Summary
Deze methode biedt een manier om te koppel optogenetics en genetisch gecodeerde calcium sensoren om beeld Baseline cytosolische calcium niveaus en veranderingen in opgeroepen calcium transiënten in het lichaam muur spieren van het modelorganisme C. elegans.
Abstract
Het modelorganisme C. elegans biedt een uitstekend systeem om in vivo calcium beeldvorming uit te voeren. Het transparante lichaam en de genetische manipulability zorgen voor de gerichte expressie van genetisch gecodeerde calcium sensoren. Dit protocol schetst het gebruik van deze sensoren voor de in vivo beeldvorming van de calcium dynamica in gerichte cellen, met name de lichaamsspieren van de wormen. Door gebruik te maken van de co-expressie van presynaptische channelrhodopsin, stimulatie van acetylcholine vrijlating van excitatory motorneuronen kan worden geïnduceerd met behulp van blauw lichtpulsen, resulterend in spier depolarisatie en reproduceerbare veranderingen in cytoplasmatische calcium Niveaus. Twee worm immobilisatie technieken worden besproken met verschillende moeilijkheidsgraden. Vergelijking van deze technieken toont aan dat beide benaderingen de Fysiologie van het neuromusculaire knooppunt behouden en de reproduceerbare kwantificering van calcium transiënten mogelijk maken. Door optogenetica en functionele calcium beeldvorming te koppelen, kunnen veranderingen in postsynaptische calcium behandeling en homeostase worden geëvalueerd in een verscheidenheid aan Mutante achtergronden. Gepresenteerde gegevens valideert zowel immobilisatie technieken en onderzoekt specifiek de rollen van de C. elegans Sarco (endo) plasmische Reculaire calcium ATPase en het calcium-geactiveerde BK kalium kanaal in de Body Wall muscle calcium regulatie.
Introduction
Dit document presenteert methoden voor in vivo calcium beeldvorming van C. elegans lichaam wand spieren met behulp van optogenetische neuronale stimulatie. Het koppelen van een spier uitgedrukt genetisch gecodeerde calcium indicator (GECI) met blauw licht veroorzaakte neuronale depolarisatie en biedt een systeem om de Evoked postsynaptisch calcium transiënten duidelijk te observeren. Dit vermijdt het gebruik van elektrische stimulatie, waardoor een niet-invasieve analyse van mutanten die de postsynaptische calcium dynamiek beïnvloeden.
Single-fluorophore GECIs, zoals GCaMP, maakt gebruik van een enkele fluorescerende proteïne molecuul gesmolten tot de M13 domein van myosin Light Chain kinase aan de N-Terminal einde en Calmoduline (CaM) op de C-Terminus. Bij calcium binding ondergaat het CaM-domein, dat een hoge affiniteit heeft met calcium, een conformationele verandering die een daaropvolgende conformationele verandering in het fluorescerende eiwit veroorzaakt, wat leidt tot een toename van de intensiteit van de fluorescentie1. GCaMP fluorescentie is opgewonden op 488 nm, waardoor het ongeschikt is om te worden gebruikt in combinatie met channelrhodopsin, die een vergelijkbare excitatie golflengte van 473 nm heeft. Daarom moet het groene fluorescerende eiwit van GCaMP worden vervangen door een rood fluorescerende proteïne, mRuby (RCaMP), om de calcium metingen met channelrhodopsine stimulatie te kunnen koppel. Met behulp van de spier uitgedrukt RCaMP, in combinatie met de cholinerge motorische neuron expressie van channelrhodopsin, maakt studies mogelijk op de worm neuromusculaire kruising (NMJ) met gelijktijdig gebruik van optogenetica en functionele beeldvorming binnen hetzelfde dier 2.
Het gebruik van channelrhodopsin omzeilt de noodzaak van de elektrische stimulatie om de neuromusculaire knooppunten van C. eleganste depolariseren, wat alleen kan worden bereikt in ontleed preparaten, waardoor deze techniek zowel eenvoudiger in gebruik en preciezer bij het targeten van specifieke weefsels. Bijvoorbeeld, channelrhodopsin is eerder gebruikt in C. elegans om reversibel activeren specifieke neuronen, leidt tot ofwel robuuste activering van excitatory of remmende neuronen3,4. Het gebruik van lichtgestimuleerde depolarisatie omzeilt ook de kwestie van neuronale schade als gevolg van de directe elektrische stimulatie. Dit biedt de mogelijkheid om de effecten van veel verschillende stimulatie protocollen, met inbegrip van aanhoudende en herhaalde stimulaties, op postsynaptisch calcium Dynamics4te onderzoeken.
