Summary
שיטה זו מספקת דרך לזוג אלקטרואופטיקה וחיישני סידן מקודד גנטית לתמונה בסיסית ציטוסולג רמות סידן ושינויים בארעיות הסידן מעורר בשרירי הגוף של האורגניזם מודל ג. אלגיה.
Abstract
האורגניזם מודל C. אלגיה מספק מערכת מעולה לבצע הדמיה vivo סידן. הגוף השקוף והmanipulability הגנטי שלו מאפשרים ביטוי ממוקד של חיישני סידן מקודדים גנטית. פרוטוקול זה מתאר את השימוש בחיישנים אלה עבור הדמיה vivo של הדינמיקה סידן בתאים ייעודיים, במיוחד שרירי הגוף של התולעים. על ידי ניצול הביטוי המשותף של המתקשר הטרום סינפטיות, גירוי של שחרור אצטילכולין מפני הנוירונים מוטוריים מוטורי יכול להיגרם באמצעות פולסים באור כחול, וכתוצאה מכך שרירים depolarization שריר ושינויים בסידן cytoplasmic רמות. שתי טכניקות השתק התולעים נידונות עם רמות שונות של קושי. השוואה בין טכניקות אלה ממחישה כי שתי הגישות משמרות את הפיזיולוגיה של הצומת העצבי ומאפשרים לכמת את הסידן. על-ידי שיוך אלקטרואופטיקה והדמיה של סידן פונקציונלי, שינויים בטיפול בסידן פוסט-סינפטית והומאוסטזיס ניתן להעריך במגוון של רקעים מוטציה. הנתונים המוצגים מאמתת הן טכניקות השתק ובודקת באופן ספציפי את התפקידים של C. אלגיה sarco (לאנדו) פלמיק סידן ATPase ואת הסידן מופעל בערוץ האשלגן המופעל בתוך שריר קיר הגוף בוויסות הסידן.
Introduction
נייר זה מציג שיטות לדימות סידן vivo של C. אלגיה שרירי קיר הגוף באמצעות הגירוי העצבי הגנטי. זיווג שריר הביע מחוון סידן מקודד גנטית (סמא) עם אור כחול המופעל הנוירופולריזציה והוא מספק מערכת להתבונן בבירור את הארעיות מעורר הסידן סינפטית. זה מונע את השימוש בגירוי חשמלי, המאפשר ניתוח לא פולשני של מוטציות המשפיעות על הדינמיקה סידן פוסט סינפטית.
חד-פלואורוופפור, כגון gcamp, משתמש במולקולה אחת של חלבון פלורסנט התמזגו לתחום M13 של רירן שרשרת האור בקצה N-terminal שלה ו קלמודולין (CaM) ב C-טרמינוס. עם כריכת סידן, התחום CaM, אשר יש זיקה גבוהה לסידן, עובר שינוי הקונפורמציה גרימת שינוי מאוחר יותר בחלבון פלורסנט המוביל להגדיל את עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית1. GCaMP הזריחה הוא נרגש ב 488 ננומטר, מה שהופך אותו לא מתאים לשמש בשילוב עם המתקשרים, אשר יש גל עירור דומה של 473 ננומטר. כך, על מנת למספר מדידות סידן עם גירוי מתקשר, חלבון פלורסנט ירוק של GCaMP צריך להיות מוחלף עם חלבון פלורסנט אדום, mRuby (RCaMP). באמצעות שריר הביע את RCaMP, בשילוב עם ביטוי הcholinergic המנוע המוטוריים של המתקשרים, היתרי לימודים בצומת הנוירוסקולריות התולעת (NMJ) עם שימוש סימולטני של אלקטרואופטיקה והדמיה פונקציונלית בתוך אותה חיה 2. שתיים.
השימוש במתקשרים עוקף את הצורך בגירוי החשמלי כדי לפשט את הצמתים הנוירוולוגיים של ה -אס. אס.אס, שניתן להשיג רק באופן גזור, ובכך להפוך טכניקה זו לקלה יותר ומדויקת יותר בעת התמקדות ברקמות ספציפיות. לדוגמה, המתקשרים השתמשו בעבר ב -C. אלגיה כדי להפעיל נוירונים מסוימים באופן הפיך, המוביל להפעלה חזקה של הנוירונים או מעכבות הניריונים3,4. השימוש בדפולריזציה מגורה גם חוסם את סוגיית הנזק העצבי בשל גירוי חשמלי ישיר. זה מספק הזדמנות לבחון את ההשפעות של פרוטוקולי גירוי שונים רבים, כולל הגירוי מתמשכת וחוזרים, על הדינמיקה הסידן פוסט סינפטית4.
האופי השקוף של הג הופך אותו לאידיאלי עבור האנליזה הפונקציונלית של ההדמיה הפלואורסצנטית. עם זאת, כאשר מגרה את הנוירונים הNMJ הממריצים בבית הספרים, בעלי חיים צפויים להגיב עם כיווץ שרירים מיידי4, מה שהופך את השתק של תולעים קריטי להמחיש שינויי סידן דיסקרטית. באופן מסורתי, סוכני תרופתי. שימשו כדי לשתק את החיות אחד תרופה כזאת בשימוש הוא levamisole, קולטן cholinergic אצטילכולין האגוניסט5,6,7. מאז levamisole מוביל הפעלה מתמדת של תת סוג של קולטני שריר מרגש, מגיב זה אינו מתאים למחקר של הדינמיקה סידן שרירים. הפעולה של levamisole מעוררת הדפולריזציה הפוסט, מרוממת את הסידן ציטוסולג, וסגר תצפיות בעקבות גירוי טרום סינפטיות. כדי להימנע משימוש בסמים משתקת, בדקנו שתי שיטות חלופיות כדי לשתק את הג. בעלי חיים היו מודבקים למטה ולאחר מכן לגזור לחשוף את שרירי הקיר הגוף, בדומה C. אלגיה NMJ אלקטרופיזיולוגיה שיטה8, או nanobeads שימשו לשתק בעלי חיים שלמים9. שני ההליכים מותר עבור מדידות הניתנות לכימות של השריר מנוחה ומעורר משני השרירים המשורשים שהיו בקלות ככמת.
