Summary
Her præsenterer vi en protokol til at kombinere to prøve behandling teknikker, højtryks frysning og mikrobølgeovn-assisteret prøve behandling, efterfulgt af minimal harpiks indlejring for at opnå data med en fokuseret ion beam scanning elektron mikroskop (FIB-SEM). Dette er påvist ved hjælp af en mus tibial nerve prøve og Caenorhabditis elegans.
Abstract
Den beskrevne prøve forberedelse teknik er designet til at kombinere de bedste kvalitet hvor de bedst egnede kontrasten for imaging modalitet i fokuseret ion beam scanning elektron mikroskop (FIB-SEM), som bruges til at opnå stakke af sekventielle billeder til 3D rekonstruktion og modellering. Højtryks frysning (HPF) giver mulighed for tæt på native strukturel bevarelse, men den efterfølgende fryse substitution ofte giver ikke tilstrækkelig kontrast, især for en større model, der er nødvendig for høj kvalitet billeddannelse i SEM kræves for 3D genopbygning. Derfor, i denne protokol, efter substitution fryse yderligere kontrasterende trin udføres ved stuetemperatur. Selv om disse trin er udført i en mikroovn, er det også muligt at følge traditionel bænk behandling, som kræver længere inkuberingstider. Den efterfølgende integrering i minimale mængder af harpiks giver mulighed for hurtigere og mere præcis målretning og forberedelse inde FIB-SEM. Denne protokol er især nyttig for prøver, der kræver forberedelse af højtryks frysning for en pålidelig ultrastrukturelle bevarelse, men ikke få nok kontrast under fryse substitution for volumen imaging ved hjælp af FIB-SEM. I kombination med minimal harpiks indlejring, giver denne protokol en effektiv arbejdsgang for erhvervelse af høj kvalitet mængde data.
Introduction
Højtryks nedfrysning er metoden prøve forberedelse af valg for at opnå høj kvalitet ultrastrukturelle konservering, som repræsenterer den native tilstand af en meget bedre end konventionelle forberedelse metoder ved hjælp af kemisk fiksering1prøve. Denne cryo-forberedelse metode er nyttig for prøver som myelinerede mus væv2 og strenge krav til brug af model organisme Caenorhabditis elegans3. Efter fryse substitution og harpiks indlejring analyseres disse prøver normalt af transmissions elektronmikroskopi (TEM) eller electron tomografi (ET). Hvis større mængder skal være afbildet ved hjælp af FIB-SEM eller seriel blok-ansigt imaging for høj opløsning storstilede 3D rekonstruktioner, er vores erfaring, ordentlig billeddannelse af SEM hæmmes ofte af manglen på kontrast. I FIB-SEM, er billedet normalt optaget af påvisning af backscattered elektroner fra den primære elektronstråle. Udbyttet af backscattered elektroner er proportional med indhold af tungmetaller i prøven. Derfor var protokoller specielt designet til volumen imaging for at forbedre kontrasten af ekstra heavy metal imprægnering. Sådanne metoder er baseret på kemisk faste prøver og anvende en kombination af osmium dinitrogentetraoxid-thiocarbohydrazide-osmium dinitrogentetraoxid4, som beskrevet af Knott et al.5, for serielle blok-ansigt og fokuseret ion beam scanning Elektron Mikroskopi. Ændringer, herunder brugen af formamid og pyrogallol6 eller bly aspartat7 har været anvendt med succes til forskellige Billeddannende teknikker.
