Summary
Denne metode giver en måde at par optogenetics og genetisk kodet calcium sensorer til billede baseline cytosolisk calcium niveauer og ændringer i fremkaldte calcium transienter i kroppen væg muskler af model organismen C. elegans.
Abstract
Den model organisme C. elegans giver et fremragende system til at udføre in vivo calcium Imaging. Dens gennemsigtige krop og genetiske manipulerbarhed giver mulighed for målrettet ekspression af genetisk kodede calcium sensorer. Denne protokol skitserer brugen af disse sensorer til in vivo billeddannelse af calcium dynamik i målrettede celler, specifikt kroppens væg muskler af orme. Ved at udnytte Co-ekspression af præsynaptic channelrhodopsin, stimulering af acetylcholin frigivelse fra excitatoriske motor neuroner kan induceres ved hjælp af blå lys impulser, resulterer i muskel depolarisering og reproducerbare ændringer i cytoplasmisk calcium Niveauer. To orm immobilisering teknikker diskuteres med varierende sværhedsgrader. En sammenligning af disse teknikker viser, at begge metoder bevarer det neuromuskulære omvejnings fysiologi og muliggør reproducerbar kvantificering af calcium transienter. Ved parring optogenetics og funktionelle calcium Imaging, ændringer i post Synaptic calcium håndtering og homøostase kan evalueres i en række mutante baggrunde. Data præsenteret validerer både immobilisering teknikker og specifikt undersøger rollerne af C. elegans sarco (endo) plasmic retikulære calcium ATPase og Calcium-aktiverede BK kalium kanal i kroppen væg muskel calcium forordning.
Introduction
Dette papir præsenterer metoder til in vivo calcium Imaging af C. elegans kropsvæg muskler ved hjælp af optogenetisk neuronal stimulation. Parring af en muskel udtrykte genetisk kodet calcium indikator (GECI) med blåt lys udløst neuronal depolarisering og giver et system til klart at observere de fremkaldte postsynaptiske calcium transienter. Dette undgår brugen af elektrisk stimulation, tillader en ikke-invasiv analyse af mutanter påvirker den postsynaptiske calcium dynamik.
Enkelt-fluorophore GECIs, såsom GCaMP, bruger et enkelt fluorescerende protein molekyle smeltet til M13 domæne af myosin lyskæde kinase ved sin N-terminal ende og calmodulin (CaM) på C-Terminus. Ved calcium binding gennemgår CaM-domænet, som har en høj affinitet for calcium, en konformationel ændring, der inducerer en efterfølgende konformationel ændring i det fluorescerende protein, hvilket fører til en stigning i fluorescens intensitet1. GCaMP Fluorescens er spændt på 488 nm, hvilket gør det uegnet til at blive brugt i forbindelse med channelrhodopsin, som har en lignende excitation bølgelængde på 473 nm. Således, for at par calcium målinger med channelrhodopsin stimulation, det grønne fluorescerende protein af GCaMP skal udskiftes med et rødt fluorescerende protein, mRuby (RCaMP). Ved hjælp af musklen udtrykte RCaMP, i kombination med den kolinerge motor neuron ekspression af channelrhodopsin, tillader undersøgelser på ormen neuromuskulære Junction (NMJ) med samtidig brug af optogenetik og funktionel billeddannelse inden for samme dyr 2.
Brugen af channelrhodopsin omgår behovet for elektrisk stimulation til at depolarisere de neuromuskulære kryds af C. elegans, som kun kan opnås i dissekeret præparater, hvilket gør denne teknik både lettere at ansætte og mere præcis ved målretning af specifikke væv. For eksempel, channelrhodopsin er tidligere blevet brugt i C. elegans at reversibelt aktivere specifikke neuroner, fører til enten robust aktivering af excitatoriske eller hæmmende neuroner3,4. Brugen af lys-stimuleret depolarisering også omgår spørgsmålet om neuronal skade på grund af den direkte elektriske stimulation. Dette giver mulighed for at undersøge virkningerne af mange forskellige stimulerings protokoller, herunder vedvarende og gentagne stimuleringer, på postsynaptisk calcium dynamik4.
C. elegans ' gennemsigtige karakter gør den ideel til den funktionelle analyse af fluorescerende billeder. Men, når stimulere excitatoriske acetylcholin neuroner på NMJ, dyr forventes at reagere med en umiddelbar muskelsammentrækning4, gør immobilisering af orme kritisk i visualisering af diskrete calcium ændringer. Traditionelt er farmakologiske midler blevet brugt til at lamme dyrene. En sådan stof anvendes er levamisole, en kolinerge acetylcholin receptor agonist5,6,7. Da levamisol fører til vedvarende aktivering af en under type af excitatoriske muskel receptorer, er dette reagens uegnet til studiet af muskel calcium dynamikken. Virkningen af levamisol inducerer postsynaptisk depolarisering, opløstende cytosolisk calcium, og occherunder observationer efter præsynaptisk stimulation. For at undgå brug af paralyserende lægemidler, vi undersøgte to alternative metoder til at immobilisere C. elegans. Dyr blev enten limet ned og derefter dissekeret åben for at udsætte kroppen væg muskler, svarende til den eksisterende C. elegans nmj Elektrofysiologi metode8, eller nanobeads blev brugt til at imprere intakte dyr9. Begge procedurer tilladt for reproducerbare målinger af hvile og fremkaldte muskel calcium transienter, der var let kvantificerbare.
