Summary
Ce protocole comporte des caractérisations de valve atrioventriculaire folioles avec force contrôlée, déplacement contrôlé, et méthodes d’essai mécanique biaxial stress-relaxation. Les résultats acquis avec ce protocole peuvent être utilisés pour l’élaboration d’un modèle constitutif pour simuler le comportement mécanique des valves fonctionnant dans un cadre de simulation par éléments finis.
Abstract
Biaxial mécanique des tests approfondis des folioles valve auriculo-ventriculaire cardiaque peuvent être utilisés pour dériver les paramètres optimaux utilisés dans les modèles de comportement, qui fournissent une représentation mathématique de la fonction mécanique de ces structures. Ce protocole de test mécanique biaxial présenté implique l’acquisition de tissu (i), (ii) la préparation d’échantillons de tissus, des essais mécaniques (iii) biaxial et (iv) le post-traitement des données acquises. Tout d’abord, acquisition de tissus nécessite obtention porcine ou ovine coeurs d’une nourriture locale et abattoir approuvé par FDA pour la dissection plus tard pour récupérer les tracts de la soupape. Ensuite, préparation du tissu nécessite l’utilisation de coupeurs de spécimen de tissu sur le tissu de la brochure pour extraire une zone claire pour les tests. Troisièmement, biaxial essais mécaniques du spécimen brochure nécessite l’utilisation d’un testeur mécanique biaxial commercial, qui se compose de force contrôlée, déplacement contrôlé, et des protocoles de tests de stress-relaxation afin de caractériser les tissus dépliant propriétés mécaniques. Enfin, post-traitement requiert l’utilisation de techniques de corrélation données images et lectures de force et de déplacement pour résumer les comportements mécaniques du tissu en réponse à une charge externe. En général, les résultats d’essais biaxial démontrent que les tissus de la brochure donnent une réponse mécanique non linéaire, anisotrope. La procédure d’essai biaxiale présentée est avantageuse à d’autres méthodes car la méthode présentée ici permet une caractérisation plus complète du tissu dépliant vanne sous un régime test unifié, par opposition à des protocoles de tests séparés sur échantillons de tissus différents. La méthode d’essai proposée a ses limites que la contrainte de cisaillement est potentiellement présente dans l’échantillon de tissu. Toutefois, aucun cisaillement potentiel est présumé négligeable.
Introduction
Fonction cardiaque correcte s’appuie sur des comportements mécaniques appropriées des folioles valve cardiaque. Dans les situations où la mécanique de dépliant valve cardiaque est compromise, valvulopathie cardiaque se produit, qui peut entraîner d’autres problèmes cardiaques. Comprendre la valvulopathie exige une compréhension approfondie des comportements mécaniques appropriées des folioles pour une utilisation dans des modèles informatiques et développement thérapeutique, et par conséquent, un régime d’essai doit être développé pour récupérer avec exactitude les bien-portants propriétés mécaniques des folioles. Dans la littérature antérieure, cette caractérisation mécanique a été réalisée à l’aide de procédures de test mécaniques biaxiales.
Procédures de test mécaniques biaxiales pour tissus mous varient à travers la littérature, avec différentes infrastructures de test utilisés pour récupérer des caractéristiques différentes,1,2,3,4, 5,6,7,8,9,10,11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. méthodes d’essai ont été étendues pour les études des caractéristiques mécaniques de dépliants de valve cardiaque. En général, biaxial essai mécanique consiste à charger le tissu valvulaire cardiaque avec forces simultanées dans les deux directions principales, mais comment cette analyse est réalisée varie selon les propriétés biomécaniques à observer. Certains de ces protocoles d’analyse comprennent (i) taux de déformation, fluage (ii), (iii) stress-relaxation et (iv) force contrôlée par test.
Tout d’abord, les tests de vitesse de déformation a été utilisé pour déterminer les comportements dépendant du temps des tissus folioles18,20. Dans ce protocole d’essai, des tracts sont chargés à une tension maximale de membrane à des moments différents de demi-cycle (c.-à-d., 1, 0,5, 0,1 et 0,05 s) pour déterminer s’il existe une différence significative dans l’étirement de la crête ou hystérésis entre les temps de chargement. Cependant, ces essais ont démontré une différence négligeable dans le tronçon observée avec différentes vitesses de déformation. Deuxièmement, dans l’essai de fluage, le tissu est chargé à la tension de membrane de pointe et qui s’est tenu à la tension de membrane de crête. Ce test permet une démonstration de comment déplacement de tissu se glisse pour maintenir la tension de membrane de pointe. Toutefois, il a été démontré que le fluage est insignifiant pour dépliants valve cardiaque sous fonctionnement physiologique3,20. En troisième lieu, dans les tests de stress-relaxation, le tissu est chargé à la tension de membrane de crête et le déplacement associé est maintenu constant pendant une période prolongée de temps3,21,22. Dans ce type de test, le stress de tissu a une réduction notable de la tension de membrane de crête. Enfin, pour tester la force contrôlée, les tissus sont cycliquement chargés à différents ratios de la tension de membrane de pointe dans chaque direction17,23. Ces tests révèlent l’anisotropie et la réponse non linéaire contrainte-déformation du matériau et en chargeant le tissu sous divers rapports, déformations physiologiques potentielles peuvent être mieux comprises. Ces investigations récentes fait apparaître ce stress-relaxation et protocoles contrôlés par force s’avérer plus avantageux d’effectuer une caractérisation mécanique des dépliants de valve cardiaque. Malgré ces avancées dans la caractérisation biomécanique de valve cardiaque, l’essai n’a été effectuée sous une unifiée essai régime, et il existe des méthodes limitées pour enquêter sur le couplage entre les sens.
