이 방법은 모델 유기체 C. elegans의신체 벽 근육에서 발동 된 칼슘 과도 의 변화와 이미지 기준선 세포질 칼슘 수준에 광유전학 및 유전적으로 코딩 된 칼슘 센서를 결합하는 방법을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
모델 유기체 C. 예쁜꼬마선충은 생체 내 칼슘 이미징을 수행하는 우수한 시스템을 제공한다. 그것의 투명한 바디 및 유전 적 변형성은 유전으로 인코딩된 칼슘 센서의 표적으로 한 표현을 허용합니다. 이 프로토콜은 표적 세포, 특히 벌레의 신체 벽 근육에서 칼슘 역학의 생체 내 이미징을 위해 이러한 센서의 사용을 설명합니다. 시냅스 전 채널로도셉신의 공동 발현을 활용함으로써, 흥분성 운동 뉴런으로부터 아세틸콜린 방출의 자극은 청색광 펄스를 사용하여 유도될 수 있으며, 그 결과 근육 탈분극및 세포질 칼슘의 재현 가능한 변화 수준. 두 가지 웜 고정 기술은 다양한 난이도에 대해 논의합니다. 이러한 기술의 비교는 두 접근법모두 신경 근육 접합의 생리학을 보존하고 칼슘 과도의 재현 가능한 정량화를 허용한다는 것을 보여줍니다. 광유전학과 기능성 칼슘 이미징을 페어링함으로써, 후성 칼슘 취급 및 항상성의 변화는 다양한 돌연변이 배경에서 평가될 수 있다. 제시된 데이터는 고정 화 기술을 모두 검증하고 특히 C. elegans 사르코 (endo)플라스성 망상 칼슘 ATPase 및 신체 벽 근육 칼슘 조절에서 칼슘 활성화 BK 칼륨 채널의 역할을 검사합니다.
서론
이 논문은 광유전적 신경 자극을 사용하여 C. elegans 신체 벽 근육의 생체 내 칼슘 이미징 방법을 제시합니다. 유전적으로 발현된 근육과 청색광이 발동된 신경탈분극을 결합하고 자극된 후발성 칼슘 과도를 명확하게 관찰하는 시스템을 제공한다. 이것은 전기 자극의 사용을 피하고, 후나해 칼슘 역학에 영향을 미치는 돌연변이의 비침습적 분석을 허용합니다.
GCaMP와 같은 단일 형광포골 GECIs는 C-말단에서 의 N 말단 및 칼모둘린(CaM)에서 미오신 경변 키나아제의 M13 도메인에 융합된 단일 형광 단백질 분자를 사용합니다. 칼슘 결합시, 칼슘에 대한 높은 친화력을 가지는 CaM 도메인은 형광 강도 의 증가로 이어지는 형광 단백질의 후속 형태 변화를 유도하는 형태 변화를 겪습니다1. GCaMP 형광은 488 nm에서 흥분하여 473 nm의 유사한 여기 파장을 가진 채널로도셉신과 함께 사용하는 것이 부적절합니다. 따라서, 채널로도신 자극과 칼슘 측정을 결합하기 위해서는 GCaMP의 녹색 형광 단백질을 적색 형광 단백질, mRuby(RCaMP)로 대체할 필요가 있다. 채널로도프신의 해 운동 뉴런 발현과 함께, 표현된 근육 RCaMP를 사용하여, 동일한 동물
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프로토콜
1. 현미경 설치
- 형광 기능이있는 화합물 현미경을 사용합니다. 이 연구를 위해, 데이터는 여기를 위한 LED가 장착된 직립 현미경(재료표)에수집되었습니다.
- 신체 벽 근육의 형광 변화를 적절하게 시각화하려면 높은 배율 목표를 사용하십시오.
- 해부 제제의 경우, 60x NA 1.0 수분 침지목표(재료 표)를사용하십시오.
- 나노 비드를 사용하는 제제의 경우 60x NA 1.4 오일 침지목표(재료 표)를사용하십시오. 이 배율은 카메라 센서에 대한 근육의 충분한 해상도를 보장합니다.
- 현미경에 부착된 고감도 카메라를 사용하여 칼슘 수치의 급격한 변화를 추적하기 위해 높은 프레임 속도로 이미지를 캡처합니다. 이 연구에서는 Ca2+ 신호의 상승 시간이 수십 밀리초만큼 빠를 수 있는 100Hz에서 풀 프레임 이미징이 가능한 sCMOS시스템(재료 표)이있는 이미지입니다.
