Summary
이 방법은 모델 유기체 C. elegans의신체 벽 근육에서 발동 된 칼슘 과도 의 변화와 이미지 기준선 세포질 칼슘 수준에 광유전학 및 유전적으로 코딩 된 칼슘 센서를 결합하는 방법을 제공합니다.
Abstract
모델 유기체 C. 예쁜꼬마선충은 생체 내 칼슘 이미징을 수행하는 우수한 시스템을 제공한다. 그것의 투명한 바디 및 유전 적 변형성은 유전으로 인코딩된 칼슘 센서의 표적으로 한 표현을 허용합니다. 이 프로토콜은 표적 세포, 특히 벌레의 신체 벽 근육에서 칼슘 역학의 생체 내 이미징을 위해 이러한 센서의 사용을 설명합니다. 시냅스 전 채널로도셉신의 공동 발현을 활용함으로써, 흥분성 운동 뉴런으로부터 아세틸콜린 방출의 자극은 청색광 펄스를 사용하여 유도될 수 있으며, 그 결과 근육 탈분극및 세포질 칼슘의 재현 가능한 변화 수준. 두 가지 웜 고정 기술은 다양한 난이도에 대해 논의합니다. 이러한 기술의 비교는 두 접근법모두 신경 근육 접합의 생리학을 보존하고 칼슘 과도의 재현 가능한 정량화를 허용한다는 것을 보여줍니다. 광유전학과 기능성 칼슘 이미징을 페어링함으로써, 후성 칼슘 취급 및 항상성의 변화는 다양한 돌연변이 배경에서 평가될 수 있다. 제시된 데이터는 고정 화 기술을 모두 검증하고 특히 C. elegans 사르코 (endo)플라스성 망상 칼슘 ATPase 및 신체 벽 근육 칼슘 조절에서 칼슘 활성화 BK 칼륨 채널의 역할을 검사합니다.
Introduction
이 논문은 광유전적 신경 자극을 사용하여 C. elegans 신체 벽 근육의 생체 내 칼슘 이미징 방법을 제시합니다. 유전적으로 발현된 근육과 청색광이 발동된 신경탈분극을 결합하고 자극된 후발성 칼슘 과도를 명확하게 관찰하는 시스템을 제공한다. 이것은 전기 자극의 사용을 피하고, 후나해 칼슘 역학에 영향을 미치는 돌연변이의 비침습적 분석을 허용합니다.
GCaMP와 같은 단일 형광포골 GECIs는 C-말단에서 의 N 말단 및 칼모둘린(CaM)에서 미오신 경변 키나아제의 M13 도메인에 융합된 단일 형광 단백질 분자를 사용합니다. 칼슘 결합시, 칼슘에 대한 높은 친화력을 가지는 CaM 도메인은 형광 강도 의 증가로 이어지는 형광 단백질의 후속 형태 변화를 유도하는 형태 변화를 겪습니다1. GCaMP 형광은 488 nm에서 흥분하여 473 nm의 유사한 여기 파장을 가진 채널로도셉신과 함께 사용하는 것이 부적절합니다. 따라서, 채널로도신 자극과 칼슘 측정을 결합하기 위해서는 GCaMP의 녹색 형광 단백질을 적색 형광 단백질, mRuby(RCaMP)로 대체할 필요가 있다. 채널로도프신의 해 운동 뉴런 발현과 함께, 표현된 근육 RCaMP를 사용하여, 동일한 동물 내의 광유전학 및 기능적 이미징을 동시에 사용하는 웜 신경 근육 접합부(NMJ)에서의 연구를 허용합니다. 2.
channelrhodopsin의 사용은 C. elegans의신경 근육 접합을 탈분극하기 위하여 전기 자극을 위한 필요를 우회합니다, 따라서 이 기술을 채택하기 쉽고 더 정밀하게 만드는 해부한 준비에서만 달성될 수 있습니다 특정 조직을 대상으로 할 때. 예를 들어, channelrhodopsin는 이전에 C. 예쁜꼬마선충에서 특정 뉴런을 가역적으로 활성화시키는 데 사용되어 왔으며, 흥분제 또는 억제 뉴런의 강력한 활성화로 이어지며3,4. 빛 자극 된 탈분극의 사용은 또한 직접적인 전기 자극으로 인한 신경 손상의 문제를 우회합니다. 이것은 후성 칼슘 역학에 지속적이고 반복적인 자극을 포함하여 많은 다른 자극 프로토콜의 효력을 검토할 기회를 제공합니다4.