Cette méthode vise à faciliter une caractérisation complète des folioles valve cardiaque par un régime de test mécanique biaxial unifié. Un régime unifié de test est considéré comme l’un où chaque foliole est testé sous tous les protocoles d’essai en une seule session. C’est avantageux, comme un tissu, les propriétés sont intrinsèquement variables entre les folioles, donc une caractérisation complète pour chaque foliole s’avère plus précise comme un descripteur que l’exécution de chaque protocole indépendamment sur divers dépliants. Le régime d’essai se compose de trois éléments principaux, à savoir (i) un protocole d’essai biaxial force contrôlée, (ii) un protocole d’essai biaxial déplacement contrôlé et (iii) un protocole d’essai biaxiale stress-relaxation. Tous les régimes d’essais utilisent un taux de charge de 4.42 tr/min et 10 cycles de chargement et de déchargement pour s’assurer de contrainte-déformation de la courbe réplicabilité par la 10ème cycle (que l'on trouve dans les travaux antérieurs)23. Tous les protocoles sont également construits fondée sur l’hypothèse de tension de membrane, qui exige que l’épaisseur soit moins de 10 % de la longueur de l’échantillon efficace.
Le protocole de force contrôlé utilisé dans cette méthode présentée se compose de 10 de chargement et de déchargement des cycles avec des tensions de membrane de pointe de 100 N/m et 75 N/m pour la valve mitrale (MV) et de la valve tricuspide (TV), respectivement de15,17. Cinq rapports de chargement sont considérés dans ce protocole d’essai contrôlé par force, à savoir : 1:1, 0.75:1, 1:0.75, 0.5:1 et 1 : 0. 5. Ces ratios de cinq chargement s’avérer utiles pour décrire les contraintes et déformations correspondant à toutes les déformations physiologiques potentiels du dépliant in vivo.
Le protocole de contrôle déplacement présenté dans cette méthode se compose de deux scénarios de déformation, à savoir (i) contrainte uniaxiale stretching et cisaillement (ii) pur. L’étirement contrainte uniaxiale, un sens du tissu est décalée vers la tension de membrane de pointe tout en fixant l’autre sens. Dans la configuration de cisaillement pur, le tissu est tendu dans une seule direction et judicieusement abrégé dans l’autre sens, donc la zone du tissu reste constante dans la déformation. Chacune de ces procédures d’essai contrôlé par déplacement est effectuée pour chacune des directions de deux tissus (directions circonférentielles et radiales).
Le protocole de stress-relaxation, utilisé dans la méthode présentée est obtenu par chargement le tissu à la tension de membrane de crête dans les deux sens et le maintien du tissu dans les déplacements correspondants pendant 15 min surveiller le comportement de relaxation de contrainte du tissu. Les procédures expérimentales on discute ensuite.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ont été approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) à l’Université de l’Oklahoma. Tous les tissus d’origine animales ont été acquis d’un département américain de l’Agriculture USDA approuvé abattoir (Country Home Meat Co., Edmond, OK).
1. tissu acquisition et nettoyage
- Récupérer le cœur animal le même jour que l’animal est abattu et stocker les coeurs dans une glacière pour assurer la fraîcheur des tissus. Transport du cœur à l’espace de laboratoire.
- À leur arrivée au laboratoire, plongez au cœur dans un seau de tamponnée au phosphate (PBS) du sérum physiologique à rincer tout excès sang. Récupérer les forceps, un napperon, une lame chirurgicale, un seau de solution PBS, eau de Javel et un sac en plastique. Préparer le napperon en le posant sur le comptoir de la dissection, ce qui permet un nettoyage plus facile du mess liés par le sang. Après que le cœur a été suffisamment rincé, placer le coeur sur le set de table (Figure 1 a).
- À l’aide de la pince, recherchez la ligne de séparation entre l’oreillette et le ventricule sur chaque côté du cœur. À l’aide d’une lame de rasoir, soigneusement faites une incision le long de cette ligne de séparation et révéler des valves cardiaques et les ventricules (Figure 1 b). Faire l’incision le long de toute la circonférence externe du cœur, tels que les oreillettes et tout matériel de cœur supérieur vers les ventricules sont révocables.
- Avec la pince, tirez soigneusement tout observé les caillots de sang dans les ventricules (Figure 1C). Si une tentative est effectuée pour retirer un caillot de sang, mais il ne pas se déplacer, assurer la tendineae de chordae ou folioles n’ont pas été attrapés. Placez les caillots de sang dans le sac de biohazard pour l’élimination des déchets.
- Lorsque tous les caillots de sang ont été supprimés des ventricules, rincez le cœur une dernière fois dans un seau avec la solution de PBS. Placer le c ? ur pur dans le sac en plastique et placez-le au congélateur.
- À l’aide d’une solution d’eau de Javel 10 % et 90 % eau, mélanger le sang avec la solution javellisée et remuer constamment pendant environ 10 mn chercher un traitement de l’eau de Javel avec succès, a indiqué par la solution de transition du rouge au jaune. Jeter le sang imprégnées d’eau de Javel par le drainage.
Attention : Eau de Javel est une substance toxique et peut être nocif si ingéré.
Remarque : Le protocole peut être suspendu ici.
2. dissection et examen de l’anatomie du coeur
- Récupérer le cœur préalablement nettoyé et laissez-le fondre dans un bain d’eau chaude. Le matériel requis pour la dissection comprendre des pinces, lames chirurgicales, napperons, PBS et petits contenants. Après le coeur est complètement décongelé, mettez-le sur un napperon pour absorber le sang restant.