Protokollen i henhold her kombinerer cryo-forberedelse af prøver af HPF og fryse substitution med efterfølgende mikrobølgeovn-assisteret behandling for øget kontrast ved hjælp af thiocarbohydrazide/osmium dinitrogentetraoxid i acetone ved stuetemperatur. Vi demonstrere det på myelinerede nervus tibialis af mus og i Caenorhabditis elegans, som repræsenterer prøver, der kræver højtryks frysning for høj kvalitet ultrastrukturelle bevarelse. Desuden er det vist hvordan, efter dehydrering og infiltration, prøverne er integreret med som lille harpiks som muligt. Denne minimale harpiks indlejring8 giver mulighed for hurtigere målretning af strukturen af interesse og reducerer den tid brugt på prøve behandling, herunder mindre tidsforbrug for udsætter region af interesse med ion stråle. Efter at have udført yderligere prøve forberedelsestrin inde i mikroskopet, imaging og fræsning af prøven udføres kontinuerligt for at erhverve en stak billeder. For 3D-visualisering bruges billedbehandling software (IMOD) til at rekonstruere dele af datasættet.
Vores arbejdsproces beskriver, hvordan de bedst egnede kontrasterende prøver for volumen imaging kan kombineres med de bedste ultrastrukturelle bevarelse af HPF og fryse substitution. Dette er nyttigt for prøver, der strengt kræver cryo-forberedelse. Programmer er begrænset til små prøver, der kan forberedes ved HPF. I prøver af forskellige karakter, såsom plantemateriale eller mikroorganismer, kræver denne protokol tilpasning.
Protocol
Alle forsøg herunder prøver fra dyr, der er beskrevet her er godkendt af den institutionelle Animal Care og lavere Sachsen statskontoret for kunden beskyttelse og mad sikkerhed (LAVES).
1. højtryks frysning og fryse substitution
- Dissekere nervus tibialis fra en mus (f.eks. C57Bl6N, 12 uger, kvinde)9.
- Fordyb nervus tibialis i en dråbe af 20% polyvinylpyrrolidon (1 g af PVP i 5 mL) i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og udskårne stykker af 2 mm længde. Derefter placere den i en metal prøve carrier (Type A, 0,2 mm dybde) ved hjælp af fine pincet. Tilføje en anden flade carrier (Type B) belagt med et tyndt lag af hexadecane som et låg og indsætte denne forsamling i modellen patron.
- Overføre flere C. elegans suspenderet i en dråbe af 20% bovint serumalbumin (BSA) i M9 (Se Tabel af materialer) med en engangs plast pipette til metal Flyselskabet (Type A). Derefter tilsættes et andet luftfartsselskab som låg på toppen (Type B) og samle patronen.
- For begge prøver, gå videre med følgende: højtryks fryse prøve carrier forsamlinger én efter én ved at indlæse dem i tre stykker patronen på lastning stationen i højtryks fryseren. Tryk på knappen proces ifølge producentens instruktioner.
Bemærk: Begge typer prøver kan behandles sammen i den efterfølgende fryse substitution. - Placere prøverne i cryovials med 2 mL af frosne 0,1% garvesyre i acetone. Udføre overførslen i et bad af flydende nitrogen uden at spilde flydende kvælstof i hætteglassene. Overførsel af cryovials til en automatisk fryse substitution enhed10 sæt ved-90 ° C og starter programmet.
Bemærk: Prøverne er holdt ved-90 ° C til 100 h. garvesyre, før osmification er brugt som bejdsemidler til at øge optagelsen af osmium dinitrogentetraoxid11. - Manuelt vaske prøver 3 x i 30 min. med 2 mL af acetone ved-90 ° C i fryse substitution enhed.
- Forlade prøverne i 2 mL 2% osmium dinitrogentetraoxid, 0,1% uranyl acetat i acetone for fortsatte farvning i automatiske fryse substitution enhed for 7 h ved-90 ° C.
Forsigtig: Osmium dinitrogentetraoxid er giftigt og bør håndteres i et stinkskab, og værnemidler skal bæres.
Bemærk: Fryse substitution enhed automatisk hæver temperatur-20 ° c ved 5 ° C/h. Prøverne opbevares ved-20 ° C i 16 h i fryse substitution enhed. Temperaturen hæves automatisk til 4 ° C ved 10 ° C/h. - Udveksle osmium dinitrogentetraoxid løsning med ren acetone, når temperaturen er nået 4 ° C. Fjerne cryovials fra fryse substitution enhed.