Het transparante karakter van C. elegans maakt het ideaal voor de fluorescerende beeldvormende functionaalanalyse. Echter, bij het stimuleren van de excitatory acetylcholine neuronen op de NMJ, dieren worden verwacht te reageren met een onmiddellijke spiercontractie4, waardoor de immobilisatie van de wormen kritisch in het visualiseren van discrete calcium veranderingen. Traditioneel, farmacologische agenten zijn gebruikt voor het verlammen van de dieren. Een dergelijke drug gebruikt is Levamisole, een cholinerge acetylcholine receptor agonist5,6,7. Aangezien levamisol leidt tot de aanhoudende activering van een subtype van excitatory spier receptoren, is dit reagens ongeschikt voor de studie van de spier calcium dynamiek. De werking van levamisol induceert postsynaptische depolarisatie, verheffende het cytosolische calcium en occluderende waarnemingen na presynaptische stimulatie. Om het gebruik van verlamde drugs te voorkomen, we onderzochten twee alternatieve methoden om te immobiliseren C. elegans. Dieren werden ofwel gelijmd en vervolgens ontleed open om de lichaamsspieren bloot te stellen, vergelijkbaar met de bestaande C. elegans nmj elektrofysiologie methode8, of nano kralen werden gebruikt om intacte dieren te immobiliseren9. Beide procedures toegestaan voor de reproduceerbare metingen van de rust en Evoked spier calcium transiënten die gemakkelijk kwantificeerbaar waren.
De methoden in dit papier kunnen worden gebruikt om de baseline cytosolische calciumspiegels en transiënten in postsynaptisch Body Wall spiercellen in C. eleganste meten. Voorbeelden van gegevens met de twee verschillende immobilisatie technieken worden gegeven. Beide technieken maken gebruik van optogenetics om de spiercellen te depolariseren zonder het gebruik van elektrische stimulatie. Deze voorbeelden tonen de haalbaarheid van deze methode aan bij het evalueren van mutaties die de postsynaptische behandeling van calcium in de wormen beïnvloeden en wijzen op de voors en tegens van de twee immobilisatie benaderingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Microscoop-installatie
- Gebruik een samengestelde microscoop met fluorescentie mogelijkheden. Voor deze studie werden gegevens verzameld op een rechtopstaande Microscoop (tabel van materialen) uitgerust met led's voor excitatie.
- Om fluorescentie veranderingen in de spieren van het lichaam goed te visualiseren, gebruik een hoge vergroting doelstelling.
- Voor ontleed preparaten, gebruik een 60x NA 1,0 water onderdompeling doel (tabel van materialen).
- Voor preparaten die nano kralen gebruiken, gebruik maken van een 60x NA 1,4 olie onderdompeling objectief (tabel van materialen). Deze vergroting zorgt voor een voldoende resolutie van de spieren op de camerasensor.
- Gebruik een camera met hoge gevoeligheid die aan de Microscoop is bevestigd om beelden met een hoge beeldsnelheid vast te leggen om snelle veranderingen in calcium niveaus te kunnen volgen. Voor deze studie, beeld met een sCMOS systeem (tabel van de materialen) geschikt voor volledige beeldvorming op 100 Hz, als de opkomst tijden voor de CA2 + signalen kunnen zo snel als tientallen milliseconden.
- Bedien camera overname en LED fluorescentie excitatie met een Micro-Manager software die in ImageJ10 wordt uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant (tabel met materialen).
- Gebruik een open-source elektronische platform plugin, die een externe open-source microcontroller board (tafel van materialen) verbindt, om de externe timing pulsen te beheren om de fluorescentie excitatie te regelen.
Opmerking: digitale uitgangen zijn beschikbaar vanaf de digitale pinnen 8 tot en met 13 voor het leveren van output bits 0 tot 5. Deze kunnen worden aangepakt als basis 2-waarden van 1, 10, 100, enz. De instellingen voor de seriële poort zijn aangegeven in tabel 1 en zijn beschikbaar via de Micro-Manager-website (tabel met materialen). Firmware voor de microcontroller board is op dezelfde manier beschikbaar op deze website. - Om de timing logica te bepalen, activeert u het Micromanager Acquisition protocol in de software volgens de instructies van de fabrikant (tabel met materialen).
Opmerking: Dit initieert tegelijkertijd een vooraf ingestelde camera frameduur en het aantal te activeren frames, evenals de logische sluiter en vooraf ingestelde oranje LED voor fluorescentie excitatie. In dit geval wordt de oranje LED Solid State schakelaar bestuurd door microcontroller bit 1 uitgang via pin 9. De camera frames out TTL (back Plate out 3 connector) activeert een stimulator. Dit precies keer de activering van de blauwe licht LED voor de activering van channelrhodopsin op een vast tijdstip na de activering van de beeld sequentie. - Om te stimuleren channelrhodopsin met blauw licht en record RCaMP veranderingen, gebruik twee LEDs. Activeer channelrhodopsin met een LED met een piek emissie golflengte van 470 nm en een band pass filter (455 tot 490 nm) en Excite RCaMP met een LED met een piek emissie golflengte van 594 nm en een bandpas filter (570 tot 600 nm).
- Om gelijktijdig channelrhodopsin te activeren en veranderingen in RCaMP-fluorescerende niveaus vast te leggen, verlicht u beide Led's en zendt u het licht naar hetzelfde optische pad met behulp van een dichroïde bundel combiner.
- Controle van de timing van LED-verlichting met Solid-State switches (tabel met materialen) bestuurd door TTL-signalen (maximale nominale tijd, 1 MS, turn-off tijd 0,3 MS: 0 tot 90% Turn-on en uitschakelen tijd van < 100 μs).
- Stel de LED-intensiteit in met de huidige lineaire voedingen met lage ruis (tabel met materialen).