- Tenir le cœur pour une vue (supérieure) de descendante pour mieux observer les structures de la soupape. En commençant par le MV sur le côté gauche du coeur, utiliser forceps manipuler les folioles et identifier une commissure, ou une ligne de joint, entre les folioles avec soin.
- Faites une incision le long de la commissure et découpez soigneusement à travers la paroi ventriculaire, en faisant attention à ne pas endommager les folioles. Il peut être nécessaire de couper les pièces jointes Cordal au cours de ce processus pour ouvrir complètement le ventricule. Une fois l’incision complète est effectuée, ouvrez le ventricule (Figure 2 a).
- Identifier les feuillets antérieurs et postérieurs de MV et utiliser une lame chirurgicale pour rompre les attaches Cordal aux muscles papillaires. Avec une pincette, étirer les folioles tendus et faire des coupes pour séparer les tracts de l’annulus. Mettre les folioles excisées dans un contenant convenablement étiqueté rempli de solution de PBS et la stocker dans un réfrigérateur à 4 ° c environ.
- Tenez le cœur pour une vue de haut en bas et identifier la TV sur le côté droit du cœur. Recherchez les commissures et faites une incision à travers les commissures et la paroi ventriculaire (Figure 2 b).
- Identifier les folioles septales postérieures et antérieures de TV et effectuer l’extraction de brochure comme fait à l’étape 2.4. Placer tous obtenus des tracts dans un contenant étiqueté rempli de solution de PBS et entreposer le contenant au réfrigérateur à 4 ° c environ.
Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Cependant, tests biomécaniques des tissus et les analyses histologiques suivantes doivent se produire dans 2 jours de la dissection du cœur.
3. dissection du tissu
- Récupérer une brochure de frigo, le coupeur de tissu à la taille spécifiée de sectionnement, un stylo chirurgical, pinces, lames de rasoir et un tapis de découpe.
- À l’aide de pinces, retirer l’échantillon de la solution de PBS et posez-le à plat sur le tapis de découpe avec la direction radiale (R) aligné sur l’axe Y et la direction circonférentielle (C) aligné sur l’axe X (Figure 3 a). Identifier du dépliant la région centrale comme la section essai.
- Aligner le couteau de tissu afin que la région test tissu désiré est dans les limites des lames de rasoir. Faire un coupe horizontalement et verticalement pour former une région carrée de la dimension désirée (Figure 3 b). En utilisant le stylo chirurgical, étiqueter la direction radiale du tissu (Figure 3 b).
- À l’aide de la lame de rasoir, coupez toutes les pièces jointes Cordal en étirant les cordons de la brochure avec la pince et faire une coupe prudente sans causer de dégâts sur la notice.
Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Si le protocole est en pause, stocker les tissus sectionnés dans un contenant étiqueté rempli de solution de PBS et entreposer le contenant au réfrigérateur à 4 ° C environ (comme il est expliqué dans l’étape 2.6). Cependant, en tissu test cas en 2 jours de la dissection.
4. configuration de biaxial testeur / de mesure d’épaisseur
- Extraire l’échantillon de tissus sectionnés, étriers numériques et une petite spatule métallique. À l’aide des étriers numériques, mesurer et noter l’épaisseur de la spatule métallique.
- À l’aide de forceps, jeter l’échantillon de tissu plat sur la spatule métallique. À l’aide des étriers numériques, mesurer l’épaisseur de la paire de spatule-tissus (Figure 3C) à trois endroits différents prospectus. Soustraire l’épaisseur de la spatule de chaque mesure et enregistre l’épaisseur moyenne.
- Préparez un bain de PBS à 37 ° C, ce qui correspond à l’état physiologique du tissu.
5. tissu montage et placement du marqueur fiducial
- Récupérer les forceps, l’échantillon de tissus, matériel de montage, un outil pointu, perles de verre (avec un diamètre de 300 à 500 µm) et colle super.
- Monter les tissus et le système d’essai biaxial (Figure 3de). Tout en montage, veiller à ce que les directions circonférentielles et radiales de tissu sont alignées avec de la machine X-Y-directions et.
- Pour le placement du marqueur fiducial, placer des perles de verre dans un petit récipient ouvert et une petite piscine de super colle dans un autre récipient. À l’aide de l’outil pointu, enduire l’extrémité avec une petite quantité de colle et coller une perle individuelle à la pointe de l’outil.
- Avec précaution, utilisez l’outil pour transférer le talon vers un coin du tiers médian de région test de tissu (Figure 3f). Répétez cette étape jusqu'à ce qu’un tableau carré de quatre perles est formé (Figure 3 g).
Remarque : Il est crucial que l’excès de colle est évité, et que les repères d’alignement ne collent pas ensemble comme des techniques de corrélation (DIC) image numérique plus tard produira des résultats de suivi inutile. Il est important que le tableau carré doit être dans le tiers médian du tissu tests région.
6. préconditionnement étape et le moment de la durée
- Pour calculer la tension de membrane appropriée, obtenir la longueur des arêtes test efficace de tissu et utiliser l’équation suivante.
(1)
NOTE : Ici, T est la tension de la membrane dans une unité de force/longueur, f est la force, et L est la longueur de test effective de l’échantillon. - Créer un protocole préconditionnement de sorte que le tissu va subir 10 cycles de chargement/déchargement sur les forces associées à tension de membrane de crête à un taux de chargement de 4.42 tr/min, y compris une précharge de 2,5 % de la force maximale (Figure 4).