2. mikroovn-assisteret behandling
Bemærk: Udføre alle de følgende trin ved stuetemperatur12 ved hjælp af en temperatur kontrolenhed til at holde temperaturen stabil (Se Tabel af materialer).
- Forlade caps reaktion rør åben under behandling i mikrobølgeovnen.
- Tag metal prøve bærere ud af cryovials og fjern prøverne fra metal transportøren ved hjælp af fine pincet eller en nål, samtidig med at de prøver, der er nedsænket i acetone i et urglas parabol (150 mm).
- Overføre prøverne til 2 mL reaktion rør ved hjælp af fine pincet eller en pipette og vask med 1 mL acetone fire gange for 40 s på 250 W.
Forsigtig: Thiocarbohydrazide er giftigt og bør håndteres i et stinkskab, beskyttende udstyr bør være slidt. - Pletten prøver med 1 mL af 1% thiocarbohydrazide i acetone for 14 min. ved 150 W at øge kontrasten. For at udføre farvning, afpipetteres thiocarbohydrazide løsning i reaktion tube, røret anbringes i mikroovnen og konfigurere programmet til at et strømniveau på 150 W (med vakuum-funktionen aktiveret) for 2 min på/2 min off, iteration for 14 min samlede. Starte mikrobølgeovnen.
Bemærk: Thiocarbohydrazide reagerer med den osmium dinitrogentetraoxid, der blev anvendt under fryse substitution. Det danner en bro, giver mulighed for flere osmium dinitrogentetraoxid skal deponeres på den oprindelige osmium dinitrogentetraoxid websteder13. - Vaske prøver 4 x med 1 mL acetone for 40 s på 250 W. Pipette acetone ind en reaktion røret, placere røret ind i mikrobølgeovnen, og vælg 250 W for 40 s. Start mikrobølgeovnen.
- Pletten i 1 mL 2% osmium dinitrogentetraoxid i acetone for 14 min. ved 150 W. Pipette osmium dinitrogentetraoxid løsning i en reaktion tube, placere røret ind i mikrobølgeovnen og konfigurere programmet til at et strømniveau på 150 W (med vakuum-funktionen aktiveret) for 2 min på/2 min off , iteration for 14 min samlede. Starte mikrobølgeovnen.
- Vaske prøver 4 x med 1 mL acetone for 40 s på 250 W (som gjort i trin 2.5).
- Infiltrere med 1 mL stigende koncentrationer af harpiks i acetone (Se Tabel af materialer) på 25%, 50%, 75%, 90%, 100% og 100% for 3 min. ved 250 W. Pipette harpiks i en reaktion tube, røret anbringes i mikroovnen, og placere plan til en magt nive l af 250 W (med vakuum-funktionen aktiveret) i 3 min. starte mikrobølgeovnen.
3. Minimal harpiks indlejring8
- Tage nervus tibialis og C. elegans ud af reaktion røret med en tandstikker og læg dem på et stykke plastic film (Se Tabel af materialer).
- Brug tandstikker at forsigtigt skubbe prøven på plastfolie, indtil ingen resterende harpiks er registreret. Bruge en halogenlampe til opvarmning (Se Tabel af materialer) så harpiks bliver mindre tyktflydende og kan fjernes nemt. Sted halogenlampen tæt nok til at opvarme harpiks (være omhyggelig med ikke at brænde hænderne).
- Polymerisere prøver i mindst 48 timer ved 60 ° C på toppen af plastfolie i ovnen.
4. forberedelse af FIB-SEM
- Skåret ud de polymeriserede prøver sammen med plastfolie med et barberblad på en størrelse som passer SEM stub og vedhæfte dem til SEM stubs ved hjælp af en ledende sølv harpiks (Se Tabel af materialer). Polymerisere igen ved 60 ° C i mindst 4 timer eller natten over.