השיטות בנייר זה ניתן להשתמש כדי למדוד את רמות הסידן בסיסית ציטוטים ו ארעיות בתאי גוף השריר הפוסט-סינפטיות ב- C. אלגיה. דוגמאות לנתונים המעסיקים את שתי טכניקות השתק השונות ניתנות. שתי טכניקות לנצל אלקטרואופטיקה כדי לחסל את תאי השריר ללא שימוש בגירוי חשמלי. דוגמאות אלה מדגימות את הכדאיות של שיטה זו בהערכת מוטציות המשפיעות על טיפול בסידן פוסט-סינפטית בתולעים ומצביעים על היתרונות והחסרונות של שתי גישות השתק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. התקנת מיקרוסקופ
- השתמש במיקרוסקופ מורכב עם יכולות של קרינה פלואורסצנטית. עבור מחקר זה, הנתונים נאספו על מיקרוסקופ זקוף (טבלת חומרים) מצויד נוריות עבור עירור.
- כדי להמחיש כראוי שינויים בעלי קרינה פלואורסצנטית שרירי הגוף, להשתמש במטרה הגדלה גבוהה.
- לקראת ההכנות לגזור, השתמש ב 60x NA 1.0 המים מטרה טבילה (טבלת חומרים).
- להכנות באמצעות nanobeads, השתמש ב-60x NA 1.4 מטרה טבילה שמן (טבלת חומרים). הגדלה זו מבטיחה רזולוציה מספקת של השרירים על חיישן המצלמה.
- השתמש במצלמה רגישות גבוהה מחוברת למיקרוסקופ כדי ללכוד תמונות בקצב מסגרת גבוהה כדי לעקוב אחר שינויים מהירים ברמות הסידן. עבור מחקר זה, תמונה עם מערכת sCMOS (טבלה של חומרים) מסוגל הדמיה מסגרת מלאה ב 100 Hz, כזמני עלייה עבור Ca 2 + אותות יכול להיות מהיר כמו עשרות אלפיותהשני .
- בקרת רכישת מצלמה ועירור הזריחה LED עם תוכנה מיקרו מנהל פועל ImageJ10 על פי הוראות היצרן (טבלת חומרים).
- השתמש בקוד פתוח לפלטפורמה אלקטרונית, אשר מחבר לוח מיקרובקר חיצוני בקוד פתוח (טבלת חומרים), כדי לנהל את פולסים העיתוי החיצוני כדי לשלוט על עירור הקרינה.
הערה: מקטעים דיגיטליים זמינים מפינים דיגיטליים 8 עד 13 המספקים סיביות פלט 0 עד 5. אלה יכולים להיות ממוען כבסיס 2 ערכים של 1, 10, 100, וכו '. הגדרות יציאה טורית מסומנות בטבלה 1 וזמינות מהאתר של מיקרו-מנהל (טבלת חומרים). הקושחה ללוח המיקרו-בקר זמינה באתר זה באופן דומה. - כדי לשלוט בלוגיקת התזמון, הפעל את פרוטוקול הרכישה המירומגר בתוכנה בהתאם להוראות היצרן (טבלת חומרים).
הערה: זה במקביל יוזם מצלמה מוגדרת מראש משך מסגרת ואת מספר מסגרות להיות מופעל, כמו גם את התריס הלוגי מראש הנורית הקבועה לעירור של הזריחה. במקרה זה, כתום LED בורר מצב מוצק נשלט על ידי פלט מיקרו סיבית 1 דרך pin 9. המצלמה מסגרת את TTL (צלחת האחורי out 3 מחבר) מפעיל מעורר. זה בדיוק הזמן ההפעלה של האור הכחול LED להפעלת המתקשרים בזמן קבוע לאחר הפעלת רצף ההדמיה. - כדי לעורר את המתקשרים עם אור כחול ושינויי שיא RCaMP, השתמש בשני נוריות. הפעל מתקשר עם LED עם השיא פליטת אורך הגל של 470 ננומטר ו מסנן bandpass (455 כדי 490 nm) ולהלהיב RCaMP עם LED עם גל פליטת שיא של ה594 ננומטר ו מסנן bandpass (570 כדי 600 nm).
- כדי להפעיל בו את המתקשרים וללכוד שינויים ברמות פלורסנט RCaMP, להאיר שיתוף הן נוריות ולהעביר את האור לאותו נתיב אופטי באמצעות מדיקרואיק קרן.
- שלוט בעיתוי של תאורה LED עם מתגי מצב מוצק (טבלת חומרים) נשלט על ידי אותות TTL (מקסימום מדורג בזמן הפעלה, 1 ms, לבטל את הזמן 0.3 ms: 0 כדי 90% הפעלה ולכבות את הזמן של < 100 μs).
- הגדר את עוצמת ה-LED באמצעות ספקי כוח ליניארי מבוקרים הנוכחיים של רעש נמוך (טבלת חומרים).
