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Biochemistry

सी elegans शरीर की दीवार की मांसपेशियों में Vivo कैल्शियम इमेजिंग में

Published: October 20, 2019 doi: 10.3791/59175
Automatic Translation
1,2, 3, 1
1Department of Biological Sciences, University of Illinois at Chicago, 2Department of Integrative Biology and Physiology, University of Minnesota, 3Department of Anatomy and Cell Biology, University of Illinois at Chicago

Summary

इस विधि से दो ऑप्टोजेनेटिक्स और आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम सेंसरों को छवि आधारभूत साइटोसोलिक कैल्शियम के स्तर और मॉडल जीव सी एलिगेंसके शरीर की दीवार की मांसपेशियों में कैल्शियम यात्रियों में परिवर्तन करने का एक तरीका मिलता है .

Abstract

मॉडल जीव सी elegans विवो कैल्शियम इमेजिंग में प्रदर्शन करने के लिए एक उत्कृष्ट प्रणाली प्रदान करता है। इसके पारदर्शी शरीर और आनुवंशिक manipulability आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम सेंसर के लक्षित अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देते हैं. इस प्रोटोकॉल लक्षित कोशिकाओं में कैल्शियम गतिशीलता के in vivo इमेजिंग के लिए इन सेंसरों के उपयोग की रूपरेखा, विशेष रूप से कीड़े के शरीर की दीवार की मांसपेशियों. presynaptic channelrhodopsin के सह-अभिव्यक्ति का उपयोग करके, उत्तेजक मोटर न्यूरॉन्स से acetylcholine रिलीज की उत्तेजना नीले प्रकाश दालों का उपयोग कर प्रेरित किया जा सकता है, मांसपेशियों depolarization और कोशिकाद्रव्यी कैल्शियम में reproducible परिवर्तन में जिसके परिणामस्वरूप स्तर. दो कृमि स्थिरीकरण तकनीकों की चर्चा कठिनाई के विभिन्न स्तरों के साथ की जाती है। इन तकनीकों की तुलना दर्शाता है कि दोनों दृष्टिकोण neuromuscular जंक्शन के शरीर क्रिया विज्ञान की रक्षा और कैल्शियम यात्रियों के reproduible परिमाणीकरण के लिए अनुमति देते हैं. optogenetics और कार्यात्मक कैल्शियम इमेजिंग बाँधना द्वारा, postsynaptic कैल्शियम हैंडलिंग और homeostasis में परिवर्तन उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि की एक किस्म में मूल्यांकन किया जा सकता है. प्रस्तुत डेटा दोनों स्थिरीकरण तकनीकों की पुष्टि करता है और विशेष रूप से सी elegans सार्को (एंडो) की भूमिकाओं की जांच करता है-प्लासी रेटिकल कैल्शियम ATPase और शरीर की दीवार मांसपेशी कैल्शियम विनियमन में कैल्शियम सक्रिय बी के पोटेशियम चैनल।

Introduction

यह पेपर ऑप्टोजेनेटिक न्यूरोनल उत्तेजना का उपयोग करके सी एलिगन ्स्स ्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स एक मांसपेशी व्यक्त आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम सूचक (जीसीआई) नीले प्रकाश के साथ तंत्रिका depolarization ट्रिगर और स्पष्ट रूप से पैदा पदों का निरीक्षण करने के लिए एक प्रणाली प्रदान करता है कैल्शियम क्षणिक. यह विद्युत उत्तेजना के उपयोग से बचा जाता है, पदों को प्रभावित करने वाले म्यूटेंट के एक गैर इनवेसिव विश्लेषण की अनुमति देता है।

जीकेएमपी जैसे सिंगल-फ्लोरोफोर जीईसी, सी-टर्मिनस में मायोसिन लाइट चेन काइनेज के एम 13 डोमेन से जुड़े एकल फ्लोरोसेंट प्रोटीन अणु का उपयोग करता है। कैल्शियम बाइंडिंग पर, केईएम डोमेन, जिसमें कैल्शियम के लिए उच्च आत्मीयता होती है, एक अनुरूपता परिवर्तन से गुजरता है जो फ्लोरोसेंट प्रोटीन में बाद में अनुरूप परिवर्तन को प्रेरित करता है जिससे फ्लोरोसेंट तीव्रता1में वृद्धि होती है। GCAMP फ्लोरोसेंट 488 एनएम पर उत्साहित है, यह channelrhodopsin, जो 473 एनएम की एक समान उत्तेजना तरंगदैर्ध्य है के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए अनुपयुक्त बना रही है. इस प्रकार, चैनलहोडोप्सिन उत्तेजना के साथ कुछ कैल्शियम माप के लिए, जीकेएमपी के हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन को लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन, एमRuby (RCaMP) के साथ प्रतिस्थापित करने की आवश्यकता है। मांसपेशियों को व्यक्त RCAMP का उपयोग करना, channelrhodopsin के कोलीनर्जिक मोटर न्यूरॉन अभिव्यक्ति के साथ संयोजन में, एक ही जानवर के भीतर optogenetics और कार्यात्मक इमेजिंग के एक साथ उपयोग के साथ कीड़ा neuromuscular जंक्शन (NMJ) पर अध्ययन की अनुमति देता है 2.

चैनलहोडोप्सिन का उपयोग सी एलिगनके न्यूरोमस्क्युलर जंक्शनों को अस्थिर करने के लिए विद्युत उत्तेजना की आवश्यकता को नजरअंदाज करता है, जो केवल विच्छेदन की तैयारी में प्राप्त किया जा सकता है, इस प्रकार इस तकनीक को रोजगार के लिए आसान और अधिक सटीक दोनों बनाता है जब विशिष्ट ऊतकों को लक्षित. उदाहरण के लिए, channelrhodopsin पहले सी elegans में इस्तेमाल किया गया है reversibly विशिष्ट न्यूरॉन्स को सक्रिय करने के लिए, उत्तेजक या निरोधात्मक न्यूरॉन्स के या तो मजबूत सक्रियण के लिए अग्रणी3,4. प्रकाश-उत्तेजित depolarization का उपयोग भी प्रत्यक्ष विद्युत उत्तेजना के कारण न्यूरॉन क्षति के मुद्दे को दरकिनार. यह कई अलग अलग उत्तेजना प्रोटोकॉल के प्रभाव की जांच करने का अवसर प्रदान करता है, निरंतर और दोहराया उत्तेजना सहित, postsynaptic कैल्शियम गतिशीलता4पर.