C. elegans의 투명한 성질은 형광 화상 진찰 기능 분석을 위해 이상적이습니다. 그러나, NMJ에서 흥분성의 아세틸 콜린 뉴런을 자극 할 때, 동물은 즉각적인 근육 수축으로 반응 할 것으로 예상된다4,이산 칼슘 변화를 시각화에 중요한 벌레의 고정을 만들기. 전통적으로, 약리학 에이전트는 동물을 마비하는 데 사용되어 왔다. 이러한 약물 중 하나는 레바미솔, 해 아세틸 콜린 수용체 작용제5,6,7. 레바미솔은 흥분성 근육 수용체의 아류형의 지속적인 활성화를 유도하기 때문에,이 시약은 근육 칼슘 역학의 연구에 적합하지 않습니다. levamisole의 작용은 세포질 칼슘을 상승시키고, 시냅스 전 자극 에 따른 관찰을 폐색, 후발성 탈분극을 유도합니다. 마비 약물의 사용을 피하기 위해, 우리는 C. 예쁜 꼬마를고정하는 두 가지 대체 방법을 검사했습니다. 동물은 접착한 다음 해부하여 체벽 근육을 노출시켰으며, 기존의 C. elegans NMJ 전기생리학 방법8,또는 나노비드는 손상되지 않은 동물을 고정시키기 위해 사용하였다9. 두 절차 모두 쉽게 정량화 할 수 있었다 휴식과 연상 근육 칼슘 과도의 재현 측정을 허용했다.
이 논문의 방법은 C. elegans의후층 성 신체 벽 근육 세포에서 기준선 세포질 칼슘 수준 과도를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 두 가지 서로 다른 고정 기술을 사용하는 데이터의 예가 제공됩니다. 두 기술은 전기 자극을 사용하지 않고 근육 세포를 탈분극하기 위해 광유전학을 활용합니다. 이 예는 벌레에 있는 후발성 칼슘 취급에 영향을 미치는 돌연변이를 평가하고 2개의 고정화 접근의 장단점을 지적하는 이 방법의 타당성을 보여줍니다.
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Protocol
1. 현미경 설치
- 형광 기능이있는 화합물 현미경을 사용합니다. 이 연구를 위해, 데이터는 여기를 위한 LED가 장착된 직립 현미경(재료표)에수집되었습니다.
- 신체 벽 근육의 형광 변화를 적절하게 시각화하려면 높은 배율 목표를 사용하십시오.
- 해부 제제의 경우, 60x NA 1.0 수분 침지목표(재료 표)를사용하십시오.
- 나노 비드를 사용하는 제제의 경우 60x NA 1.4 오일 침지목표(재료 표)를사용하십시오. 이 배율은 카메라 센서에 대한 근육의 충분한 해상도를 보장합니다.
- 현미경에 부착된 고감도 카메라를 사용하여 칼슘 수치의 급격한 변화를 추적하기 위해 높은 프레임 속도로 이미지를 캡처합니다. 이 연구에서는 Ca2+ 신호의 상승 시간이 수십 밀리초만큼 빠를 수 있는 100Hz에서 풀 프레임 이미징이 가능한 sCMOS시스템(재료 표)이있는 이미지입니다.
- 제조업체의지침(재료 표)에따라 ImageJ10에서 실행되는 마이크로 관리자 소프트웨어로 카메라 획득 및 LED 형광 흥분을 제어합니다.
- 외부 오픈 소스 마이크로 컨트롤러 보드(재료 표)를연결하는 오픈 소스 전자 플랫폼 플러그인을 사용하여 외부 타이밍 펄스를 관리하여 형광 여기를 제어하십시오.
참고: 디지털 출력은 디지털 핀 8에서 13까지 사용할 수 있어 출력 비트 0에서 5까지 제공됩니다. 이러한 값은 1, 10, 100 등의 기본 2 값으로 해결할 수 있습니다. 직렬 포트 설정은 표 1에 표시되며 마이크로 관리자 웹 사이트(재료표)에서확인할 수 있습니다. 마이크로 컨트롤러 보드에 대한 펌웨어는이 웹 사이트에서 유사하게 사용할 수 있습니다. - 타이밍 논리를 제어하려면 제조업체의지침(재료 표)에따라 소프트웨어에서 마이크로관리자 획득 프로토콜을 활성화합니다.
참고: 이렇게 하면 사전 설정된 카메라 프레임 지속 시간과 활성화할 프레임 수, 형광 여기를 위한 논리적 셔터 및 미리 설정된 황색 LED가 동시에 시작됩니다. 이 경우, 앰버 LED 솔리드 스테이트 스위치는 핀 9를 통한 마이크로 컨트롤러 비트 1 출력에 의해 제어된다. 카메라는 TTL(백 플레이트 아웃 3 커넥터)을 프레임아웃하여 자극기트리거를 트리거합니다. 이는 이미징 서열의 활성화 후 설정된 시간에 채널로도프신의 활성화를 위한 청색광 LED의 활성화를 정밀하게 배배한다. - 청색광으로 채널러독신을 자극하고 RCaMP 변화를 기록하려면 두 개의 LED를 사용하십시오. 470 nm의 피크 방출 파장과 밴드 패스 필터 (455 ~ 490 nm)의 LED로 channelrhodopsin을 활성화하고 594 nm의 피크 방출 파장과 밴드 패스 필터 (570 ~ 600 nm)의 LED로 RCaMP를 흥분시킵니다.