- כדי להבטיח את התזמון המדויק של נורית האור הכחולה, הפעל אותו ישירות על-ידי פעימת TTL לממסר המצב המוצק מגירוי. הפעל את פרוטוקול גירוי האור הכחול לתוך מתכנת (טבלת חומרים), המשמשת כטיימר מדויק מתחילת רכישת התמונה לתאורת LED כחולה. בניסוי זה, להפעיל גירוי באור כחול לאחר 2 s של לכידת RCaMP פלואורסצנטית בלבד ולהשתמש ברכבת של 5, 2 ms פולסים אור כחול עם 50 ms מרווחי הזמן הinterpulse כדי להפעיל את המתקשרים.
הערה: העיכוב לפני פולסים באור כחול, משך הפולסים באור הכחול, הזמן שבין הפולסים, ומספר הפולסים ברכבת יכול להיות מוגדר בשלב זה ולשקף את הפרמטרים הספציפיים של עניין ניסיוני.
2. ג. אלגיה הכנה לדוגמא ורכישת נתונים
- כדי לעורר באופן מיסטי נוירונים טרום סינפטיות, להשיג בעלי חיים ביטוי המתקשרים הcholinergic הנוירונים, מונע עם האזור מקדם unc-17 , ו rcamp הביע בכל השרירים קיר הגוף מונחה עם היזם myo-3 אזור2.
הערה: רק השימוש בבעלי חיים עם טרנסגנים משולבים ורמות עמידות של קרינה פלואורסצנטית מומלצים כביטוי המשתנה בסוגי התאים המתאימים עלול להשפיע על האמינות של רכישת נתונים. - לעשות מלאי עבודה של כלטרנס ברשתית על ידי דילול אבקת הרשתית (טבלה של חומרים) באתנול כדי ליצור ריכוז סופי של 100 מ"מ ולאחסן ב-20 ° c. מלאי עבודה זה יהיה יציב למשך כשנה אחת.
- צור מלאי של OP50 E. coli, גדל ב-LB מדיה, שיושלם עם הרשתית כלטרנס מהמלאי עובד שנעשו בשלב 2.2, בריכוז הסופי של 80 μm. הכרך המשמש למניה OP50 + רשתית יהיה תלוי במספר הלוחות הנחוצים לניסוי.
- זרעים נמטודות הצמיחה מדיה (ngm) צלחות עם כ 300 μl של OP50 + מניות רשתית ולאפשר צלחות להתייבש בלילה בטמפרטורת החדר בחושך.
- לגדול C. אלגיה זנים לגיל הרצוי בחושך על OP50 + לוחות ngm רשתית ב 20 ° c. , בשביל הניסוי הזה. תשתמשו בתולעים למבוגרים
- עבור הניסוי באמצעות הכנת גזור, רק להשתמש gravid למבוגרים תולעים כמו ביצוע הניתוח על הצעיר, בעלי חיים קטנים יותר הוא מאתגר מאוד. השאירו את החיות על הצלחות OP50-רשתית למינימום של 3 ימים עבור הפעלה המתקשר יעיל.
- אם משתמשים בתכשיר ההכנה לגזור8,11 (איור 1א), בצעו ניתוח באור נמוך.
- מקום בעלי חיים בצלחת מבתר עם בסיס coverslip מצופה סיליקון כי הוא מתמלא 1 מ"מ Ca2 + פתרון מסחטות המורכב של 150 MM הנאקל, 5 מ"מ kcl, 1 מ"מ cacl2, 4 מ"מ mgcl2, 10 מ"מ גלוקוז, 5 מ"מ מילימטר, ו 15 מ"מ hepes (pH 7.3 ,-340 osm).
- הדבק בעלי חיים באמצעות דבק עור אקטואלי נוזלי עם צביעה כחול לאורך הצד השני של התולעת ולעשות חתך קוטיקולה לרוחב לאורך ממשק הדבק/תולעת באמצעות מחטים זכוכית.
- השתמש בפיפטה בפה כדי לנקות את מעיים הפנים מחלל התולעת.
- הדבק את כנף הקוטיקולה של בעל החיים כדי לחשוף את השרירים קיר הגוף המדילי להדמיה.
- אם משתמשים בתכשיר להכנת nanobead (איור 1B)
- הפוך פתרון מותכת 5% agarose באמצעות ddH2O לנפח הסופי של 100 mL.
- באמצעות הפיפטה פסטר, מניחים טיפה של הפתרון agarose מותכת על שקופית זכוכית ומיד מניחים שקופית זכוכית שנייה מעל החלק העליון, בניצב הראשון, באמצעות לחץ עדין כדי ליצור כרית agarose אפילו. הסר את השקופית העליונה לפני השימוש.
- הוסף כ 4 μL של פוליסטירן nanobeads (טבלת חומרים) לאמצע כרית agarose.
- באור נמוך, לקחת 4-6 C. אלגיה לתוך הפתרון nanobead, בטוח בעלי חיים לא שוכב אחד על השני, ובזהירות המקום שמיכות על גבי.
- מניחים את השקופית המוכנה או את הצלחת לחיתוך על המיקרוסקופ, ולמצוא ולהתמקד תולעת באמצעות הגדלה 10x ו עמעום שדה בהיר התאורה.
- מעבר להגדלה 60x ו-RCaMP עירור הזריחה כדי לזהות שריר קיר הגוף ventromedial כי הוא הקדמי אל הפות ובמישור המוקד הנכון.
הערה: השרירים הקדמי של הפות נבחרו כפי שהם משקפים שרירים בדרך כלל מגורה בניסויים אלקטרופיזיולוגיה. - לשנות את מסלול התמונה מן העין למצלמה על ידי משיכת החוצה למתג ולחיצה בתוך תוכנת רכישת נתונים (טבלת חומרים).
