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Hemmung der Aspergillus Flavus Wachstum und Aflatoxin in transgenen Mais mit dem Ausdruck der α-Amylase-Inhibitor von Lablab Purpureus L.

Published: February 15, 2019 doi: 10.3791/59169
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1
1Southern Regional Research Center, USDA-ARS, Food and Feed Safety Research Unit, 2Department of Plant Pathology, University of Arkansas

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll um Aspergillus Flavus Wachstum und Aflatoxin in Maiskörner mit dem Ausdruck einer antimykotischen Proteins zu analysieren.  Mit GFP exprimierenden A. Flavus Belastung überwacht wir die Infektion und die Ausbreitung des Pilzes in Reife Kerne in Echtzeit. Der Test ist schnell, zuverlässig und reproduzierbar.

Abstract

Aflatoxinkontamination in Nahrungs-und Futtermitteln ist eine große Herausforderung weltweit. Aflatoxine, produziert durch den Pilz Aspergillus Flavus (A. Flavus) sind potente Karzinogene, die Ernte Wert in Mais und andere Öl reiche Ernten wie Erdnuss neben posieren ernsthafte Bedrohung für die menschliche und tierische Gesundheit erheblich reduzieren. Unterschiedliche Ansätze, einschließlich der klassischen Züchtung, transgene Ausdruck von Widerstand verbunden sind Proteine und RNA-Interferenz (RNAi)-basierten Host-induzierte Gen-silencing von kritischen A. Flavus gen Ziele werden ausgewertet, um zu erhöhen Aflatoxin Widerstand in anfälligen Pflanzen. Frühere Studien haben gezeigt, dass eine wichtige Rolle in der Pathogenese und Aflatoxin Produktion A. Flavus , schlägt dieses Gen/Enzym α-Amylase ist ein potenzielles Ziel, A. Flavus Wachstum und Aflatoxin-Produktion zu reduzieren. In diesem Zusammenhang wurde die aktuelle Studie durchgeführt, um heterologen Expression (unter Kontrolle der konstitutiven CaMV 35 s -Promoter) eines Lablab Purpureus L. α-Amylase-Inhibitor-ähnlichen Proteins (AILP) im Mais gegen A. Flavusbewerten. AILP ist ein 36-kDa-Protein, das ist ein kompetitiver Inhibitor des Enzyms A. Flavus α-Amylase und gehört zur Familie der Lektine – Arcelin – α-Amylase-Inhibitor Protein gemeinsam Bohne. In-vitro-Studien vor der aktuellen Arbeit hatte die Rolle des AILP bei der Hemmung von A. Flavus α-Amylase-Aktivität und Pilzwachstum gezeigt. Pilzwachstum und Aflatoxin-Produktion in Reife Kerne wurden mit GFP exprimierenden A. Flavus Belastung in Echtzeit überwacht. Dieser Kernel screening Assay (KSA) ist sehr einfach einzurichten und bietet zuverlässige und reproduzierbare Daten auf Infektion und das Ausmaß der Ausbreitung, die quantifiziert werden konnte zur Beurteilung von Genetik und transgenen Linien. Die Fluoreszenz von den Strapazen der GFP ist eng korreliert, pilzartige Wachstum und durch Verlängerung, es ist gut für Aflatoxin-Werte korrelierten.  Das Ziel der aktuellen Arbeit war, dieses Vorwissen in ein kommerziell wichtigen Getreide wie Mais, Aflatoxin Widerstand erhöhen zu implementieren. Unsere Ergebnisse zeigen eine Ermäßigung von 35 % – 72 % A. Flavus Anstieg AILP exprimierenden transgener Maiskörner, die wiederum in einer 62 bis 88 % Verringerung Aflatoxin übersetzt.

Introduction

Mykotoxinbelastungen durch die Pilz-Gattungen, Aspergillus, Fusarium, Penicilliumund Alternaria ist ein großes Problem der Lebensmittel und Futtermittel angebauten weltweit1,2,3. Unter diesen phytopathogenen Pilzen hat Aspergillus die höchsten negative Auswirkungen auf die Ernte Wert und die Gesundheit von Mensch und Tier. Aspergillus flavus (A. Flavus) ist eine opportunistische Pflanze-Erreger, die infiziert Öl reichen Ernten wie Mais, Baumwollsaat und Erdnuss und produziert die potente Karzinogene, Aflatoxine, sowie zahlreiche giftige sekundäre Pflanzenstoffe (SMs). Mais ist ein wichtiges Nahrungsmittel und Futtermittel weltweit angebaut und ist sehr anfällig für Verunreinigungen durch A. Flavus. Die wirtschaftliche Auswirkungen einer Aflatoxinkontamination auf verliert und Minderwert bei Mais kann so viel wie $ 686,6 Millionen/Jahr in den USA2 mit prognostizierten Veränderungen des globalen Klimas, die Auswirkungen von Aflatoxinen kann dazu führen, dass größere wirtschaftliche Verluste in Mais mit Schätzungen so hoch wie $ 1,68 Milliarden/Jahr in die nahe Zukunft2. Angesichts der wirtschaftlichen und gesundheitlichen Beeinträchtigungen von Aflatoxinen in Mensch und Tier, möglicherweise vor der Ernte Aflatoxin Kontrolle im Mais der effizienteste Weg zur Verhinderung von Aflatoxinkontamination in Lebensmitteln und Futtermitteln.

Die großen vor der Ernte Kontrollansatz für Aflatoxin Widerstand in Mais, der in den letzten Jahrzehnten eingesetzt hat ist in erster Linie durch Züchtung, die eine erhebliche Menge an Zeit4erfordert. Vor kurzem hatte Biocontrol einige Erfolge bei der Reduzierung der Aflatoxin in groß angelegte Feld Anwendungen5,6. Neben Biocontrol hatte Anwendung modernster molekularer Tools wie z. B. "Host induzierte Gen-Silencing" (HIGS) durch RNAi und transgene Ausdruck des Widerstands-assoziierte Proteine einige Erfolge bei der Reduzierung von A. Flavus Wachstum und aflatoxin Produktion in kleinem Maßstab Labor- und Studien. Diese Ansätze werden derzeit neben der Identifizierung von neuen potenziellen A. Flavus gen Zielen für zukünftige Manipulation optimiert.