सी elegans की पारदर्शी प्रकृति यह फ्लोरोसेंट इमेजिंग कार्यात्मक विश्लेषण के लिए आदर्श बनाता है. हालांकि, जब NMJ पर उत्तेजक acetylcholine न्यूरॉन्स उत्तेजक, जानवरों के लिए एक तत्काल मांसपेशियों में संकुचन के साथ प्रतिक्रिया की उम्मीद कर रहे हैं4, असतत कैल्शियम परिवर्तन visualizing में महत्वपूर्ण कीड़े की immobilization बनाने. परंपरागत रूप से, औषधीय एजेंटों जानवरों को लकवा मार करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। ऐसी ही एक दवा का इस्तेमाल किया जाता है लेविमिसोल , एक कोलीनर्जिक एसीटाइलकोलिन रिसेप्टर एगोनिस्ट5,6,7. चूंकि levamisole उत्तेजक मांसपेशी रिसेप्टर्स के एक उपप्रकार के लगातार सक्रियण की ओर जाता है, इस अभिकर्मक मांसपेशियों कैल्शियम गतिशीलता के अध्ययन के लिए अनुपयुक्त है. लेवैमिसोल की क्रिया पोस्टिनैप्टिक विध्रुवण को प्रेरित करती है, साइटोसोलिक कैल्शियम को ऊपर उठाती है, और presynaptic उत्तेजना के बाद अवलोकन ों को रोक देती है। लकवाग्रस्त दवाओं के उपयोग से बचने के लिए, हमने सी एलिगनको स्थिर करने के लिए दो वैकल्पिक तरीकों की जांच की। जानवरों को या तो चिपका दिया गया था और फिर शरीर की दीवार की मांसपेशियों को उजागर करने के लिए खुला विच्छेदन किया गया था, मौजूदा सी एलिगन NMJ इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी विधि8के समान , या नैनोबीड का उपयोग बरकरार जानवरों को स्थिर करने के लिए किया गयाथा 9. दोनों प्रक्रियाओं आराम के reproduible माप के लिए अनुमति दी और मांसपेशियों कैल्शियम यात्रियों कि आसानी से परिमाणात्मक थे पैदा की.

इस कागज में तरीकों का उपयोग बेसलाइन साइटोसोलिक कैल्शियम के स्तर को मापने के लिए किया जा सकता है और सी एलिगन्समें पोस्टिनैप्टिक शरीर की दीवार मांसपेशियों की कोशिकाओं में यात्रियों को मापने के लिए किया जा सकता है। दो अलग-अलग स्थिरीकरण तकनीकों को नियोजित करने वाले आंकड़ों के उदाहरण दिए गए हैं। दोनों तकनीकों optogenetics का लाभ लेने के लिए विद्युत उत्तेजना के उपयोग के बिना मांसपेशियों की कोशिकाओं depolarize. ये उदाहरण उत्परिवर्तनों के मूल्यांकन में इस विधि की व्यवहार्यता प्रदर्शित करते हैं जो कीड़े में पोस्टीनैप्टिक कैल्शियम हैंडलिंग को प्रभावित करते हैं और दो स्थिरीकरण दृष्टिकोणों के पेशेवरों और विपक्षों को इंगित करते हैं।

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Protocol

1. माइक्रोस्कोप सेटअप

  1. फ्लोरोसेंट क्षमताओं के साथ एक यौगिक माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें. इस अध्ययन के लिए, उत्तेजित करने के लिए एल ई डी से सुसज्जित एक ईमानदार सूक्ष्मदर्शी (सामग्री की तालिका) पर डेटा एकत्र किए गए थे।
  2. आदेश में ठीक से शरीर की दीवार की मांसपेशियों में फ्लोरोसेंट परिवर्तन कल्पना करने के लिए, एक उच्च आवर्धन उद्देश्य का उपयोग करें.
    1. विच्छेदित तैयारी के लिए 60x एनए 1.0 जल विसर्जन उद्देश्य (सामग्री की तालिका) का उपयोग करें।
    2. नैनोबीड्स का उपयोग करने की तैयारी के लिए, 60x एनए 1.4 तेल विसर्जन उद्देश्य(सामग्री की तालिका) काउपयोग करें। इस आवर्धन कैमरा सेंसर पर मांसपेशियों के पर्याप्त संकल्प सुनिश्चित करता है.
  3. एक उच्च संवेदनशीलता एक उच्च फ्रेम दर पर छवियों पर कब्जा करने के लिए आदेश में कैल्शियम के स्तर में तेजी से परिवर्तन को ट्रैक करने के लिए माइक्रोस्कोप से जुड़ी कैमरा का प्रयोग करें. इस अध्ययन के लिए, एक SCMOS प्रणाली के साथ छवि (सामग्री की तालिका) 100 हर्ट्ज पर पूर्ण फ्रेम इमेजिंग में सक्षम, के रूप में वृद्धि बार के लिए Ca 2+ संकेतों के रूप में के रूप में तेजी से हो सकता है मिलीसेकंड के दसियों.
  4. नियंत्रण कैमरा अधिग्रहण और एलईडी फ्लोरोसेंट उत्तेजना एक माइक्रो प्रबंधक सॉफ्टवेयर ImageJ10 में चल रहा है के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार (सामग्री की तालिका).
  5. एक खुला स्रोत इलेक्ट्रॉनिक मंच प्लगइन है, जो एक बाहरी खुला स्रोत microcontroller बोर्ड(सामग्री की तालिका)जोड़ता है का उपयोग करें, फ्लोरोसेंट उत्तेजना को नियंत्रित करने के लिए बाहरी समय दालों का प्रबंधन करने के लिए.
    नोट: डिजिटल बहिष्कार डिजिटल पिन से उपलब्ध हैं 8 करने के लिए 13 आउटपुट बिट्स प्रदान 0 करने के लिए 5. इन्हें 1, 10, 100 आदि के आधार 2 मूल्यों के रूप में संबोधित किया जा सकता है। सीरियल पोर्ट सेटिंग्स तालिका 1 में इंगित कर रहे हैं और माइक्रो प्रबंधक वेबसाइट से उपलब्ध (सामग्री की तालिका). माइक्रोकंट्रोलर बोर्ड के लिए फर्मवेयर इसी तरह इस वेबसाइट पर उपलब्ध है.
  6. समय तर्क को नियंत्रित करने के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार सॉफ्टवेयर में micromanager अधिग्रहण प्रोटोकॉल सक्रिय (सामग्री की तालिका).
    नोट: यह एक साथ एक पूर्व निर्धारित कैमरा फ्रेम अवधि और सक्रिय किया जा करने के लिए फ्रेम की संख्या, साथ ही तार्किक शटर और पूर्व निर्धारित एम्बर फ्लोरोसेंट उत्तेजना के लिए एलईडी शुरू होता है। इस स्थिति में, एम्बर एलईडी ठोस राज्य स्विच माइक्रोनियंत्रक बिट 1 आउटपुट पिन 9 के माध्यम से नियंत्रित किया जाता है। कैमरा TTL बाहर फ्रेम (वापस थाली बाहर 3 संबंधक) एक उत्तेजक चलाता है. यह ठीक बार इमेजिंग अनुक्रम के सक्रियण के बाद एक निर्धारित समय पर channelrhodopsin के सक्रियण के लिए एलईडी नीले प्रकाश के सक्रियण.
  7. नीले प्रकाश और रिकॉर्ड RCAMP परिवर्तन के साथ channelrhodopsin को प्रोत्साहित करने के लिए, दो एल ई डी का उपयोग करें. 470 एनएम और एक bandpass फिल्टर (455 से 490 एनएम) की एक चोटी उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के साथ एक एलईडी के साथ एक एलईडी के साथ channelrhodopsin सक्रिय करें और 594 nm और एक bandpass फिल्टर (570 से 600 एनएम) की एक चोटी उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के साथ एक एलईडी के साथ RCaMP उत्तेजित.
  8. एक साथ channelrhodopsin को सक्रिय करने और RCAMP फ्लोरोसेंट के स्तर में परिवर्तन पर कब्जा करने के लिए, सह एल ई डी रोशन और एक dichroic बीम कंबाइन का उपयोग कर एक ही ऑप्टिकल पथ के लिए प्रकाश संचारित.
  9. ठोस राज्य स्विच के साथ एलईडी रोशनी के समय को नियंत्रित (सामग्री की तालिका) TTL संकेतों द्वारा नियंत्रित (अधिकतम रेटेड बारी पर समय, 1 एमएस, बारी बंद समय 0.3 एमएस: 0 से 90% बारी पर और बंद समय के बंद कर देते हैं $lt; 100 $).
  10. वर्तमान नियंत्रित कम शोर रैखिक बिजली की आपूर्ति के साथ एलईडी तीव्रता सेट (सामग्री की तालिका).
  11. नीले प्रकाश एलईडी की सटीक समय सुनिश्चित करने के लिए, यह एक stimulator से ठोस राज्य रिले करने के लिए TTL नाड़ी द्वारा सीधे सक्रिय करें. एक stimulator में नीले प्रकाश उत्तेजना प्रोटोकॉल कार्यक्रम (सामग्री की तालिका),जो छवि अधिग्रहण के शुरू से नीले एलईडी रोशनी के लिए एक सटीक टाइमर के रूप में कार्य करता है. इस प्रयोग में, केवल RCAMP फ्लोरोसेंट पर कब्जा करने के 2 s के बाद नीले प्रकाश उत्तेजना पर बारी और 5, 2 एमएस नीले प्रकाश दालों की एक ट्रेन का उपयोग करें 50 एमएस interpulse अंतराल के साथ channelrhodopsin सक्रिय करने के लिए.
    नोट: नीले प्रकाश दालों से पहले देरी, नीले प्रकाश दालों की अवधि, दालों के बीच समय, और ट्रेन में दालों की संख्या सभी इस बिंदु पर सेट किया जा सकता है और प्रयोगात्मक ब्याज के विशिष्ट मापदंडों को प्रतिबिंबित करना चाहिए.