- Sputter frakke prøver på SEM stub med guld i 1 min på 35 mA ved hjælp af en sputter coater (platinum/palladium kan også bruges, en 10 nm tykke belægning er tilstrækkelig) og placere dem inde FIB-SEM.
5. opsamling inde FIB-SEM
- Billede prøverne med sekundære elektron detektoren ved hjælp af grundlæggende software kørende mikroskop (Se Tabel af materialer). Prøven skal være orienteret således at region af interesse (f.eks., midterste del af nervus tibialis eller C. elegans) er i synsfeltet.
Bemærk: For at udføre dataopsamling, vippe scenen til en position så prøven ansigter ion stråle på en 90° vinkel på en passende arbejde afstand (5 mm) i det såkaldte tilfældigt punkt af ion og elektron strålen. Ved hjælp af vores instrument, opnås dette på et tidspunkt tilt 54° og 5 mm arbejde afstand. - For at indstille den korrekte position af prøven skal centrere et fælles træk ved 0° tilt mens imaging med sekundære elektron detektor. Langsomt recentering tilt til 54° (5°, 20°, 54°), det samme objekt ved at flytte M-aksen.
- Finde tilfældigt punktet ved at centrere en funktion mens imaging med sekundære elektron detektoren ved 54°, efterfulgt af flytter funktionen til den centrale position i tilstanden FIB. Udføre dette ved at vise sigtekornet i SEM software har en indikation af centrum. Derefter først flytte den valgte stikprøve funktion til midten af billedområdet ved hjælp af funktionen center punkt af SEM software. Derefter center funktion langs y-aksen ved at flytte fase i z. Nogen endelige forskydning mellem FIB og SEM er korrigeret med SEM beam Skift.
- Åbn den avancerede software (Se Tabel af materialer) til optagelse af 3D datasæt og følg guiden software trin for trin.
- På region af interesse, depositum carbon eller platin (400 nm) på toppen af Investeringsafkastet ved hjælp af en 3 nA nuværende at tillade selv fræsning og reducere artefakter induceret ved opladning.
Bemærk: Ved at trække det pågældende område at være sleben på modellen overfladen afbildet med FIB (bredde, højde, dybde), softwaren beregner og superimposes størrelser af forskellige sample forberedelse funktioner, såsom skyttegravene at være sleben eller område for Platinum/carbon deposition. Også være forsigtig af imaging prøveoverfladen med for høj FIB strømme, da dette kan beskadige prøveoverfladen. En strøm af 50 pA er tilstrækkelig for billeddannelse. - Bruge fokuseret ion stråle til mill en skyttegrav til at udsætte regionen af interesse (ROI) ved hjælp af en 15/30 nA aktuelle.
- Bruge fokuseret ion stråle for at polere tværsnit med en 7 nA aktuelle.
- Efter at have afsluttet prøveforberedelsen, angive de følgende imaging parametre: FIB fræsning parametre under fanen FIB setup (FIB fræsning aktuelle); SEM imaging parametre i fanen Opsætning og billedet tuning parametre under fanen SEM AutoTune (udføre autofokus og autostigmation hver 60 min, 50 nm pixelstørrelse, hviletid 3, line gennemsnitlige 3). Optimere dette for hver prøve.
- For at forhindre enhver termisk drift forårsager blok-ansigt til at glide under flugt, forlade plads til mindst 2 h før du starter erhvervelse.
- Erhverve datasæt i en kontinuerlig mill og erhverve tilstand med en 700 pA FIB aktuelle. Brug 1,5 kV (analytisk tilstand, 900 V) ESB detektor med et gitter spænding 400 V at erhverve billeder hver med 5 nm pixelstørrelse ved hjælp af avanceret software (Se Tabel af materialer) og 50 nm skive tykkelse. Et billede erhvervelse tager omkring 1,5 min med en hviletid på 6 µs.
- Start dataopsamling. En FIB billede på den aktuelle fræsning er erhvervet for at sikre, at prøven ikke bevæge sig, og den rigtige region af interesse er valgt. Juster om nødvendigt.