Neben Gene, die Mykotoxinproduktion als potentielle Ziele von transgenen Kontrollstrategien direkt beteiligt sind, haben Pilze Amylasen gezeigt worden, um eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Pathogenese und Mykotoxin-Erfolgsproduktion in frühen Phasen der Host-Pflanze-Infektion. Ein paar Beispiele Pythium Pleroticum (kausaler Agent Ingwer Rhizom Fäulnis), Fusarium Solani (kausaler Agent der Blumenkohl willst), wo positive Korrelationen zwischen Pathogenität und α-Amylase Expression und Aktivität beobachtet 7,8. Hemmung der α-Amylase-Aktivität durch gen-Knockout oder Knockdown Ansätze wirkt sich negativ auf Pilz Wachstum und Toxin-Produktion. Ein α-Amylase-Ko-Mutante von A. Flavus konnte Aflatoxine wenn auf Stärke Substrat oder entkeimten Maiskörner9gewachsen zu produzieren. In Fusarium Verticillioides , keine α-Amylase Ko-Belastung während der Infektion von Maiskörnern10Fumonisin B1 (Mykotoxine) produzieren. In einer neueren Studie Gilbert Et Al. (2018) gezeigt, dass ein RNAi-basierten Knock down- A. Flavus α-Amylase Ausdrucksformen durch HIGS A. Flavus Wachstum und Aflatoxin Produktion während Maiskorn Infektion11 deutlich reduziert .

Spezifische Inhibitoren der α-Amylase-Aktivität haben auch ähnliche Ergebnisse produziert, wie Down-Regulierung der α-Amylase Ausdruck entnommen. Der erste Bericht über die Rolle der ein α-Amylase-Inhibitor in Pilzresistenz kamen aus der Isolierung und Charakterisierung von einer 14-kDa-Trypsin-α-Amylase-Inhibitor von Maislinien resistent gegen A. Flavus12. Weitere screening von mehreren hundert Pflanzenarten Fakhoury und Woloshuk führten zur Identifizierung eines 36-kDa α-Amylase-Inhibitor-ähnlichen Proteins (AILP) aus den Samen der Hyazinthe Bohnen, Lablab Purpureus L.13. Der Peptidsequenz AILP glich Lektine aus der Familie der Lektine – Arcelin – α-Amylase-Inhibitor berichtet gemeinsam Bohne14,15. Gereinigten AILP wird keine hemmende Aktivität gegenüber Säugetieren Trypsin und weitere in-vitro Charakterisierung zeigte deutliche Hemmung der A. Flavus Wachstum und conidial Keimung13aufweisen. Die Berichte hier eindeutig zeigt α-Amylase kann dienen als Target in der Steuerung Ansätze beschränken, Krankheitserreger oder Schädlinge, die abhängig von Stärke Mobilisierung (durch α-Amylase-Aktivität) und Erwerb der lösliche Zucker als Energiequelle während ihrer Pathogene Interaktion mit Wirtspflanzen.

Alpha-Amylase ist bekannt, dass kritische A. Flavus Pathogenität9,10,11, und angesichts der Bedeutung der AILP als ein potenter Anti-A. Flavus Agent (α-Amylase Hemmung/Antigrowth)13, Wir generierten transgene Maispflanzen mit dem Ausdruck Lablab AILP gen unter der konstitutiven CaMV-35 s-Promoter. Ziel war es zu untersuchen, ob heterologen Expression von dieser α-Amylase-Inhibitor in Mais gegen A. Flavus Pathogenese und Aflatoxin Produktion während Maiskorn Infektion wirksam ist. Unsere Ergebnisse zeigen, dass transgene Maiskörner mit dem Ausdruck AILP deutlich A. Flavus Wachstum und Aflatoxin Produktion während der Kernel-Infektion reduziert.

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Protocol

(1) Plasmid Konstrukte und Mais transformation

  1. PCR verstärkt Lablab AILP mithilfe der Primer 5'-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 'und 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3"einfügen. Die PCR-Bedingungen umfassen einen anfängliche Denaturierung Schritt bei 98 ° C für 30 s (Schritt 1), gefolgt von Denaturierung bei 98 ° C für 10 s (Schritt 2), Glühen bei 55 ° C für 30 s (Schritt 3), Dehnung bei 72 ° C für 20 s (Schritt 4), 31 Zyklen von Schritt 2 zu Schritt 4 , und eine endgültige Dehnung Schritt bei 72 ° C für 5 min. Klon das PCR-Produkt in einer modifizierten pCAMBIA 1.300 Vektor mit Xbaich und Pstich Restriktionsschnittstellen. Reihenfolge der letzten Pflanze Ziel Vektor, die Ausrichtung und die Sequenz des Gens geklonte AILP im Vektor zu bestätigen.
  2. Agrobakterium Stamm EHA101 mit dem letzten Vektor-Konstrukt (Abbildung 1) als früher beschriebenen 16zu verwandeln.
  3. Nutzung umgewandelt Agrobacterium , enthält die letzte Pflanze Ziel Vektor, unreifen Mais (Zea Mays L. Hi-II) Embryonen (die Pflanze Transformation Anlage der Iowa State University durchgeführt) zu verwandeln 16.
  4. T0 Pflanzen im Gewächshaus (26-29 ° C; 16/8 h Photoperiode ergänzt mit Hochdruck Na-Lampen) und wiederholt werden um T-6 -Generation um Homozygotie für transgene Merkmal zu erreichen zu erhalten.

