Summary
Denne metoden gir en måte å par optogenetics og genetisk kodet kalsium sensorer til bilde Baseline cytosolic kalsium nivåer og endringer i fremkalt kalsium transienter i kroppen veggen musklene i modellen organisme C. elegans.
Abstract
Modellen organisme C. elegans gir et utmerket system for å utføre in vivo kalsium bildebehandling. Den gjennomsiktige kroppen og genetiske manipulability tillater målrettede uttrykk for genetisk kodede kalsium sensorer. Denne protokollen skisserer bruken av disse sensorene for in vivo Imaging av kalsium dynamikk i målrettede celler, spesielt kroppen veggen musklene i ormer. Ved å benytte co-uttrykk for presynaptiske nerve channelrhodopsin, stimulering av acetylkolin utgivelse fra eksitatoriske motor neurons kan bli indusert ved hjelp av blått lyspulser, resulterer i muskel depolarization og reproduserbar endringer i cytoplasmatiske kalsium Nivåer. To ormen immobilisering teknikker er diskutert med varierende vanskelighetsgrad. Sammenligning av disse teknikkene viser at begge tilnærminger bevare fysiologi av nevromuskulær krysset og la for reproduserbar kvantifisering av kalsium transienter. Ved sammenkobling av optogenetics og funksjonell kalsium avbildning kan endringer i postsynaptic kalsium håndtering og homeostase evalueres i en rekke mutant bakgrunner. Data presentert validerer både immobilisering teknikker og spesielt undersøker rollene til C. elegans sarco (Endo) plasmid Retikulære kalsium ATPase og kalsium-aktivert BK kalium kanal i kroppen veggen muskel kalsium regulering.
Introduction
Dette papiret presenterer metoder for in vivo kalsium Imaging av C. elegans Body Wall musklene bruker optogenetic neuronal stimulering. Sammenkobling av en muskel uttrykt genetisk kodet kalsium indikator (GECI) med blått lys utløst neuronal depolarization og gir et system for å tydelig observere fremkalt postsynaptic kalsium transienter. Dette unngår bruk av elektrisk stimulering, slik at en ikke-invasiv analyse av mutanter påvirker postsynaptic kalsium dynamikk.
Single-fluoroforen GECIs, som GCaMP, bruker et enkelt fluorescerende protein molekyl smeltet til M13 domenet av myosin lys kjeden kinase på sin N-Terminal ende og calmodulin (CaM) på C-Terminus. Ved kalsium binding, gjennomgår CaM-domenet, som har en høy affinitet for kalsium, en conformational endring som fremkaller en påfølgende conformational endring i fluorescerende protein som fører til en økning i fluorescens intensitet1. GCaMP fluorescens er spent på 488 NM, noe som gjør det uegnet til å bli brukt i forbindelse med channelrhodopsin, som har en lignende eksitasjon bølgelengde på 473 NM. Således, for å par kalsium målinger med channelrhodopsin stimulering, det grønne fluorescerende proteinet av GCaMP må byttes ut med et rødt fluorescerende protein, mRuby (RCaMP). Bruke muskelen uttrykt RCaMP, i kombinasjon med kolinerge motoriske Nevron uttrykk for channelrhodopsin, tillater studier ved ormen nevromuskulær Junction (NMJ) med samtidig bruk av optogenetics og funksjonell Imaging innenfor samme dyr 2i det.
Bruken av channelrhodopsin omgår behovet for elektrisk stimulering for å depolarize den nevromuskulær kryss av C. elegans, som bare kan oppnås i dissekert preparater, og dermed gjør denne teknikken både enklere å ansette og mer presis Når du målretter mot spesifikke vev. For eksempel, channelrhodopsin har tidligere vært brukt i C. elegans å reverserbart aktivere spesifikke neurons, fører til enten robust aktivering av eksitatoriske eller hemmende neurons3,4. Bruken av lys-stimulert depolarization også omgår spørsmålet om neuronal Kader på grunn av direkte elektrisk stimulering. Dette gir en mulighet til å undersøke virkningene av mange ulike stimulering protokoller, inkludert vedvarende og gjentatt stimuleringer, på postsynaptic kalsium dynamikk4.