2. सी elegans नमूना तैयारी और डेटा अधिग्रहण

  1. ऑप्टिकली presynaptic न्यूरॉन्स को प्रोत्साहित करने के लिए, उत्तेजक कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स में channelrhodopsin व्यक्त जानवरों को प्राप्त, unc-17 प्रमोटर क्षेत्र के साथ संचालित, और RCAMP मायो-3 प्रमोटर के साथ संचालित सभी शरीर की दीवार की मांसपेशियों में व्यक्त क्षेत्र2|
    नोट: केवल एकीकृत transgenes और फ्लोरोसेंट के मजबूत स्तर के साथ पशुओं के उपयोग की सिफारिश कर रहे हैं के रूप में इसी सेल प्रकार में चर अभिव्यक्ति डेटा अधिग्रहण की विश्वसनीयता को प्रभावित कर सकता है.
  2. एथेनॉल में रेटिना पाउडर (सामग्री की तालिका) को कम करके सभीट्रांस रेटिना का कार्य स्टॉक बनाकर 100 उम की अंतिम सांद्रता बनायें तथा -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। यह कार्य स्टॉक लगभग एक वर्ष के लिए स्थिर होगा।
  3. OP50 ई. कोलाईका एक स्टॉक बनाएँ, LB मीडिया में उगाया, काम कर रहे शेयर से सभीट्रांस रेटिना के साथ पूरक चरण 2.2 में किए गए, 80 डिग्री सेल्सियस की एक अंतिम एकाग्रता पर. OP50+ रेटिना स्टॉक के लिए उपयोग किया जाने वाला वॉल्यूम प्रयोग के लिए आवश्यक प्लेटों की संख्या पर निर्भर करेगा।
  4. बीज सूत्रकृमि विकास मीडिया (एनजीएम) प्लेटें जिसमें ओपी 50+रेटिनल स्टॉक का लगभग 300 डिग्री सेल्सियस होता है और प्लेटों को अंधेरे में कमरे के तापमान पर रात भर सूखने की अनुमति दी जाती है।
  5. 20 डिग्री सेल्सियस पर OP50 + रेटिना एनबीएम प्लेटों पर अंधेरे में वांछित उम्र के लिए सी elegans उपभेदों हो। इस प्रयोग के लिए, वयस्क कीड़े का उपयोग करें.
    1. विच्छेदन तैयारी का उपयोग कर प्रयोग के लिए, केवल छोटे, छोटे जानवरों पर विच्छेदन प्रदर्शन के रूप में gravid वयस्क कीड़े का उपयोग अत्यंत चुनौतीपूर्ण है. एक प्रभावी channelrhodopsin सक्रियण के लिए कम से कम 3 दिनों के लिए OP50-रेटिना प्लेटों पर जानवरों को छोड़ दें।
  6. यदि विच्छेदित तैयारी8,11 ( चित्र1क)का प्रयोग करते हैं , तो कम प्रकाश में विच्छेदन करें।
    1. एक सिलिकॉन लेपित कवरस्लिप बेस के साथ एक विच्छेदन डिश में जानवरों को रखें जो 1 एमएम सीए2+ एक्स्ट्रासेल्यूलर समाधान से भरा होता है जिसमें 150 एमएम नैकल, 5 एमएम केसीएल, 1 एमएम सीएसीएल2,4 एमएम एमजीसीएल2,10 एमएम ग्लूकोज, 5 एमएम सुक्रोज, और 15 एमएम एचईपी (पीएच 7.3) से भरा हुआ है। , -340 Osm).
    2. कीड़ा के पृष्ठीय पक्ष के साथ नीले रंग के साथ तरल सामयिक त्वचा चिपकने वाला का उपयोग कर जानवरों नीचे गोंद और कांच की सुइयों का उपयोग कर गोंद /
    3. कृमि गुहा से आंतरिक विसरा को साफ करने के लिए एक मुंह पिपेट का उपयोग करें।
    4. इमेजिंग के लिए अधर मध्यस्थ शरीर की दीवार की मांसपेशियों को बेनकाब करने के लिए जानवर के क्यूटिकल फ्लैप को गोंद।
  7. यदि नैनोबीड तैयारी का उपयोग किया जाता है (चित्र 1ख)
    1. 100 एमएल के अंतिम आयतन में डीडीएच2ओ का उपयोग करके पिघला हुआ 5% अगारोस विलयन बनाएं।
    2. एक पास्चर पिपेट का उपयोग करना, एक गिलास स्लाइड पर पिघला हुआ agarose समाधान की एक बूंद जगह है और तुरंत शीर्ष पर एक दूसरे गिलास स्लाइड जगह, पहले के लंबवत, कोमल दबाव का उपयोग करने के लिए एक भी agarose पैड बनाने के लिए. उपयोग करने से पहले शीर्ष स्लाइड निकालें.
    3. अगारोस पैड के मध्य में लगभग 4 डिग्री सेल्सियस पॉलीस्टाइरीन नैनोबीड्स (सामग्री की तालिका) जोड़ें।
    4. कम रोशनी में, नैनोबीड समाधान में 4-6 सी एलिगन चुनें, सुनिश्चित करें कि जानवर एक दूसरे के ऊपर नहीं रखना चाहते हैं, और ध्यान से शीर्ष पर एक कवरस्लिप रखें।
  8. तैयार स्लाइड या विच्छेदन डिश माइक्रोस्कोप पर रखें, और खोजने के लिए और 10x आवर्धन और मंद उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी का उपयोग कर एक कीड़ा पर ध्यान केंद्रित।
  9. 60x आवर्धन और RCAMP फ्लोरोसेंट उत्तेजना के लिए स्विच करने के लिए एक ventromedial शरीर की दीवार की मांसपेशियों है कि योनी के लिए पूर्वकाल है और सही फोकल विमान में की पहचान.
    नोट: योनी के लिए पूर्वकाल मांसपेशियों का चयन कर रहे हैं के रूप में वे मांसपेशियों को प्रतिबिंबित आमतौर पर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगों में प्रेरित.
  10. टोगल बाहर खींच और डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर (सामग्री कीतालिका)के भीतर लाइव क्लिक करके कैमरे के लिए नेत्रिका से छवि मार्ग बदलें.
    नोट: सुनिश्चित करें कि नीले प्रकाश उत्तेजना मार्ग इस बिंदु पर बंद कर दिया है सुनिश्चित करने के लिए कि channelrhodopsin छवियों पर कब्जा करने से पहले सक्रिय नहीं मिलता है.
  11. माइक्रोस्कोप ठीक ध्यान का उपयोग कर डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के भीतर छवि फोकस.
  12. एक बार जब मांसपेशी ध्यान में स्पष्ट रूप से है, लाइव बटन पर क्लिक करके लाइव छवि बंद कर देते हैं.
  13. डेटा प्राप्ति सॉफ़्टवेयर में ROI बटन क्लिक करें और उस पर केंद्रित होने वाले मांसपेशी के आस-पास एक बॉक्स बनाएँ.
  14. stimulator पर, नीले प्रकाश उत्तेजना मार्ग है कि पहले चरण 1.10 में क्रमादेशित किया गया है पर स्विच.
  15. समोस कैमरा के माध्यम से छवि को कैप्चर करने के लिए इमेजिंग सॉफ़्टवेयर में प्राप्त करें क्लिक करें. ऐसा करने के लिए, 1,000 फ्रेम और 2x binning के साथ 10 s करने के लिए जोखिम समय सेट.