2. Spore Keimung assay

  1. Blattproben zu ernten und Lagern bei-80 ° C. Blattproben mit einem Mörser und Stößel mit flüssigem Stickstoff zu mahlen. In 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen 0,5 g wiegen Sie ab, fügen Sie 17 µL Protease-Inhibitor hinzu und legen Sie Rohre auf Eis.
  2. Zentrifugieren Sie Rohre für 10 min bei 16.000 X g. 225 µL Pflanzenextrakt zu 0,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und auf Eis.
  3. Bereiten Sie in einem 15 mL Zentrifugenröhrchen eine 5 mL-Spore-Aussetzung der Aspergillus Flavus 70 – GFP in 1 %-Kartoffel-Dextrose-Bouillon (w/V). Wirbel und Spore Konzentration 105 Sporen/ml mit einem Zählkammern anpassen.
    Achtung: A. Flavus produziert Aflatoxine, alle Arbeiten mit dieser Pilz in einem biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt werden.
  4. Brüten Sie in PDB bei 28 ° C bis Kultur 50 % Initiation der Spore Keimung erreicht durch Vorwölbung der Sporen.
  5. Wirbel und aliquoten 25 µL Spore-Lösung für die 225 µL Pflanze zu extrahieren. 20 Stunden bei 28 ° C mit intermittierenden schütteln inkubieren Sie Proben.
  6. Aliquoten 25 µL Spore-Lösung auf einem Objektträger und Messen Sie die Länge der Keim Röhren Sporen mit der Digitalkamera-Software. Verwenden Sie ein Minimum von 20 wiederholte Messungen für jede Zeile.
    Hinweis: In dieser Phase legen Sie alle Kulturen bei 4 ° C Kolonie Wachstumsstop bis bereit zu zählen.

3. Kernel Screening Assay (KSA)

  1. KSA-Kappen durch Kleben 4 Snap Caps (22 mm) in einer Petrischale 60 x 15 mm zu konstruieren. Lassen Sie Kleber für 48 Stunden trocknen, bevor Sie Kappen verwenden. Jede KSA-Kappe bildet ein Rep (Abbildung 2).
  2. Sprühen Sie in einem sterilen biologischen Sicherheitsschrank eine quadratischen Bioassay-Fach (24 x 24 cm) mit 70 % Ethanol: H2O (V/V) und lassen Sie an der Luft trocknen. Das Fach sterile Chromatographiepapier hinzufügen. Sprühen Sie 9 KSA-Kappen mit 70 % Ethanol, lassen Sie Luft trocknen, und legen Sie in die Bioassay-Fach.
  3. Für jeden getesteten transgenen Maislinie 20 unbeschädigt Kerne auswählen und platzieren in einem 50 mL Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie 70 % Ethanol und 4 Minuten ruhen lassen. Schütteln Sie Röhren während der Sterilisation. Gießen Sie das Ethanol und spülen Kerne dreimal in sterilen entionisiertem H2O.
  4. Bereiten Sie eine Spore-Aussetzung der Aspergillus Flavus 70 – GFP17 aus einer 6 Tage alten Kultur auf V8-Medium (5 % V8 Saft, 2 % Agar, pH 5,2) angebaut.
    1. Fügen Sie 20 mL steriles 0,02 % Triton X-100/entionisiertem H2O (V/V) und Schrott aus Sporen mit einer sterilen Schleife. Aus dem Inokulum und in eine sterile 300 mL-Becherglas pipettieren.
    2. Vorbereiten eine 5-fold Verdünnung mit 0,02 % Triton x-100, führen Sie dann eine Spore-Zählung mit einem Zählkammern. Verdünnen Sie wieder, wenn notwendig, 100 mL mit einer Konzentration von 4 x 106 Sporen/mL zu erhalten.
  5. Kerne in einer sterilen 300 mL-Becherglas mit Stir Bar zu platzieren. Das Becherglas Inokulum hinzufügen.
    Achtung: Inokulum Kerne hinzufügen bewirkt Lösung zu spritzen. Becherglas auf einer Platte unter Rühren 3 Minuten lang. Nach 3 Minuten Inokulum in eine leere Becherglas abgießen.
  6. Mit einer Pinzette, legen Sie Kerne in die Bioassay-Teller (1 Kernel/GAP). Fügen Sie 30 mL entionisiertem Wasser am unteren Rand jeder Bioassay-Tablett und 7 Tage bei 31 ° C im Dunkeln inkubieren.
  7. Bereiten Sie Kerne für die Fotografie.
    1. 4 Kerne aus jeder Zeile für mikroskopische Analyse und Fotografie beiseite.
      Hinweis: Kerne können bei 4 ° C nicht länger als 5 Tage vor dem Abschluss Fotografie gespeichert werden.
    2. Fotografieren Sie Kerne nach sieben Tagen nach der Impfung mit A. Flavus (Abbildung 3).
    3. Saubere äußere der Kerne mit einem weichen Tuch und deionisiertes Wasser. Führen Sie Längsprofile der Kerne und sofort Fotografieren unter dem Fluoreszenz-Mikroskop.
  8. Kerne für die Analyse vorbereiten.
    1. Saubere Fassade der verbleibenden Kerne mit einem weichen Tuch und deionisiertes Wasser.
    2. Platz 4 Kerne, bilden 1 Rep, in einem 15 mL Schraubverschluss Polycarbonat Fläschchen mit 2 Kugeln aus rostfreiem Stahl. Sofort frieren Sie Fläschchen in flüssigem Stickstoff und Store bei-80 ° C bis zu Weiterverarbeitung und Analyse ein.
    3. -80 ° C Gefrierschrank entnehmen Sie Fläschchen und Mahlen Sie der Kerne in einem Homogenisator bei 1.500 u/min für 3 Minuten.
      Hinweis: Bewahren Sie Kerne mit flüssigem Stickstoff eingefroren.