Den gjennomsiktige natur C. elegans gjør det ideelt for fluorescerende Imaging funksjonell analyse. Men når stimulere eksitatoriske acetylkolin neurons på NMJ, dyr er forventet å svare med en umiddelbar muskel sammentrekning4, noe som gjør immobilisering av ormer kritisk i visualisere diskrete kalsium endringer. Tradisjonelt har farmakologiske midler blitt brukt til å lamme dyrene. Et slikt legemiddel som brukes er levamisole, en kolinerge acetylkolin reseptor Agonistiske5,6,7. Siden levamisole fører til vedvarende aktivering av en under type av eksitatoriske muskel reseptorer, denne reagens er uegnet for studiet av muskel kalsium dynamikk. Handlingen av levamisole induserer postsynaptic depolarization, heve cytosolic kalsium, og okkluderer observasjoner etter presynaptiske nervestimulering. For å unngå bruk av lammende narkotika, undersøkte vi to alternative metoder for å nakkens C. elegans. Dyrene var enten limt ned og deretter dissekert åpne for å eksponere kroppen veggen musklene, lik den eksisterende C. elegans nmj elektrofysiologi metode8, eller nanobeads ble brukt til å nakkens intakt dyr9. Begge prosedyrene er tillatt for reproduserbar målinger av hvile og fremkalt muskel kalsium transienter som var lett målbare.
Metodene i dette papiret kan brukes til å måle Baseline cytosolic kalsium nivåer og transienter i postsynaptic kroppen veggen muskelceller i C. elegans. Eksempler på data som sysselsetter de to ulike immobilisering teknikkene er gitt. Begge teknikkene dra nytte av optogenetics å depolarize muskelceller uten bruk av elektrisk stimulering. Disse eksemplene viser muligheten for denne metoden i å evaluere mutasjoner som påvirker postsynaptic kalsium håndtering i ormer og påpeke fordeler og ulemper med de to immobilisering tilnærminger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. oppsett av mikroskop
- Bruk et sammensatt mikroskop med fluorescens egenskaper. For denne studien ble data samlet inn på et oppreist mikroskop (tabell av materialer) utstyrt med lysdioder for eksitasjon.
- For å riktig visualisere fluorescens endringer i kroppen vegg muskler, bruk en høy forstørrelse mål.
- For dissekert preparater, bruk en 60x NA 1,0-objektiv for nedsenkingi vann (tabell med materialer).
- For preparater som bruker nanobeads, bruk en 60x NA 1,4-objektiv for olje nedsenking (tabell med materialer). Denne forstørrelsen sikrer tilstrekkelig oppløsning av musklene på kamerasensoren.
- Bruk et kamera med høy følsomhet som er festet til mikroskopet for å ta bilder med høy bildefrekvens for å spore raske endringer i kalsium nivåer. For denne studien, bilde med en sCMOS system (tabell av materialer) i stand til fullformat imaging på 100 Hz, som stige ganger for ca2 + signaler kan være så rask som titalls millisekunder.
- Kontroll kamera oppkjøpet og LED fluorescens eksitasjon med en mikro-Manager programvare som kjører i ImageJ10 i henhold til produsentens instruksjoner (tabell av materialer).
- Bruk en åpen kildekode elektronisk plattform plugin, som forbinder en ekstern åpen kildekode-microcontroller bord (tabell av materialer), for å administrere eksterne timing pulser å kontrollere fluorescens eksitasjon.
Merk: digitale outs er tilgjengelige fra digitale pinner 8 til 13, som gir utdata fra 0 til 5. Disse kan rettes som base 2 verdier på 1, 10, 100, etc. Innstillinger for seriell port er angitt i tabell 1 og tilgjengelig fra mikro-Manager-nettstedet (tabell over materialer). Firmware for microcontroller styret er tilsvarende tilgjengelig på dette nettstedet. - For å kontrollere timing logikken, aktivere micromanager oppkjøpet protokollen i programvaren i henhold til produsentens instruksjoner (tabell av materialer).