3. डेटा विश्लेषण

  1. इमेजिंग सॉफ्टवेयर में डेटा फ़ाइल खोलें (सामग्री की तालिका)और, बहुभुज उपकरणका उपयोग कर, ब्याज की मांसपेशियों की रूपरेखा. यह ROI है.
  2. छवि पर जाएँ | ढेर ] प्लॉट जेड-अक्ष प्रोफ़ाइल और स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर(सामग्री की तालिका) में जिसके परिणामस्वरूप डेटा अंक निर्यात करते हैं। यह फ़ंक्शन ROI चयन माध्य मान बनाम समय बिंदु को प्लॉट करता है.
  3. 3.2 में उल्लिखित चरणों का उपयोग करके पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट माप प्राप्त करने के लिए जानवर के बाहर बहुभुज उपकरण के साथ बनाई गई मांसपेशी ROI को ले जाएँ. परिणामी डेटा को स्प्रेडशीट कार्यपुस्तिका में निर्यात करें.
  4. स्प्रेडशीट कार्यपुस्तिका में, प्रत्येक समय बिंदु पर मांसपेशी फ्लोरोसेंट मानों से पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट मान घटाएँ. यह पृष्ठभूमि घटाया फ्लोरोसेंट संकेत प्रदान करता है.
  5. औसत पृष्ठभूमि डेटा बिंदुओं के पहले 2 s के लिए फ्लोरोसेंट घटाया. यह आधारभूत फ्लोरोसेंट माप, एफ दे देंगे.
  6. प्रत्येक समय बिंदु पर सामान्यीकृत फ्लोरोसेंट स्तर की गणना करने के लिए आधारभूत फ्लोरोसेंट माप का उपयोग करें। ऐसा करने के लिए, समीकरण ([F/F)+1 का उपयोग करें। [F (F(t)-F) का प्रतिनिधित्व करता है, जहां F(t) किसी दिए गए समय बिंदु पर फ्लोरोसेंट माप है और F आधार रेखा मान है। +1 y-अक्ष ऑफ़सेट के रूप में जोड़ा जाता है।
  7. चरण दोहराएँ 3-2-3.6 प्रत्येक मांसपेशी छवि है कि संग्रहीत किया जाता है के लिए. प्रति छवि एक या एकाधिक मांसपेशियों की कोशिकाओं का उपयोग शोधकर्ता के विवेक पर है. प्रयोग के n एक शक्ति विश्लेषण प्रदर्शन करके निर्धारित किया जा सकता है.
  8. निर्माता के निर्देशों के अनुसार सॉफ्टवेयर ग्राफिंग में फ्लोरोसेंट मूल्यों का पता लगाने के लिए चरण 3-2-3.6 से संसाधित डेटा का उपयोग करें (सामग्री की तालिका)।
  9. इस ट्रेस से, निर्माता के निर्देशों के अनुसार ग्राफिंग सॉफ्टवेयर में प्रदान किए गए उपकरणों का उपयोग करते हुए, कैल्शियम क्षणिक की गतिज माप, जैसे पीक समय और आधा क्षय समय तक वृद्धि।