- Créez un nouveau répertoire test arbitraire pour stocker temporairement les données préconditionnement, car il n’est pas nécessaire au calcul ultérieur. Établir un taux de charge de 4.42 N/min pour les analyses subséquentes.
- Créer un nouvel ensemble de test des paramètres et définissez le nom du protocole comme Preconditioning0 (Figure 4 a). Pour les axes X et, réglez le mode de commande à être la force et la fonction de contrôle comme étape. Définir l' ampleur de la charge comme la force associée ciblée tension de membrane de crête (cf. étape 6.1) (Figure 4 b). Régler la précharge grandeur que 2,5 % de la force maximale pour la première répétition uniquement (Figure 4C). Définir l' étirer la durée et durée de récupération deux à 25 s. ensemble le nombre de répétitions pour être 10 (Figure 4e).
- Fin de l’étape de préconditionnement, prenez note de la déformation du tissu dans les directions X et Y. Élaboration d’un protocole pour passer l’échantillon à la force maximale, en commençant par la taille enregistrée.
- Récupérer un chronomètre à des fins de synchronisation. Commencer la force maximale, protocole de chargement et démarrer le chronomètre simultanément lorsque la machine commence à actionnement (Figure 5 a). Arrêter le chronomètre lorsque la manoeuvre s’arrête. S’arrêter sera évident par le biais de signaux auditifs.
- Enregistrer la déformation de tissu après préconditionnement pointe aux côtés de l’époque de la chronomètre représentant l’heure stretch optimale du tissu (Figure 5 b).
(1)7. biaxial essais mécaniques
- Élaboration d’un protocole de force contrôlée à un taux de chargement de 4.42 N/min.
- Ouvrez un nouveau répertoire de test et nommez le test. Définir les données à enregistrer dans un emplacement connu pour usage dans les calculs de contrainte et de déformation ultérieures. Amener l’échantillon sur la configuration de montage original.
- Créer un ensemble de protocole intitulé FirstImage. Définir l’axe des abscisses et le mode de contrôle d’axe des ordonnées à la force et la fonction de commande à l’étape. Définir l' ampleur de la charge à 0 mN. Affectez l' étirer la durée et la durée de récupération chaque 1 seconde. Définir le nombre de répétitions à 1. Définissez la fréquence de sortie de données et la fréquence de sortie d’image chaque à 1 Hz.
- Construire un nouvel ensemble de test, nommé PreconditioningA. Établir les paramètres de tests tels que le tissu va subir 10 répétitions de chargement/déchargement cyclique à la force ciblée pour la tension de membrane désiré exactement comme a été préparé à l’étape 6.2. Notez que maintenant, le temps extensible et l’heure de récupération doivent être le temps enregistré à l’étape 6.3.2. Aucune images ne sont capturées dans l' A tester ensemble, mais les données sont capturées à 15 Hz.
- Construire un autre test set, nommé PreconditioningB. Tous les paramètres d’essai devraient être identiques à ceux tel que mentionné dans l’étape précédente, à l’exception que la fréquence de sortie d’image est définie sur 15 Hzet aucun précharge n’est appliquée.
- Après le protocole de préconditionnement, créer des protocoles d’essai afin que le tissu est chargé à la tension de membrane de pointe dans les rapports suivants de chargement circonférentielle-à-radial à un taux de chargement de 4.42 N/min : 1:1, 0.75:1, 1:0.75, 0.5:1 et 1:0.5 (Figure 6 ). Récupérer les données des deux derniers cycles de chaque rapport de chargement pour traitement ultérieur de données et les analyses visées à l’article 10. Référer au tableau 1 pour une description détaillée des protocoles à établir.
- Préparer un protocole d’analyse contrôlées par déplacement à un taux de chargement de 4.42 N/min comme suit. (i) biaxiale qui s’étend dans la direction X et l’axe Y les déplacements associés avec les tronçons circonférentielles et radiales de pointe, respectivement (Figure 7 a). (ii) Pure de cisaillement le long de l’axe X — qui s’étend dans la direction X associée à l’étirement circonférentielle de pic et raccourcissement dans la direction Y, tout en gardant la zone pointillée constante sous déformation (Figure 7 b). (iii) la contrainte uniaxiale qui s’étend le long de l’axe X (Figure 7 c). (iv) Pure de cisaillement le long de l’axe Y (Figure 7D). (v) la contrainte uniaxiale qui s’étend le long de l’axe Y (Figure 7e).
- Entre chacune de ces étapes, construire un repos « cycle » de 1 min qui maintient le tissu à la configuration d’origine montée. Récupérer les données des deux derniers cycles de chaque rapport de charge pour le traitement des données et des analyses (article 9). Reportez-vous au tableau 2 pour obtenir une description détaillée des protocoles à établir.
- Élaboration d’un protocole de relaxation stress afin que le tissu est chargé dans chaque direction, à un taux de charge de 4.42 tr/min, pour les déplacements liés à des tensions de membrane de crête (étape 7.2) et qui s’est tenue à ce déplacement pendant 15 min (Figure 8 et Figure 9). Après 15 min, le protocole doit être défini pour récupérer le tissu à sa configuration de montage original.
Remarque : Dans le cas de tissus larmoiement, abandonner le test immédiatement afin d’éviter tous dommages éventuels causés au système essai biaxial.
8. fixation du tissu pour l’analyse de l’histologie
- Démontez le tissu de la système d’essai biaxial. Placez le tissu dans un récipient rempli de formol 10 % et ensuite placer le contenant dans un milieu réfrigéré à 4 ° c environ. Fixer le tissu pendant 24 à 48 h, selon l’épaisseur du tissu.