6. data visualisering
- Åbn billeder i Fiji ved at trække mappen der indeholder alle billederne i Fiji og vælg Virtual stak.
- Beskære region af interesse ved hjælp af rektangelværktøjet (billede > Beskær).
- Invertere data for at vise den traditionelle transmissions Elektron Mikroskopi kontrast med membraner viser oppe i mørke (Edit > inverter).
- Bruge TrackEM214 (Fiji15) til justering. Indlæse data i TrackEM2 (fil > Ny > TrackEM2) ved at klikke på lag. Efter alle billeder er indlæst, justere dem ved hjælp af flerlags mosaik funktion (Højreklik på billede > Juster > Juster multi-lag mosaik). Efter justering, eksporteres billederne som enkelte tiff-filer (Højreklik på billede > Eksporter > Make flad billede). Vælg alle billeder, der skal eksporteres, og vælg Gem til fil.
- For efterbehandling, bruge en Gaussisk sløring (processen > filtre > Gaussian blur; sigma 2) og lokale kontrastforbedring (processen > øger lokale kontrast; CLAHE: blocksize 127, histogram placeringer 256, maksimal hældning 1,5), som anvendes i Fiji at udglatte billedet og få et bedre signal / støj-forhold.
- IMOD16 bruges til at udføre en manuel segmentering og visualisere strukturen af interesse i 3D. Åbn datasættet i IMOD og vælg Tegnefunktioner (særlige > Tegnefunktioner) til at udføre manuel segmenteringen. Forskellige manuelle værktøjer kan bruges til at følge strukturen af interesse i hele volumen (for eksempel slutte, Sculpt). Bruge mikroskopi billede Browser (MIB17) til semi-automatiske segmentering.
Representative Results
Arbejdsprocessen starter med en prøve (her, en frisk dissekeret mus nervus tibialis) anbringes i metal luftfartsselskaber til højtryks nedfrysning (figur 1a). Luftfartsselskaberne er inddrives fra flydende kvælstof (figur 1b) og placeret i en fryse substitution enhed på toppen af den frosne første kemiske cocktail (figur 1 c). Efter en lang fryse substitution protokol herunder 2% osmium dinitrogentetraoxid og 0,1% uranyl acetat, fjernes prøverne fra luftfartsselskaber ved stuetemperatur (fig. 1 d). For yderligere at forbedre kontrasten, er prøverne overført til plasticrør skal behandles i mikroovn (figur 1e). Vakuumkammer og temperatur kontrolenhed bruges til at optimere processen (figur 1f).
For at kunne udføre minimal harpiks indlejring, tandstikkere og plader af plastfolie er nødvendige (figur 2a). Efter infiltrerer prøverne med harpiks ved hjælp af mikrobølgeovnen, er de placeret på stykker af plastfolie og flyttet rundt, indtil nogen harpiks er tilbage på prøveoverfladen. En halogenlampe bruges til at dræne den resterende harpiks og forlader prøven minimalt indlejret (figur 2b) på plastfolie. Det skal bemærkes, at mere harpiks fjernes fra toppen af prøven er god. Der bør stadig være en lille mængde forlod nedenunder prøven at holde det fastgjort til underlaget. Prøven bliver polymeriserede på plastfolie er skåret og monteret på toppen af SEM stub med sølv ledende harpiks (figur 2 c). Stubben er polymeriserede i mindst 4 timer ved 60 ° C (figur 2d). Komponenterne skal blandes grundigt eller blandingen kan ikke polymerisere korrekt. For at undgå opladning inde scanning elektron mikroskop, er Stubben sputter belagt med gold eller platinum/palladium (figur 2e).