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Representative Results

इस तकनीक उत्परिवर्ती में परिवर्तन का मूल्यांकन कैल्शियम हैंडलिंग या मांसपेशियों depolarization को प्रभावित करने के लिए सोचा. बेसलाइन फ्लोरोसेंट स्तर और फ्लोरोसेंट यात्रियों कल्पना और मांसपेशियों के भीतर cytosolic कैल्शियम और कैल्शियम गतिज आराम कर रहे थे मूल्यांकन किया गया. यह महत्वपूर्ण है कि पशुओं को रेटिना के सफल समावेश को सुनिश्चित करने के लिए कम से कम तीन दिनों के लिए सभी-ट्रांस रेटिना पर उगाया गया था, जिससे बाद में चैनलहोडोप्सिन को सक्रिय किया गया (चित्र 2ए)। यदि जंतुओं को सभी-ट्रांस रेटिना के संपर्क में नहीं लिया जाता है, तो कोई मांसपेशी कैल्शियम क्षणिका नहीं होता है(चित्र 2ठ)। हालांकि इन जानवरों को अभी भी आधारभूत cytosolic कैल्शियम के स्तर का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, कैल्शियम में किसी भी गतिशील परिवर्तन पर कब्जा नहीं किया जाएगा. इसके अतिरिक्त, पशु या विच्छेदन स्वास्थ्य के लिए एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में, पशु नीले प्रकाश उत्तेजना के बाद अनुबंध होगा. एक मांसपेशी संकुचन है कि कीड़ा के शरीर की कम से कम सकल आंदोलन का कारण बनता है के साथ एक रिकॉर्डिंग डेटा संग्रह के लिए चयन किया गया था जब स्थिरीकरण के लिए नैनोबीड का उपयोग कर. यदि कच्चे फ्लोरोसेंट मूल्यों को इकट्ठा करने के लिए उपयोग की जाने वाली मांसपेशी जोरदार ढंग से अनुबंध करती है, जिससे कृमि का पूरा शरीर गति में आ जाता है, तो क्षणिक ट्रेस इस गति आर्टीफैक्ट (चित्र 2ब्) को प्रतिबिंबित करेगा और परिमाणीकरण से हटा दिया जाना चाहिए।

एससी-1 जीन टिड्डी के लिए एक उत्परिवर्तन मानचित्रण सी elegans मांसपेशी निकोटिनिक रिसेप्टर स्थानीयकरण को प्रभावित उत्परिवर्तनों के लिए एक स्क्रीन से अलग किया गया था। सी एलिगेंस एससीए-1 जीन कीड़ा में सार्को (एंडो) के केवल समलॉग को एन्कोड करता है और यह शरीर की दीवार की मांसपेशियों में मौजूद एकमात्र सेरका पंपहै 12,13. हानि के समारोह sca-1 म्यूटेंट स्तनधारी मांसपेशियों में कैल्शियम homeostasis को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका SERCA नाटकों के आधार पर मांसपेशियों में कैल्शियम हैंडलिंग में परिवर्तन प्रदर्शित करने के लिए भविष्यवाणी की गई थी14,15,16 ,17,18. GECI RCAMP शरीर की दीवार की मांसपेशियों में व्यक्त किया गया था और नीले प्रकाश सक्रिय channelrhodopsin उत्तेजक कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स में व्यक्त किया गया था दोनों intracellular आधार रेखा आधाररेखा कैल्शियम और sca-1 म्यूटेंट में कैल्शियम गतिशीलता का मूल्यांकन करने के लिए. विच्छेदन तैयारी तकनीक के साथ, नियंत्रण की तुलना में एससीए-1 उत्परिवर्ती में आरकेएमपी फ्लोरोसेंट के आधारभूत स्तर में वृद्धि देखी गई (चित्र 3ए, बी), यह सुझाव देते हुए कि SERCA फ़ंक्शन की हानि की ओर जाता है आराम कोशिका द्रव्यीय कैल्शियम का ऊंचा स्तर. जब कैल्शियम गतिशीलता की जांच की गई, के बाद presynaptic उत्तेजना 5 की एक ट्रेन के साथ ट्रिगर, 2 एमएस नीले प्रकाश दालों (चित्र 3सी),वहाँ sca-1 (tm5339) म्यूटेंट में चोटी कैल्शियम के स्तर में एक महत्वपूर्ण कमी थी के रूप में नियंत्रण की तुलना में (चित्र 3डी),जो एसआर में कम कैल्शियम भंडार को प्रतिबिंबित कर सकता है. तथापि, शिखर समय अथवा अर्ध क्षय काल में कोई परिवर्तन नहीं देखा गया (चित्र 3ई, थ्)। यह पता चलता है कि acetylcholine रिसेप्टर्स के माध्यम से कैल्शियम प्रवेश के रूप में या तो बाहरी स्रोत से cytosolic कैल्शियम में परिवर्तन पैदा की और / . इसी प्रकार के परिणाम नैनोबीड तैयारी का उपयोग करके देखे जा सकते हैं, जैसा कि चित्र 4 19में दर्शाया गया है। डेटा के इस recapitulation सबूत है कि इन तकनीकों के दोनों शरीर की दीवार मांसपेशियों cytoplasmic कैल्शियम के स्तर को आराम के रूप में अच्छी तरह से प्रेरित कैल्शियम यात्रियों को देखने को मापने के लिए शारीरिक हैं प्रदान करता है. यह भी दर्शाता है कि कीड़ा के विच्छेदन पशु है कि अपने कैल्शियम से निपटने या postsynaptic मांसपेशियों depolarize करने की क्षमता को बदल देता है को नुकसान का कारण नहीं है.

इस प्रोटोकॉल का उपयोग म्यूटेंट की जांच करने के लिए भी किया जा सकता है जो अप्रत्यक्ष रूप से सी एलिगन्समें कैल्शियम हैंडलिंग को प्रभावित करते हैं . समारोह slo-1 (eg142) म्यूटेंट की हानि इस प्रदर्शन के लिए मूल्यांकन किया गया. स्लो-1 जीन कैल्शियम-सक्रिय बीके पोटेशियम चैनल को एन्कोड करता है, जिसे न्यूरॉन्स और मांसपेशियों दोनों में व्यक्त किया जाता है20,21. अध्ययन ों ने पहले शरीर की दीवार की मांसपेशियों में SLO-1 के लिए एक भूमिका का वर्णन किया है, यह प्रदर्शित करता है कि कार्य उत्परिवर्ती की हानि में मांसपेशियों की कार्रवाई की क्षमता के बाद पोस्टीनैप्टिक पुनर्ध्रुवण में दोष होता है20,21. इस hyperexcitability के कारण आधारभूत कैल्शियम के स्तर और कैल्शियम क्षणिक गतिशीलता में संभावित परिवर्तन नैनोबीड स्थिरीकरण का उपयोग कर जांच की गई. जब RCaMP के आधारभूत स्तर मापा गया, slo-1 (eg142) उत्परिवर्ती नियंत्रण की तुलना में वृद्धि फ्लोरोसेंट प्रदर्शित (चित्र 5ए, बी)19. यह पता चलता है कि बी के चैनल भी cytosolic कैल्शियम के आधारभूत स्तर को विनियमित कर सकते हैं. उत्कश कैल्शियम क्षणिककी गतिज का मूल्यांकन करते समय नियंत्रण की तुलना में अधिकतम कैल्शियम स्तर में कोई परिवर्तन नहीं देखा गया (चित्र 5सी, डी)। स्लो-1 (उदाहरण 142) म्यूटेंट, तथापि, नियंत्रण की तुलना में चोटी के समय में काफी वृद्धि का प्रदर्शन किया (चित्र 5ई)। यह पूर्वासनापात्मक उत्तेगतता20,21में पहले से सूचित वृद्धि को प्रतिबिंबित कर सकता है . तथापि, नियंत्रण की तुलना में स्लो-1 (उदाहरण142) में आधे क्षय समय में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं हुआ (चित्र 5थ्)। एक साथ, इन आंकड़ों का प्रदर्शन है कि इस विधि के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पूर्व और postsynaptic उत्परिवर्तनों दोनों आराम और प्रेरित शरीर की दीवार मांसपेशियों कैल्शियम पर.