Attention : Le formol est un carcinogène connu et, s’il est respiré, un excès peut provoquer des poumons se fixe. Tous les travaux avec formol doivent être effectuée sous une hotte avec une ventilation adéquate. - Après que le tissu a été corrigé dans du formol pendant 24 à 48 h, transférer le tissu dans une solution d’éthanol 80 % pour l’histologie plus tard. Le tissu doit être conservé en solution dans un milieu réfrigéré à 4 ° C.
Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Une fois que les tissus sont fixés, les spécimens peuvent être analysés à tout moment. Si le protocole est en pause, stocker le tissu dans un contenant étiqueté rempli à 80 % d’éthanol et entreposer le contenant au réfrigérateur à 4 ° C environ (comme il est expliqué dans l’étape 8.2). - Préparer le tissu pour l’analyse de l’histologie commerciale selon les instructions du fournisseur. Si un certain constituant de dépliant, comme le collagène, l’élastine, glycosaminoglycanes, etc., est d’un intérêt de l’étude, veiller à ce que la tache de l’histologie appropriée est employée.
NOTE : Diapositives de l’histologie peuvent être visualisés en utilisant un microscope pour observer des constituants désirées (Figure 10). - En utilisant le programme ImageJ de traitement d’image, effectuer des méthodes de déconvolution des couleurs pour déterminer la proportion de chaque constituant tachée dans le tissu. Pour plus de détails sur ces procédures, veuillez consulter Ruifrok et Johnston24.
9. biaxiales données tests, procédures de post-traitement
- Effectuer le suivi des DIC-basé sur les quatre marqueurs fiducial à partir des images prises au cours de la mécanique biaxial stable (Figure 11) afin de déterminer les positions des marqueurs temporels.
(2)- Si on désire effectuer l’analyse en ce qui concerne la configuration de montage, soit Xj’ai les positions de marqueur dans l’état non déformée au début de l’essai biaxiale. Si on désire effectuer l’analyse en ce qui concerne la déformation après préconditionnement, soit Xj’ai les positions du marqueur à la fin du protocole de préconditionnement.
Remarque : Les étapes suivantes seront dérouleront de la même manière, quelle que soit la configuration de référence choisie.
NOTE : Ici, XI et xj’ai sont les positions non déformées et déformées des marqueurs, respectivement, et dj’ai est le vecteur de déplacement de chaque marqueur.
- Si on désire effectuer l’analyse en ce qui concerne la configuration de montage, soit Xj’ai les positions de marqueur dans l’état non déformée au début de l’essai biaxiale. Si on désire effectuer l’analyse en ce qui concerne la déformation après préconditionnement, soit Xj’ai les positions du marqueur à la fin du protocole de préconditionnement.
- Calculer le gradient de déformation (F) des marqueurs fiducial en utilisant un quatre nœuds bilinéaire par éléments finis de23,2,25.
(3)
NOTE : Ici, de BxIet ByIsont les dérivées de fonction shape par éléments finis dans les directions X et Y pour nœud I, respectivement et uI(t) et vI( t) sont dépendantes du temps X - et Y-déplacements, respectivement, comme précédemment déterminé à l’étape 9.1. Notez que les coordonnées X et Y correspondent aux directions circonférentielles et radiales du tissu. - Calculer le tenseur de déformation de Cauchy – vert (C) de droit et le tenseur de déformation vert (E).
(4)
NOTE : Ici, j’ai est le tenseur identité de second ordre. Déterminer que la circonférentielles et radiales s’étend en prenant la racine carrée des valeurs principe de C. - Déterminer la première Piola-Kirchhoff (1er-PK) tenseur (P).
(5)
NOTE : Ici, l est l’épaisseur de l’échantillon, et T,C et TR sont les tensions membranaires appliquées dans les directions circonférentielles et radiales, respectivement. - En outre, calculer les autres tenseurs contrainte, tels que le tenseur des contraintes Cauchy (σ) et deuxième Piola-Kirchoff (2e-PK) tenseur (S).
(6)
NOTE : Ici, J est la jacobienne du tenseur gradient de déformation F.
(2)
(3)
(4)
(5)
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Representative Results
Données de stress-étirement de la force contrôlée biaxial essais mécaniques révèlent une courbe non linéaire avec quelque ressemblance d’une courbe exponentielle (Figure 12). Au sujet de la réponse dans chaque direction principale, le comportement du matériau est isotrope transverse, avec le tronçon radial supérieur à la déformation circonférentielle. Dans certains cas, les directions de l’anisotropie peuvent retourner, avec la direction circonférentielle présentant une plus grande conformité à la direction radiale. Cette réponse retournée est observée dans la télé plus souvent que dans le MV.
De déplacement contrôlé testing, stress-stretch données suit une réponse non linéaire pour la direction principale en cours de tension (cisaillement pur, contrainte uniaxiale [Figure 13]). Lorsque le tissu raccourcit dans l’autre sens principal, un « stress négatif (compression) » est observé. Dans le protocole de contrainte uniaxiale, il présente aussi une réaction de stress-stretch croissante dans le sens limité, démontrant l’accouplement de l’étirement appliqué dans l’autre sens principal.
Des tests de stress-relaxation, normalisé membrane tension-temps données suit une courbe non linéaire en décomposition (Figure 14a, b). Le MV et TV dépliant tissus présentent une plus grande réduction du stress dans le sens radial par rapport à celle dans la direction circonférentielle.