- Om de precieze timing van het blauwe lampje te waarborgen, activeert u het direct door TTL-puls naar het Solid-State Relais van een stimulator. Program meer het Blue Light stimulatie protocol in een stimulator (tabel met materialen), die als een precieze timer fungeert vanaf het begin van de beeld verwerving tot blauwe LED-verlichting. In dit experiment, schakel blauw licht stimulatie na 2 s van het vastleggen van RCaMP fluorescentie alleen en gebruik een trein van 5, 2 MS blauw lichtpulsen met 50 MS interpulse intervallen om te activeren channelrhodopsin.
Opmerking: de vertraging voor blauw lichtpulsen, de duur van de blauwe lichtpulsen, de tijd tussen pulsen, en het aantal pulsen in de trein kan allemaal worden ingesteld op dit punt en moet de specifieke parameters van de experimentele interesse weerspiegelen.
2. C. elegans monstervoorbereiding en gegevensverzameling
- Om presynaptische neuronen optisch te stimuleren, dieren te verkrijgen die channelrhodopsin uitdrukken in excitatory cholinerge neuronen, gedreven door de UNC-17- promotor regio, en rcamp uitgedrukt in alle Body Wall-spieren aangedreven door de Myo-3- promotor regio2.
Opmerking: alleen het gebruik van dieren met geïntegreerde transgenen en robuuste niveaus van fluorescentie worden aanbevolen, omdat de variabele expressie in de overeenkomstige celtypen de betrouwbaarheid van het verzamelen van gegevens kan beïnvloeden. - Maak een werkende voorraad van all-trans retinale door het retinale poeder (tabel met materialen) in ethanol te verdunen om een eindconcentratie van 100 mm te creëren en bij-20 °c op te slaan. Deze werkvoorraad zal ongeveer een jaar stabiel zijn.
- Maak een voorraad van OP50 E. coli, GETEELD in lb media, aangevuld met all-trans retinale uit de werk kolf gemaakt in stap 2,2, bij een eindconcentratie van 80 μM. Het volume dat wordt gebruikt voor de OP50 + retinale voorraad zal afhankelijk zijn van het aantal platen dat nodig is voor het experiment.
- Zaad nematode groeimedia (NGM) platen met ongeveer 300 μL van de OP50 + retinale voorraad en laat platen te drogen 's nachts op kamertemperatuur in het donker.
- Kweek C. elegans stammen naar de gewenste leeftijd in het donker op OP50 + RETINALE NGM platen bij 20 °c. Gebruik voor dit experiment volwassen wormen.
- Voor het experiment met behulp van de ontleed preparaat, gebruik alleen zwangere volwassen wormen als het uitvoeren van de dissectie op jongere, kleinere dieren is zeer uitdagend. Laat de dieren op de OP50-retinale platen voor een minimum van 3 dagen voor een effectieve channelrhodopsin activering.
- Bij gebruik van de ontleed preparaat8,11 (Figuur 1A), het uitvoeren van dissecties bij weinig licht.
- Plaats dieren in een ontsnij bare schaal met een silicone gecoate afdek basis die is gevuld met een 1 mM CA2 + extracellulaire oplossing bestaande uit 150 mm NaCl, 5 mm KCl, 1 mm CACL2, 4 mm MgCl2, 10 mm glucose, 5 mm sucrose en 15 mm HEPES (pH 7,3 ,-340 OSM).
- Lijm de dieren met behulp van de vloeibare actuele huid lijm met blauwe kleurplaat langs de rugzijde van de worm en maak een laterale cuticula incisie langs de lijm/worm-interface met behulp van glazen naalden.
- Gebruik een pipet om de inwendige ingewanden uit de worm holte te wissen.
- Lijm de cuticula flap van het dier om de ventrale mediale lichaamsspieren te blootstellen voorbeeld vorming.
- Bij gebruik van de nanobead bereiding (Figuur 1B)
- Maak een gesmolten 5% agarose oplossing met ddH2O tot een eindvolume van 100 ml.
- Gebruik een Pasteur-pipet om een druppel gesmolten agarose-oplossing op een glazen glijbaan te plaatsen en plaats onmiddellijk een tweede glazen Slide over de bovenkant, loodrecht op de eerste, met behulp van zachte druk om een gelijkmatige agarose pad te maken. Verwijder de bovenste dia voor gebruik.
- Voeg ongeveer 4 μL polystyreen nano kralen (tabel met materialen) toe aan het midden van het agarose pad.
- In het lage licht, pick 4-6 C. elegans in de nano kraal oplossing, ervoor te zorgen dat de dieren niet op elkaar te leggen, en zorgvuldig plaats een dekslip op de top.
- Plaats de bereide glij-of dissectie schaal op de Microscoop en zoek en concentreer u op een worm met 10x vergroting en Dim heldere veldverlichting.
- Schakel over naar 60x vergroting en RCaMP fluorescentie excitatie om een ventromediale Body Wall muscle te identificeren die anterieur is aan de vulva en in het juiste brandvlak.
Opmerking: spieren voorste naar de vulva zijn geselecteerd als ze weerspiegelen spieren vaak gestimuleerd in elektrofysiologie experimenten. - Verander het beeld traject van het oculair naar de camera door de Toggle uit te trekken en op Live te klikken binnen de Data Acquisition software (tabel met materialen).