- 채널로도프신을 동시에 활성화하고 RCaMP 형광 레벨의 변화를 포착하기 위해 두 LED를 공동 조명하고 이색 빔 결합기를 사용하여 동일한 광학 경로로 빛을 전송합니다.
- TTL 신호에 의해 제어되는 솔리드 스테이트스위치(재료 표)로LED 조명타이밍을 제어합니다(최대 정격 턴온 시간, 1ms, 턴오프 시간 0.3ms: 0 ~ 90% 턴온 및 끄기 시간 < 100 μs).
- 현재 제어되는 저잡음 선형 전원 공급장치(재료 표)로LED 강도를 설정합니다.
- 청색광 LED의 정확한 타이밍을 보장하려면 TTL 펄스로 자극기에서 솔리드 스테이트 릴레이로 직접 활성화하십시오. 청색광 자극 프로토콜을자극기(재료표)에프로그래밍하여 이미지 수집 시작부터 청색 LED 조명에 이르기까지 정확한 타이머 역할을 합니다. 본 실험에서, RCaMP 형광만을 포착한 2초 후에 청색광 자극을 켜고 50 ms 인터펄스 간격으로 5ms 청색광 펄스의 기차를 사용하여 채널로도프신을 활성화한다.
참고: 청색광 펄스 전의 지연, 청색광 펄스의 지속 시간, 펄스 사이의 시간 및 열차의 펄스 수는 모두 이 시점에서 설정할 수 있으며 실험적 관심의 특정 파라미터를 반영해야 합니다.
2. C. elegans 샘플 준비 및 데이터 수집
- 시냅스 전 뉴런을 광학적으로 자극하기 위해, unc-17 프로모터 영역으로 구동되는 흥분성 콜린성 뉴런에서 채널로덕신을 발현하는 동물을 얻고, myo-3 프로모터로 구동되는 모든 신체 벽 근육에서 RCaMP를 발현 지역2.
참고: 해당 세포 유형에서의 가변 발현이 데이터 수집의 신뢰성에 영향을 미칠 수 있기 때문에 통합 된 트랜스유전자와 견고한 수준의 형광을 가진 동물의 사용만이 권장됩니다. - 에탄올에 망막분말(재료표)을희석하여모든-트랜스망막의 작동 재고를 만들어 -20°C에서 최종 농도를 100 mM으로 만들고 저장한다. 이 작업 재고는 약 1 년 동안 안정될 것입니다.
- LB 미디어에서 자란 OP50 대장균의재고를 생성하고, 80 μM의 최종 농도에서 2.2 단계에서 만든 작업 재고에서 모든트랜스 망막으로 보충. OP50+망막 스톡에 사용되는 부피는 실험에 필요한 플레이트 수에 따라 달라집니다.
- 종자 선충 성장 매체 (NGM) 플레이트는 OP50 + 망막 스톡의 약 300 μL과 접시가 어둠 속에서 실온에서 하룻밤 건조 할 수 있습니다.
- C. 예쁜꼬마선충균주를 20°C에서 OP50+망막 NGM 플레이트에서 어둠 속에서 원하는 나이에 성장시다. 이 실험에서는 성인 웜을 사용합니다.
- 해부된 제제를 이용한 실험의 경우, 더 젊고 작은 동물에 대한 해부를 수행하는 것으로서 그라비드 성충 벌레만 사용하는 것은 매우 어려운 일입니다. 효과적인 채널로도프신 활성화를 위해 최소 3일 동안 OP50 망막 플레이트에 동물을 두십시오.
- 해부제제8,11(도 1A)을사용하는 경우, 저조도에서 해부를 수행한다.
- 1mMCa2+ 세포외 용액으로 150mMM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2,4 mM MgCl2,10 mM 포도당, 5 mM 수크로오스, 15 mM HEPES (pH 7.3)로 구성된 실리콘 코팅 커버 슬립 베이스로 해부 접시에 동물을 놓습니다. , -340 Osm).
- 벌레의 등쪽을 따라 청색 착색으로 액체 국소 피부 접착제를 사용하여 동물을 접착제와 유리 바늘을 사용하여 접착제 / 웜 인터페이스를 따라 측면 표피 절개를합니다.
- 입 피펫을 사용하여 웜 캐비티에서 내부 내장을 지웁히 립니다.
- 동물의 표피 플랩을 접착제로 하여 이미징을 위해 복부 내측 신체 벽 근육을 노출시다.
- 나노 비드 제제를 사용하는 경우(그림 1B)
- ddH2O를 사용하여 용융 된 5 % 아가로즈 용액을 100 mL의 최종 부피에 만듭니다.