(4) PCR-Screening von transgener Maiskörner

  1. Verwenden Sie DNA-Isolierung-Kit genomischen DNA (gDNA) isolieren aus pulverisierte Maiskörner infiziert mit A. Flavus gemäß den Anweisungen des Herstellers. 10-15 mg pulverisierte Maiskörner kurz, 280 µL Puffer F, 20 µL Protease und 3 µL Dithiothreitol (DTT) hinzufügen. Brüten und schütteln in einem Thermomixer (56 ° C, 1.200 u/min, 30 min). 10.000 x g für 1 min Zentrifugieren und den klare Überstand auf äquilibriert Spalte übertragen. Inkubation bei Raumtemperatur für 3 min und Zentrifuge bei 700 X g für 1 min zum gDNA eluieren.
  2. 0,8 µL der extrahierten gDNA zum Einrichten einer 20 µL-PCR-Reaktion für jede Probe mit einem PCR-Kit zu nehmen. Folgen Sie Thermocyclings Bedingungen, wie im Protokoll des Herstellers empfohlen. Die PCR-Bedingungen umfassen einen anfängliche Denaturierung Schritt bei 98 ° C für 5 min (Schritt 1) gefolgt von Denaturierung bei 98 ° C für 5 s (Schritt 2), Glühen bei 55 ° C für 5 s (Schritt 3), Dehnung bei 72 ° C für 20 s (Schritt 4), 40 Zyklen von Schritt 2 zu Schritt 4 , und eine endgültige Dehnung Schritt bei 72 ° C für 1 min (Schritt 5).
  3. Verwenden Sie vorwärts Primer 5'-TATACCACCCCCATCCGTGT-3' und reverse-Primer 5'-AGCTCGGAAGCAAAAGACCA-3 "bestätigen das Vorhandensein von Lablab AILP gen in transgener Maiskörner.

(5) RNA-Isolierung, cDNA Synthese und semi-quantitativen RT-PCR

  1. Nehmen Sie homogenisiert A. Flavus infiziert Maiskörner zuvor gespeichert bei-80 ° C für die RNA-Extraktion. Mit einem total RNA Isolierungskit laut Protokoll des Herstellers aber mit geringfügigen Änderung18RNA extrahieren. Mischen Sie nach Zugabe von 50 mg Pulver homogenisiert Maiskorn in dem Extraktionspuffer es gut (ohne Heizungsjobstep) mit einer 1 mL Pipettieren Spitze und lassen Sie es auf Eis für 5-6 Minuten, bevor Sie fortfahren Folgeschritte wie im Protokoll des Herstellers beschrieben.
  2. Bereiten Sie mithilfe eines cDNA Synthese Kits nach des Herstellers Protokoll 18cDNA.
  3. Verwenden Sie 0,5 µL unverdünnte cDNA pro PCR-Reaktion für semi-quantitativen RT-PCR als früher beschriebenen18. Verwenden Sie vorwärts und rückwärts Primer qAILP-F 5'-TCCCAACAAGGCAACTACTG-3' und qAILP-R 5' - CGGTGTCGAAGAGACCTAGATA - 3' bzw. zu erkennen Lablab AILP Genexpression und forward und reverse Primer qRib-F 5ʹ-GGCTTGGCTTAAAGGAAGGT-3ʹ und qRib-R 5ʹ-TCAGTCCAACTTCCAGAATGG-3ʹ bzw. für den Ausdruck von Mais ribosomale Strukturgen (Rib), GRMZM2G02483819 als Zimmermädchen gen.

(6) GLP Quantifizierung

  1. Bereiten Sie 50 mL 0,2 M monobasic Natriumphosphat (NaH2PO4) und 0,2 M Diabas-Natriumphosphat (Na2HPO4·7H2O) in entionisiertem H2O.
  2. 100 mL Phosphatpuffer pH 7,0 Sorenson bilden. Für pH 7,0 hinzufügen von 19,5 mL NaH2PO4 Lager, 30,5 mL NaHPO4·7H2O Lager und 50 mL entionisiertem H2O.
  3. 25 mg Kernel Mahlgut (Frischgewicht, FW) wiegen Sie ab und in einen 1,0 mL Microcentrifuge Schlauch. Hinzu kommen die Zentrifugenröhrchen und Wirbel für 30 500 µL Phosphatpuffer s.
  4. Zentrifugieren Sie Proben für 15 Minuten bei 16.000 X g. Pipettieren 100 µL Überstand in ein schwarz 96-well-Platte. Lesen Sie die Proben mit einem Fluorometer (Erregung 485 nm, Emission 528 nm).

7. total Aflatoxin-Analyse

  1. Verarbeitung und Aflatoxin Probengewinnung
    1. Trocken-Kernel Proben in einem Umluft-Ofen für 2 Tage bei 60 ° C. Wiegen Sie Proben und legen Sie in ein 50-mL-Erlenmeyerkolben mit einem Glasstopfen.
    2. Verleihen Sie in einer Dampfhaube 25 mL Methylenchlorid jedem Kolben.
      Achtung: Methylenchlorid ist sehr volatil und gilt als gefährlicher (reizend, karzinogen). Latex weder Nitril-Handschuhe sind sicher für die Arbeit mit Methylenchlorid. Verwenden Sie verbesserte organische Lösungsmittel beständig PolyVinylAlcohol Handschuhe.
    3. Schütteln Sie Proben für 30 min auf ein Handgelenk Aktion Shaker. Gießen Sie nach 30 min langsam den Extrakt durch eine geriffelte Filterpapier Kreis in einer 80-mL-Becherglas. Lassen Sie die Becher über Nacht trocknen unter einem Abzug.
    4. Am nächsten Tag Spritzen Methylenchlorid (ca. 5 mL) um die innere Felge von der trockenen Becher, wirbeln herum und gießen Sie in 2 Dram Glasfläschchen. Lassen Sie Fläschchen öffnen, um in einer Abzugshaube über Nacht trocknen.
  2. Aflatoxin-Analyse
    1. 4,0 mL 80 % Methanol hinzufügen: entionisiertem H2O (V/V), Fläschchen.
    2. Verwendung eines Aflatoxin Extraktion Kit Filtern reinigen Methanol-Lösung mit der angegebenen Spalte. Analysieren Sie total Aflatoxin Ebenen mit einem Fluorometer gemäß den Anweisungen des Herstellers.