Merk: Dette initierer samtidig en forhåndsinnstilt kamera ramme varighet og antall rammer som skal aktiveres, samt den logiske lukkeren og forhåndsinnstilt gult LED for fluorescens eksitasjon. I dette tilfellet styres den oransje LED Solid State Switch av microcontroller bit 1 utgang gjennom PIN 9. Kameraet rammer ut TTL (bakplaten ut 3 forbinde) avtrekker en stimulator. Dette nettopp ganger aktiveringen av det blå lyset LED for aktivering av channelrhodopsin på et angitt tidspunkt etter aktivering av bildesekvens. - For å stimulere channelrhodopsin med blått lys og registrere RCaMP endringer, bruk to lysdioder. Aktiver channelrhodopsin med en LED med en topp bølgelengde på 470 NM og et båndpassfilter (455 til 490 NM) og opphisse RCaMP med en LED med en topp bølgelengde på 594 NM og et båndpassfilter (570 til 600 NM).
- For å samtidig aktivere channelrhodopsin og fange endringer i RCaMP fluorescerende nivåer, co-belyse både lysdioder og overføre lyset til samme optiske banen ved hjelp av en dichroic bjelke combiner.
- Kontrollere tidspunktet for LED-belysning med solid state brytere (tabell av materialer) styres av TTL signaler (maksimal vurdert turn-on tid, 1 MS, turn-off tid 0,3 MS: 0 til 90% turn-on og slå av tid på < 100 μs).
- Still inn LED-intensiteten med gjeldende kontrollerte lav støy lineære strømforsyninger (tabell med materialer).
- For å sikre presis timing av blått lys LED, aktivere den direkte ved TTL puls til solid-state relé fra en stimulator. Program den blå lys stimulering protokollen til en stimulator (tabell over materialer), som fungerer som en presis tidtaker fra starten av bildet oppkjøpet til blå LED-belysning. I dette eksperimentet, slå på blått lys stimulering etter 2 s for å fange RCaMP fluorescens bare og bruke et tog på 5, 2 MS blått lyspulser med 50 MS interpulse intervaller for å aktivere channelrhodopsin.
Merk: forsinkelsen før blått lyspulser, varigheten av det blå lyset pulser, tiden mellom pulser, og antall pulser i toget kan alle settes på dette punktet og bør gjenspeile de spesifikke parametrene av eksperimentell interesse.
2. C. elegans sample forberedelse og datainnsamling
- For å optisk stimulere presynaptiske nerve neurons, få dyr uttrykker channelrhodopsin i eksitatoriske kolinerge neurons, drevet med UNC-17 promoter regionen, og RCaMP uttrykt i alle kroppens vegg muskler drevet med Myo-3 promoter region2.
Merk: bare bruk av dyr med integrert transgenes og robuste nivåer av fluorescens anbefales som variabel uttrykk i de tilsvarende celletyper kan påvirke påliteligheten av datainnsamling. - Lag en fungerende lager av all-trans retinal ved å fortynne retinal pulver (tabell av materialer) i etanol for å skape en endelig konsentrasjon av 100 mm og lagre ved-20 ° c. Denne arbeids bestanden vil være stabil i omtrent ett år.
- Opprett et lager av OP50 E. coli, VOKST i lb Media, supplert med all-trans retinal fra arbeider massen gjort i trinn 2,2, ved en endelig konsentrasjon av 80 μM. Volumet som brukes for OP50 + retinal lager vil være avhengig av antall plater som er nødvendig for eksperimentet.
- Seed nematode vekst medier (NGM) plater med ca 300 μL av OP50 + retinal lager og la platene tørke over natten ved romtemperatur i mørket.
- Grow C. elegans stammer til ønsket alder i MØRKET på OP50 + retinal NGM plater ved 20 ° c. For dette eksperimentet, bruk voksen ormer.