- 파스퇴르 파이펫을 사용하여 용융 아가로즈 용액을 유리 슬라이드에 떨어 뜨리고 즉시 두 번째 유리 슬라이드를 첫 번째 슬라이드위에 놓고 부드러운 압력을 사용하여 아가로즈 패드를 만듭니다. 사용하기 전에 상단 슬라이드를 제거합니다.
- 아가로즈 패드 의 중간에 폴리스티렌 나노 비드(재료 표)의약 4 μL을 추가합니다.
- 저조도에서 4-6 C. 예쁜 꼬마를 나노 비드 용액에 넣고 동물이 서로 위에 놓지 않도록하고 조심스럽게 덮개를 맨 위에 놓습니다.
- 준비된 슬라이드 또는 해부를 현미경에 놓고 10배 배율및 희미한 밝은 필드 조명을 사용하여 웜을 찾아 서 집중시다.
- 60x 배율 및 RCaMP 형광 여기로 전환하여 외음부 앞쪽과 올바른 초점 평면에 있는 혈관 내 신체 벽 근육을 식별합니다.
참고: 외음부에 근육 전방은 전기 생리학 실험에서 일반적으로 자극되는 근육을 반영하기 때문에 선택됩니다. - 토글을 당기고 데이터 수집소프트웨어(재료 표)내에서 라이브를 클릭하여 접안 렌즈에서 카메라로 의 이미지 경로를 변경합니다.
참고: 이미지를 캡처하기 전에 채널로도셉신이 활성화되지 않도록 이 시점에서 청색광 자극 경로가 꺼져 있는지 확인합니다. - 현미경 미세 초점을 사용하여 데이터 수집 소프트웨어 내에서 이미지를 집중합니다.
- 근육이 선명해지면 라이브 버튼을 클릭하여 라이브 이미지를 끕니다.
- 데이터 수집 소프트웨어에서 ROI 버튼을 클릭하고 초점을 맞추고 있는 근육 주위에 상자를 만듭니다.
- 자극기에서 1.10 단계에서 이전에 프로그래밍된 청색광 자극 경로를 켭타십시오.
- 이미징 소프트웨어에서 획득을 클릭하여 CMOS 카메라를 통해 이미지를 캡처합니다. 이렇게 하려면 노출 시간을 1,000프레임과 2x 비닝으로 10초로 설정합니다.
3. 데이터 분석
- 이미징소프트웨어(재료 표)에서데이터 파일을 열고 다각형 도구를사용하여 관심 있는 근육을 간략하게 설명합니다. 이것이 ROI입니다.
- 이미지로 이동 | 스택 | Z축 프로파일을 플롯하고 결과 데이터 점을 스프레드시트소프트웨어(재료 표)로내보냅니다. 이 함수는 ROI 선택 평균 값과 시간 점을 플로팅합니다.
- 3.2에 설명된 단계를 사용하여 배경 형광 측정을 얻기 위해 동물 외부의 다각형 도구를 사용하여 생성된 근육 ROI를 이동합니다. 결과 데이터를 스프레드시트 통합 문서로 내보냅니다.
- 스프레드시트 통합 문서에서 각 시점의 근육 형광 값에서 배경 형광 값을 뺍니다. 이것은 배경 감산 형광 신호를 제공합니다.
- 데이터 점의 처음 2초에 대한 배경 감산 형광을 평균화합니다. 이는 기준선 형광 측정, F를 줄 것이다.
- 기준선 형광 측정을 사용하여 각 시점에서 정규화된 형광 수준을 계산합니다. 이렇게 하려면 방정식(ΔF/F)+1을 사용합니다. ΔF는 (F(t)-F를 나타내며, 여기서 F(t)는 주어진 시점에서 형광 측정이고 F는 기준선 값입니다. +1은 y축 오프셋으로 추가됩니다.
- 수집되는 각 근육 이미지에 대해 3.2-3.6 단계를 반복합니다. 이미지 당 단일 또는 여러 근육 세포를 사용 하 여 연구원의 재량에. 실험의 n은 전력 분석을 수행함으로써 결정될 수 있다.
- 3.2-3.6단계의 처리된 데이터를 사용하여 제조업체의지침(재료 표)에따라 그래프 소프트웨어에서 형광 값의 흔적을 확인합니다.
- 이 추적에서 제조업체의 지침에 따라 그래프 소프트웨어에 제공된 도구를 사용하여 피크 시간 및 반 부패 시간으로 상승과 같은 칼슘 과도의 역학을 측정합니다.