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Representative Results

Mais-Transformation und molekulare Screening von transgenen Pflanzen

Unreife Embryonen Hi-II-Maislinien verwandelten sich mit Agrobacterium Tumefaciens EHA101 Stamm, enthält die letzte Pflanze Ziel Vektor mit dem Ausdruck der Lablab Purpureus AILP gen unter der Kontrolle des CaMV- 35 s Promotor. Fünf unabhängig transformierte Maislinien wurden an die T6-Generation für nachfolgende Studien vorgerückt. Der transgenen Maispflanzen waren viel kleiner und weniger kräftig aber nicht zeigen Auffälligkeiten im Vergleich zu den isogenen negative Kontrollpflanzen. PCR-Amplifikation des Zielgens AILP zeigte eine 548 bp Amplifikate, nur in die transgenen Maislinien gegenüber den Kontrollpflanzen (Abb. 4A) beobachtet. Das AILP gen zeigte Ausdruck in transgenen Linien, während kein AILP Ausdruck in den Kontrollpflanzen (Abbildung 4 b) beobachtet wurde.

Aspergillus flavus Spore-Assay mit Blatt-Extrakte

Grobe Blatt Auszüge aus jungen Genmais erstellten Anlagen wurden durch Schleifen in Flüssigkeit N und 16.000 x gzentrifugieren. Frühen Stadium keimenden Sporen wurden die Blatt-Extrakt für 20 Stunden ausgesetzt und die mittlere Spore Bodenaggregaten Länge wurde von 20 Proben aufgenommen. Bodenaggregaten Länge von Sporen ausgesetzt transgenen Blatt Extrakte zeigten eine 58 % – 80 % Reduktion im Vergleich zu der negativen Kontrolle (Abbildung 5)

Aspergillus flavus Wachstum während der Kernel-Infektion

Ein Kernel Screening Assay (KSA) wurde durchgeführt, um das Wachstum von A. Flavus in den transgenen und Kontrolle Körnern zu untersuchen. Negativ beeinflusst die Expression des Gens AILP in transgenen Körner A. Flavus Wachstum. In der aktuellen Studie verwendete A. Flavus -Stamm enthält eine GLP-Reporter ermöglicht die Überwachung und Quantifizierung von Pilzwachstum in Echtzeit. Deutlicher Rückgang der GFP Fluoreszenz beobachtet in transgenen AILP Kerne im Vergleich zu den isogenen Negativkontrolle (Abbildung 6). AILP Linien 4 und 5 zeigten eine signifikante Reduktion in Pilzwachstum, 69 % und 72 %, jeweils gefolgt von anderen Linien wo wurde eine 35 – 60 % Reduktion im Vergleich zu die Kontrolle Kerne (Abb. 7A) beobachtet.

Aflatoxin-Produktion in den infizierten Körnern

Heterologen Expression des Gens in Mais AILP ergab signifikante Reduktion von Aflatoxin-Gehalt in der transgenen Linien vs. Kontrolle. Die Aflatoxin-Daten zur Verfügung gestellt, hier ist der totale Aflatoxin-Inhalt in die infizierten Kerne erkannt. Ein 62 bis 88 % Rückgang der Aflatoxin-Inhalt wurde in die AILP Kerne im Vergleich zu der Kontrolle (Abb. 7 b) beobachtet. Unter den 5 verschiedenen AILP Linien zeigte Linie 4 den niedrigsten Aflatoxin Inhalt (486 ng/g DW), gefolgt von anderen Linien zwischen 640-1.498 ng/g DW in den Körnern vs. Kontrolle (3.986 ng/g DW).