הערה: ודא כי מסלול גירוי האור הכחול מכובה בנקודה זו כדי לוודא שהמתקשר אינו מופעל לפני שהוא מבצע לכידת תמונות. - למקד את התמונה בתוך תוכנת רכישת נתונים באמצעות מיקרוסקופ מיקוד דק.
- לאחר השריר הוא בבירור בפוקוס, לכבות את התמונה לחיות על ידי ביטול לחיצה על כפתור חי .
- לחץ על לחצן ROI בתוכנה לרכישת נתונים וליצור תיבה סביב שריר להיות מרוכז.
- על הגירוי, לעבור על מסלול גירוי האור הכחול שתוכנן בעבר בשלב 1.10.
- לחץ על ' רכוש ' בתוכנת הדימות כדי ללכוד את התמונה באמצעות מצלמת ה-CMOS. כדי לעשות זאת, לקבוע את זמן החשיפה 10 s עם 1,000 מסגרות 2x binning.
3. ניתוח נתונים
- פתח את קובץ הנתונים בתוכנת הדימות (טבלה של חומרים) ובאמצעות הכלי מצולע, המתאר את שריר הריבית. זוהי ההחזר.
- עבור לתמונה | ערימות | מגרש Z הפרופיל ציר ולייצא את נקודות הנתונים המתקבלים לתוך תוכנת הגיליון האלקטרוני (טבלת חומרים). פונקציה זו מתווה את הערך הממוצע לבחירת ROI לעומת נקודת הזמן.
- הזז את ROI השריר שנוצר עם הכלי מצולע מחוץ לבעל החיים כדי לקבל מדידה ברקע הזריחה באמצעות השלבים המתוארים ב 3.2. יצא את הנתונים שיתקבלו בחוברת העבודה של הגיליון האלקטרוני.
- בחוברת העבודה של הגיליון האלקטרוני, הפחת את ערכי הזריחה ברקע מערכי הקרינה השרירים בכל נקודה. פעולה זו מספקת את אות הפלורסנט המופחת.
- ממוצע הרקע המחוסר את הזריחה עבור 2 ה-s הראשונים של נקודות הנתונים. זה ייתן את המדידה הבסיסית של זריחה, F.
- השתמש במדידה הפלואורסצנטית הבסיסית כדי לחשב את רמת הזריחה המנורמלת בכל נקודת זמן. לשם כך, השתמש במשוואה (ΔF/F) + 1. ΔF מייצג (F (t)-F), כאשר F (t) הוא המדידה הפלואורסצנטית בכל נקודת זמן נתונה ו-F הוא הערך הבסיסי. ה-+ 1 נוסף כהיסט של ציר y.
- חזור על שלבים 3.2-3.6 עבור כל תמונת שריר שנאספה. שימוש בתאי שריר יחיד או מרובים לכל תמונה הוא לפי שיקול דעתה של החוקר. את ה-n של הניסוי ניתן לקבוע על ידי ביצוע ניתוח כוח.
- השתמש בנתונים המעובדים משלבים 3.2-3.6 כדי ליצור מעקב אחר ערכי הפלורסנט בתוכנת הגרפים בהתאם להוראות היצרן (טבלת חומרים).
- מתוך מעקב זה, למדוד את הקינטיקה של זמני הסידן, כגון עלייה לזמן שיא ומחצית הזמן ריקבון, באמצעות הכלים המסופקים בתוכנת הגרפים לפי הוראות היצרן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
טכניקה זו העריכה שינויים מוטציות חשבו להשפיע על טיפול בסידן או depolarization השריר. רמות הניאון הבסיסית ו ארעיות פלורסנט היו דמיינו ומנוחה cytosolic סידן וקינטיקה סידן בתוך השריר הוערכו. חשוב כי החיות גדלו על הרשתית כל הטרנס לפחות שלושה ימים כדי להבטיח את התאגדות מוצלחת של הרשתית, ובכך לאחר מכן הפעלת המתקשר (איור 2א). אם בעלי חיים אינם חשופים הרשתית כל טרנס, לא השריר החולף הסידן הוא הפעיל (איור 2ב). למרות בעלי חיים אלה יכולים עדיין לשמש כדי להעריך את רמות הסידן בסיסית ציטוסולג, כל שינוי דינאמי בסידן לא יתפס. בנוסף, כשליטה פנימית לבעלי חיים או בריאות לחיתוך, החיה תהיה חוזה בעקבות גירוי אור כחול. הקלטה עם כיווץ שרירים הגורם לתנועה גסה מינימלית של גוף התולעת נבחרה לאיסוף נתונים בעת שימוש בננו-מודעות לצורך השתק. אם השריר המשמש כדי לאסוף את ערכי הזריחה raw חוזים במרץ, גורם לגוף כולו של התולעת לזוז, המעקב החולף ישקף את התנועה הזאת (איור 2ג) ויש להיפטר מן הכמת.