Metoderne i dette papir kan bruges til at måle baseline cytosolisk calcium niveauer og transienter i postsynaptiske kropsvæg muskelceller i C. elegans. Eksempler på data, der anvender de to forskellige immobilisering teknikker er givet. Begge teknikker drage fordel af optogenetics at depolarisere muskelcellerne uden brug af elektrisk stimulation. Disse eksempler demonstrere gennemførligheden af denne metode i vurderingen af mutationer, der påvirker postsynaptisk calcium håndtering i orme og påpege fordele og ulemper ved de to immobilisering tilgange.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. opsætning af mikroskop
- Brug et sammensat mikroskop med fluorescens egenskaber. Til denne undersøgelse blev data indsamlet på et oprejst mikroskop (tabel over materialer) udstyret med lysdioder til excitation.
- For at kunne visualisere fluorescens ændringer korrekt i kropsvæv muskler, brug en høj forstørrelse mål.
- For dissekeret præparater, brug en 60x NA 1,0 vand nedsænkning mål (tabel over materialer).
- For præparater, der bruger nanobeads, skal du bruge en 60x NA 1,4 olie nedsænkning mål (tabel over materialer). Denne forstørrelse sikrer tilstrækkelig opløsning af musklerne på kamerasensoren.
- Brug et Højfølsom kamera, der er fastgjort til mikroskopet, til at optage billeder med en høj billedhastighed for at spore hurtige ændringer i calciumniveauerne. Til denne undersøgelse, billede med en sCMOS system (tabel over materialer) i stand til fuld frame imaging på 100 Hz, som Rise gange for ca2 + signaler kan være så hurtigt som snesevis af millisekunder.
- Kontrol kamera erhvervelse og LED fluorescens excitation med en Micro-Manager software, der kører i ImageJ10 i henhold til producentens anvisninger (tabel over materialer).
- Brug en open source elektronisk platform plugin, som forbinder en ekstern open-source microcontroller Board (tabel af materialer), til at styre den eksterne timing impulser til at styre fluorescens excitation.
Bemærk: digitale outs er tilgængelige fra digitale Pins 8 til 13, der giver output bits 0 til 5. Disse kan behandles som base 2-værdier på 1, 10, 100, osv. Indstillinger for seriel port er angivet i tabel 1 og kan findes på Micro Manager-webstedet (tabel over materialer). Firmware til microcontroller Board er ligeledes tilgængelig på denne hjemmeside. - For at styre tids logikken skal du aktivere Manager-anskaffelses protokollen i softwaren i henhold til producentens anvisninger (tabel over materialer).
Bemærk: dette initierer samtidig en forudindstillet kamera ramme varighed og antallet af rammer, der skal aktiveres, samt den logiske udløser og forudindstillede gule LED for fluorescens excitation. I dette tilfælde styres den gule LED solid state-switch af microcontroller bit 1-udgang gennem PIN 9. Kameraet rammer ud TTL (back Plate out 3 stik) udløser en stimulator. Dette præcist gange aktivering af det blå lys LED for aktivering af channelrhodopsin på et fastsat tidspunkt efter aktivering af Imaging sekvens. - For at stimulere channelrhodopsin med blåt lys og registrere RCaMP ændringer, bruge to lysdioder. Aktivér channelrhodopsin med en led med en peak emission bølgelængde på 470 nm og et båndpas filter (455 til 490 nm) og ophidse rcamp med en led med en peak emission bølgelængde på 594 nm og et båndpas filter (570 til 600 nm).
- For samtidig at aktivere channelrhodopsin og fange ændringer i rcamp fluorescerende niveauer, co-belyse begge lysdioder og sende lyset til den samme optiske vej ved hjælp af en koldtlysreflektorlamper stråle kombinatør.
- Styre timingen af LED-belysning med solid state switches (tabel over materialer) styres af TTL-signaler (maksimal nominel turn-on tid, 1 MS, turn-off tid 0,3 MS: 0 til 90% turn-on og slukke tid på < 100 μs).
- Indstil LED-intensiteten med de nuværende kontrollerede lavstøj lineære strømforsyninger (tabel over materialer).
- For at sikre den præcise timing af den blå lysdiode, aktiveres den direkte af TTL Pulse til solid-state Relay fra en stimulator. Program den blå lys stimulation protokol i en stimulator (tabel over materialer), der fungerer som en præcis timer fra starten af billedet erhvervelse til blå LED belysning. I dette eksperiment, tænde blå lys stimulation efter 2 s at fange RCaMP fluorescens kun og bruge et tog på 5, 2 MS blå lys pulser med 50 MS interpulse intervaller for at aktivere channelrhodopsin.