- For eksperimentet ved hjelp av dissekert forberedelser, bruk bare gravid voksne ormer som utfører disseksjon på yngre, mindre dyr er ekstremt utfordrende. La dyrene på OP50-retinal plater i minst 3 dager for en effektiv channelrhodopsin aktivering.
- Hvis du bruker dissekert Preparation8,11 (figur 1A), Utfør dissections i svakt lys.
- Plasser dyr i en dissekere tallerken med en silikon-belagt dekkglass base som er fylt med en 1 mM ca2 + ekstracellulære løsning bestående av 150 mm NaCl, 5 mm KCl, 1 mm CaCl2, 4 mm MgCl2, 10 mm glukose, 5 mm sukrose, og 15 mm HEPES (pH 7,3 ,-340 OSM).
- Lim ned dyr ved hjelp av væsken aktuell hud klebemiddel med blå farge langs rygg siden av ormen og lage en lateral cuticle snitt langs limet/ormen grensesnittet ved hjelp av glass nåler.
- Bruk en munn pipette for å fjerne den innvendige innvollene fra Orme hulrommet.
- Lim ned cuticle klaffen av dyret for å avdekke ventrale midtre kroppen veggen muskler for Imaging.
- Ved bruk av nanobead tilberedning (figur 1B)
- Lag en smeltet 5% agarose løsning med ddH2O til et endelig volum på 100 ml.
- Bruke en Pasteur pipette, plassere en dråpe smeltet agarose løsning på et glass lysbilde og umiddelbart plassere en andre glass lysbilde over toppen, vinkelrett på den første, ved hjelp av forsiktig Trykk for å skape en jevn agarose pad. Fjern det øverste lysbildet før bruk.
- Tilsett ca 4 μL av polystyren nanobeads (tabell av materialer) til midten av agarose puten.
- I det lave lyset, plukke 4-6 C. elegans inn i nanobead løsning, slik at dyrene ikke lå oppå hverandre, og nøye plassere en dekkglass på toppen.
- Plasser forberedt lysbilde eller disseksjon parabolen på mikroskopet, og finne og fokusere på en orm med 10x forstørrelse og Dim lyse felt belysning.
- Bytt til 60x forstørrelse og RCaMP fluorescens eksitasjon å identifisere en ventromedial kropp veggen muskel som er fremre til den snappe og i riktig fokalplanet.
Merk: musklene fremre til den snappe er valgt som de reflekterer musklene ofte stimulert i elektrofysiologi eksperimenter. - Endre bildet sti fra okularet til kameraet ved å trekke ut veksleknappen og klikke Live innenfor datainnhenting programvare (tabell av materialer).
Merk: Kontroller at den blå lys stimulering sti er slått av på dette punktet for å sikre at channelrhodopsin ikke blir aktivert før du tar bilder. - Fokuser bildet i datainnsamlingsprogram varen ved hjelp av det fine fokuset på mikroskopet.
- Når muskelen er klart i fokus, slå av Live-bildet ved unclicking Live Button.
- Klikk ROI -knappen i datainnsamling programvare og lage en boks rundt muskelen blir fokusert på.
- På stimulator, slå på den blå lys stimulering veien som tidligere er programmert i trinn 1,10.
- Klikk på Hent i bildebehandlingsprogrammet for å ta bildet gjennom CMOS-kameraet. For å gjøre dette, sett eksponeringstiden til 10 s med 1 000 rammer og 2x binning.
3. data analyse
- Åpne datafilen i bildebehandlingsprogrammet (innholdsfortegnelsen), og bruk Polygon-verktøyettil å skissere muskel av interesse. Dette er AVKASTNINGEN.
- Gå til bilde | Stabler | Plot Z-aksen profil og eksportere de resulterende datapunkter inn i regnearkprogram vare (tabell av materialer). Denne funksjonen plotter verdien for valg av ROI-verdi kontra tids punktet.