सीरियल सेटिंग मान
उत्तर टाइमआउट 500
बॉड दर 57600
DelayBetweenCharsMs 0
Handshaking बंद
समता कोई नहीं
स्टॉपBits 1
वर्बोज़ 0

तालिका 1: माइक्रोनियंत्रक प्लगइन के लिए सीरियल पोर्ट सेटिंग्स, जो एक बाहरी microcontroller बोर्ड को नियंत्रित करताहै। यह फ्लोरोसेंट उत्तेजना को नियंत्रित करने के लिए बाहरी समय दालों कार्यक्रम के लिए प्रयोग किया जाता है.

Figure 1
चित्र 1: विभिन्न स्थिरीकरण तकनीकों का आलेखीय निरूपण. (ए) यह ग्राफिक स्थिरीकरण के लिए विच्छेदन तकनीक को दर्शाता है. कृमि का शरीर जानवर के पृष्ठीय पक्ष के चारों ओर (नीला) चिपका हुआ है। क्यूटिकल के साथ एक पृष्ठीय चीरा एक क्यूटिकल फ्लैप उत्पन्न करता है। इस फ्लैप हरे रंग में अधर तंत्रिका कॉर्ड के synapses (channelrhodopsin) और RCAMP लाल रंग में मांसपेशियों को व्यक्त करने के बीच गठित बरकरार NMJs को बेनकाब करने के लिए नीचे चिपके हुए किया गया है. (बी) यह ग्राफिक नैनोबीड स्थिरीकरण तकनीक को दर्शाता है। बरकरार कीड़ा समाधान में नैनोबीड्स के एक प्रतिनिधित्व से घिरा हुआ है, कि जब overlying coverslip द्वारा संकुचित, कीड़ा स्थिर. सी elegansकी पारदर्शिता के कारण, अधर तंत्रिका कॉर्ड हरे रंग में कल्पना की जा सकती है (channelrhodopsin) और RCAMP मांसपेशियों को व्यक्त लाल रंग में कल्पना की जा सकती है. कृमि के बीच में अंडाभ योनी का प्रतिनिधित्व करता है, जो अधर शरीर की दीवार की मांसपेशियों की पहचान करने वाला एक मील का पत्थर है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: कैल्शियम यात्रियों के प्रतिनिधि निशान. (ए) एक कैल्शियम क्षणिक का एकल ट्रेस प्रतिनिधित्व 5, 2 एमएस नीले प्रकाश दालों की एक ट्रेन द्वारा 50 एमएस इंटरपल्स अंतराल पर पैदा की, सीमित शरीर आंदोलन के साथ एक जानवर में दर्ज (- आंदोलन) सभीट्रांस रेटिना की उपस्थिति में हो (+ सभी- ट्रांस रेटिना). कील कलाकृतियों नीले प्रकाश उत्तेजना दालों रहे हैं, के रूप में दोनों एल ई डी सह एक साथ रोशन कर रहे हैं. (B)एकल ट्रेस प्रतिनिधित्व 5 की एक ट्रेन के जवाब में एक कैल्शियम क्षणिक की अनुपस्थिति दिखा, 2 एमएस नीले प्रकाश दालों के साथ 50 एमएस interpulse अंतराल के साथ एक जानवर है कि सभीट्रांस रेटिना को उजागर नहीं किया गया है (- सभीट्रांस रेटिना , - आंदोलन). (ग) कैल्शियम क्षणिका का एकल ट्रेस प्रतिनिधित्व जो 5, 2 एमएस ब्लू लाइट दालों की एक गाड़ी द्वारा 50 एमएस इंटरपल्स अंतराल के साथ पैदा किया गया है, एक जानवर में दर्ज किया गया है जिसमें महत्वपूर्ण मांसपेशी संकुचन था जिससे आंदोलन कलाकृतियों (+ आंदोलन, + सर्वांत आदरणीय). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र ासान 3: आधार रेखा कैल्शियम का स्तर और नियंत्रण और एससीए-1 (tm5339) नमूनों से कैल्शियम यात्रियों को पैदा किया जो विच्छेदन तकनीक का उपयोग करके तैयार किए गए थे। (ए) sca-1 (tm5339) म्यूटेंट और नियंत्रण में आधारभूत RCaMP फ्लोरोसेंट के प्रतिनिधि छवियों. स्केल बार ] 50 डिग्री मी. (बी) बेसलाइन फ्लोरोसेंट स्तर एससीए-1 (tm5339) म्यूटेंट (एन जेड 13) और नियंत्रण (n$9) में परिमाणीकरण। (ग) एससी-1 (tm5339) म्यूटेंट और नियंत्रण जानवरों के लिए कैल्शियम यात्रियों को पैदा करने के एनसेंबल औसत निशान। (घ)चैनलहोडोप्सिन से पीक आरकेएमपी फ्लोरोसेंट के परिमाणीकरण से एससी-1 (टीएम5339) म्यूटेंट (एन जेड 12) और नियंत्रण (एनजेड9) में कैल्शियम प्रतिक्रियाएं पैदा हुई। (ई) चैनलहोडोप्सिन के उच्चतम समय तक वृद्धि की मात्रा निर्धारण से एससी-1 (टीएम5339) म्यूटेंट (एन जेड 12) और नियंत्रण (एन जेड8) में कैल्शियम क्षणिकाओं का जन्म हुआ। (च)चैनलहोडोप्सिन के अर्ध क्षय समय परिमाणीकरण से एससी-1 (टीएम5339) म्यूटेंट (एन जेड 12) और नियंत्रण (एनजेड7) में कैल्शियम क्षणिकाओं का उत्सर्जन हुआ। सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मूल्यों थे: नहीं महत्वपूर्ण पी और 0.05, * p $0.05, * * p$0.01, * * * p$0.001. त्रुटि सलाखों मतलब का प्रतिनिधित्व करते हैं - SEM. डेटा Shapiro-Wilk परीक्षण और महत्व का उपयोग कर सामान्यीकृत किया गया एक मान Whitney परीक्षण के साथ गैर सामान्य वितरण के लिए निर्धारित किया गया था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: बेसलाइन कैल्शियम का स्तर और नियंत्रण और sca-1 (tm5339) नैनोबीड स्थिरीकरण का उपयोग कर तैयार नमूनों से कैल्शियम यात्रियों पैदा की। (A) sca-1 (tm5339) म्यूटेंट और नियंत्रण में आधारभूत फ्लोरोसेंट के प्रतिनिधि छवियों, स्केल बार 50 डिग्री सेल्सियस (बी) sca-1 (tm5339) म्यूटेंट में आधाररेखा RCAMP फ्लोरोसेंट के स्तर के परिमाणीकरण (n$14) और नियंत्रण (n]13) . (सी) एससीए-1 (tm5339) म्यूटेंट और नियंत्रण के लिए कैल्शियम यात्रियों का उत्कंध का औसत। (घ)पीक आरकेएमपी फ्लोरोसेंट के परिमाणीकरण के बाद एससीए-1 (टीएम5339) म्यूटेंट (एन जेड 14) और नियंत्रण (एन जेड 13) में कैल्शियम प्रतिक्रिया पैदा हुई। (म) एससीए-1 (tm5339) म्यूटेंट (एन जेड 14) और नियंत्रण (एन जेड 12) में उत्परिवर्ती कैल्शियम यात्रियों के पीक समय तक वृद्धि की मात्रानिर्धारण। (च) एससी-1 (tm5339) म्यूटेंट (n$14) और नियंत्रण (n]13) में कैल्शियम यात्रियों के आधे क्षय समय की मात्रानिर्धारण। चित्र19से अनुकूलित है। सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मान थे: महत्वपूर्ण नहीं पी और 0.05, * पी $ 0.05, * * पी $ 0.01, * * * पी $ 0.001. त्रुटि सलाखों के शो मतलब मतलब - SEM. डेटा सामान्यता Shapiro-Wilk परीक्षण और महत्व का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था गैर सामान्य वितरण के लिए एक मान Whitney परीक्षण के साथ निर्धारित किया गया था. यह आंकड़ा19से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: बेसलाइन कैल्शियम का स्तर और नियंत्रण और slo-1 (eg142) नैनोबीड्स स्थिरीकरण का उपयोग कर तैयार नमूनों से कैल्शियम यात्रियों पैदा की। (क) स्लो-1 (eg142) म्यूटेंट और नियंत्रण में आधारभूत फ्लोरोसेंट की प्रतिनिधि छवियों, स्केल बार 50 डिग्री सेल्सियस (बी) स्लो-1 (eg142) म्यूटेंट (n $29) और नियंत्रण (n$13) में आधाररेखा RCAMP फ्लोरोसेंट स्तर का परिमाणीकरण। (ग) स्लो-1 (eg142) म्यूटेंट और नियंत्रण के लिए कैल्शियम क्षणिकों का उत्कंधकाए औसत। (छ) स्लो-1 (उदा142) म्यूटेंट (एन जेड 29) और नियंत्रण (एन जेड 13) में कैल्शियम की प्रतिक्रिया के बाद शिखर आरकेएमपी फ्लोरोसेंट का परिमाणीकरण। (ई) स्लो-1 (eg142) म्यूटेंट (n ]29) और नियंत्रण (n$13) में उत्परिवर्ती कैल्शियम यात्रियों के पीक समय तक वृद्धि की मात्रा( । (च) स्लो-1 (उदा142) म्यूटेंट (एन जेड111) और नियंत्रण (एन जेड 13) में उत्परिवर्ती कैल्शियम यात्रियों के आधे क्षय समय का परिमाणीकरण। चित्र19से अनुकूलित है। सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मान थे: महत्वपूर्ण नहीं पी और 0.05, * पी $ 0.05, * * पी $ 0.01, * * * पी $ 0.001. त्रुटि सलाखों के शो मतलब मतलब - SEM. डेटा सामान्यता Shapiro-Wilk परीक्षण और महत्व का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था गैर सामान्य वितरण के लिए एक मान Whitney परीक्षण के साथ निर्धारित किया गया था. यह आंकड़ा19से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