Bemærk: forsinkelsen før blåt lys pulserer, varigheden af den blå lys impulser, tiden mellem impulser, og antallet af impulser i toget kan alle indstilles på dette punkt og bør afspejle de specifikke parametre for eksperimentel interesse.
2. C. elegans prøveforberedelse og dataindsamling
- At optisk stimulere præsynaptiske neuroner, få dyr, som udtrykker channelrhodopsin i excitatoriske kolinerge neuroner, drevet med UNC-17 promotoren region, og rcamp udtrykt i alle kroppens vægmuskler drevet med MYO-3 promotoren region2.
Bemærk: det anbefales kun at bruge dyr med integrerede transgener og robuste niveauer af fluorescens, da variabel ekspression i de tilsvarende celletyper kan påvirke pålideligheden af dataindsamlingen. - Lav et arbejdslager af All-Trans retinal ved fortynding af det retinale pulver (tabel over materialer) i ethanol for at skabe en endelig koncentration på 100 mm og opbevares ved-20 °c. Denne arbejds bestand vil være stabil i ca. et år.
- Opret en bestand af OP50 E. coli, dyrket i lb medier, suppleret med All-Trans retinal fra arbejds bestanden lavet i trin 2,2, i en endelig koncentration på 80 μM. Den mængde, der anvendes til OP50 + nethinde bestanden, vil afhænge af det antal plader, der er nødvendige for forsøget.
- NGM-plader (Seed fyrretræsnematoden Growth Media) med ca. 300 μL af OP50 + retinal bestanden og lad pladerne tørre natten over ved stuetemperatur i mørket.
- Vokse C. elegans stammer til den ønskede alder i MØRKET på OP50 + RETINAL NGM plader ved 20 °c. Brug voksne orme til dette eksperiment.
- For eksperimentet ved hjælp af dissekeret forberedelse, kun bruge gravid voksne orme som udfører dissektion på yngre, mindre dyr er yderst udfordrende. Lad dyrene på OP50-retinal pladerne i mindst 3 dage for en effektiv channelrhodopsin aktivering.
- Hvis du bruger den dissekterede præparat8,11 (figur 1A), Udfør dissektionerne i svagt lys.
- Placer dyrene i en dissekere skål med en silikonebelagt dækseddel base, der er fyldt med en 1 mm ca2 + ekstracellulær opløsning sammensat af 150 mm NaCl, 5 mm KCl, 1 mm CaCl2,4mm mgcl2, 10 mm glucose, 5 mm saccharose og 15 mm Hepes (pH 7,3 ,-340 OSM).
- Lim ned dyr ved hjælp af flydende aktuel hud klæbemiddel med blå farve langs Rygsiden af ormen og gøre en lateral neglebånd indsnit langs lim/orm grænseflade ved hjælp af glas nåle.
- Brug en mund pipette til at rydde den indvendige indvolde fra orme hulen.
- Lim ned cutikel flap af dyret for at udsætte den ventrale mediale krop væg muskler til billeddannelse.
- Ved brug af nanobead-præparatet (figur 1B)
- Lav en smeltet 5% agopstået opløsning ved hjælp af ddH2O til en endelig volumen på 100 ml.
- Ved hjælp af en Pasteur-pipette skal du placere en dråbe smeltet agopatløsning på en glas rutsjebane og straks anbringe en anden glas rutsjebane over toppen, vinkelret på den første, ved hjælp af forsigtigt Tryk for at skabe en endnu agoprejst pad. Fjern det øverste dias før brug.
- Tilsæt ca. 4 μL polystyren nanobeads (tabel over materialer) til midten af agrose pad.
- I det lave lys skal du plukke 4-6 C. elegans ind i nanobead-opløsningen og sørge for, at dyrene ikke ligger oven på hinanden, og forsigtigt placere en dækseddel på toppen.
- Placer den forberedte slide eller dissektion skål på mikroskopet, og Find og Fokuser på en orm ved hjælp af 10x forstørrelse og Dim lyse felt belysning.
- Skift til 60x forstørrelse og rcamp fluorescens excitation at identificere en ventromedial kropsvæg muskel, der er forreste til vulva og i det korrekte brændfly.
Bemærk: musklerne forreste til vulva er valgt, da de afspejler muskler, der almindeligvis stimuleres i Elektrofysiologi eksperimenter. - Skift billed vejen fra okular til kameraet ved at trække ud af kontakten og klikke Live i dataindsamlingen software (tabel over materialer).
Bemærk: Sørg for, at den blå lys stimulationsvej er slukket på dette punkt for at sikre, at channelrhodopsin ikke bliver aktiveret, før du fanger billeder. - Fokuser billedet i dataindsamlings softwaren ved hjælp af mikroskopet fint fokus.