מיפוי מוטציה אל מקור הגנים " סקה -1 " היה מבודד ממסך עבור מוטציות המשפיעה על הלוקליזציה של השריר הנוגע לקולטן שרירים. C. אלגיה-1 גן מקודד את היומן היחיד של sarco (אנדו) הפלסטיק רשתית atpase (serca) בתולעת והוא המשאבה serca רק להציג את שרירי הקיר הגוף12,13. אובדן הפונקציה מוטציות 1 המוטאנטים ניבאו שינויים התערוכה הטיפול בסידן שרירים בהתבסס על התפקיד החשוב serca משחק שמירה על הומאוסטזיס סידן בשריר המיונקים14,15,16 ,17,18. מחנה השארה התבטא בשרירי הקיר של הגוף, ומתעל האור הכחול המופעל על ידי הנודופסין הcholinergic בנוירונים, כדי להעריך גם את הסידן הבסיסי התאיים והדינמיקה הסידן במווטציות -1 . עם טכניקת ההכנה לגזור, עליות רמות הבסיסית של הזריחה RCaMP נצפו במוטציה סקה-1 בהשוואה לפקד (איור 3A, B), הרומז כי אובדן של הפונקציה serca מוביל רמות גבוהות של סידן cytoplasmic מנוחה. כאשר הסידן הדינמיקה נבדקו, בעקבות גירוי טרום סינפטיות המופעל עם רכבת של 5, 2 ms כחול פולסים אור (איור 3ג), הייתה ירידה משמעותית ברמות הסידן שיא בתוך מוטציות tm5339-1 ( מוטנטים) כמו לעומת הפקד (איור 3ד), אשר עשוי לשקף חנויות סידן מופחתת ב-SR. אולם שום שינוי לא נראה בעלייה לשיא הזמן או החצי ריקבון הזמן (איור 3E, F). זה מרמז כי שינויים מעורר בסידן ציטוסולג ממקור חיצוני כגון כניסת סידן באמצעות קולטני אצטילכולין ו/או מגודרת מתח ערוצי סידן, כמו גם מחנויות פנימיות אינם מושפעים סקה -1 (tm5339) מוטציות . תוצאות דומות ניתן לצפות באמצעות הכנה nanobead, כפי שמוצג באיור 419. זה לכידה של הנתונים מספק ראיות כי הן של טכניקות אלה הם פיזיולוגיים עבור מדידת שריר קיר הגוף מנוחה cytoplasmic רמות סידן, כמו גם התבוננות ממריצים הסידן. זה גם מוכיח כי הניתוח של התולעת אינו גורם נזק לחיה המשנה את הטיפול בסידן שלה או את היכולת לערער שרירי הסינפטית הפוסט.
פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לבחון מוטציות המשפיעים בעקיפין על טיפול בסידן ב- C. אלגיה. אובדן של פונקציה איטי-1 (eg142) מוטציות הוערכו כדי להדגים את זה. הגנים הסלו-1 מקודד ערוץ אשלגן המופעל באמצעות סידן, אשר מתבטא הן בנוירונים והן בשרירים20,21. מחקרים תיארו בעבר תפקיד עבור איטי-1 בגוף השרירים בקיר, הוכחת כי אובדן של מוטציות פונקציה יש פגם בפוסט הסינפטית הבאה בעקבות הפוטנציאל פעולה שרירים20,21. שינויים אפשריים ברמות הסידן בסיסית והדינמיקה הארעית של הסידן בשל יכולת היפראפרוליזציה הזאת נבחנו באמצעות האפשרות של nanobead. כאשר רמות הבסיסית של RCaMP נמדדו, איטי-1 (eg142) מוטציות הציגו להגדיל את הזריחה לעומת הפקדים (איור 5א, ב)19. זה מרמז כי ערוצי BK עשוי גם לווסת את רמות הבסיסית של סידן ציטוסולג. לא שינויים ברמות הסידן שיא נראו לעומת השליטה (איור 5ג, ד) בעת הערכת קינטיקה של הסידן חולף מעורר. עם זאת, המוטנטים האיטי-1 (eg142) הציגו עלייה משמעותית בזמן השיא לעומת השליטה (איור 5E). הדבר עשוי לשקף עלייה שדווחה בעבר ב-מקדם הסינפטיות20,21. עם זאת, לא היה שינוי משמעותי במשך הזמן החצי דעיכה במוטציות -1 (eg142) לעומת השליטה (איור 5F). יחד, נתונים אלה מדגימים כי שיטה זו ניתן להשתמש כדי להעריך את ההשפעות של מוטציות טרום ופוסט סינפטית על מנוחה ומגורה הגוף שריר סידן.
| הגדרה טורית | ערך |
| זמן קצוב לתשובה | 500 |
| קצב שידור | 57600 |
| דלאיבין-Sms | 0 |
| לחיצת יד | את |
| זוגיות | לא |
| StopBits | 1 |
| פורט | 0 |
טבלה 1: הגדרות יציאה טורית עבור תוסף מיקרו, השולט בלוח מיקרו-בקר חיצוני. זה משמש כדי לתכנת פולסים עיתוי חיצוני כדי לשלוט עירור הזריחה.