Les résultats histologiques représentatifs du feuillet antérieur de la valve mitrale (MVAL) et tissus de foliole antérieur (TVAL) de la valve tricuspide par Masson de trichrome sont présentés à la Figure 10. Coloration trichrome de Masson montre typiques constituants trouvés dans les valvules auriculo-ventriculaire, tels que les fibres de collagène (bleu) et des cellules interstitielles valvulaires (cytoplasme rouge et noirs noyaux). Autres taches permet de visualiser les constituants comme l’élastine (Verhoeff-van Gieson tache) et de glycosaminoglycanes (bleu Alcian tache).
Figure 1 : photos expérimentales des coeurs de porc provient d’un abattoir local. (un) A tout coeur est rincé de sang avec une solution de PBS. (b), une coupe est opérée entre les oreillettes et les ventricules de révéler les deux les valves mitrale et tricuspides. (c) les caillots de sang sont ensuite éliminés du cœur avant du ranger. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : photos expérimentales du cœur porcin ouvert révélant les cinq auriculo-ventriculaire du coeur valve dépliants et autres composants de l’appareil de la vanne. (a) la valve mitrale avec la dissection du cœur gauche le long de la commissure entre les deux feuillets, montrant la foliole antérieure (MVAL) et feuillet postérieur (MVPL) et (b) de la valve tricuspide avec une dissection similaire sur le côté droit de coeur, révélant la foliole antérieure (TVAL), feuillet postérieur (TVPL) et du feuillet septal (compétition). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : photos expérimentales de la brochure excisée en préparation pour le test mécanique biaxial. Coeur valve dépliant test exige (a) la notice en vrac région test sectionnées en (b) un 10 mm x 10 mm (sens radial notée par marqueurs stylo chirurgicale). (c) la brochure l’épaisseur est mesurée. Spécimens sont montés à (d) le biaxial système d’essai de (e) piercing le tissu à dents métalliques. Après le montage, les marqueurs fiducial (f) sont collées sur la surface du tissu avant (g) l’immersion dans une solution de PBS à 37 ° C. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : exemple paramètres de protocole pour les essais préconditionnement d’un tract de valve mitrale antérieure d’un 7,5 x 7,5 mm test région. Le protocole préconditionnement est créé par le test mode de commande et force dans l’axe des abscisses, les conditions de (c) la précharge, les paramètres (d), l’axe des y d’être les mêmes que dans l’axe des abscisses, la définition (a) du protocole de nom, (b) et (e. ) les paramètres de cycle. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : exemple paramètres de protocole pour l’étape de synchronisation pour un dépliant antérieur de la valve mitrale d’un 7,5 x 7,5 mm test région. L’étape de synchronisation requiert (un) se déplaçant le tissu de la déformation après préconditionnement à la tension de membrane de crête (et de la déformation de pic correspondant) tout en commençant en même temps un chronomètre pour enregistrer l’heure d’étirement. Lorsque la force de la cible est atteinte, (b) la déformation après préconditionnement est enregistré. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : schématique de la force contrôlée biaxial procédure d’essai pour l’essai mitrale et feuillets de la valve tricuspide. Le protocole d’essai se compose d’un chargement d’equibiaxial préconditionnement étape pour exercer le tissu à son état in vivo, suivie de divers taux de chargement de la tension de membrane de pointe dans chaque direction de tissu (Tx:Ty) : 1:1, 0.75:1, 1:0.75, 0.5:1 et 1 : 0. 5. Chaque paragraphe du protocole test force contrôlée est effectuée pendant 10 cycles de chargement/déchargement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : schéma du déplacement contrôlé biaxial procédure d’essai pour l’essai mitrale et feuillets de la valve tricuspide. Le protocole d’analyse se compose de (un) biaxiales déplacements liés à des tensions de crête membrane, cisaillement pur (b) dans la direction X, (c) contrainte uniaxiale déplacement dans la direction X, cisaillement pur (d) dans le Axe Y et (e) contraint uniaxiale déplacement dans la direction Y. Chaque paragraphe du protocole de test contrôlé par déplacement est effectué pendant 10 cycles de chargement/déchargement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : paramètres de test de stress-relaxation exemple pour un dépliant antérieur de la valve mitrale avec une zone de test efficace de 7,5 x 7,5 mm. Test des paramètres définis pour la relaxation stress testing pour un dépliant antérieur de la valve mitrale où déplacement ciblé est la déformation de tissus de pointe spécifique à ce tissu. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 9 : schéma de la 15 min stress-relaxation procédure d’essai pour l’essai mitrale et les feuillets de la valve tricuspide. Le protocole d’analyse consiste à tenir biaxiales déplacements associés à des tensions de membrane de crête pendant 15 min, après quoi le tissu est revenu à la configuration de montage. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 10 : exemple de données histologiques de tracts antérieure des valves cardiaques auriculo-ventriculaire. Images d’histologie représentatif de (a) la valve mitrale antérieure dépliant et (b) le feuillet postérieur de la valve tricuspide. Les deux sont souillées avec coloration trichrome de Masson, un : collagène en bleu, cytoplasme et kératine en rouge et en noir de noyaux. La barre d’échelle = 200 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 11 : images représentatives illustrant le suivi des coordonnées de quatre marqueurs fiducial pendant le test mécanique biaxial en utilisant une données image technique de corrélation (DIC). (a) le tissu configuration de montage. (b) la configuration après l’étape de préconditionnement. (c) la configuration déformée associée à l’échantillon de tissus soumis à des charges mécaniques. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 12 : données représentatives des protocoles force contrôlée pour le feuillet antérieur de la valve mitrale (MVAL). Des données représentatives démontrent l’anisotropie du matériau et la réponse de déformation non linéaire des tissus sous chargement biaxiale à différents taux de chargement de la tension de membrane de crête dans chaque direction de tissu (Tx:Ty) : (a) 1:1, (b) 0.75:1, (c) 1:0.75, 0.5:1 (d) et (e) 1 : 0. 5. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 13 : données représentatives des protocoles déplacement contrôlé pour le feuillet antérieur de la valve mitrale (MVAL). Des données représentatives illustre l’anisotropie du matériau et la réponse de déformation non linéaire des tissus au cours de (un) biaxiales déplacements liés à des tensions de crête membrane, cisaillement pur (b) dans la direction X, (c) contrainte uniaxiale déplacement dans la direction X, cisaillement pur (d) sur l’axe Y, et (e) contrainte uniaxiale déplacement dans la direction Y. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 14 : données représentatives des protocoles relaxation à l’effort pour la mitrale et tricuspide valve antérieures dépliants. Des données représentatives pour (a) le MVAL et (b) la TVAL, illustrant la réduction du stress exponentielle au fil du temps. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Nom du jeu | Axe des abscisses | Axe y | Tronçon (s) | Cale (s) | Récupérer le (s) | Repos (s) | XPreload (mN) | YPreload (mN) | Reps | Données (Hz) | Image (Hz) | |
| FirstImage | Étape 0,0 (mN) | Étape 0,0 (mN) | 1 | 0 | 1 | 0 | 0,0 (première) | 0,0 (première) | 1 | 1 | 1 | |
| PreconditioningA | Étape F (mN) | Étape F (mN) | t | 0 | t | 0 | 0.025*F (premier) | 0.025*F (premier) | 8 | 15 | 0 | |
| PreconditioningB | Étape F (mN) | Étape F (mN) | t | 0 | t | 0 | Aucun | Aucun | 2 | 15 | 15 | |
| 1:1A | Étape F (mN) | Étape F (mN) | t | 0 | t | 0 | Aucun | Aucun | 10 | 15 | 0 | |
| 1:1B | Étape F (mN) | Étape F (mN) | t | 0 | t | 0 | Aucun | Aucun | 2 | 15 | 15 | |
| 0.75:1A | Étape (0.75*F) (mN) | Étape F (mN) | t | 0 | t | 0 | Aucun | Aucun | 10 | 15 | 0 | |
| 0.75:1B | Étape (0.75*F) (mN) | Étape F (mN) | t | 0 | t | 0 | Aucun | Aucun | 2 | 15 | 15 | |
| 1:0.75A | Étape F (mN) | Étape (0.75*F) (mN) | t | 0 | t | 0 | Aucun | Aucun | 10 | 15 | 0 | |
| 1:0.75B | Étape F (mN) | Étape (0.75*F) (mN) | t | 0 | t | 0 | Aucun | Aucun | 2 | 15 | 15 | |
| 0.5:1A | Étape (0,5 *F) (mN) | Étape F (mN) | t | 0 | t | 0 | Aucun | Aucun | 10 | 15 | 0 | |
| 0.5:1B | Étape (0,5 *F) (mN) | Étape F (mN) | t | 0 | t | 0 | Aucun | Aucun | 2 | 15 | 15 | |
| 1:0.5A | Étape F (mN) | Étape (0,5 *F) (mN) | t | 0 | t | 0 | Aucun | Aucun | 10 | 15 | 0 | |
| 1:0.5B | Étape F (mN) | Étape (0,5 *F) (mN) | t | 0 | t | 0 | Aucun | Aucun | 2 | 15 | 15 | |
Tableau 1 : test complet paramètres pour tous les protocoles du régime contrôlé par force test. Forces (en millinewtons) sont écrits comme F pour représenter la force associée à la tension de membrane de crête ciblées. Stretch temps s’écrit t pour représenter le temps extensible (en secondes) spécifique au tissu mis à l’essai.
| Axe des abscisses | Axe y | Tronçon (s) | Cale (s) | Récupérer le (s) | Repos (s) | XPreload (mN) | YPreload (mN) | Reps | Données (Hz) | Image (Hz) |
| Étape 0,0 (mN) | Étape 0,0 (mN) | 1 | 0 | 1 | 0 | 0,0 (première) | 0,0 (première) | 1 | 1 | 1 |
| Rampe dx (%) | Rampe dy (%) | t | 0 | t | 0 | 0.025*F (premier) | 0.025*F (premier) | 10 | 15 | 0 |
| Rampe dx (%) | Rampe dy (%) | t | 0 | t | 0 | Aucun | Aucun | 2 | 15 | 15 |
| Rampe 0,0 (%) | Rampe 0,0 (%) | 0 | 0 | 0 | 60 | Aucun | Aucun | 1 | 15 | 0 |
| Rampe dx (%) | Rampe 1 /dy (%) | t | 0 | t | 0 | Aucun | Aucun | 10 | 15 | 0 |
| Rampe dx (%) | Rampe 1 /dy (%) | t | 0 | t | 0 | Aucun | Aucun | 2 | 15 | 15 |
| Rampe 0,0 (%) | Rampe 0,0 (%) | 0 | 0 | 0 | 60 | Aucun | Aucun | 1 | 15 | 0 |
| Rampe 1 /dx (%) | Rampe dy (%) | t | 0 | t | 0 | Aucun | Aucun | 10 | 15 | 0 |
| Rampe 1 /dx (%) | Rampe dy (%) | t | 0 | t | 0 | Aucun | Aucun | 2 | 15 | 15 |
| Rampe 0,0 (%) | Rampe 0,0 (%) | 0 | 0 | 0 | 60 | Aucun | Aucun | 1 | 15 | 0 |
| Rampe dx (%) | Rampe 0,0 (%) | t | 0 | t | 0 | Aucun | Aucun | 10 | 15 | 0 |
| Rampe dx (%) | Rampe 0,0 (%) | t | 0 | t | 0 | Aucun | Aucun | 2 | 15 | 15 |
| Rampe 0,0 (%) | Rampe 0,0 (%) | 0 | 0 | 0 | 60 | Aucun | Aucun | 1 | 15 | 0 |
| Rampe 0,0 (%) | Rampe dy (%) | t | 0 | t | 0 | Aucun | Aucun | 10 | 15 | 0 |
| Rampe 0,0 (%) | Rampe dy (%) | t | 0 | t | 0 | Aucun | Aucun | 2 | 15 | 15 |
Tableau 2 : test complet paramètres pour tous les protocoles du régime test déplacement contrôlé. Les déplacements (en pourcentages) sont écrits comme dx et dy représenter le pic après préconditionnement allongement en pourcentage dans les directions X et Y, respectivement. Stretch temps s’écrit t pour représenter le temps extensible (en secondes) spécifique au tissu mis à l’essai. Abréviations : PS = cisaillement pur ; CU = contrainte uniaxiale.