- Når musklen er klart i fokus, slukke for Live-billede ved at fjerne klikke på Live -knappen.
- Klik på knappen ROI i dataindsamlingen software og oprette en boks omkring musklen er fokuseret på.
- På stimulatoren skal du tænde for den blå lysstimulationsvej, der tidligere er programmeret i trin 1,10.
- Klik på Hent i billedbehandlings softwaren for at hente billedet via CMOS-kameraet. For at gøre dette, indstille eksponeringstid til 10 s med 1.000 frames og 2x Binning.
3. data analyse
- Åbn datafilen i billedbehandlings softwaren (tabel over materialer), og brug polygon værktøjettil at skitsere den muskel af interesse. Dette er ROI.
- Gå til billede | Stakke | Plot Z-akse profil og eksportere de resulterende datapunkter i regnearks softwaren (tabel over materialer). Denne funktion afbilde middelværdien for valg af ROI i forhold til tidspunktet.
- Flyt den muskel ROI, der er oprettet med polygon værktøjet uden for dyret, for at få en baggrunds fluorescens måling ved hjælp af trinene beskrevet i 3,2. Eksporter de resulterende data til regnearkets projektmappe.
- I regnearkets projektmappe trækkes baggrunds fluorescens værdier fra musklens fluorescens værdier på hvert tidspunkt. Dette giver baggrunden trukket fluorescerende signal.
- Gennemsnitlig baggrund fratrukket fluorescens for de første 2 s af datapunkter. Dette vil give den grundlæggende fluorescens måling, F.
- Brug den oprindelige fluorescens måling til at beregne det normaliserede fluorescens niveau ved hvert tidspunkt. Det kan du gøre ved at bruge ligningen (ΔF/F) + 1. ΔF repræsenterer (F (t)-F), hvor F (t) er fluorescens målingen på et givet tidspunkt, og F er den oprindelige værdi. + 1 tilføjes som en y-akse forskydning.
- Gentag trin 3.2-3.6 for hvert muskel billede, der indsamles. Ved hjælp af enkelt eller flere muskelceller per billede er på skøn af forskeren. N af eksperimentet kan bestemmes ved at udføre en effektanalyse.
- Brug de behandlede data fra trin 3.2-3.6 til at spore de fluorescerende værdier i graf-software i henhold til producentens anvisninger (tabel over materialer).
- Fra dette spor, måle kinetikken af calcium forbigående, såsom stigning til peak tid og halv forfald tid, ved hjælp af de værktøjer, der findes i grafen software som i henhold til producentens anvisninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne teknik evalueret ændringer i mutanter menes at påvirke calcium håndtering eller muskel depolarisering. Baseline fluorescens niveauer og fluorescerende transienter blev visualiseret og hvilende cytosolisk calcium og calcium kinetik i musklen blev evalueret. Det er vigtigt, at dyrene i mindst tre dage dyrkes på All-Trans-retinal for at sikre en vellykket inkorporering af retinal, hvorved channelrhodopsin (figur 2A) derefter aktiveres. Hvis dyrene ikke udsættes for alle Trans retinal, udløses der ikke forbigående muskel calcium (figur 2B). Selv om disse dyr stadig kan anvendes til at evaluere baseline cytosolisk calcium niveauer, vil eventuelle dynamiske ændringer i calcium ikke blive fanget. Desuden, som en intern kontrol for dyrs eller dissektion sundhed, dyret vil kontrakt efter blå lys stimulation. En optagelse med en muskelsammentrækning, der forårsager minimal grov bevægelse af ormen krop blev valgt til dataindsamling, når du bruger nanobeads for immobilisering. Hvis musklen bruges til at indsamle de rå fluorescens værdier kontrakter energisk, forårsager hele kroppen af ormen til at flytte, den forbigående spor vil afspejle denne bevægelse artefakt (figur 2C) og bør kasseres fra kvantificering.