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Representative Results
이 기술은 칼슘 취급 또는 근육 탈분극에 영향을 미칠 것으로 생각되는 돌연변이의 변화를 평가했습니다. 기준선 형광 수준 및 형광 과도를 가시화하고 근육 내의 세포질 칼슘 및 칼슘 역학을 쉬게 하였다. 동물들이 망막의 성공적인 혼입을 보장하기 위해 적어도 3일 동안 모든 트랜스 망막에서 성장하여, 이어서 채널로도종신을 활성화시키는 것이중요하다(도 2A). 동물이 모든 트랜스 망막에 노출되지 않는 경우, 어떤 근육 칼슘 과도 트리거되지 않습니다(그림 2B). 이 동물은 여전히 기준선 세포질 칼슘 수준을 평가하기 위하여 이용될 수 있더라도, 칼슘에 있는 어떤 동적 변경든지 붙잡히지 않을 것입니다. 또한, 동물 또는 해부 건강에 대한 내부 통제로서, 동물은 청색광 자극에 따라 계약을 맺을 것입니다. 고정화를 위해 나노비드를 사용할 때 웜의 몸체의 총 이동을 최소화하는 근육 수축을 가진 기록이 데이터 수집을 위해 선택되었습니다. 원시 형광 값을 수집하는 데 사용되는 근육이 활발하게 수축하여 웜의 전신이 움직이게 하면 과도 추적이 이 동작 아티팩트(그림2C)를반영하고 정량화에서 폐기되어야 합니다.
sca-1 유전자 궤적에 대한 돌연변이 매핑은 C. elegans 근육 니코틴 수용체 국소화에 영향을 미치는 돌연변이에 대한 화면에서 분리되었다. C. elegans sca-1 유전자는 웜에 있는 사르코 (endo)plasmic 망상 칼슘 ATPase (SERCA)의 유일한 상동체를 인코딩하고 바디 벽 근육에 존재하는 유일한 SERCA 펌프입니다12,13. 기능 상실 sca-1 돌연변이체는 포유류근육14, 15,16에서 칼슘 항상성을 유지하는 데 SERCA가 중요한 역할을 하는 것에 기초하여 근육 칼슘 취급에 변화를 나타낼 것으로 예측되었다. ,17,18. GECI RCaMP는 신체 벽 근육에서 발현되었고 청색 광 활성화 채널로호도신은 sca-1 돌연변이체에서 세포내 기준선 칼슘 및 칼슘 역학을 모두 평가하기 위해 흥분성 콜린성 뉴런으로 발현되었다. 해부된 제제 기술로, 대조군과 비교했을 때 Sca-1 돌연변이체에서 RCaMP 형광의 기준선 수준의 증가가 관찰되었고(그림3A,B),SERCA 기능의 손실이 이어진다는 것을 시사 휴식 세포질 칼슘의 높은 수준. 칼슘 역학을 검사했을 때, 5, 2 ms 청색광펄스(도 3C)의열차로 촉발된 시냅스 전 자극에 이어, sca-1(tm5339) 돌연변이체에서 피크 칼슘 수치가 현저한 감소하였다. SR에서 감소 된 칼슘 저장을 반영 할 수있는 대조군(그림 3D)에비해. 그러나 피크 시간 또는 반 부패 시간으로 상승하는 변화는 없었다(그림 3E,F). 이것은 아세틸 콜린 수용체 및 / 또는 전압 게이트 칼슘 채널을 통해 칼슘 진입과 같은 외부 소스에서 세포칼슘의 변화를 불러 일으킨 변화뿐만 아니라 내부 상점에서 sca-1 (tm5339) 돌연변이에 영향을받지 않는다는 것을 시사합니다. . 도 419에나타낸 바와 같이 나노비드 제제를 사용하여 유사한 결과를 관찰할 수 있다. 데이터의 이 회수는 이 기술 둘 다 세포질 칼슘 수준을 쉬게 하는 바디 벽 근육을 측정하고 자극된 칼슘 과도를 관찰하기 위한 생리적이다는 증거를 제공합니다. 이것은 또한 벌레의 해부는 그것의 칼슘 처리를 바꾸는 동물에 손상을 일으키는 원인이 되지 않습니다 또는 후성 근육탈편도하는 기능을 보여줍니다.
이 프로토콜은 또한 C. elegans에있는 칼슘 취급에 간접적으로 영향을 미치는 돌연변이를 검토하기 위하여 이용될 수 있습니다. 기능 슬로-1(eg142) 돌연변이체의 손실은 이를 입증하기 위해 평가되었다. slo-1 유전자는 칼슘 활성화 BK 칼륨 채널을 인코딩하며, 이는 뉴런과 근육모두에서 20,21로발현됩니다. 연구는 이전에 신체 벽 근육에서 SLO-1에 대한 역할을 설명, 기능 돌연변이의 손실이 근육 작용 잠재력 에 따라 후분 항분극에 결함이 있음을 입증20,21. 이 과민성으로 인한 기준선 칼슘 수준 및 칼슘 과도 역학의 가능한 변화는 나노비드 고정을 사용하여 조사되었다. RCaMP의 기준선 수준을 측정했을 때, slo-1(eg142) 돌연변이체는 대조군과 비교하여 형광증가(도5A, B)19를나타냈다. 이것은 BK 채널또한 cytosolic 칼슘의 기준선 수준을 통제할 수 있다는 것을 건의합니다. 피크 칼슘 수치의 변화는 대조군(도5C,D)과비교하여 유발된 칼슘의 역학을 과도하게 평가할 때 보아도 보였다. 그러나 슬로-1(eg142) 돌연변이체는 대조군과 비교하여 피크 시간으로 현저히 증가된 상승을 나타내었다(도5E). 이는 시냅스 전 흥분성20,21에서이전에 보고된 증가를 반영할 수 있다. 그러나, 대조군과 비교하여 슬로1(eg142) 돌연변이체에서 반부패 시간에 유의한 변화는없었다(도 5F). 함께, 이러한 데이터는 이 방법이 휴식 및 자극 된 신체 벽 근육 칼슘 모두에 대한 사전 및 후발 성 돌연변이의 효과를 평가하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다.