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Discussion
Les étapes essentielles pour ce test mécanique biaxial comprennent (i) l’orientation correcte de la notice, (ii) bon testeur biaxial installation pour négligeable au cisaillement et (iii) une application minutieuse des marqueurs fiducial. L’orientation de cette brochure est cruciale pour la caractérisation mécanique obtenue du tissu dépliant car le matériau est anisotrope dans la nature. Ainsi, les directions radiales et circonférentielles doivent s’appeler pour aligner correctement les échantillons de tissus avec le test X - et Y-directions. Il est également essentiel que le testeur biaxial est calibré correctement afin que le spécimen est fixé au système avec négligeable la contrainte de cisaillement introduite. Si on observe une quantité non négligeable de cisaillement, les résultats peuvent grandement erronées dans les calculs de déformation et contrainte tissu ultérieures. Une attention particulière est nécessaire à l’application des quatre marqueurs fiducial pour s’assurer qu’aucun des marqueurs collent aux autres pour éviter des calculs inexacts des souches de tissu. En ce qui concerne les calculs de déformation des tissus, les lecteurs intéressés sont désignés les procédures précisées aux précédentes études2,23,25.
Quelques modifications qui pourraient être apportées aux protocoles actuels comprennent l’ajout des taux de déformation et tests à l’infrastructure de test de fluage. Ces tests permettent d’aperçu des propriétés viscoélastiques différent du dépliant aortique valve (AVS), mais il a été démontré dans la littérature antérieure que le taux de déformation et de fluage sont insignifiants pour tissus de dépliant valve cardiaque sous physiologiquement conditions de fonctionnement.
Limitations de cette méthode incluent la possibilité d’introduction de cisaillement dans le cas d’un mauvais alignement plan du spécimen et collé des marqueurs fiducial qui invalident les données, comme mentionné précédemment. Autres limitations de cette méthode incluent l’utilisation de tiges de spécimen de montage, comme le spécimen n’est contrôlé que par cinq points sur chaque bord, plutôt que d’un serrage complet à bords de modèle de contrôle. L’utilisation de tiges par rapport aux méthodes serrage entraîne des problèmes d’avec les protocoles d’essais uniaxiaux telle que les dents peuvent permettre de petites déformations malgré le déplacement de la tige en bout attaché au système test biaxial étant constante. Toutefois, cette déformation du mouvement tine individuels peut supposer négligeable.
Cette méthode est significative dans ses avantages par rapport aux autres méthodes, parce que tous les protocoles d’analyse (contrôlée par force, déplacement contrôlé et stress-relaxation) sont effectuées dans un échantillon de tissu unifié. Des solutions de rechange à la méthodologie présentée peuvent uniquement exécuter un protocole d’essai pour chacun des tissus, plutôt que de trois combinés des protocoles d’essai. Cela implique que ces alternatives ne peuvent pas être aussi précis dans leur description des comportements de tissus, comme les propriétés des tissus peuvent varier considérablement entre les tissus de différentes matières animales.
Cette méthode peut être étendue par application à d’autres matériaux sans compter que les folioles de valve cardiaque auriculo-ventriculaire. Par exemple, ces méthodes peuvent être utiles pour la caractérisation des autres tissus mous, ou les matériaux polymères/caoutchouc-type. Dispensé régime constituerait pour la caractérisation complète de tout ce matériel compatible avec un appareil biaxial, condition une installation adéquate, par exemple une capacité de charge-cellule appropriée et la taille de l’échantillon.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par l’American Heart Association scientifique Development Grant 16SDG27760143. Les auteurs aimerait également remercier la bourse de recherche de bureau de recherche de l’Université de l’Oklahoma, de premier cycle pour support Colton Ross et Devin Laurence tutoré.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Formalin Solution, Neutral Bufffered | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
| 40X-2500X LED Lab Trinocular Compound Microscope | AmScope | SKU: T120C | |
| BioTester - Biaxial Tester | CellScale Biomaterials Testing | 1.5N Load Cell Capacity | |
| ImageJ | National Institute of Health, Bethesda, MD | Version 1.8.0_112 | |
| LabJoy | CellScale Biomaterials Testing | Version 10.66 | |
| MATLAB | MathWorks | Version 2018b | |
| Phosphate-Buffered Saline | n/a | Recipe for 1L 1X PBS Solution: 8.0g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na2HPO4, 0.24g KH2PO4 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) | VWR International | H3515541105024 | Razord blades for tissue retrieval and preparation procedures |
References
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