En mutation kortlægning til SCA-1 gen locus blev isoleret fra en skærm for mutationer, der påvirker C. elegans muskel nicotinsyre receptor lokalisering. C. elegans SCA-1 gen koder den eneste ligner af sarco (endo) plasmic retikulære calcium ATPase (Serca) i ormen og er den eneste Serca pumpe til stede i kropsvæg muskler12,13. Tab-of-funktion SCA-1 mutanter blev forudsagt at udvise ændringer i muskel calcium håndtering baseret på den vigtige rolle Serca spiller i opretholdelsen af calcium homøostase i pattedyrs muskler14,15,16 ,17,18. Den GECI RCaMP blev udtrykt i kroppen væg muskler og den blå lys-aktiverede channelrhodopsin blev udtrykt i excitatoriske kolinerge neuroner til at evaluere både den intracellulære baseline calcium og calcium dynamik i SCA-1 mutanter. Med den dissekterede forberedelses teknik blev der observeret stigninger i de oprindelige niveauer af RCaMP-fluorescens i SCA-1- mutanten sammenlignet med kontrolelementet (figur 3A, B), hvilket tyder på, at tab af Serca-funktion fører til forhøjede niveauer af hvilende cytoplasmisk calcium. Når calcium dynamikken blev undersøgt, efter præsynaptisk stimulation udløst med et tog på 5, 2 MS blå lys pulser (figur 3C), var der et signifikant fald i Peak calcium niveauer i SCA-1 (tm5339) mutanter som sammenlignet med kontrol (figur 3D), som kan afspejle reducerede calcium lagre i SR. Men ingen ændring blev set i stigningen til peak tid eller den halve forfald tid (figur 3E, F). Dette tyder på, at fremkaldte ændringer i cytosolisk calcium fra enten ekstern kilde såsom calcium indgang gennem acetylcholin receptorer og/eller spændings-gated calcium kanaler samt fra interne butikker påvirkes ikke i SCA-1 (tm5339) mutanter . Lignende resultater kan observeres ved hjælp af nanobead-præparatet, som vist i figur 419. Denne rekapitulation af data giver bevis for, at begge disse teknikker er fysiologiske til måling af kropsvæg muskel hvilende cytoplasmatiske calcium niveauer samt observere stimuleret calcium transienter. Dette viser også, at dissektion af ormen ikke forårsager skade på dyret, der ændrer sin calcium håndtering eller evnen til at depolarisere postsynaptiske muskler.
Denne protokol kan også bruges til at undersøge mutanter, der indirekte påvirker calcium håndtering i C. elegans. Tab af funktion SLO-1 (eg142) mutanter blev evalueret for at påvise dette. SLO-1- genet koder en calcium-aktiveret BK kalium kanal, som udtrykkes i både neuroner og muskler20,21. Undersøgelser har tidligere beskrevet en rolle for SLO-1 i kroppen væg muskler, viser, at tab af funktion mutanter har en defekt i postsynaptisk repolarisering efter muskel action potentialer20,21. Mulige ændringer i baseline calcium niveauer og calcium forbigående dynamik på grund af denne hyperexcitabilitet blev undersøgt ved hjælp af nanobead immobilisering. Når baseline niveauer af RCaMP blev målt, SLO-1 (eg142) mutanter vises øge fluorescens i forhold til kontrollerne (figur 5A, B)19. Dette tyder på, at BK-kanaler også kan regulere baseline niveauer af cytosolisk calcium. Ingen ændringer i Peak calcium niveauer blev set i forhold til kontrol (figur 5C, D) ved vurdering af kinetikken af den fremkaldte calcium forbigående. Den SLO-1 (eg142) mutanter, dog udstillet en signifikant øget stigning til peak tid i forhold til kontrol (figur 5E). Dette kan afspejle en tidligere rapporteret stigning i præsynaptisk ophidelse20,21. Der var dog ingen signifikant ændring i den halve forfald tid i SLO-1 (eg142) mutanter i forhold til kontrol (figur 5F). Sammen, disse data viser, at denne metode kan bruges til at evaluere virkningerne af præ-og postsynaptiske mutationer på både hvilende og stimuleret krops væggen muskel calcium.
| Seriel indstilling | Værdi |
| Timeout for svar | 500 |
| Baudhastighed | 57600 |
| DelayBetweenCharsMs | 0 |
| Handshaking | Ud |
| Paritet | Ingen |
| Stoppbitar | 1 |
| Detaljeret | 0 |
Tabel 1: serielle portindstillinger for microcontroller plugin, som styrer en ekstern microcontroller Board. Dette bruges til at programmere eksterne timing impulser til at styre fluorescens excitation.