GECIs सी elegans न्यूरोबायोलॉजी में एक शक्तिशाली उपकरण हैं. पिछले काम कैल्शियम इमेजिंग तकनीक का उपयोग किया है दोनों न्यूरॉन्स और मांसपेशियों की कोशिकाओं में कार्यों की एक विस्तृत विविधता की जांच करने के लिए, संवेदी और व्यवहार प्रतिक्रियाओं सहित, उत्तेजना के विभिन्न तरीकों के साथ. कुछ अध्ययनों में रासायनिक उद्दीपकों का प्रयोग संवेदी एएसएच न्यूरॉन्स22,23 में कैल्शियम यात्रियों को गति प्रदान करने के लिए या ग्रसनी की पेशियों में कैल्शियम तरंगों को प्रेरित करने के लिएकियागया है . एक अन्य समूह ने यांत्रिक उत्तेजना का उपयोग किया जबकि कीड़े स्पर्श रिसेप्टर न्यूरॉन्स25में कैल्शियम प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए माइक्रोफ्लूइडिक चिप्स में रखे गए थे . फिर भी, दूसरों को बिजली उत्तेजना का र्यरत है दोनों न्यूरॉन्स26 और शरीर की दीवार की मांसपेशियों में कैल्शियम परिवर्तन कल्पना27. क्या इन अध्ययनों के बीच आम है बाहरी उत्तेजनाओं की आवश्यकता है, जैसे समाधान या उपकरण, कैल्शियम यात्रियों को ट्रिगर करने के लिए. प्रोटोकॉल यहाँ उल्लिखित optogenetic उत्तेजना से प्राप्त नियंत्रण पर capitalizes, जो न्यूरॉन विशिष्टता प्रदान करता है, मांसपेशियों के कार्यात्मक विश्लेषण के साथ युग्मित एक ही प्रयोगात्मक प्रतिमान में GECIs2 व्यक्त की.