Figure 1
Abbildung 1: Vektor-Design für transgene Ausdruck Lablab AILP -gen in Mais. 35 s = Blumenkohl-Mosaik-Virus oder CaMV konstitutiven Promoter; RB = rechten Rand; LB = linke Grenze; NptII = Neomycin-Phosphotransferase-Kanamycin-Resistenz-Gen; Nein und 35 s = Transkription Terminatoren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Kernel Screening Assay. (A, B) Sterilisieren Sie Kerne zu und gießen Sie in ein steriles Becherglas in einem biologischen Sicherheitsschrank. (C-E) Kerne mit A. Flavus Spore Aussetzung zu impfen. (F-H) Legen Sie mit einer sterilen Pinzette, Kerne in Bioassay Gericht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Light Aufnahmen von A. Flavus Wachstum. (A) isogenen Negativkontrolle. (B-F) Transgene Kerne mit dem Ausdruck AILP (Linien 1-5) eine Woche nach der Inokulation. Maßstabsleiste = 1 cm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4. Molekulare Screening von transgenen Pflanzen. (A) PCR Bestätigung der transgene Maispflanzen (Bahnen 1-5) mit Lablab AILP (548 bp diagnostische DNA-Fragment; C = isogenen negativ-Kontrolle; NEB 2-Log DNA-Leiter als DNA-Marker verwendet). (B) Expression Lablab AILP Gens in transgene Maislinien (Bahnen 1-5) mittels RT-PCR. Lane C stellt isogenen Negativkontrolle. Mais ribosomale Strukturgen (Rib), GRMZM2G02483819 als Zimmermädchen gen diente (NEB 2-Log DNA-Leiter: DNA-Marker). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5. Wirkung von groben Blatt Auszüge aus transgenen Mais AILP Pflanzen auf A. Flavus Sporen keimen im Vergleich zu einer isogenen Negativkontrolle (Neg). Bedeutet Trennung erfolgte durch Dunnetts Nachtest nach ANOVA. Ebenen der signifikante Reduktion sind gekennzeichnet durch Sternchen (***P ≤ 0,0001). Fehlerbalken zeigen Standardfehler von Mitteln für 20 Proben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6. GFP Fluoreszenz von A. Flavus Belastung 70-GFP in transgenen Kerne mit dem Ausdruck AILP nach einwöchiger Bioassay. Isogene Negativkontrollen (A) wurden verwendet, um die Pilzinfektion zu bewerten und die Ausbreitung in transgenen Kerne (B-F aus transgenen Linien 1 bis 5). Mindestens vier Kerne wurden für jede Zeile unter dem Fluoreszenz-Mikroskop untersucht. Maßstabsleiste = 2 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7: Wachstum und Aflatoxin Produktion ein Flavus . (A) A. Flavus 70-GFP Infektion und Zunahme der Maiskörner nach 7 Tagen in einem Kernel Screening Assay. Durchschnitt von drei unabhängigen Experimenten mit vier biologischen repliziert jedes Mal. GFP-Quantifizierung (in relativen Einheiten in Fluoreszenz, RFU) zeigt Pilzwachstum in transgene Maislinien AILP einer isogenen negative Kontrolle zum Ausdruck zu bringen. Bedeutet Trennung erfolgte durch Dunnetts Nachtest nach ANOVA. Ebenen der signifikante Reduktion ist gekennzeichnet durch Sternchen (*P ≤ 0,05; **P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001). Fehlerbalken zeigen Standardfehler Mittel für vier randomisierten biologische repliziert. (B) Aflatoxin-Produktion von A. Flavus 70-GFP in Maiskörner nach 7 Tagen in einem Kernel Screening Assay. Durchschnitt von 12 biologische Wiederholungen und jede Wiederholung enthalten vier Kerne. Aflatoxin Ebenen in transgenen AILP Kerne (Linien 1 bis 5) im Vergleich zu einer isogenen Negativkontrolle (Neg). Bedeutet Trennung erfolgte durch Dunnetts Nachtest nach ANOVA. Ebenen der signifikante Reduktion ist gekennzeichnet durch Sternchen (**P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001). Fehlerbalken zeigen Standardfehler Mittel für vier randomisierten biologische repliziert. Siehe zusätzliche Abbildungen zum Anzeigen der Daten im Bedienfeld " B " frei von Verzerrung aufgrund Pilz Hemmung. Korrelation zwischen GFP schließen = RFU und Aflatoxin Werte sind ebenfalls vorhanden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Sup Figure 1
Zusätzliche Abbildung 1: Daten aus Abbildung 7 b neu gezeichnet, um Aflatoxin Produktion zeigen von A. Flavus 70-GFP in Maiskörner nach 7 Tagen in einem Kernel Screening Assay Verzerrung aufgrund Pilzwachstum Hemmung zu beseitigen. Aflatoxin Werte wurden geteilt durch das Pilzwachstum Hemmung als GLP-RFU Werte in Abbildung 7dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Sup Figure 2
Ergänzende Abbildung2: Korrelation zwischen GFP-RFU-Werte (= Pilzbefall) und Aflatoxin Ebenen schließen (R2 = 0,86) berichtet in der KSA. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Ertragsverluste bei landwirtschaftlichen Nutzpflanzen durch Erreger und Schädlinge ist ein globales Problem-20. Derzeit, Anwendung von synthetischen Fungiziden und Pestiziden ist das vorherrschende Mittel für steuernde Anlage Krankheitserreger und Schädlinge, aber passives Toxizität von diesen Biochemikalien in Lebens- und Futtermitteln kann ernsthafte Bedrohung für die menschliche und tierische Gesundheit21darstellen. Angesichts der wirtschaftlichen Bedeutung der Mais als Lebensmittel und Futtermittel Getreide Verringerung oder Beseitigung von Aflatoxinkontamination ist von größter Bedeutung2,3,22. Konventioneller Züchtung durch resistente gen Introgression in anfälligen Sorten ist ein zeitaufwendiger Prozess und dieser Widerstand ist nicht immer stabil wie Aflatoxin Widerstand eine Polygene Eigenschaft ist und Ausdruck der beteiligten Gene unterscheiden sich erheblich mit Veränderungen in der Umweltparameter4. Alternative Ansätze werden geprüft, um zu erhöhen und Host Pflanze Verteidigung gegen A. Flavus auf umweltfreundliche Weise zu stabilisieren.

In der aktuellen Studie wählten wir zur Bewertung der Wirksamkeit des Gens AILP aus Hyazinthe Bohnen im Mais gegen A. Flavus. Da AILP als kompetitiver Inhibitor der α-Amylase und auch antimykotische Eigenschaften besitzt, haben wir dieses Gen unter starken konstitutiven Promoter CaMV- 35 s. Ziel war es, die Produktion dieses heterologen Proteins in Mais unabhängig vom Entwicklungsstadium oder Gewebetyp zu erhöhen. Ausdruck der α-Amylase-Gens in die transgenen Maislinien (Abbildung 4AB) unterstützt stabile Expression dieses Gens in einer heterologen System. Negativ beeinflusst das Pilzwachstum so offensichtlich von der Rückgang der räumlichen Verteilung der GFP Fluoreszenz im Inneren der infizierten AILP Kerne und Rückgang der allgemeinen GFP-Fluoreszenz in den Körnern (Abbildung 6 und Abbildung 7A).