Prøverne er placeret i FIB-SEM og afbildet med en sekundær elektron detektor til at målrette regionen af interesse (figur 3ae). En ion stråle bruges til at fjerne materiale direkte foran region af interesse at eksponere et tværsnit (figur 3b-d, 3f-h). Standardprotokoller lider ofte af en mangel på membran kontrast (figur 3bf), mens den forbedrede protokol giver en stærk membran kontrast (figur 3 c-d, 3 g-h).
EM data (efter post-processing) er visualiseret ved hjælp af IMOD, et image processing og modellering program. For at opnå en bedre forståelse af 3D-oplysninger, virtuelle reslicing af data bruges (figur 4a). Forskellige strukturer i datasættet er segmenteret manuelt (figur 4b-d).
Figur 1: højtryks-frysning, fryse-substitution og mikrobølgeovn-assisteret forædling. a prøve carrier indeholdende mus nervus tibialis, skala bar 3 mm. (b) prøve carrier indeholdende mus nervus tibialis efter højtryks indefrysning, skala bar 3 mm. c automatisk fryse substitution (AFS) enhed med prøver. Indsatser: skræddersyede metal beholder for op til 23 prøve hætteglas og to store hætteglas indeholdende kemikalier i AFS. (d) prøver at blive fjernet fra hangarskibe i en glasskål i acetone, skalere bar 3 mm. (e) prøver i reaktion rør skal sættes i mikrobølgeovnen til forarbejdning. (f) vakuum kammer og temperatur kontrol enhed af mikrobølgeovnen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Minimal harpiks indlejring og forberedelse af FIB-SEM. a en plastfolie og tandstikkere, der bruges til den minimale harpiks indlejring, skala bar 4 cm. (b) Nervus tibialis drænet af harpiks på toppen af plastfolie, skala bar 250 µm. c Nervus tibialis polymeriserede på plastfolie, så skåret og monteret på toppen af SEM Stubben med sølv ledende harpiks, skala bar 250 µm. (d) prøver polymeriserede oven på SEM stub, skala bar 3 mm. (e) prøver belagt med guld på SEM stub, skala bar 3 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: forberedelse af prøven inde FIB-SEM. (en og e) Sekundære elektron billede inde FIB-SEM prøvens overflade (en) Nervus tibialis, skala bar 100 µm. (e) C. elegans, skala bar 2 µm. (b-d) og (f-h) tværsnit gennem prøven ved hjælp af ESB detektor for billeddannelse. (b og c) Nervus tibialis, skalere bar 2 µm. (f og g) C. elegans, skala bar 1 µm og 200 nm. (b og f) Vist er resultaterne af højtryks frysning og fryse substitution uden ekstraudstyr, mens alle andre billeder viser resultaterne af forbedrede fryse substitution. (d og h) Detaljeret billede af prøven ved anvendelse af ESB detektor. (d) Nervus tibialis, skala bar 200 nm. (h) C. elegans, skala bar 200 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Image erhvervelse og visualisering. a EM data vist i IMOD med næsten resliced x / z- og z-y-fly, skala bar 2 µm. (b) segmenterede axoner på EM-data (blå), Remak bundter (rød), myelin skafter (gul og orange) og mitokondrier (turkis), skala bar 2 µm. (c og d) 3D model, scale bar 2 µm og 500 nm . Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Protokollen blev udviklet for at illustrere den optimal bevarelse og kontrast til at udføre seriel blok-ansigt imaging med en FIB-SEM. Derfor valgte vi at anvende cryo-immobilisering efterfulgt af post farvning bruge fryse substitution og mikrobølgeovn-assisteret behandling. Denne protokol er derfor begrænset til prøver, der er lille nok til højtryks nedfrysning. Størrelsesbegrænsninger på 3 til 6 mm i bredde og tykkelse af ~ 200 µm er etableret af størrelsen af stikprøven transportøren, som svarer til prøvestørrelse, der kan fryses korrekt med denne teknik. Dette er relevant for musen nerve prøve, da iskiasnerven er for stor i diameter til at passe ind i de 0,2 mm luftfartsselskaber, der er nødvendige for at sikre korrekt frysning. Derfor anbefales omhyggelig dissektion af en mindre nerve som den tibial nerve eller andre tynde nerve som den femorale nerve. Da myelinskeden er følsomme over for stretching, skal stor omhu tages under dissektion af den friske og rentabel nerve at undgå håndtering artefakter. Generelt bør kun levedygtige prøver anvendes til elektron mikroskopiske undersøgelser.