Opmerking: Zorg ervoor dat de blauwe lichtstimulatie route op dit punt is uitgeschakeld om ervoor te zorgen dat de channelrhodopsin niet wordt geactiveerd voordat beelden worden vastgelegd. - Focus de afbeelding binnen de software voor gegevensverzameling met behulp van de Microscoop Fine focus.
- Zodra de spier duidelijk scherp is, schakelt u het live-beeld uit door op de knop Live te klikken.
- Klik op de ROI -knop in de software voor het verzamelen van gegevens en maak een vak rond de spier waarop wordt gefocust.
- Schakel op de stimulator het blauwe lichtstimulatie traject in dat eerder is geprogrammeerd in stap 1,10.
- Klik op verwerven in de beeldvormings software om de afbeelding via de CMOS-camera vast te leggen. Om dit te doen, stelt u de belichtingstijd in op 10 s met 1.000 frames en 2x binning.
3. gegevensanalyse
- Open het gegevensbestand in de imaging software (tabel met materialen) en schets met behulp van het gereedschap Veelhoekde spier van belang. Dit is de ROI.
- Ga naar afbeelding | Stapels | Plot Z-AXIS profile en exporteer de resulterende gegevenspunten naar de spreadsheet software (tabel met materialen). Deze functie plots de gemiddelde waarde van de ROI-selectie ten opzichte van het tijdspunt.
- Verplaats de spier ROI gemaakt met het veelhoek gereedschap buiten het dier om een achtergrond fluorescentie meting te krijgen met behulp van de stappen beschreven in 3,2. Exporteer de resulterende gegevens naar de werkblad werkmap.
- In de werkblad werkmap trekt u de achtergrond fluorescentie waarden van de spier fluorescentie waarden op elk moment af. Hiermee wordt het fluorescerende signaal op de achtergrond afgetrokken.
- Gemiddelde de achtergrond van de fluorescentie voor de eerste 2 s van gegevenspunten afgetrokken. Dit geeft de baseline fluorescentie meting, F.
- Gebruik de baseline fluorescentie meting om het genormaliseerde fluorescentie niveau op elk tijdpunt te berekenen. Gebruik hiervoor de vergelijking (ΔF/F) + 1. ΔF vertegenwoordigt (F (t)-F), waarbij F (t) de fluorescentie meting is op een bepaald tijdstip en F de baselinewaarde is. De + 1 wordt toegevoegd als een offset van de y-as.
- Herhaal stap 3.2-3.6 voor elk spier beeld dat wordt verzameld. Het gebruik van één of meerdere spiercellen per afbeelding is naar goeddunken van de onderzoeker. De n van het experiment kan worden bepaald door een vermogens analyse uit te voeren.
- Gebruik de verwerkte gegevens uit de stappen 3.2 tot en met 3.6 om een spoor te maken van de fluorescentie waarden in de grafische software volgens de instructies van de fabrikant (tabel met materialen).
- Meet vanuit dit spoor de kinetiek van de calcium transiënt, zoals de stijg-en tijdperiode en de halve vervaltijd, met behulp van de gereedschappen in de grafische software volgens de instructies van de fabrikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze techniek evalueerde veranderingen in mutanten die invloed hadden op de behandeling van calcium of spier depolarisatie. De baseline fluorescentie spiegels en de fluorescerende transiënten werden gevisualiseerd en de rust cytosolische calcium-en calcium kinetiek in de spier werden geëvalueerd. Het is belangrijk dat de dieren gedurende ten minste drie dagen op het all-trans retinale zijn geteeld om te zorgen voor een geslaagde opname van retinale, waardoor de channelrhodopsin vervolgens wordt geactiveerd (Figuur 2A). Als dieren niet worden blootgesteld aan all-trans retinale, wordt er geen spier calcium Transient geactiveerd (Figuur 2B). Hoewel deze dieren nog steeds kunnen worden gebruikt om cytosolische calciumspiegels in de uitgangssituatie te evalueren, zullen eventuele dynamische veranderingen in calcium niet worden opgevangen. Bovendien zal het dier, als een interne controle voor de gezondheid van dieren of dissectie, een contract volgen na stimulatie van het blauw licht. Een opname met een spiercontractie die een minimale bruto beweging van het lichaam van de worm veroorzaakt, werd geselecteerd voor gegevensverzameling bij het gebruik van nano kralen voor immobilisatie. Als de spier die wordt gebruikt voor het verzamelen van de ruwe fluorescentie waarden krachtig contracten, waardoor het hele lichaam van de worm te bewegen, de voorbijgaande Trace zal dit bewegings artefact reflecteren (Figuur 2C) en moet worden weggegooid van kwantificering.