| 직렬 설정 | 값 |
| 시간 시간 정에 대한 답변 | 500 |
| 바우처 요금 | 57600 |
| 지연 사이차렘스 | 0 |
| 핸드셰이킹 | 꺼기 |
| 패리티 | 없음 |
| 스톱 비트 | 1 |
| 자세한 | 0 |
표 1: 외부 마이크로 컨트롤러 보드를 제어하는 마이크로 컨트롤러 플러그인의 직렬 포트 설정. 이것은 형광 여기를 통제하기 위하여 외부 타이밍 펄스를 프로그램하기 위하여 이용됩니다.
그림 1: 다양한 고정 기술의 그래픽 표현. (A)이 그래픽은 고정화를 위한 해부 기술을 보여 줍니다. 벌레의 몸은 동물의 등쪽 주위에 (파란색)를 접착된다. 표피를 따라 등도 절개는 표피 플랩을 생성합니다. 이 플랩은 녹색 (채널로도프신)과 붉은 근육을 표현하는 RCaMP의 복부 신경 코드의 시냅스 사이에 형성 된 그대로 NMJs를 노출하기 위해 아래로 붙어있다. (B)이 그래픽은 나노비드 고정 기술을 보여줍니다. 온전한 웜은 용액에서 나노 비드의 표현으로 둘러싸여 있으며, 오버리 커버 슬립에 의해 압축될 때 웜을 고정시됩니다. C. elegans의투명성 때문에, 복부 신경 코드는 녹색 (channelrhodopsin)에서 시각화 될 수 있고 근육을 표현하는 RCaMP는 빨간색으로 시각화 될 수 있습니다. 벌레의 중간에 난형은 외음부를 나타냅니다, 이는 복부 신체 벽 근육을 식별하는 랜드 마크입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 칼슘 과도의 대표적인 흔적. (A)50 ms 의 열차에 의해 유발된 칼슘 과도의 단일 미량 표현 50 ms 인터펄스 간격으로, 모든트랜스 망막의 존재 내에서 성장한 제한된 신체 운동 (- 운동)을 가진 동물에 기록 (+ 모든 - 트랜스 망막). 스파이크 아티팩트는 두 LED가 동시에 동시에 조명되기 때문에 청색광 자극 펄스입니다. (B)모든 트랜스 망막에 노출되지 않은 동물에서 50 ms 의 인터펄스 간격을 가진 5, 2 ms 청색광 펄스의 열차에 반응하여 과도 칼슘의 부재를 나타내는 단일 트레이스 표현 (- 모든-트랜스 망막 , - 운동). (C)5, 2 ms 의 열차에 의해 연상 된 칼슘 과도의 단일 추적 표현 50 ms 인터펄스 간격으로, 운동 유물로 이어지는 상당한 근육 수축을 가진 동물에 기록 (+ 운동, + + 모든트랜스 망막). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 해부 기술을 사용하여 제조된 대조군 및 sca-1(tm5339) 샘플로부터 기준선 칼슘 수치 및 자극된 칼슘 과도. (A) sca-1(tm5339) 돌연변이 및 대조군에서 기준선 RCaMP 형광의 대표적인 이미지. 스케일 바 = 50 μm.(B) sca-1(tm5339) 돌연변이체(n=13) 및 대조군(n=9)에서 기준선 형광 수준 정량화. (C) sca-1(tm5339) 돌연변이 및 대조군 동물에 대한 칼슘 과도성 의 앙상블 평균 흔적. (D)채널로정형신으로부터의 피크 RCaMP 형광의 정량화는 sca-1(tm5339) 돌연변이체(n=12) 및 대조군(n=9)에서 칼슘 반응을 불러일으켰다. (E)채널로도셉신의 피크 시간으로의 상승의 정량화는 sca-1(tm5339) 돌연변이체(n=12) 및 대조군(n=8)에서 칼슘 과도를 불러일으켰다. (F)채널로독신의 반부패 시간 정량화는 sca-1(tm5339) 돌연변이체(n=12) 및 대조군(n=7)에서 칼슘 과도를 유발하였다. 통계적으로 유의한 값은 유의한 p>0.05, * p≤0.05, ** p≤0.01, *** p≤0.001이었다. 오차 바는 평균 ± SEM. 데이터를 Shapiro-Wilk 테스트를 사용하여 정규화되었고 비정규 분포에 대한 Mann-Whitney 테스트로 유의를 결정하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 나노비드 고정을 사용하여 제조된 대조군 및 sca-1(tm5339) 샘플로부터 기준선 칼슘 수치 및 자극된 칼슘 과도. (A) sca-1(tm5339) 돌연변이체 및 대조군에서의 기준선 형광의 대표적인 이미지, 스케일 바 50 μm.