Mikrobølgeovn-assisteret forarbejdning og minimal harpiks indlejring er designet til fremskyndelse af forberedelsen og målrettet proces. Mikrobølgeovn-assisteret behandling anvender en modificeret OTO protokol4 bruges til stuetemperatur kemisk fiksering. En husstand mikrobølgeovn vil ikke give de samme resultater, da der er nogen homogen fordeling af mikrobølger, dens temperatur kontrolleres ikke, og der er ingen vakuum, der kan anvendes. De mindre en prøve, bedre penetration af kemikalier; Derfor, de bedste resultater er opnået ved mindre prøver. For at undgå beskadigelse af prøven ved overophedning, er temperaturkontrol og anvendelse af minimalt kræves mikrobølgeovn magt kritisk. Mikrobølgeovn-assisteret behandlingstrin kan udføres på bænken, hvis der er ingen mikroovn tilgængelige, som vil føre til længere sagsbehandlingstider. Direkte mål strukturer i SEM er det vigtigt at fjerne så meget harpiks som muligt fra toppen af prøven. Efter optagelse af et datasæt, er efterbehandling af de rå data nødvendige for at reducere filstørrelsen og forbedre signal-støj-forhold. Moderne volumen Billeddannende teknikker producere store mængder data. Derfor, for at udføre databehandling i en hurtig og fyldestgørende måde, tilstrækkelig RAM på arbejdsstationen er nødvendig. For justering operationer kræves mindst to gange så meget RAM som datasæt størrelse.
Denne protokol er blevet testet på nervus tibialis musen så godt som i C. elegans. Hall et al. 12 anvendes en lignende ekstraudstyr skridt efter deres fryse substitution på bænken til forberedelse af C. elegans. For enhver anden model organisme som zebrafisk er justeringer af protokollen sandsynligvis nødvendigt. En mulig ændring er at ændre sammensætningen af fryse substitution cocktail, som ved tilsætning af vand, der bruges til kontrast enhancement18. Derudover varigheden af fryse substitution har tilpasses til prøven og kan forkortes betydeligt efter hurtig fryse substitution protokol19. En mulighed er anvendelsen af agitation for fremskyndelse fryse substitution proces20. Efter fryse substitution, yderligere er ændringer mulige, såsom gentagen anvendelse af kemikalier og osmium dinitrogentetraoxid21. I løbet af mikrobølgeovn behandling, kan temperatur, inkuberingstider og strømstyringsindstillinger varieres for at optimere resultaterne for de respektive prøve.