Een mutatie mapping naar het SCA-1 gen Locus werd geïsoleerd van een scherm voor mutaties die C. elegans spier nicotinische receptor lokalisatie beïnvloeden. Het C. elegans SCA-1 gen codeert de enige homologatie van de Sarco (endo) plasmische reculaire calcium ATPase (serca) in de worm en is de enige serca-pomp aanwezig in de spieren van het lichaam van de muur12,13. Verlies van functie SCA-1 mutanten werden voorspeld veranderingen te vertonen in de spier behandeling van calcium op basis van de belangrijke rol die serca speelt bij het behoud van calcium homeostase in de spieren van zoogdieren14,15,16 ,17,18. De GECI RCaMP werd uitgedrukt in de spieren van het lichaam van de muur en de blauwe lichtgeactiveerde channelrhodopsin werd uitgedrukt in excitatory cholinerge neuronen om zowel de intracellulaire Baseline calcium en calcium dynamiek in SCA-1 mutanten te evalueren. Met de ontleed bereidingstechniek werden stijgingen van de baseline niveaus van RCaMP-fluorescentie waargenomen in de SCA-1 mutant in vergelijking met de controle (Figuur 3A, B), wat suggereert dat het verlies van de serca-functie leidt tot verhoogde niveaus van rust cytoplasmische calcium. Wanneer de calcium dynamica werd onderzocht, na presynaptische stimulatie getriggerd met een trein van 5, 2 MS blauw lichtpulsen (Figuur 3C), was er een significante afname in piek calcium niveaus in de SCA-1 (tm5339) mutanten als in vergelijking met de controle (Figuur 3D), die de verlaagde calcium voorraden in de SR kan weerspiegelen. Er werd echter geen verandering gezien in de opkomst tot piek tijd of de halve vervaltijd (Figuur 3E, F). Dit suggereert dat opgeroepen veranderingen in cytosolische calcium uit een externe bron zoals calcium binnenkomst via acetylcholine-receptoren en/of voltage-gated calcium kanalen, alsmede van interne winkels worden niet beïnvloed in SCA-1 (tm5339) mutanten . Vergelijkbare resultaten kunnen worden waargenomen met behulp van de nano kraal preparaat, zoals weergegeven in Figuur 419. Deze recapitulatie van gegevens biedt bewijs dat beide van deze technieken fysiologisch zijn voor het meten van lichaam muur spier rusten cytoplasmische calcium niveaus, alsmede observeren gestimuleerd calcium transiënten. Dit toont ook aan dat het dissectie van de worm geen schade veroorzaakt aan het dier dat zijn calcium behandeling verandert of het vermogen om postsynaptische spieren te depolariseren.
Dit protocol kan ook worden gebruikt om mutanten te onderzoeken die indirect van invloed zijn op de behandeling van calcium in C. elegans. Verlies van functie SLO-1 (eg142) mutanten werden geëvalueerd om dit te demonstreren. Het SLO-1 gen codeert een calcium-geactiveerde BK kalium kanaal, die wordt uitgedrukt in zowel neuronen als spieren20,21. Studies hebben eerder beschreven een rol voor SLO-1 in lichaam muur spieren, aantonen dat verlies van functie mutanten hebben een defect in postsynaptisch repolarisatie na spier actiemogelijkheden20,21. Mogelijke veranderingen in Baseline calcium niveaus en calcium voorbijgaande dynamiek als gevolg van deze hyperexcitability werden onderzocht met behulp van nano kraal immobilisatie. Wanneer de baseline niveaus van RCaMP werden gemeten, weergegeven SLO-1 (eg142) mutanten de fluorescentie in vergelijking met de besturingselementen (Figuur 5A, B)19. Dit suggereert dat BK kanalen ook de basisniveaus van cytosolische calcium kunnen reguleren. Er werden geen veranderingen in de piek calciumspiegels gezien in vergelijking met de controle (Figuur 5C, D) bij de evaluatie van de kinetiek van het opgeroepen calcium voorbijgaande. De SLO-1 (eg142) mutanten vertoonden echter een significant toegenomen opkomst tot piek tijd in vergelijking met de controle (Figuur 5E). Dit kan een eerder gerapporteerde toename van presynaptische prikkelbaarheid20,21weerspiegelen. Er was echter geen significante verandering in de halve vervaltijd in SLO-1 (eg142) mutanten in vergelijking met de controle (Figuur 5F). Samen, deze gegevens tonen aan dat deze methode kan worden gebruikt voor het evalueren van de effecten van pre-en postsynaptisch mutaties op zowel rust en gestimuleerd lichaam muur spier calcium.
| Seriële instelling | Waarde |
| Time-out voor antwoord | 500 |
| Baudrate | 57600 |
| Een van de meest populaire | 0 |
| Handshaking | Uit |
| Pariteit | Geen |
| StopBits | 1 |
| Uitgebreide | 0 |
Tabel 1: seriële poortinstellingen voor microcontroller plugin, die een externe microcontroller board bestuurt. Dit wordt gebruikt om externe timing pulsen te programmeren om fluorescentie excitatie te regelen.