Die Entwicklung von Kernel Screening Assay (KSA) nutzt ein gentechnisch A. Flavus Reporter Belastung mit dem Ausdruck eines Gens kodieren das grüne fluoreszierende Protein (GFP) aus der Qualle Aequorea Victoria18, 23. um Regelungsstrategien für jeden Erreger zu entwickeln, ist es notwendig, die Art der Infektion, zu verbreiten und Besiedlung innerhalb der Wirtspflanze oder Gewebe zu verstehen. Die Besiedelung und Ausbreitung von Aflatoxigenic saprophytischen, A. Flavus ist nicht gut verstanden, weil genetische Regulation des Widerstandes gegen die Erreger, wenn einer vorhanden ist, ist nicht gut verstanden. Einsatz der GFP exprimierenden A. Flavus Belastung macht es möglich, in Echtzeit zu verfolgen, der Infektion und Kolonisation. Die GFP-Belastung und dem Wildtyp wich nicht wesentlich Erreger Aggressivität und Aflatoxin Produktion23ab. Allerdings ist das GFP-gen in diesem besonderen Belastungen der konstitutiv exprimierten Glyceraldehyde Phosphat Dehydrogenase (GpdA) gen Veranstalter 24 unterstellt ist eher geneigt, für die Verfolgung von Pilzwachstum. Mit diesem Fleck auf Baumwollsamen und Maiskörner, haben wir eine enge Beziehung zwischen GFP Fluoreszenz ausgehend aus dem Pilz, Pilzbefall und Aflatoxin Ebenen18,23gezeigt.

Um eine enge Korrelation mit Aflatoxin produziert Fähigkeit zu etablieren, werden Gfp angetrieben durch Aflatoxin gen Promotoren wie OmtA oder Ver-125,26 besser geeignet als GpdA. Die GFP Fluoreszenz ist empfindlich genug, um für die Erkennung und Messung in Echtzeit der selbst kleine Veränderungen im Pilzwachstum, erlauben sowohl in-vitro- und in Plantaund Evaluierung der hemmenden Aktivitäten von unbekannten antimykotische Proteine und Peptide wie AILP und andere11,17,18,23. Darüber hinaus ergibt sich aus der KSA korreliert gut mit Feld Leistung beständig oder anfällig Maislinien in Bezug auf die Bewertung für Aflatoxin-Kontamination-27.

Die KSA ist sehr nützlich in unserem Labor auf Bildschirm klassisch gezüchtete neue Sorten4 und transgenen Linien11,18. Es ist einfach einzurichten und KSA in jedem Labor durchführen. Man muss unbeschädigt, sauber Kernel verwenden, um dieses Tests durchzuführen, so dass ein klares Verständnis der Pflanze-Pilz Interaktion Hosts ausgewertet werden konnte. Wir scannen routinemäßig alle Kerne, die wir in unserem Labor unter einem Stereomikroskop verwenden, bevor Sie den Test durchführen. Es sei darauf hingewiesen, dass die Bedingungen, die wir für die KSA einsetzen hoher Luftfeuchtigkeit (95 % RH) und konstante Temperatur (31 ° C) enthalten. Mit dem Beginn der simulierten Keimungsprozess unter diesen Bedingungen bietet der Assay ideale Voraussetzungen, um die Integrität der Samenschale, Erbgut des Kernels einschließlich pilzbefallverhütende Gene/Proteine eingeschaltet, während der Keimung, und/oder Pilzbefall zu testen Infektion. Pilzartige Infektion und Aflatoxin Produktion werden immer höher in KSA im Vergleich zu ihr Auftreten im Feld; Allerdings wurde eine enge Korrelation etablierten4,27.

In diesem KSA ist nachgewiesen, dass AILP Pilzwachstum in Maiskörner reduziert. AILP besitzt antimykotische Eigenschaften der pflanzlichen Lektine und hat gezeigt, dass α-Amylase, hemmen abnehmender Stärke Aufschlüsselung und Pilzwachstum zu begrenzen. In-vitro-Studien gezeigt, dass AILP Hemmung A. Flavus konnte wuchs in Zucker-reichen Kartoffel Traubenzucker Brühe (PDB) künstliche Wachstumsmedium, unter Angabe ihrer Antimykotika/Wachstum Hemmung Tätigkeit unabhängig von der Amylase-Hemmung Aktivität-13. Anderen pflanzlichen Lektine isoliert von Urtica Dioica (Brennnessel), Hevea Brasiliensis (Kautschukbaum) und Knollen von Solanum Tuberosum (Kartoffel) zeigen auch ähnliche antimykotische Eigenschaften und verhindert Wachstum von Botrytis cinerea , Pyrenophora Triticiund Fusarium Oxysporum28,29,30,31. Alpha-Amylase-Inhibitoren sind nicht nur wirksam gegen Pilze und Bakterien, sondern wurden auch gezeigt, um wirksam gegen Schadinsekten32. Alpha-Amylasen sind kritisch für normales Wachstum und Entwicklung der Pflanze-Fütterung Insekten gemeldet, und mehrere Insekten α-Amylase-Inhibitoren wurden isoliert von Pflanzen wie Weizen, Gartenbohne und Mais12,33, 34,35. Einem deutlichen Rückgang der Pilz Bodenaggregaten Länge von Sporen ausgesetzt groben Blatt Extrakte (Abbildung 5), Verringerung der Pilzwachstum im AILP exprimierenden Mais Körner wie gezeigt durch die Reduktion der GFP Fluoreszenz sowohl qualitativ ( Abbildung 6) und quantitativ (Abb. 7A) ist möglicherweise durch eine Kombination der α-Amylase-Hemmung und antimykotische Eigenschaften. Experimente mit diesen AILP exprimierenden Mais Pflanzen gegen andere Krankheitserreger und Schädlinge werden in Zukunft von großem Interesse für seine Wirksamkeit gegen verschiedene biotische Stressoren von Saatgut und vegetativen Geweben zu testen. Die Antimykotika und Wachstum Hemmung Eigenschaften der Lektin ist vor allem zu seiner Vernetzung mit Chitin und Hemmung von Bodenaggregaten Tipp Ausbau28zugeschrieben. In der Tat zeigten in-vitro-AILP-vermittelte Hemmung der α-Amylasen aus verschiedenen Pilz- und bakteriellen Ursprung mehr als 65 % Hemmung in Pilzerreger einschließlich A. Flavus, Magnaporthe Grisea, Helminthosporium Victoriaeund 41 Hemmung der bakteriellen Erreger Bacillus Subtilis13%. Die Ergebnisse auf Reduktion von A. Flavus Wachstum hier vorgestellten stehen im Einklang mit der Rolle der α-Amylase-Inhibitoren als Antimykotika. Die aktuelle Studie zeigt praktische Anwendung solch nützliche Informationen, die früher in-vitro-Untersuchungen.