Denne protokol viser, at sådanne ekstraudstyr kan kombineres med andre fryse substitution protokoller og forskellige typer af prøver som beskrevet af Hal12 , der er afbildet i en FIB-SEM eller af serielle blok-ansigt scanning Elektron Mikroskopi. Disse billeddannelse teknikker kræver øget kontrast, som er mindre vigtigt for transmissions Elektron Mikroskopi.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
FIB-SEM og A.S. (placeringen af operatoren FIB-SEM) er finansieret af Cluster of Excellence og Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Research Center nanoskala mikroskopi og molekylær fysiologi af hjernen (CNMPB). Vi takker lab af Thomas Müller-Reichert for at levere C. elegans prøver. Vi takke Ulrich Weikert for at deltage i filmen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrumentation | |||
| Leica HPM100 | Leica | ||
| Automatic Freeze Substitution | Leica | ||
| Laboratory microwave with temperature control unit | Ted Pella | ||
| EM ACE600 with gold target | Leica | ||
| Crossbeam 540 | Zeiss | ||
| Halogen lamp 12 V/ 20 W | Osram | ||
| Oven | VWR | ||
| Freezing | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| M9 | Homemade | According to C. Elegans- A practical approach I.A.Hope | |
| Hexadecene | Sigma-Aldrich | 52276 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P2307 | |
| A type carrier | Wohlwend GmbH | #241 | |
| B type carrier | Wohlwend GmbH | #242 | |
| Slit carrier | Wohlwend GmbH | #446 | |
| Plastic Pasteur pipettes | VWR | 612-1684 | |
| Forceps | FST | 11200-10 | |
| Freeze substitution | |||
| Acetone | science services | 10015 | |
| Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
| Osmium tetroxide | EMS | 19100 | |
| Uranyl acetate | SPI-Chem | 02624-AB | |
| Acetone | EMS | 10015 | |
| Thiocarbohydrazide | Sigma-Aldrich | 223220 | |
| Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7884-450EA | |
| Watch glass dishes, 150 mm | VWR | 216-2189H | |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.094 | |
| Durcupan resin | Sigma-Aldrich | 44610 | |
| Mounting | |||
| SEM stubs | Science Services | E75200 | |
| Aclar | Science Services | 50425-10 | |
| Toothpicks | |||
| filter paper | VWR | 512-3618 | |
| conductive silver resin | EMS | 12670-EE | EPO-TEK EE 129-4 |
| Software | |||
| Image acquisition | Zeiss | SmartSEM | |
| Image acquisition | Zeiss | Atlas5 A3D | |
| Image processing | Open source | Fiji | http://fiji.sc/#download |
| Image visualization | Open source | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/imod/ |
References
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).
- Möbius, W., Nave, K. -A., Werner, H. B. Electron microscopy of myelin: Structure preservation by high-pressure freezing. Brain Research. 1641, 92-100 (2016).
- Mancuso, J., Lich, B., McDonald, K. Three-Dimensional Reconstruction Methods for Caenorhabditis elegans Ultrastructure. Methods in Cell Biology. 96, 331-361 (2010).
- Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , Available from: https://www.ncmir.ucsd.edu/sbem-protocol (2010).
- Knott, G., Rosset, S., Cantoni, M. Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue. Journal of Visualized Experiments. (53), e2588 (2011).
- Eberle, A. L., et al. High-resolution, high-throughput imaging with a multibeam scanning electron microscope. Journal of Microscopy. 259 (2), 114-120 (2015).
- Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics. Nature Communications. 6, 1-7 (2015).
- Schieber, N. L., et al. Minimal resin embedding of multicellular specimens for targeted FIB-SEM imaging. Methods in Cell Biology. 140, (2017).
- Batt, J. A. E., Bain, J. R. Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. Journal of Visualized Experiments. (81), e50657 (2013).
- Möbius, W., et al. Electron Microscopy of the Mouse Central Nervous System. Methods in Cell Biology. 96, 475-512 (2010).
- Hayat, M. A. Stains and Cytochemical Methods. , Plenum Press. New York and London. (1993).
- Hall, T. J., Hartweig, E., Nguyen, K. C. Q. OTO Fixation for SEM and Blockface Imaging. , Available from: http://www.wormatlas.org/EMmethods/OTOFix.htm (2018).
- Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
- Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLoS Biology. 14 (1), 1-13 (2016).
- Walther, P., Ziegler, A. Freeze substitution of high-pressure frozen samples: The visibility of biological membranes is improved when the substitution medium contains water. Journal of Microscopy. 208 (1), 3-10 (2002).
- Mcdonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of Microscopy. 243 (3), 227-233 (2011).
- Reipert, S., et al. Agitation Modules: Flexible Means to Accelerate Automated Freeze Substitution. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. , (2018).
- Lešer, V., Drobne, D., Pipan, Ž, Milani, M., Tatti, F. Comparison of different preparation methods of biological samples for FIB milling and SEM investigation. Journal of Microscopy. 233 (2), 309-319 (2009).