Figuur 1: grafische weergave van verschillende immobilisatie technieken. (A) deze afbeelding demonstreert de dissectie techniek voor immobilisatie. Het lichaam van de worm wordt gelijmd (blauw) rond de rugzijde van het dier. Een rugincisie langs de cuticula genereert een cuticula flap. Deze flap is gelijmd om de intacte NMJs te blootstellen tussen de synapsen van het ventrale zenuw snoer in het groen (channelrhodopsin) en RCaMP die de spieren in het rood uitdrukken. (B) deze afbeelding toont de nanobead immobilisatie techniek. De intact worm is omgeven door een representatie van de nano kralen in oplossing, dat wanneer gecomprimeerd door de bovenliggende coverslip, immobiliseer de worm. Als gevolg van de transparantie van C. elegans, kan het ventrale zenuw snoer worden gevisualiseerd in het groen (channelrhodopsin) en rcamp uitdrukken van de spieren kunnen worden gevisualiseerd in rood. De eivormige in het midden van de worm vertegenwoordigt de vulva, dat is een mijlpaal identificeren van de ventrale lichaam muur spieren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: representatieve sporen van calcium transiënten. A) enkelvoudige spoor representatie van een voorbijgaande calcium die wordt opgeroepen door een trein van 5, 2 MS blauw lichtpulsen bij 50 MS interpulserende intervallen, opgenomen in een dier met een beperkte lichaamsbeweging (-beweging), gekweekt in aanwezigheid van all-trans retinale (+ all- trans retinale). De Spike-artefacten zijn de blauwe licht stimulatie pulsen, omdat beide Led's gelijktijdig worden verlicht. B) een enkele spoor voorstelling waaruit blijkt dat er geen calcium-voorbijgaande aard is als reactie op een trein van 5, 2 MS blauw lichtpulsen met 50 MS interpulserende intervallen in een dier dat niet is blootgesteld aan all-trans retinale (-all- ,-beweging). C) een enkelvoudige spoor voorstelling van een calcium voorbijgaande die is opgeroepen door een trein van 5, 2 MS blauw lichtpulsen met 50 MS interpulserende intervallen, geregistreerd in een dier met een aanzienlijke spiercontractie die leidt tot bewegings artefacten (+ beweging, + all-trans retinale). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: calciumspiegels op baseline en opgeroepen calcium transiënten uit controle-en SCA-1 (tm5339) monsters bereid met behulp van de dissectie techniek. A) representatieve beelden van rcamp-fluorescentie op baseline in SCA-1 (tm5339) mutanten en-controles. Schaalbalk = 50 μm. (B) bij Baseline fluorescentie niveaus kwantificering in SCA-1 (tm5339) mutanten (n = 13) en controle (n = 9). C) ensemble gemiddelde sporen van Evoked calcium transiënten voor SCA-1 (tm5339) mutanten en controledieren. D) de kwantificering van piek rcamp-fluorescentie van channelrhodopsin leidde tot calcium responsen in SCA-1 (tm5339) mutanten (n = 12) en controles (n = 9). (E) kwantificering van de opkomst tot piek tijd van channelrhodopsin opgeroepen calcium transiënten in SCA-1 (tm5339) mutanten (n = 12) en controles (n = 8). (F) half vervaltijd kwantificering van channelrhodopsin opgeroepen calcium transiënten in SCA-1 (tm5339) mutanten (n = 12) en controles (n = 7). Statistisch significante waarden waren: niet significant p > 0,05, * p ≤ 0,05, * * p ≤ 0,01, * * * p ≤ 0,001. Foutbalken staan voor gemiddelde ± SEM. gegevens werden genormaliseerd met behulp van Shapiro-Wilk-tests en significantie werd bepaald met een Mann-Whitney-test voor niet-normale distributies. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: calciumconcentraties op baseline en opgeroepen calcium transiënten van controle en SCA-1 (tm5339) monsters bereid met behulp van nano kraal immobilisatie. A) representatieve beelden van het uitgangsniveau van fluorescentie in SCA-1 (tm5339) mutanten en-bedieningsorganen, schaalbalk 50 μm.B) kwantificering van Baseline rcamp-fluorescentie niveaus in SCA-1 (tm5339) mutanten (n = 14) en de controle (n = 13) . C) gemiddelde van Evoked calcium transiënten voor SCA-1 (tm5339) mutanten en controles. D) kwantificering van piek rcamp-fluorescentie na opgeroepen calcium respons in SCA-1 (tm5339) mutanten (n = 14) en controles (n = 13). E) kwantificering van de stijg-en piek tijd van opgeroepen calcium transiënten in SCA-1 (tm5339) mutanten (n = 14) en controles (n = 12). F) kwantificering van de halve vervaltijd van Evoked calcium transiënten in SCA-1 (tm5339) mutanten (n = 14) en controle (n = 13). Figuur is aangepast van19. Statistisch significante waarden waren: niet significant p > 0,05, * p ≤ 0,05, * * p ≤ 0,01, * * * p ≤ 0,001. Foutbalken tonen gemiddelde ± SEM. gegevens normaliteit werd beoordeeld met behulp van Shapiro-Wilk-tests en significantie werd bepaald met een Mann-Whitney-test voor niet-normale distributies. Dit cijfer is gewijzigd met toestemming van19. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: calciumconcentraties op baseline en opgeroepen calcium transiënten van controle en SLO-1 (eg142) monsters bereid met behulp van nano kralen immobilisatie. A) representatieve beelden van de fluorescentie graad in SLO-1 (eg142) mutanten en-besturingselementen, schaalbalk 50 μm.B) kwantificering van Baseline rcamp-fluorescentie niveaus in SLO-1 (eg142) mutanten (n = 29) en de controle (n = 13). C) gemiddelde van opgeroepen calcium transiënten voor SLO-1 (eg142) mutanten en controles. D) kwantificering van piek rcamp-fluorescentie na opgeroepen calcium respons in SLO-1 (eg142) mutanten (n = 29) en besturingselementen (n = 13). E) kwantificering van de stijg-en piek tijd van opgeroepen calcium transiënten in SLO-1 (eg142) mutanten (n = 29) en besturingselementen (n = 13). F) kwantificering van de halve vervaltijd van opgeroepen calcium transiënten in SLO-1 (eg142) mutanten (n = 11) en besturingselementen (n = 13). Figuur is aangepast van19. Statistisch significante waarden waren: niet significant p > 0,05, * p ≤ 0,05, * * p ≤ 0,01, * * * p ≤ 0,001. Foutbalken tonen gemiddelde ± SEM. gegevens normaliteit werd beoordeeld met behulp van Shapiro-Wilk-tests en significantie werd bepaald met een Mann-Whitney-test voor niet-normale distributies. Dit cijfer is gewijzigd met toestemming van19. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GECIs zijn een krachtig hulpmiddel in C. elegans neurobiologie. Vorige werk heeft gebruikt calcium Imaging technieken om een breed scala van functies in zowel neuronen en spiercellen, met inbegrip van zintuiglijke en gedragsmatige reacties, met gevarieerde methoden van stimulatie te onderzoeken. Sommige studies hebben chemische stimuli gebruikt om te leiden tot calcium transiënten in sensorische as neuronen22,23 of voor het opwekken van calcium golven in faryngeale spieren24. Een andere groep gebruikte mechanische stimulatie terwijl wormen werden vastgehouden in microfluïdische chips om calcium reacties in touch receptor neuronen25te onderzoeken. Nog steeds, anderen hebben elektrische stimulatie gebruikt om te visualiseren van calcium veranderingen in beide neuronen26 en lichaam muur spieren27. Wat gebruikelijk is tussen deze onderzoeken is de eis van externe stimuli, zoals oplossingen of apparatuur, om calcium transiënten te activeren. Het protocol dat hier wordt geschetst kapitaliseert op de controle opgedaan met optogenetische stimulatie, die neuronale specificiteit biedt, in combinatie met de functionele analyse van spier uitgedrukt GECIs2 in hetzelfde experimentele paradigma.
Twee vormen van worm immobilisatie worden beschreven en, terwijl elke methode moet worden geëvalueerd bij het aanpakken van experimentele behoeften, produceren zowel ontleed als fysiologisch ongeschonden preparaten complementaire resultaten waardoor onderzoekers gebruik kunnen maken van beide benaderingswijzen in hun onderzoek. Er is een verhoogde technische uitdaging voor het gebruik van de dissectie-techniek, waarbij de gebruiker vereist is om zowel het precieze gebruik van de chirurgische lijm als de micro dissectie te beheersen zonder het zenuw snoer of de spieren te beschadigen. Bovendien, als gevolg van de moeilijkheidsgraad van de dissectie, alleen zwangere volwassenen moeten worden gebruikt, die de experimentele tijdpunten kunnen beperken. Bovendien is de dissectie techniek ook veel moeilijker uit te voeren op mutanten die kleine, dunne of zieke dieren produceren, opnieuw mogelijk om experimentele parameters te beperken. Het voordeel van deze techniek is dat het het lichaam bewegings artefact als gevolg van depolarisatie beperkt, lijmen voorkomt overmatige verplaatsing van het lichaam van de worm, en biedt ook toegang tot de NMJ voor oplossings veranderingen en drugs toepassingen. Bovendien, elk preparaat blootstelt hetzelfde gebied van de worm, die garandeert lichaam muur spieren zal consequent in focus. De tweede techniek, met behulp van nano kralen om de wormen te immobiliseren, is minder betrokken en kan snel geleerd worden. Ook kunnen alle leeftijds dieren met deze methode worden gebruikt, waardoor veranderingen in de behandeling van calcium door ontwikkeling kunnen worden gemonitord. Zorg moet worden genomen bij het plaatsen van de wormen in de nano kraal oplossing, als te veel manipulatie van de dieren kan leiden tot barsten. Ook mag de dekslip niet worden verplaatst eenmaal geplaatst op de top van de dieren, omdat dit kan leiden tot de dieren te rollen of te draaien op zichzelf, weer leidt tot de schade. Hoewel het gebruik van de nano kralen een test met een hoge doorvoer kan bieden waarin de dieren mogelijk kunnen worden teruggewonnen, is er geen standaardisatie van de lichaamspositie van het dier, dus elk dier mag geen spieren van de lichaams wand hebben in een duidelijk brandpuntsvlak. Als het experiment vraagt om een groot aantal dieren, kunnen verschillende methoden van immobilisatie nodig zijn, zoals agar-gebaseerde micro putten, die de bulk calcium fluorescentie Imaging28mogelijk maken. Ongeacht de beperkingen van deze twee technieken, ofwel kan worden gebruikt om betrouwbare, gemakkelijk kwantificeerbaar calcium transiënten binnen C. elegans lichaam muur spieren te verkrijgen.