איור 1: ייצוג גרפי של טכניקות השתק שונות. (א) גרפיקה זו ממחישה את טכניקת החיתוך לצורך השתק. גוף התולעת מודבק למטה (כחול) סביב הצד השני של החיה. חתך העור לאורך הקוטיקולה יוצר כנף קוטיקולה. הכנף הודבק למטה כדי לחשוף את NMJs שלם שנוצר בין הסינפסות של חוט העצב הגחוני בירוק (המתקשרים) ו RCaMP המבטא שרירים באדום. (ב) הגרפיקה הזאת ממחישה את טכניקת הנאובליזציה של nanobead. התולעת ללא שינוי מוקפת בייצוג של nanobeads בפתרון, כי כאשר דחוס על ידי שמיכות על גבי, לשתק את התולעת. בגלל השקיפות של הג, ניתן לדמיין את חוט העצב הגחוני בירוק (המתקשרים) ו-rcamp המבטא שרירים ניתן לדמיין באדום. האוריק באמצע התולעת מייצג את הפות, שהוא נקודת ציון המזהה את שרירי קיר הגוף הגעית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: עקבות נציגים של מארעיות סידן. (א) ייצוג מעקב יחיד של הארעי הסידן שעורר על ידי רכבת של 5, 2 ms הפולסים אור כחול ב 50 ms מרווחי הדופק הבין, הקליט בעלי חיים עם תנועת גוף מוגבלת (-התנועה) גדל בנוכחות שלטרנס טראנס (+ all- טראנס רשתית). חפצי הדקר הם הפולסים הכחולים של גירוי באור, כמו שני הנוריות מוארות בו זמנית. (ב) ייצוג מעקב יחיד המציג את העדר ארעי של סידן בתגובה לרכבת של 5, 2 ms פולסים באור כחול עם 50 ms מרווחי הדופק בבעלי חיים כי לא נחשף כלטרנס טראנס (-טרנס טראנס ברשתית , תנועה). (ג) מעקב יחיד ייצוג של ארעי הסידן כי כבר עורר על ידי רכבת של 5, 2 ms הפולסים אור כחול עם 50 ms מרווחי הזמן interpulse, הקליט בעלי חיים כי היה התכווצות שרירים משמעותיים המובילה ממצאים התנועה (+ תנועה, + הרשתית הכול-טרנס ). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: רמות הסידן הבסיסיות והשלבים של הסידן הtm5339 משליטה, ולאחר מכן לסרוק את הדגימות שהוכנו באמצעות טכניקת החיתוך. (א) תמונות מייצגות של מוטציות בסיסיות של rcamp בסקה-1 (tm5339) מוטנטים ובקרות. סרגל בקנה מידה = 50 μm. (ב) רמות הזריחה של בסיס הקוונפיקציה ב -tm5339 מוטציות (n = 13) ושליטה (n = 9). (ג) הרכב עקבות ממוצעים של מוטאנטים סידן מעורר עבור סקה -1 (tm5339) מוטציות ובעלי חיים בקרה. (ד) קוונפיקציה של שיא הקרינה הפלואורסצנטית מתקשר התגובות סידן התגובה בסקה 1 (tm5339) מוטציות (n = 12) ופקדים (n = 9). (ה) הכמת של עלייתו לשיא הזמן של המתקשרים מעורר מוטאנטים סידן ב סקה-1 (tm5339) מוטציות (n = 12) ובקרות (n = 8). (ו) חצי כימות הריקבון של המתקשרים המזמנים את הסידן משני מוטציות בסקה-1 (tm5339) מוטנטים (n = 12) ובקרות (n = 7). ערכים משמעותיים סטטיסטית היו: לא משמעותי p > 0.05, * p ≤ 0.05, * * p ≤ 0.01, * * * p ≤ 0.001. קווי שגיאה מייצגים את הממוצע ± SEM. הנתונים הנורמו מתוך בדיקות ומשמעויות של שפירו-וילק היתה נחושה במבחן של מאן-ויטני להפצות שאינן נורמליות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: רמות הסידן הבסיסיות והשלבים של הסידן הרמקו משליטה ומסקה-1 (tm5339) דגימות שהוכנו באמצעות שימוש בשיטת nanobead. (א) תמונות מייצגות של הזריחה הבסיסית ב -tm5339-1 ( ב) מוטציות ובקרות, בקנה מידה בר 50 Μm. (ב) קוונפיקציה של רמות בסיסית rcamp פלואורסצנטית ב -tm5339 מוטציות (n = 14) ואת השליטה (n = 13) . (ג) ממוצע של מארעיות סידן מעורר עבור סקה -1 (tm5339) מוטציות ושליטה. (ד) קוונפיקציה של שיא הזריחה rcamp בעקבות תגובת סידן מעורר בסקה 1 (tm5339) מוטציות (n = 14) ובקרות (n = 13). (ה) הקוונפיקציה של עלייה לשיא הזמן של המקומאנטים סידן מעורר ב סקה -1 (tm5339) מוטציות (n = 14) ופקדים (n = 12). (ו) הקוונפיקציה של מחצית הזמן של ריקבון הסידן מעורר בשנת סקה 1 (tm5339) מוטציות (n = 14) ושליטה (n = 13). הדמות מותאמת מגיל19. ערכים משמעותיים סטטיסטית היו: לא משמעותי p > 0.05, * p ≤ 0.05, * * p ≤ 0.01, * * * p ≤ 0.001. קווי שגיאה מציגים משמעות ל-± SEM. נתונים נורמליות הוערך באמצעות בדיקות שפירא-וילק ומשמעותם הייתה נחושה במבחן מאן-ויטני להפצות שאינן נורמליות. דמות זו שונתה עם רשות מ19. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: רמות הסידן בסיסית והשלבים הללו הסידן מגיע משליטה ו -איטי-1 (eg142) דגימות שהוכנו באמצעות nanobeads משתק. (א) דמויות מייצגות של פלואורסצנטית בסיסי באיטי-1 (eg142) מוטציות ובקרות, סרגל בקנה מידה 50 Μm. (ב) כימות של רמות זריחה בסיסית rcamp ב -איטי-1 (eg142) מוטציות (n = 29) והפקד (n = 13). (ג) ממוצע של מארעיות סידן מעורר עבור איטי-1 (eg142) מוטציות ושליטה. (ד) קוונפיקציה של שיא הזריחה rcamp בעקבות תגובת סידן מעורר ב -איטי-1 (eg142) מוטציות (n = 29) ובקרות (n = 13). (ה) הכמת של עלייתה לשיא הזמן של מוטאנטים סידן מעורר ב איטי-1 (eg142) מוטציות (n = 29) ובקרות (n = 13). (ו) הקוונפיקציה של מחצית הזמן של ריקבון הסידן מעורר ארעיות ב -איטי-1 (eg142) מוטציות (n = 11) ופקדים (n = 13). הדמות מותאמת מגיל19. ערכים משמעותיים סטטיסטית היו: לא משמעותי p > 0.05, * p ≤ 0.05, * * p ≤ 0.01, * * * p ≤ 0.001. קווי שגיאה מציגים משמעות ל-± SEM. נתונים נורמליות הוערך באמצעות בדיקות שפירא-וילק ומשמעותם הייתה נחושה במבחן מאן-ויטני להפצות שאינן נורמליות. דמות זו שונתה עם רשות מ19. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הסמנים הם כלי רב-עוצמה בנוירוביולוגיה. עבודה קודמת יש שימוש בטכניקות הדמיה סידן כדי לבחון מגוון רחב של פונקציות הן נוירונים ותאי שריר, כולל תגובות חישה והתנהגותית, עם שיטות מגוונות של גירוי. מחקרים מסוימים השתמשו גירויים כימיים כדי להפעיל מארעיות סידן בנוירונים אפר חושי22,23 או כדי לגרום לגלי סידן בשריר הלוע24. קבוצה נוספת מנוצל גירוי מכני בעוד תולעים הוחזקו בצ microflu, כדי לבחון תגובות סידן ב קולטן מגע נוירונים25. עדיין, אחרים המועסקים גירוי חשמלי כדי להמחיש שינויי סידן בנוירונים שניהם26 ושרירי הקיר הגוף27. מה שנפוץ בין מחקרים אלה הוא הדרישה של גירויים חיצוניים, כגון פתרונות או ציוד, כדי להפעיל מונאנטים סידן. הפרוטוקול המתואר כאן הפיכת על השליטה הנובעת מגירוי אלקטרואופטיקה, אשר מספק ספציפיות עצביים, בשילוב עם ניתוח פונקציונלי של שריר הביעהסמתיים היא 2 באותה פרדיגמה ניסויית.
שתי צורות של שינוי התולעת מתוארות, ואילו כל שיטה צריכה להיות מוערכת כאשר מדובר בצרכים ניסיוניים, הן הכנות שלמות והן מבחינה פיזיולוגית מפיקות תוצאות משלימות המאפשרות לחוקרים להשתמש בכל אחת מהגישה במחקר שלהם. יש אתגר טכני מוגבר לשימוש בטכניקת הניתוח, כאשר המשתמש נדרש לשלוט הן בשימוש מדויק של דבק כירורגי מיקרוניתובלי לפגוע בחוט העצב או השרירים. בנוסף, בשל רמת הקושי של הניתוח, יש להשתמש רק מבוגרים gravid, אשר יכול להגביל את נקודות הזמן ניסיוני. יתר על כן, טכניקת הניתוח היא גם הרבה יותר קשה לבצע על מוטציות המייצרים חיות קטנות, רזה, או חולני, שוב יכול להגביל את הפרמטרים הניסיוניים. היתרון של טכניקה זו הוא כי היא מגבילה את הגוף החפץ כתוצאה מדפולריזציה, הדבקה מונעת תנועה עודפת של הגוף של התולעת, וכן מספקת גישה NMJ עבור שינויים פתרון ויישומים התרופות. בנוסף, כל הכנה חושפת את אותו אזור של התולעת, אשר מבטיח שרירי הגוף יהיה בעקביות בפוקוס. הטכניקה השנייה, באמצעות nanobeads לשתק את התולעים, הוא פחות מעורב, ניתן ללמוד במהירות. כמו כן, כל גיל בעלי חיים ניתן להשתמש עם שיטה זו, המאפשר שינויים בסידן הטיפול באמצעות פיתוח להיות מנוטרים. אכפת צריך להילקח כאשר הצבת את התולעים לתוך הפתרון nanobead, כמו מניפולציה יותר מדי של בעלי חיים עלול לגרום להם להתפוצץ. כמו כן, אין להזיז את הכיסויים לאחר שהונחו על גבי בעלי החיים, שכן הדבר עלול לגרום לבעלי החיים להתגלגל או להתהפך על עצמם, ששוב יגרמו לנזק. למרות השימוש nanobeads יכול לספק שיטת תפוקה גבוהה שבה בעלי החיים יכולים להיות התאושש, אין סטנדרטיזציה של מיקום הגוף של החיה, ולכן כל חיה לא יכול להיות שרירי הקיר הגוף במישור מוקד ברור. אם הניסוי קורא למספר רב של בעלי חיים, שיטות שונות של השתק עשוי להיות נחוץ, כגון אגר מבוססי מיקרו-בארות, אשר מאפשרים הדמיה בצובר סידן פלואורסצנטית28. ללא קשר למגבלות של שתי טכניקות אלה, או יכול להיות מנוצל כדי להשיג אמין, בקלות הניתנות לכימות הסידן בתוך שרירי הגוף C. אלגיה .