Figur 1: grafisk gengivelse af forskellige immobilisering teknikker. A) denne grafik viser dissektions teknikken for immobilisering. Kroppen af ormen er limet ned (blå) omkring dorsale side af dyret. En rygincision langs neglebånd genererer en neglebånd flap. Denne flap er blevet limet ned for at udsætte den intakte NMJs dannet mellem synapser af ventrale nerveledning i grøn (channelrhodopsin) og RCaMP udtrykker muskler i rødt. (B) denne grafik viser nanobead immobiliserings teknikken. Den intakte orm er omgivet af en repræsentation af nanobeads i opløsning, at når komprimeret af overliggende coverslip, immobilisere ormen. På grund af gennemsigtigheden af C. elegans, den ventrale nerveledning kan visualiseres i grøn (channelrhodopsin) og rcamp udtrykker muskler kan visualiseres i rødt. Den ægformede i midten af ormen repræsenterer vulva, som er et vartegn, der identificerer den ventrale krop væg muskler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentative spor af calcium transienter. A) single Trace-gengivelse af et calcium-forbigående fremkaldt af et tog på 5,5 MS blåt lys pulser ved 50 MS interpulse intervaller, registreret i et dyr med begrænset kropsbevægelse (-bevægelse) dyrket i nærværelse af All-Trans retinale (+ All- Trans retinal). Spike artefakter er den blå lys stimulation impulser, da begge lysdioder er co-belyst samtidigt. B) single Trace-gengivelse, der viser, at der ikke er et calcium-forbigående som reaktion på et tog på 5,5 MS blåt lys pulser med 50 MS interpulse intervaller i et dyr, der ikke har været udsat for All-Trans retinale (-All-Trans retinal ,-bevægelse). C) enkelt spor gengivelse af et calcium-forbigående, som er blevet fremkaldt af et tog på 5, 2 MS blåt lys pulser med 50 MS interpulse intervaller, registreret i et dyr, der havde signifikant muskelsammentrækning fører til bevægelse artefakter (+ bevægelse, + All-Trans -retinal). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: baseline calcium niveauer og fremkaldte calcium transienter fra kontrol og SCA-1 (tm5339) prøver tilberedt ved hjælp af dissektion teknik. A) repræsentative billeder af den oprindelige rcamp-fluorescens i SCA-1 (tm5339) mutanter og kontroller. Scale bar = 50 μm.B) kvantificering af fluorescens niveauer ved baseline i SCA-1 (tm5339) mutanter (n = 13) og kontrol (n = 9). C) ensemble gennemsnitlige spor af fremkaldte calcium transienter til SCA-1 (tm5339) mutanter og kontroldyr. D) kvantificering af peak rcamp fluorescens fra channelrhodopsin fremkaldte calcium respons i SCA-1 (tm5339) mutanter (n = 12) og kontrol (n = 9). E) kvantificering af stigningen i spidsbelastnings tiden for channelrhodopsin fremkaldte calcium transienter i SCA-1 (tm5339) mutanter (n = 12) og kontrol (n = 8). F) kvantificering af den halve henfalds tid for channelrhodopsin fremkaldte calcium transienter i SCA-1 (tm5339) mutanter (n = 12) og kontrol (n = 7). Statistisk signifikante værdier var: ikke signifikant p > 0,05, * p ≤ 0,05, * * p ≤ 0,01, * * * p ≤ 0,001. Fejllinjer repræsenterer Mean ± SEM. data blev normaliseret ved hjælp af Shapiro-Wilk tests og signifikans blev bestemt med en Mann-Whitney test for ikke-normale distributioner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: calcium niveauer i baseline og fremkaldte calcium transienter fra kontrol og SCA-1 (tm5339) prøver tilberedt med nanobead immobilisering. (A) repræsentative billeder af baseline fluorescens i SCA-1 (tm5339) mutanter og kontroller, skala stang 50 μm.B) kvantificering af det oprindelige rcamp-fluorescens niveau i SCA-1 (tm5339) mutanter (n = 14) og kontrol (n = 13) . C) gennemsnit af fremkaldte calcium transienter til SCA-1 (tm5339) mutanter og kontroller. D) kvantificering af peak rcamp fluorescens efter fremkaldt calcium respons i SCA-1 (tm5339) mutanter (n = 14) og kontrol (n = 13). E) kvantificering af stigningen i spidsbelastnings tiden for fremkaldte calcium transienter i SCA-1 (tm5339) mutanter (n = 14) og kontrol (n = 12). F) kvantificering af den halve henfalds tid for fremkaldte calcium transienter i SCA-1 (tm5339) mutanter (n = 14) og kontrol (n = 13). Figuren er tilpasset fra19. Statistisk signifikante værdier var: ikke signifikant p > 0,05, * p ≤ 0,05, * * p ≤ 0,01, * * * p ≤ 0,001. Fejllinjer viser Mean ± SEM. data normalitet blev vurderet ved hjælp af Shapiro-Wilk tests og signifikans blev bestemt med en Mann-Whitney test for ikke-normale distributioner. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra19. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: baseline calcium niveauer og fremkaldte calcium transienter fra kontrol og SLO-1 (eg142) prøver tilberedt ved hjælp af nanobeads immobilisering. (A) repræsentative billeder af baseline fluorescens i SLO-1 (eg142) mutanter og kontroller, skala stang 50 μm.B) kvantificering af det oprindelige rcamp-fluorescens niveau i SLO-1 (eg142) mutanter (n = 29) og kontrol (n = 13). C) gennemsnit af fremkaldte calcium transienter til SLO-1 (eg142) mutanter og kontrol. D) kvantificering af peak rcamp fluorescens efter fremkaldt calcium respons i SLO-1 (eg142) mutanter (n = 29) og kontrol (n = 13). E) kvantificering af stigningen i spidsbelastnings tiden for fremkaldte calcium transienter i SLO-1 (eg142) mutanter (n = 29) og kontrol (n = 13). F) kvantificering af den halve henfalds tid for fremkaldte calcium transienter i SLO-1 (eg142) mutanter (n = 11) og kontrol (n = 13). Figuren er tilpasset fra19. Statistisk signifikante værdier var: ikke signifikant p > 0,05, * p ≤ 0,05, * * p ≤ 0,01, * * * p ≤ 0,001. Fejllinjer viser Mean ± SEM. data normalitet blev vurderet ved hjælp af Shapiro-Wilk tests og signifikans blev bestemt med en Mann-Whitney test for ikke-normale distributioner. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra19. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GECIs er et kraftfuldt værktøj i C. elegans neurobiologi. Tidligere arbejde har udnyttet calcium Imaging teknikker til at undersøge en bred vifte af funktioner i både neuroner og muskelceller, herunder sensoriske og adfærdsmæssige reaktioner, med varierede metoder til stimulation. Nogle undersøgelser har brugt kemiske stimuli til at udløse calcium transienter i sensoriske aske neuroner22,23 eller til at fremkalde calcium bølger i faryngealt muskler24. En anden gruppe udnyttede mekanisk stimulation, mens orme blev afholdt i mikrofluidisk chips til at undersøge calcium respons i touch receptor neuroner25. Still, andre har ansat elektrisk stimulation til at visualisere calcium ændringer i både neuroner26 og kropsvæg muskler27. Hvad der er fælles mellem disse undersøgelser er kravet om eksterne stimuli, såsom løsninger eller udstyr, til at udløse calcium transienter. Den protokol, der er skitseret her kapitaliserer på kontrol opnået fra optogenetic stimulation, som giver neuronal specificitet, kombineret med den funktionelle analyse af muskel udtrykt GECIs2 i samme eksperimentelle paradigme.
To former for orm immobilisering er beskrevet, og mens hver metode bør evalueres, når der tages fat på eksperimentelle behov, både dissekeret og fysiologisk intakte præparater producere supplerende resultater gør det muligt for efterforskerne at bruge enten tilgang i deres forskning. Der er en øget teknisk udfordring at bruge dissektion teknik, med brugeren er forpligtet til at mestre både præcis brug af den kirurgiske lim og microdissektion uden at beskadige nerveledningen eller musklerne. Desuden, på grund af sværhedsgraden af dissektion, kun gravid voksne bør anvendes, som kan begrænse de eksperimentelle tidspunkter. Endvidere, dissektion teknik er også meget sværere at udføre på mutanter, der producerer små, tynde, eller syg dyr, igen muligvis begrænse eksperimentelle parametre. Fordelen ved denne teknik er, at det begrænser kroppen motion artefakt som følge af depolarisering, limning forhindrer overskydende bevægelse af ormen krop, og giver også adgang til NMJ for løsning ændringer og Drug applikationer. Derudover, hver præparat udsætter det samme område af ormen, som garanterer kroppen væg muskler vil være konsekvent i fokus. Den anden teknik, ved hjælp af nanobeads at immobilisere orme, er mindre involveret og kan hurtigt læres. Også, enhver alder dyr kan bruges med denne metode, giver mulighed for ændringer i calcium håndtering gennem udvikling, der skal overvåges. Der skal udvises forsigtighed, når ormene placeres i nanobead-opløsningen, da for megen manipulation af dyrene kan få dem til at sprænge. Desuden må dæksedlen ikke flyttes, når den er anbragt oven på dyrene, da det kan få dyrene til at rulle eller vride på sig selv, hvilket igen fører til skaden. Selvom brugen af nanobeads kan give en høj gennemløbs analyse, hvor dyrene potentielt kunne inddrives, er der ingen standardisering af dyrets kropsposition, og derfor kan hvert dyr ikke have krops vægmuskler i et klart brændfly. Hvis eksperimentet kræver et stort antal dyr, kan der være behov for forskellige metoder til immobilisering, såsom agar-baserede mikro-brønde, som giver mulighed for bulk calcium fluorescens Imaging28. Uanset begrænsningerne af disse to teknikker, enten kan udnyttes til at opnå pålidelige, let kvantificerbare calcium transienter inden for C. elegans kropsvæg muskler.