(B) sca-1(tm5339) 돌연변이체(n=14) 및 대조군(n=13)의 기준선 RCaMP 형광 수준의 정량화 . (C) sca-1 (tm5339) 돌연변이 및 대조군을 위한 유발된 칼슘 과도의 평균. (D) sca-1(tm5339) 돌연변이체(n=14) 및 대조군(n=13)에서 칼슘 반응을 불러일으킨 후 피크 RCaMP 형광의 정량화. (E) sca-1(tm5339) 돌연변이체(n=14) 및 대조군(n=12)에서 유발된 칼슘 과도성의 피크 시간으로의 상승정량화. (F) sca-1(tm5339) 돌연변이체(n=14) 및 대조군(n=13)에서 유발된 칼슘 과도의 반 부패 시간을 정량화한다. 그림은19에서적응된다. 통계적으로 유의한 값은 유의한 p > 0.05, * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001이었다. 오차 막대는 ±SEM. 데이터 정규성을 Shapiro-Wilk 시험을 사용하여 평가하였고 비정규 분포에 대한 Mann-Whitney 검정으로 유의성을 평가하였다. 이 그림은19에서허가하에 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 나노비드 고정화를 사용하여 제조된 대조군 및 슬로-1(eg142) 샘플로부터 기준선 칼슘 수치 및 자극된 칼슘 과도. (a) slo-1(eg142) 돌연변이체 및 대조군에서의 기저선 형광의 대표적인 이미지, 스케일 바 50 μm.(B) Slo-1(eg142) 돌연변이체(n=29) 및 대조군(n=29)에서 의 기준선 RCaMP 형광 수준의 정량화. (C) slo-1(eg142) 돌연변이 및 대조군을 위한 유발된 칼슘 과도의 평균. (D) 슬로-1(eg142) 돌연변이체(n=29) 및 대조군(n=13)에서 칼슘 반응을 불러일으킨 후 피크 RCaMP 형광의 정량화. (e) 슬로-1(eg142) 돌연변이체(n=29) 및 대조군(n=13)에서 유발된 칼슘 과도성의 피크 시간으로의 상승정량화. (F) 슬로-1(eg142) 돌연변이체(n=11) 및 대조군(n=13)에서 유발된 칼슘 과도의 반 부패 시간을 정량화한다. 그림은19에서적응된다. 통계적으로 유의한 값은 유의한 p > 0.05, * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001이었다. 오차 막대는 ±SEM. 데이터 정규성을 Shapiro-Wilk 시험을 사용하여 평가하였고 비정규 분포에 대한 Mann-Whitney 검정으로 유의성을 평가하였다. 이 그림은19에서허가하에 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
GEC는 C. elegans 신경생물학에 있는 강력한 공구입니다. 이전 연구는 다양한 자극 방법으로 감각 및 행동 반응을 포함한 뉴런과 근육 세포 모두에서 다양한 기능을 검사하기 위해 칼슘 이미징 기술을 활용했습니다. 일부 연구는 감각 ASH뉴런22,23에서 칼슘 과도를 유발하거나 인두 근육에서 칼슘 파를 유도하기 위해 화학 자극을 사용했다24. 또 다른 그룹은 기계적 자극을 이용하였고, 웜은 미세유체 칩에 보관되어 터치 수용체 뉴런에서 칼슘 반응을 조사하였다25. 아직도, 그 외는 둘 다 뉴런26 및 바디 벽 근육27에있는 칼슘 변화를 구상하기 위하여 전기 자극을 채택했습니다. 이 연구 결과 사이에서 일반적인 것은 칼슘 과도를 시작하기 위하여 해결책 또는 장비와 같은 외부 자극의 필요조건입니다. 여기에 설명된 프로토콜은 동일한 실험 패러다임에서 GECIs2를 발현하는 근육의 기능적 분석과 결합된 광유전학적 자극으로부터 얻은 대조군을 활용합니다.