Reduzierung der Aflatoxin-Gehalt (Abb. 7 b) in AILP-Maislinien auszudrücken ist möglicherweise durch Hemmung der A. Flavus α-Amylase-Aktivität, was zu verminderten Abbau von gespeicherten Stärke, und reduziert Erwerb von Zucker als eine Energiequelle von Maiskörnern während Pathogene Interaktion. Als α-Amylase Pilz eine wichtige Rolle beim Abbau von Kernel Stärken spielt, ändert jede Änderung im Pilz α-Amylase-Aktivität von AILP wahrscheinlich Gehalt an löslichen Zuckern während der Kernel-Infektion. Inhalt der lösliche Zucker, vor allem Saccharose und Glucose, hat Korrelation mit erhöhten Produktion von AFB1 und insgesamt Aflatoxine in Mais und andere A. Flavus anfällig für Nutzpflanzen wie Erdnuss36,37. Saccharose-Gehalt in künstlichen Wachstumsmedien, A. Flavus Aflatoxin Produktion38erhöhen. Andere lösliche Zucker wie Glukose und Maltose Beitrag auch positiver zur Aflatoxin Produktion sowohl in künstliche Medien und Saatgut Substrate38. Hemmung der α-Amylase-Aktivität und die Verringerung der Mykotoxinproduktion bei anderen Pilzen verstärkt eine wichtige Rolle der Pilz α-Amylasen in Toxinproduktion während der Kernel-Infektion. Alpha-Amylase Knockout-Mutanten von F. Verticillioides und A. Flavus versäumt, Fumonisin B1 und Aflatoxine bzw. nach Infektion der Maiskörner9,10zu produzieren. Ebenso wurde Down-Regulierung von A. Flavus α-Amylase Pilz Wachstum und Aflatoxin Produktion im Maiskorn Infektion11deutlich reduziert. Ein 62-88 % Rückgang Aflatoxin in transgenen Linien stehen im Einklang mit früheren Berichten über die Rolle der α-Amylase in der Aflatoxin-Produktion. Es ist darauf hinzuweisen, dass die in-vitro-Kernel Screening Assay (KSA) strenger als normalerweise gefunden unter natürlichen Bedingungen ist. Bedingungen während des in-vitro-Tests sind auch sehr förderlich für Aflatoxin-Produktion, so dass die prozentuale Veränderung Aflatoxin-Gehalt in der transgenen Linien möglicherweise aussagekräftiger als die absoluten Zahlen von Aflatoxin-Inhalten in den infizierten Körnern. Die hier vorgestellten Ergebnisse sind vielversprechend und zukünftige Experimente unter Freilandbedingungen sind wichtig, um das Potenzial dieser AILPprüfen-Maislinien für Aflatoxin Widerstand unter einem natürlichen Szenario zum Ausdruck zu bringen.

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Disclosures

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt.

Acknowledgments

Wir danken David Meints, University of Arkansas für seine Hilfe bei der Entwicklung und Analyse von transgenem Mais während der frühen Generationen. Diese Arbeit erhielt die finanzielle Unterstützung des USDA-ARS CRIS-Projekts 6054-42000-025-00D. Erwähnung von Handelsnamen oder kommerzielle Produkte in diesem Artikel wird ausschließlich zum Zweck der Bereitstellung von spezifischen Informationen und bedeutet keine Empfehlung oder Billigung durch das US Department of Agriculture. USDA-ARS gleicher Beschäftigung Gelegenheit (EEO) Politik Mandate Chancengleichheit für alle Personen und verbietet Diskriminierung in allen Aspekten der Agentur Personalpolitik, Methoden und Erfahrungen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Caisson
Amazing Marine Goop Eclectic Products
C1000 Touch CFX96 Real-Time System Bio-Rad
Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm Fisher Scientific 08-772F
Eppendorf 5424 Microcentrifuge Fisher Scientific
Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL Ace Glass 6999-10
Ethanol
FluoroQuant Afla Romer Labs COKFA1010
Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm Fisher Scientific 09-790-14E
Force Air Oven VWR
FQ-Reader Romer Labs EQFFM3010
Geno/Grinder 2010 OPS Diagnostics SP 2010-115
Improved PolyVinylAlcohol Organic Solvent Resistant Gloves Ansell 012-15-554
Innova 44 Incubator Shaker Brunswick Scientific
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890
liquid Nitrogen
Low Form Griffin Beakers, 100 mL DKW Life Sciences 14000-100
Methanol
Methylene Chloride
Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants Nexttec 47N
Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera Nikon
Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera Nikon
Nunc Square BioAssay Dishes ThermoFisher Scientific 240835
Phire Plant Direct PCR Kit ThermoFisher Scientific F130WH
Polycarbonate Vials, 15 ml OPS Diagnostics PCRV 15-100-23
Potato Dextrose Broth
Snap Cap, 22 mm DKW Life Sciences 242612
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich
Sodium Phosphate monobasic Sigma-Aldrich
Spectrum Plant Total RNA Kit Sigma-Aldrich STRN50
Stainless Steel Grinding Balls, 3/8'' OPS Diagnostics GBSS 375-1000-02
Stir Plate
Synergy 4 Fluorometer Biotek
T100 Thermal Cycler Bio-Rad
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
V8 juice Campbell's
Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3 Fisher Scientific 09-820P
Wrist-Action Shaker Burrell Scientific

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Umweltwissenschaften Ausgabe 144 α-Amylase-Inhibitor Aflatoxin Aspergillus Flavus Mais Kernel screening Assay Lablab Purpureus Mais transgenen
Hemmung der <em>Aspergillus Flavus</em> Wachstum und Aflatoxin in transgenen Mais mit dem Ausdruck der α-Amylase-Inhibitor von <em>Lablab Purpureus</em> L.
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