C. elegans bieden vele voordelen als een in vivo systeem voor de functionele beeldvormings studies. De dieren zijn transparant, waardoor de koppeling van optogenetische neuronale depolarisatie door het gebruik van channelrhodopsin met de GECI RCaMP om de resulterende postsynaptisch calcium transiënten in de spier te meten. Pre-stimulatieniveaus van RCaMP-fluorescentie kunnen ook worden gebruikt om de cytosolische calciumspiegels op baseline te beoordelen. De genetische traceerbaarheid van C. elegans maakt de studie van nieuwe mutaties die van invloed kunnen zijn op de calcium homeostase of het hanteren van gemakkelijk te volgen, vaak met gemakkelijk verkrijgbare Mutant allelen. Met behulp van de technieken die in dit protocol worden beschreven, kunnen postsynaptische calciumbeeldvormings gegevens efficiënt en tegen relatief lage kosten worden verkregen, waardoor dit een aantrekkelijk systeem is voor een breed scala aan beeldvormings experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Dr. Alexander Gottschalk voor ZX1659, de RCaMP en channelrhodopsin met worm stam, Dr. Hongkyun Kim voor de SLO-1 (eg142) worm stam, en het nationale Bioresource project voor de SCA-1 (tm5339) worm stam.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| all-trans retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | Necessary for excitation of channel rhodopsin |
| Amber LED | RCaMP illumination | ||
| Arduino UNO | Mouser | 782-A000066 | Controls fluorescence illumination |
| Blue LED | channelrhodopsin illumination | ||
| BX51WI microscope | Olympus | Fixed state compound microscope | |
| Current controlled low noise linear power supply | Ametek | Sorenson | Controls LED intensity |
| Igor Pro | Wavemetrics | Wavemetrics.com | Graphing software |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov | Image processing software |
| LUMFLN 60x water NA 1.4 | Olympus | Water immersion objective for dissected preparation | |
| Master-8 Stimulator | A.M.P.I | Master timer for image acquisition and LED illumination | |
| Micro-Manager | micro-manager.org | Controls camera acquisition and LED excitiation | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| pco.edge 4.2 CMOS camera | pco. | 4.2 | High-speed camera |
| PlanApo N 60x oil NA 1.4 | Olympus | Oil immersion objective for nanobead preparation | |
| Polybead microspheres | Polysciences, Inc. | 00876-15 | For worm immobilization |
| solid state switches | Sensata Technologies | Crydom CMX100D6 | Controls timing of LED illumination |
| Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | SY1627 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele |
| Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele | |
| Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Gottschalk Lab | ZX1659 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line |
References
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).
- Nagel, G., et al. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Current Biology. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Liewald, J. F., et al.
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L.
- Lewis, J. A., et al. Cholinergic Receptor Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).
- Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature Neuroscience. 9, 791-798 (1999).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization. PLoS ONE. 8 (1), 1-6 (2013).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using umanager. Current Protocols in Molecular Biology. (Suppl 92), 1-17 (2010).
- Richmond, J. Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction. Journal of Visualized Experiments. (24), 1-4 (2009).
- Hoon Cho, J., Bandyopadhyay, J., Lee, J., Park, C. S., Ahnn, J. Two isoforms of sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) are essential in Caenorhabditis elegans. Gene. 261, 211-219 (2000).
- Zwaal, R. R., et al. The Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase Is Required for Development and Muscle Function in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (47), 43557-43563 (2001).
- Stammers, A. N., et al. The regulation of sarco(endo)plasmic reticulum calcium-ATPases (SERCA). Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93, 1-12 (2015).
- Clapham, D. E.
- Hovnanian, A. Serca pumps and human diseases. Calcium Signalling and Disease: Molecular Pathology of Calcium. , 337-363 (2007).
- Periasamy, M., Kalyanasundaram, A. SERCA pump isoforms: Their role in calcium transport and disease. Muscle and Nerve. 35 (4), 430-442 (2007).
- Gehlert, S., Bloch, W., Suhr, F. Ca2+-Dependent Regulations and Signaling in Skeletal Muscle: From Electro-Mechanical Coupling to Adaptation. International Journal of Molecular Sciences. 16, 1066-1095 (2015).
- Martin, A. A., Richmond, J. E. The sarco(endo)plasmic reticulum calcium ATPase SCA-1 regulates the Caenorhabditis elegans nicotinic acetylcholine receptor ACR-16. Cell Calcium. 72, 104-115 (2018).
- Wang, Z., Saifee, O., Nonet, M. L., Salkoff, L. SLO-1 Potassium Channels Control Quantal Content of Neurotransmitter Release at the C. elegans Neuromuscular Junction. Neuron. 32, 867-881 (2001).
- Abraham, L. S., Oh, H. J., Sancar, F., Richmond, J. E., Kim, H. An Alpha-Catulin Homologue Controls Neuromuscular Function through Localization of the Dystrophin Complex and BK Channels in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 6 (8), 1-13 (2010).
- Gourgou, E., Chronis, N. Chemically induced oxidative stress affects ASH neuronal function and behavior in C. elegans. Scientific Reports. 6, 1-9 (2016).
- Zahratka, J. A., Williams, P. D. E., Summers, P. J., Komuniecki, R. W., Bamber, B. A. Serotonin differentially modulates Ca2+ transients and depolarization in a C. elegans nociceptor. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1041-1050 (2015).
- Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26 (3), 583-594 (2000).
- Nekimken, A. L., et al. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. 17 (6), 1116-1127 (2017).
- Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (74), 1-9 (2013).
- Jospin, M., Jacquemond, V., Mariol, M. C., Ségalat, L., Allard, B. The L-type voltage-dependent Ca2+channel EGL-19 controls body wall muscle function in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 159 (2), 337-347 (2002).
- Wabnig, S., Liewald, J. F., Yu, S., Gottschalk, A. High-Throughput All-Optical Analysis of Synaptic Transmission and Synaptic Vesicle Recycling in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. , 1-26 (2015).