C. elegans giver mange fordele som et in vivo-system til de funktionelle billeddannelses studier. Dyrene er gennemsigtige, så parring af optogenetisk neuronal depolarisering gennem brug af channelrhodopsin med GECI RCaMP at måle de resulterende postsynaptiske calcium transienter i musklen. Præ-stimulation niveauer af rcamp fluorescens kan også anvendes til at vurdere baseline cytosolisk calcium niveauer. Den genetiske tracerbarhed af C. elegans gør studiet af nye mutationer, der kan påvirke calcium homøostase eller håndtering let at forfølge, ofte med let tilgængelige mutant alleler. Ved hjælp af de teknikker, der er skitseret i denne protokol, kan postsynaptiske calcium-imaging data opnås effektivt og til relativt lave omkostninger, hvilket gør dette til et attraktivt system for en bred vifte af billeddannelse eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Alexander Gottschalk for ZX1659, RCaMP og channelrhodopsin indeholdende orm stamme, Dr. Hongkyun Kim for SLO-1 (eg142) orm stamme, og det nationale Bioresource projekt for SCA-1 (tm5339) orm stamme.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| all-trans retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | Necessary for excitation of channel rhodopsin |
| Amber LED | RCaMP illumination | ||
| Arduino UNO | Mouser | 782-A000066 | Controls fluorescence illumination |
| Blue LED | channelrhodopsin illumination | ||
| BX51WI microscope | Olympus | Fixed state compound microscope | |
| Current controlled low noise linear power supply | Ametek | Sorenson | Controls LED intensity |
| Igor Pro | Wavemetrics | Wavemetrics.com | Graphing software |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov | Image processing software |
| LUMFLN 60x water NA 1.4 | Olympus | Water immersion objective for dissected preparation | |
| Master-8 Stimulator | A.M.P.I | Master timer for image acquisition and LED illumination | |
| Micro-Manager | micro-manager.org | Controls camera acquisition and LED excitiation | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| pco.edge 4.2 CMOS camera | pco. | 4.2 | High-speed camera |
| PlanApo N 60x oil NA 1.4 | Olympus | Oil immersion objective for nanobead preparation | |
| Polybead microspheres | Polysciences, Inc. | 00876-15 | For worm immobilization |
| solid state switches | Sensata Technologies | Crydom CMX100D6 | Controls timing of LED illumination |
| Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | SY1627 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele |
| Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele | |
| Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Gottschalk Lab | ZX1659 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line |
References
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).
- Nagel, G., et al. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Current Biology. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Liewald, J. F., et al.
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L.
- Lewis, J. A., et al. Cholinergic Receptor Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).
- Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature Neuroscience. 9, 791-798 (1999).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization. PLoS ONE. 8 (1), 1-6 (2013).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using umanager. Current Protocols in Molecular Biology. (Suppl 92), 1-17 (2010).
- Richmond, J. Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction. Journal of Visualized Experiments. (24), 1-4 (2009).
- Hoon Cho, J., Bandyopadhyay, J., Lee, J., Park, C. S., Ahnn, J. Two isoforms of sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) are essential in Caenorhabditis elegans. Gene. 261, 211-219 (2000).
- Zwaal, R. R., et al. The Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase Is Required for Development and Muscle Function in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (47), 43557-43563 (2001).
- Stammers, A. N., et al. The regulation of sarco(endo)plasmic reticulum calcium-ATPases (SERCA). Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93, 1-12 (2015).
- Clapham, D. E.
- Hovnanian, A. Serca pumps and human diseases. Calcium Signalling and Disease: Molecular Pathology of Calcium. , 337-363 (2007).
- Periasamy, M., Kalyanasundaram, A. SERCA pump isoforms: Their role in calcium transport and disease. Muscle and Nerve. 35 (4), 430-442 (2007).
- Gehlert, S., Bloch, W., Suhr, F. Ca2+-Dependent Regulations and Signaling in Skeletal Muscle: From Electro-Mechanical Coupling to Adaptation. International Journal of Molecular Sciences. 16, 1066-1095 (2015).
- Martin, A. A., Richmond, J. E. The sarco(endo)plasmic reticulum calcium ATPase SCA-1 regulates the Caenorhabditis elegans nicotinic acetylcholine receptor ACR-16. Cell Calcium. 72, 104-115 (2018).
- Wang, Z., Saifee, O., Nonet, M. L., Salkoff, L. SLO-1 Potassium Channels Control Quantal Content of Neurotransmitter Release at the C. elegans Neuromuscular Junction. Neuron. 32, 867-881 (2001).
- Abraham, L. S., Oh, H. J., Sancar, F., Richmond, J. E., Kim, H. An Alpha-Catulin Homologue Controls Neuromuscular Function through Localization of the Dystrophin Complex and BK Channels in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 6 (8), 1-13 (2010).
- Gourgou, E., Chronis, N. Chemically induced oxidative stress affects ASH neuronal function and behavior in C. elegans. Scientific Reports. 6, 1-9 (2016).
- Zahratka, J. A., Williams, P. D. E., Summers, P. J., Komuniecki, R. W., Bamber, B. A. Serotonin differentially modulates Ca2+ transients and depolarization in a C. elegans nociceptor. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1041-1050 (2015).
- Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26 (3), 583-594 (2000).
- Nekimken, A. L., et al. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. 17 (6), 1116-1127 (2017).
- Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (74), 1-9 (2013).
- Jospin, M., Jacquemond, V., Mariol, M. C., Ségalat, L., Allard, B. The L-type voltage-dependent Ca2+channel EGL-19 controls body wall muscle function in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 159 (2), 337-347 (2002).
- Wabnig, S., Liewald, J. F., Yu, S., Gottschalk, A. High-Throughput All-Optical Analysis of Synaptic Transmission and Synaptic Vesicle Recycling in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. , 1-26 (2015).