- Flytt muskel ROI opprettet med polygon verktøyet utenfor dyret for å få en bakgrunn fluorescens måling ved hjelp av trinnene som er beskrevet i 3,2. Eksporter de resulterende dataene til regneark arbeidsboken.
- I regneark arbeidsboken trekker du bakgrunns fluorescens verdier fra muskel fluorescens verdiene ved hvert tidspunkt. Dette gir bakgrunnen trukket fluorescerende signal.
- Gjennomsnittlig bakgrunn trekkes fluorescens for de første 2 s av datapunkter. Dette vil gi Baseline fluorescens måling, F.
- Bruk fluorescens mål for grunnlinje til å beregne normalisert fluorescens nivå ved hvert tidspunkt. Hvis du vil gjøre dette, bruker du formelen (ΔF/F) + 1. ΔF representerer (F (t)-F), der F (t) er fluorescens måling på et gitt tidspunkt og F er den opprinnelige verdien. + 1 legges til som en y-akse-forskyvning.
- Gjenta trinn 3.2-3.6 for hvert muskel bilde som samles inn. Ved hjelp av én eller flere muskelceller per bilde er på skjønn av forskeren. N av eksperimentet kan bestemmes ved å utføre en kraft analyse.
- Bruk de behandlede dataene fra trinn 3.2-3.6 til å lage et spor av de fluorescerende verdiene i grafisk programvare i henhold til produsentens instruksjoner (tabell over materialer).
- Fra dette sporet, måle Kinetics av kalsium forbigående, for eksempel stige til peak tid og halv forfall tid, ved hjelp av verktøyene som tilbys i grafisk programvare i henhold til produsentens instruksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne teknikken evaluerte endringer i mutanter tenkt å påvirke kalsium håndtering eller muskel depolarization. Baseline fluorescens nivåer og fluorescerende transienter ble visualisere og hviler cytosolic kalsium og kalsium Kinetics i muskelen ble evaluert. Det er viktig at dyrene ble dyrket på all-trans retinal i minst tre dager for å sikre vellykket innlemmelse av retinal, og dermed aktivere channelrhodopsin (figur 2A). Hvis dyr ikke utsettes for all-trans retinal, ingen muskel kalsium transient utløses (figur 2B). Selv om disse dyrene kan fortsatt brukes til å evaluere Baseline cytosolic kalsium nivåer, vil eventuelle dynamiske endringer i kalsium ikke bli fanget. I tillegg, som en intern kontroll for dyr eller disseksjon helse, vil dyret kontrakten etter blått lys stimulering. Et opptak med en muskel sammentrekning som forårsaker minimal grov bevegelse av ormen kroppen ble valgt for datainnsamling ved bruk nanobeads for immobilisering. Hvis muskelen brukes til å samle rå fluorescens verdier kontrakter kraftig, forårsaker hele kroppen av ormen til å flytte, vil forbigående spor reflektere denne bevegelsen gjenstand (figur 2C) og bør kastes fra kvantifisering.