두 가지 형태의 웜 고정이 설명되고, 각 방법은 실험적 요구를 해결할 때 평가되어야하지만, 해부 및 생리학적으로 손상되지 않은 제제는 조사자가 두 가지 접근법을 사용할 수 있도록 보완적인 결과를 생성합니다. 그들의 연구에. 해부 기술을 사용하는 것에 대한 기술적 도전이 증가하고 있으며, 사용자는 신경 코드 나 근육을 손상시키지 않고 수술 용 접착제및 미세 해부를 정밀하게 사용하는 것을 마스터해야합니다. 또한 해부 난이도때문에 실험 시간 포인트를 제한 할 수있는 중력 성인만 사용해야합니다. 또한, 해부 기술은 또한 작은, 얇은, 또는 병약한 동물을 생성하는 돌연변이에 능력을 발휘하기 위하여 훨씬 더 단단합니다, 다시 가능하게 실험적인 매개변수를 제한하. 이 기술의 장점은 탈분극으로 인한 신체 운동 아티팩트를 제한하고 접착하면 웜 신체의 과도한 움직임을 방지하고 솔루션 변경 및 약물 응용 을 위해 NMJ에 대한 액세스를 제공한다는 것입니다. 추가적으로, 각 준비는 바디 벽 근육이 집중에 일관되게 있을 것이라는 점을 보장하는 벌레의 동일 지역을 드러낸다. 두 번째 기술은 나노 비드를 사용하여 웜을 고정시키는 데 덜 관여하고 신속하게 배울 수 있습니다. 또한, 모든 연령의 동물을 이 방법으로 사용할 수 있어 개발을 통한 칼슘 취급의 변화를 모니터링할 수 있습니다. 동물의 너무 많은 조작이 파열될 수 있으므로 벌레를 나노비드 용액에 넣을 때주의를 기울여야합니다. 또한, 덮개 슬립은 동물이 스스로 굴러가거나 비틀어 손상을 입힐 수 있으므로 동물 위에 놓으면 이동해서는 안됩니다. 나노비드를 사용하면 동물이 잠재적으로 회복될 수 있는 높은 처리량 의 분석실험을 제공할 수 있지만, 동물의 신체 위치의 표준화는 없으므로 모든 동물은 명확한 초점 면에서 신체 벽 근육을 갖지 못할 수 있습니다. 실험이 많은 수의 동물을 요구하는 경우, 벌크 칼슘 형광이미징(28)을허용하는 한천계 마이크로웰과 같은 상이한 고정화 방법이 필요할 수 있다. 이 두 기술의 한계에 관계없이 C. elegans 신체 벽 근육 내에서 신뢰할 수 있고 쉽게 정량화 할 수있는 칼슘 과도를 얻는 데 사용할 수 있습니다.
C. 예쁜꼬마선충은 기능성 이미징 연구를 위한 생체 내 시스템으로서 많은 이점을 제공한다. 동물은 투명, 근육에 결과 후 분사 칼슘 과도 측정하는 GECI RCaMP와 channelrhodopsin의 사용을 통해 광유전 적 신경 탈분극의 페어링을 허용. RCaMP 형광의 사전 자극 수준은 또한 기준선 세포질 칼슘 수준을 평가하기 위하여 이용될 수 있습니다. C. elegans의 유전 성관성은 칼슘 항상성에 영향을 미칠 수 있는 새로운 돌연변이의 연구 또는 쉽게 구할 수 있는 돌연변이 대두를 가진 수시로 추구하기 쉬운 취급을 만듭니다. 이 프로토콜에 설명된 기술을 사용하여, 후발성 칼슘 이미징 데이터는 효율적이고 상대적으로 저렴한 비용으로 얻을 수 있어 광범위한 이미징 실험을 위한 매력적인 시스템입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 ZX1659에 대한 박사 알렉산더 고트샬크, RCaMP 및 웜 균주를 포함하는 channelrhodopsin, 슬로-1 (eg142) 웜 균주에 대한 김홍균 박사, 그리고 sca-1 (tm5339) 웜 균주에 대한 국가 생물 자원 프로젝트에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| all-trans retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | Necessary for excitation of channel rhodopsin |
| Amber LED | RCaMP illumination | ||
| Arduino UNO | Mouser | 782-A000066 | Controls fluorescence illumination |
| Blue LED | channelrhodopsin illumination | ||
| BX51WI microscope | Olympus | Fixed state compound microscope | |
| Current controlled low noise linear power supply | Ametek | Sorenson | Controls LED intensity |
| Igor Pro | Wavemetrics | Wavemetrics.com | Graphing software |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov | Image processing software |
| LUMFLN 60x water NA 1.4 | Olympus | Water immersion objective for dissected preparation | |
| Master-8 Stimulator | A.M.P.I | Master timer for image acquisition and LED illumination | |
| Micro-Manager | micro-manager.org | Controls camera acquisition and LED excitiation | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| pco.edge 4.2 CMOS camera | pco. | 4.2 | High-speed camera |
| PlanApo N 60x oil NA 1.4 | Olympus | Oil immersion objective for nanobead preparation | |
| Polybead microspheres | Polysciences, Inc. | 00876-15 | For worm immobilization |
| solid state switches | Sensata Technologies | Crydom CMX100D6 | Controls timing of LED illumination |
| Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | SY1627 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele |
| Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele | |
| Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Gottschalk Lab | ZX1659 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line |
References
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