कृमि स्थिरीकरण के दो रूपों का वर्णन किया गया है और, जबकि प्रत्येक विधि का मूल्यांकन किया जाना चाहिए जब प्रयोगात्मक जरूरतों को संबोधित, दोनों विच्छेदन और शारीरिक रूप से बरकरार तैयारी पूरक परिणाम का उत्पादन जांचकर्ताओं या तो दृष्टिकोण का उपयोग करने की अनुमति अपने शोध में. विच्छेदन तकनीक का उपयोग करने के लिए एक वृद्धि हुई तकनीकी चुनौती है, उपयोगकर्ता तंत्रिका कॉर्ड या मांसपेशियों को नुकसान पहुँचाए बिना शल्य गोंद और microdissection के दोनों सटीक उपयोग मास्टर करने के लिए आवश्यक किया जा रहा है. इसके अतिरिक्त, विच्छेदन की कठिनाई के स्तर के कारण, केवल gravid वयस्कों का उपयोग किया जाना चाहिए, जो प्रयोगात्मक समय अंक को सीमित कर सकता है. इसके अलावा, विच्छेदन तकनीक भी बहुत म्यूटेंट है कि छोटे, पतले, या बीमार जानवरों का उत्पादन, फिर संभवतः प्रयोगात्मक मापदंडों को सीमित पर प्रदर्शन करने के लिए कठिन है. इस तकनीक का लाभ यह है कि यह depolarization से उत्पन्न शरीर की गति कलाकृति को सीमित करता है, gluing कीड़ा के शरीर के अतिरिक्त आंदोलन को रोकता है, और यह भी समाधान परिवर्तन और दवा अनुप्रयोगों के लिए NMJ के लिए पहुँच प्रदान करता है. इसके अतिरिक्त, प्रत्येक तैयारी कीड़ा है, जो शरीर की दीवार की मांसपेशियों की गारंटी देता है के एक ही क्षेत्र को उजागर करता है ध्यान में लगातार हो जाएगा. दूसरी तकनीक, कीड़े स्थिर करने के लिए नैनोबीड्स का उपयोग कर, कम शामिल है और जल्दी से सीखा जा सकता है. इसके अलावा, किसी भी उम्र जानवरों इस विधि के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, विकास के माध्यम से कैल्शियम हैंडलिंग में परिवर्तन के लिए निगरानी की जा करने के लिए अनुमति देता है. नैनोबीड समाधान में कीड़े रखते समय देखभाल करने की आवश्यकता होती है, क्योंकि जानवरों के बहुत अधिक हेरफेर के कारण उन्हें फट सकता है। इसके अलावा, कवरस्लिप को जानवरों के शीर्ष पर एक बार रखा गया नहीं होना चाहिए, क्योंकि इससे जानवरों को खुद पर रोल या मोड़ का कारण बन सकता है, जिससे फिर से नुकसान हो सकता है। हालांकि नैनोबीड्स का उपयोग कर एक उच्च थ्रूपुट परख प्रदान कर सकता है जिसमें जानवरों को संभावित रूप से बरामद किया जा सकता है, पशु के शरीर की स्थिति का कोई मानकीकरण नहीं है, इस प्रकार हर जानवर को एक स्पष्ट फोकल विमान में शरीर की दीवार की मांसपेशियों को नहीं हो सकता है। यदि प्रयोग में बड़ी संख्या में पशुओं की मांग की जाती है, तो स्थिरीकरण के विभिन्न तरीके आवश्यक हो सकते हैं, जैसे कि आगर-आधारित माइक्रो-वेल्स, जो थोक कैल्शियम फ्लोरोसेंट इमेजिंग28के लिए अनुमति देते हैं। इन दो तकनीकों की सीमाओं के बावजूद, या तो सी elegans शरीर की दीवार की मांसपेशियों के भीतर विश्वसनीय, आसानी से परिमाणात्मक कैल्शियम यात्रियों को प्राप्त करने के लिए उपयोग किया जा सकता है.

सी elegans कार्यात्मक इमेजिंग अध्ययन के लिए एक में विवो प्रणाली के रूप में कई लाभ प्रदान करते हैं. जानवरों पारदर्शी हैं, मांसपेशियों में जिसके परिणामस्वरूप postsynaptic कैल्शियम यात्रियों को मापने के लिए GECI RCAMP के साथ channelrhodopsin के उपयोग के माध्यम से optogenetic न्यूरॉन depolarization की जोड़ी की अनुमति. आरकेएमपी फ्लोरोसेंट के पूर्व-उत्तेजना स्तर का उपयोग आधारभूत साइटोसोलिक कैल्शियम के स्तर का आकलन करने के लिए भी किया जा सकता है। सी elegans की आनुवंशिक पथक्षमता उपन्यास उत्परिवर्तनों कि कैल्शियम homeostasis को प्रभावित कर सकते हैं या आसानी से आगे बढ़ाने के लिए हैंडलिंग का अध्ययन करता है, अक्सर आसानी से उपलब्ध उत्परिवर्ती alleles के साथ. इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित तकनीकों का उपयोग करते हुए, पोस्टीनैप्टिक कैल्शियम-इमेजिंग डेटा कुशलतापूर्वक और अपेक्षाकृत कम लागत पर प्राप्त किया जा सकता है, जिससे यह इमेजिंग प्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए एक आकर्षक प्रणाली बना सकता है।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों के लिए धन्यवाद डॉ अलेक्जेंडर Gottschalk $X1659, RCaMP और channelrhodopsin युक्त कीड़ा तनाव, डॉ Hongkyun किम के लिए स्लो-1 (eg142) कीड़ा तनाव, और sca-1 (tm5339) कीड़ा तनाव के लिए राष्ट्रीय Bioresource परियोजना.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
all-trans retinal Sigma-Aldrich R2500 Necessary for excitation of channel rhodopsin
Amber LED RCaMP illumination
Arduino UNO Mouser 782-A000066 Controls fluorescence illumination
Blue LED channelrhodopsin illumination
BX51WI microscope Olympus Fixed state compound microscope
Current controlled low noise linear power supply Ametek Sorenson Controls LED intensity
Igor Pro Wavemetrics Wavemetrics.com Graphing software
ImageJ NIH imagej.nih.gov Image processing software
LUMFLN 60x water NA 1.4 Olympus Water immersion objective for dissected preparation
Master-8 Stimulator A.M.P.I Master timer for image acquisition and LED illumination
Micro-Manager micro-manager.org Controls camera acquisition and LED excitiation
Microsoft Excel Microsoft Spreadsheet software
pco.edge 4.2 CMOS camera pco. 4.2 High-speed camera
PlanApo N 60x oil NA 1.4 Olympus Oil immersion objective for nanobead preparation
Polybead microspheres Polysciences, Inc. 00876-15 For worm immobilization
solid state switches Sensata Technologies Crydom CMX100D6 Controls timing of LED illumination
Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2
(h134R)::yfp,lin-15(+)};
Pmyo3::RCaMP35]		 Richmond Lab SY1627 Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele
Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2
(h134R)::yfp,lin-15(+)};
Pmyo3::RCaMP35]		 Richmond Lab Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele
Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2
(h134R)::yfp,lin-15(+)};
Pmyo3::RCaMP35]		 Gottschalk Lab ZX1659 Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line

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References

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सी <em>elegans</em> शरीर की दीवार की मांसपेशियों में Vivo कैल्शियम इमेजिंग में
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Martin, A. A., Alford, S., Richmond, … More

Martin, A. A., Alford, S., Richmond, J. E. In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles. J. Vis. Exp. (152), e59175, doi:10.3791/59175 (2019).

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