ג. אלגיה מספקים יתרונות רבים כמערכת vivo ללימודי הדמיה פונקציונלית. בעלי החיים הם שקופים, המאפשרים את הזיווג של אלקטרואופטיקה נוירוגנטית באמצעות שימוש במתקשרים באמצעות מתקשר עם מחנה הסמאני למדוד את מעבר הסידן שהתקבל הפוסט-סינפטית בשריר. טרום גירוי רמות של RCaMP פלואורסצנטית יכול לשמש גם כדי להעריך את רמות הסידן cytosolic בסיסית. ההשפעה הגנטית של הג הופך את המחקר של מוטציות הרומן שעלולות להשפיע על הומאוסטזיס סידן או טיפול קל לרדוף, לעתים קרובות עם מוטציה זמין בקלות. שימוש בטכניקות המתוארות בפרוטוקול זה, נתונים ליצירת הדמיה של סידן סינפטית ניתן להשיג ביעילות בעלות נמוכה יחסית, מה שהופך את זה למערכת אטרקטיבית עבור מגוון רחב של ניסויי דימות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחברים מודים לד ר אלכסנדר גוטשאלק עבור ZX1659, RCaMP והמתקשרים המכילים זן התולעת, ד ר Hongkyun קים עבור מאמץ התולעת איטי-1 (eg142) , ואת הפרויקט הלאומי Bioresource עבור מאמץ של לסרוק -1 (tm5339) תולעת.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| all-trans retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | Necessary for excitation of channel rhodopsin |
| Amber LED | RCaMP illumination | ||
| Arduino UNO | Mouser | 782-A000066 | Controls fluorescence illumination |
| Blue LED | channelrhodopsin illumination | ||
| BX51WI microscope | Olympus | Fixed state compound microscope | |
| Current controlled low noise linear power supply | Ametek | Sorenson | Controls LED intensity |
| Igor Pro | Wavemetrics | Wavemetrics.com | Graphing software |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov | Image processing software |
| LUMFLN 60x water NA 1.4 | Olympus | Water immersion objective for dissected preparation | |
| Master-8 Stimulator | A.M.P.I | Master timer for image acquisition and LED illumination | |
| Micro-Manager | micro-manager.org | Controls camera acquisition and LED excitiation | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| pco.edge 4.2 CMOS camera | pco. | 4.2 | High-speed camera |
| PlanApo N 60x oil NA 1.4 | Olympus | Oil immersion objective for nanobead preparation | |
| Polybead microspheres | Polysciences, Inc. | 00876-15 | For worm immobilization |
| solid state switches | Sensata Technologies | Crydom CMX100D6 | Controls timing of LED illumination |
| Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | SY1627 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele |
| Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele | |
| Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Gottschalk Lab | ZX1659 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line |
References
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).
- Nagel, G., et al. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Current Biology. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Liewald, J. F., et al.
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L.
- Lewis, J. A., et al. Cholinergic Receptor Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).
- Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature Neuroscience. 9, 791-798 (1999).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization. PLoS ONE. 8 (1), 1-6 (2013).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using umanager. Current Protocols in Molecular Biology. (Suppl 92), 1-17 (2010).
- Richmond, J. Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction. Journal of Visualized Experiments. (24), 1-4 (2009).
- Hoon Cho, J., Bandyopadhyay, J., Lee, J., Park, C. S., Ahnn, J. Two isoforms of sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) are essential in Caenorhabditis elegans. Gene. 261, 211-219 (2000).
- Zwaal, R. R., et al. The Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase Is Required for Development and Muscle Function in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (47), 43557-43563 (2001).
- Stammers, A. N., et al. The regulation of sarco(endo)plasmic reticulum calcium-ATPases (SERCA). Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93, 1-12 (2015).
- Clapham, D. E.
- Hovnanian, A. Serca pumps and human diseases. Calcium Signalling and Disease: Molecular Pathology of Calcium. , 337-363 (2007).
- Periasamy, M., Kalyanasundaram, A. SERCA pump isoforms: Their role in calcium transport and disease. Muscle and Nerve. 35 (4), 430-442 (2007).
- Gehlert, S., Bloch, W., Suhr, F. Ca2+-Dependent Regulations and Signaling in Skeletal Muscle: From Electro-Mechanical Coupling to Adaptation. International Journal of Molecular Sciences. 16, 1066-1095 (2015).
- Martin, A. A., Richmond, J. E. The sarco(endo)plasmic reticulum calcium ATPase SCA-1 regulates the Caenorhabditis elegans nicotinic acetylcholine receptor ACR-16. Cell Calcium. 72, 104-115 (2018).
- Wang, Z., Saifee, O., Nonet, M. L., Salkoff, L. SLO-1 Potassium Channels Control Quantal Content of Neurotransmitter Release at the C. elegans Neuromuscular Junction. Neuron. 32, 867-881 (2001).
- Abraham, L. S., Oh, H. J., Sancar, F., Richmond, J. E., Kim, H. An Alpha-Catulin Homologue Controls Neuromuscular Function through Localization of the Dystrophin Complex and BK Channels in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 6 (8), 1-13 (2010).
- Gourgou, E., Chronis, N. Chemically induced oxidative stress affects ASH neuronal function and behavior in C. elegans. Scientific Reports. 6, 1-9 (2016).
- Zahratka, J. A., Williams, P. D. E., Summers, P. J., Komuniecki, R. W., Bamber, B. A. Serotonin differentially modulates Ca2+ transients and depolarization in a C. elegans nociceptor. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1041-1050 (2015).
- Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26 (3), 583-594 (2000).
- Nekimken, A. L., et al. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. 17 (6), 1116-1127 (2017).
- Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (74), 1-9 (2013).
- Jospin, M., Jacquemond, V., Mariol, M. C., Ségalat, L., Allard, B. The L-type voltage-dependent Ca2+channel EGL-19 controls body wall muscle function in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 159 (2), 337-347 (2002).
- Wabnig, S., Liewald, J. F., Yu, S., Gottschalk, A. High-Throughput All-Optical Analysis of Synaptic Transmission and Synaptic Vesicle Recycling in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. , 1-26 (2015).