- 제조업체의지침(재료 표)에따라 ImageJ10에서 실행되는 마이크로 관리자 소프트웨어로 카메라 획득 및 LE....
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결과
이 기술은 칼슘 취급 또는 근육 탈분극에 영향을 미칠 것으로 생각되는 돌연변이의 변화를 평가했습니다. 기준선 형광 수준 및 형광 과도를 가시화하고 근육 내의 세포질 칼슘 및 칼슘 역학을 쉬게 하였다. 동물들이 망막의 성공적인 혼입을 보장하기 위해 적어도 3일 동안 모든 트랜스 망막에서 성장하여, 이어서 채널로도종신을 활성화시키는 것이중요하다(도 2A). 동물이 모든 트랜스 망막에 노출되지 않는 경우, 어떤 근육 칼슘 과도 트리거되지 않습니다(그림 2B). 이 동물은 여전히 기준선 세포질 칼슘 수준을 평가하기 위하여 이용될 수 있더라도, 칼슘에 있는 어떤 동적 변경든지 붙잡히지 않을 것입니다. 또한, 동물 또는 해부 건강에 대한 내부 통제로서, 동물은 청색광 자극에 따라 계약을 맺을 것입니다. 고정화를 위해.......
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토론
GEC는 C. elegans 신경생물학에 있는 강력한 공구입니다. 이전 연구는 다양한 자극 방법으로 감각 및 행동 반응을 포함한 뉴런과 근육 세포 모두에서 다양한 기능을 검사하기 위해 칼슘 이미징 기술을 활용했습니다. 일부 연구는 감각 ASH뉴런22,23에서 칼슘 과도를 유발하거나 인두 근육에서 칼슘 파를 유도하기 위해 화학 자극을 사용했다24. 또 다른 그룹은 기계적 자극을 이용하였고, 웜은 미세유체 칩에 보관되어 터치 수용체 뉴런에서 칼슘 반응을 조사하였다25. 아직도, 그 외는 둘 다 뉴런26 및 바디 벽 근육27에있는 칼슘 변화를 구상하기 위하여 전기 자극을 채택했습니다. 이 연구 결과 사이에서 일반적인 것은 칼슘 과도를 시작하기 위.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
저자는 ZX1659에 대한 박사 알렉산더 고트샬크, RCaMP 및 웜 균주를 포함하는 channelrhodopsin, 슬로-1 (eg142) 웜 균주에 대한 김홍균 박사, 그리고 sca-1 (tm5339) 웜 균주에 대한 국가 생물 자원 프로젝트에 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| all-trans 망막 | Sigma-Aldrich | R2500 | 채널 로돕신 여기에 필요 |
| 호박색 LED | RCaMP 조명 | ||
| Arduino UNO | Mouser | 782-A000066 | 형광 조명 제어 |
| 청색 LED | 채널로돕신 조명 | ||
| BX51WI 현미경 | Olympus | 고정 상태 복합 현미경 | |
| 전류 제어 저잡음 선형 전원 공급 장치 | Ametek | Sorenson, | LED 강도 제어 |
| Igor Pro | Wavemetrics | Wavemetrics.com | 그래프 소프트웨어 |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov | 이미지 처리 소프트웨어 |
| LUMFLN 60x 물 NA 1.4 | 올림푸스 | 침수 대물렌즈 해부 준비 | |
| Master-8 Stimulator | A.M.P.I | 이미지 획득 및 LED 조명용 마스터 타이머 | |
| Micro-Manager | micro-manager.org | 카메라 획득 및 LED 여기 제어 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | 스프레드시트 소프트웨어 | |
| pco.edge 4.2 CMOS 카메라 | pco. | 4.2 | 고속 카메라 |
| PlanApo N 60x 오일 NA 1.4 | 나 | 노비드 준비를 위한 | |
| Polybead microspheres | Polysciences, Inc. | 00876-15 | 웜 고정 |
| 고체 상태 스위치 | Sensata Technologies | Crydom CMX100D6 | LED 조명의 타이밍 제어 |
| 형질전환 변형, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] | Richmond Lab | SY1627 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele |
| Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] | Richmond Lab | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele | |
| Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] | Gottschalk Lab | ZX1659 | 흥분성 신경 채널 로돕신 및 체벽 근육 RCaMP 발현 웜 라인 |
참고문헌
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. G....
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재인쇄 및 허가
