyon ve sıralamanın simge durumuna küçültülmüş10' dur. O buz gibi orta bu donma-çözülme protokolü ile elde yüksek canlılık sağlamak için her kullanım ile taze yapılması çok önemlidir. İzole CD4 + T hücre canlılığı %90 üzerinde non-spesifik sindirim transposase reaksiyon1önlemek için kalmalıdır.
Unutmayın ki o daha fazla en iyi duruma getirme değişken hücre tipleri ve miktarları ile bu iletişim kuralını kullanmak için gerekli. Tn5 transposase çekirdek oranı bu protokolündeki 500.000 çekirdeği için ataç-seq çekirdekleri farklı bir dizi ile gerçekleştirme Eğer optimize edilmiş beri Tn5 transposase miktarda buna göre ayarlanmalıdır. Çekirdeği Tn5 bir fazlalığı nedeniyle aşırı lizis için yüksek arka plan kapalı Kromatin neden olabilir ve sıralama kütüphanelerin, altında lizis tam bir PCR sağlamıyor olabilir iken düşük karmaşıklık Kütüphane1güçlendirilmiş. Bu Karışıklıkları önlemek için bu dikkatli çekirdeği sayım gerçekleştirmek ve gerekli Tn5 oranı en iyi duruma getirmek için tavsiye edilir. Daha fazla veri kalitesini artırmak için bu PCR güçlendirme döngüleri en iyi duruma getirmek için qPCR izleyerek tavsiye edilir. Son kütüphane çok fazla amplifikasyon döngüleri uğrar, önyargı sıralama veri2tanıttı olabilir. Bu zaman ve para tasarrufu için yeni nesil sıralama önce ataç-seq kütüphanelerin uygun kalite kontrolü yapmak tavsiye edilir.
Biz gösterildiği bir değiştirilmiş lizis arabellek mitokondrial DNA kirlilik azaltma anahtarı ve geniş bir hücre tipleri etkilidir. Diğer protokoller mitokondrial kirlenme alternatif lizis arabellekleri7,19 ile veya bir CRISPR-aracılı mitokondrial DNA tükenmesi20yoğun işlem tarafından sayısında ele sahip. Bizim alternatif ataç-seq Protokolü sıralama okuma bir geliştirilmiş lizis arabellek ile mitokondrial DNA kirlenme ve erişilebilir bir tekniği yapar ataç seq sadeliği korunması azaltmak için çaba katkıda bulunur. RNA-seq ve tek hücreli sıralama ile birlikte, ATAÇ-seq epigenetik yönetmelik keşfetmek için güçlü bir araçtır. Bu gelişmiş ataç-seq iletişim kuralı ve veri çözümleme paketi sıralama maliyeti azaltmak ve daha yüksek kalitede sonuçlar üretmek yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Atsede Siba teknik destek için teşekkür ederiz. C.S.C. NIH grant 1R61DA047032 tarafından desteklenir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS, Sterile | Gibco | 10010023 | Can use other comparable products. |
| 5810/5810 R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets | Eppendorf | 22625501 | Can use other comparable products. |
| 96 Well Round Bottom Plate | Thermo Scientific | 163320 | Can use other comparable products. |
| Agilent 4200 Tape Station System | Agilent | G2991AA | Suggested for quality assessment. |
| Cryotubes | Thermo Scientific | 374081 | Can use other comparable products. |
| DMSO | Sigma | D8418 | Can use other comparable products. |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Invitrogen Life Technologies | 11131D | Critical Component |
| Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit | Invitrogen Life Technologies | 11346D | Critical Component |
| Dynamagnet | Invitrogen Life Technologies | 12321D | Critical Component |
| FCS | Gemini Bio Products | 100-500 | Can use other comparable products. |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 50674626 | Suggested for quality assessment. |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade | Sigma | M2393 | Can use other comparable products. |
| MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer) | Qiagen | 28004 | Critical Component |
| Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0001 | Can use other comparable products. |
| NaCl, Molecular Biology Grade | Sigma | S3014 | Can use other comparable products. |
| NEBNext High Fidelity 2x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | Critical Component |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (2x TD Buffer, Tn5 Enzyme) | Illumina | FC1211030 | Critical Component |
| Nuclease Free Sterile dH20 | Gibco | 10977015 | Can use other comparable products. |
| Polysorbate 20 (Tween20) | Sigma | P9416 | Can use other comparable products. |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25780 | Critical Component |
| Precision Water Bath | Thermo Scientific | TSGP02 | Can use other comparable products. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | Critical Component |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen Life Technologies | Q32851 | Suggested for quality assessment. |
| Qubit FlouroMeter | Invitrogen Life Technologies | Q33226 | Suggested for quality assessment. |
| Rosette Sep Human CD4+ Density Medium | Stem Cell Technologies | 15705 | Critical Component |
| Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15022 | Critical Component |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | Can use other comparable products. |
| Sterile Resevoir | Thermo Scientific | 8096-11 | Can use other comparable products. |
| T100 Thermocycler with Heated Lid | BioRad | 1861096 | Can use other comparable products. |
| Tris-HCL | Sigma | T5941 | Can use other comparable products. |
References
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide. Current Protocols in Molecular Biology. 21, 1-29 (2015).
- Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2010).
- Pajoro, A., Muiño, J. M., Angenent, G. C., Kaufmann, K. Profiling Nucleosome Occupancy by MNase-seq: Experimental Protocol and Computational Analysis. Methods in Molecular Biology. 1675, 167-181 (2018).
- Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
- Rosenberg, A. B., et al. Single-cell profiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding. Science. 360 (6385), 176-182 (2018).
- Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
- Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes. Nucleic Acids Research. 45 (6), e41 (2017).
- Lara-Astiaso, D., et al. Chromatin state dynamics during blood formation. Science. 345 (6199), 943-949 (2014).
- Gate, R. E., et al. Genetic determinants of co-accessible chromatin regions in activated T cells across humans. Nature Genetics. , (2018).
- Sanjana, N. E., et al. High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome. Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).
- Andrews, S. FastQC A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. Babraham Bioinformatics. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc (2018).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Broad Institute. Picard Tools. , Available from: http://broadinstitute.github.io/picard/ (2018).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Stark, R., Brown, G. DiffBind: Differential Binding Analysis of ChIP-Seq Peak Data. , Available from: http://bioconductor.org/packages/devel/bioc/vignettes/DiffBind/inst/doc/DiffBind.pdf (2018).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Wu, J., et al. The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos. Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).