En mutasjon kartlegging til SCA-1 gen geometriske var isolert fra en skjerm for mutasjoner som påvirker C. elegans muskel nikotins reseptor lokalisering. Den C. elegans SCA-1 genet koder den eneste homologe av sarco (Endo) plasmid retikulære kalsium ATPase (SERCA) i ormen og er den eneste SERCA pumpen til stede i kroppen vegg musklene12,13. "Tap av funksjon" -SCA-1 mutanter ble spådd til å vise endringer i muskel kalsium håndtering basert på den viktige rollen SERCA spiller i å opprettholde kalsium homeostase i pattedyr musklene14,15,16 ,17,18. Den GECI RCaMP ble uttrykt i kroppen veggen musklene og den blå lys-aktivert channelrhodopsin ble uttrykt i eksitatoriske kolinerge neurons å evaluere både intracellulære Baseline kalsium og kalsium dynamikk i SCA-1 mutanter. Med dissekert Forberedelses teknikk ble økninger i Baseline nivåer av RCaMP-fluorescens observert i SCA-1- mutant sammenlignet med kontrollen (Figur 3A, B), noe som tyder på at tap av SERCA-funksjon fører til forhøyede nivåer av hvile cytoplasmatiske kalsium. Når kalsium dynamikk ble undersøkt, etter presynaptiske nervestimulering utløst med et tog på 5, 2 MS blått lyspulser (Figur 3C), var det en betydelig reduksjon i topp kalsium nivåer i SCA-1 (tm5339) mutanter som sammenlignet med kontrollen (Figur 3D), som kan reflektere REDUSERTE kalsium lagre i SR. Men ingen endring ble sett i økningen til peak tid eller halv forfall tid (Figur 3E, F). Dette tyder på at fremkalt endringer i cytosolic kalsium fra enten ekstern kilde som kalsium oppføring gjennom acetylkolin reseptorer og/eller spenning-gated kalsiumkanaler så vel som fra interne butikker er ikke berørt i SCA-1 (tm5339) mutanter . Lignende resultater kan observeres ved hjelp av nanobead forberedelser, som vist i Figur 419. Denne recapitulation av data gir bevis for at begge disse teknikkene er fysiologiske for å måle kroppens veggen muskel hviler cytoplasmatiske kalsium nivåer samt observere stimulert kalsium transienter. Dette viser også at Disseksjon av ormen ikke forårsaker skade på dyret som endrer sin kalsium håndtering eller evnen til å depolarize postsynaptic muskler.
Denne protokollen kan også brukes til å undersøke mutanter som indirekte påvirker kalsium håndtering i C. elegans. Tap av funksjon slo-1 (eg142) mutanter ble evaluert for å demonstrere dette. Den slo-1 genet koder en kalsium-aktivert BK kalium kanal, som uttrykkes i både neurons og muskler20,21. Studier har tidligere beskrevet en rolle for slo-1 i kroppen veggen muskler, viser at tap av funksjon mutanter har en defekt i postsynaptic repolarisasjon følgende muskel handling potensialer20,21. Mulige endringer i Baseline kalsium nivåer og kalsium transient dynamikk på grunn av denne hyperexcitability ble undersøkt ved hjelp av nanobead immobilisering. Når Baseline nivåer av RCaMP ble målt, slo-1 (eg142) mutanter vises øke fluorescens i forhold til kontrollene (figur 5A, B)19. Dette tyder på at BK-kanaler kan også regulere Baseline nivåer av cytosolic kalsium. Ingen endringer i topp kalsium nivåer ble sett på som i forhold til kontroll (figur 5C, D) når evaluere Kinetics av fremkalt kalsium transient. Den slo-1 (eg142) mutanter, men viste en betydelig økt økning til peak tid i forhold til kontroll (figur 5E). Dette kan gjenspeile en tidligere rapportert økning i presynaptiske nerve excitability20,21. Det var imidlertid ingen vesentlige endringer i halv forfall tid i slo-1 (eg142) mutanter i forhold til kontroll (figur 5F). Sammen viser disse dataene at denne metoden kan brukes til å evaluere effekten av pre-og postsynaptic mutasjoner på både hvile og stimulert kroppen veggen muskel kalsium.
| Seriell innstilling | Verdi |
| Tidsavbrudd for svar | 500 |
| Overføringshastighet | 57600 |
| DelayBetweenCharsMs | 0 |
| Handshaking | Av |
| Paritet | Ingen |
| StopBits | 1 |
| Detaljert | 0 |
Tabell 1: seriell portinnstillinger for microcontroller plugin, som styrer en ekstern microcontroller bord. Dette brukes til å programmere eksterne timing pulser å kontrollere fluorescens eksitasjon.
Figur 1: grafisk fremstilling av ulike immobilisering teknikker. (A) denne grafikken demonstrerer disseksjon teknikk for immobilisering. Liket av ormen er limt ned (blå) rundt rygg siden av dyret. En rygg innsnitt langs cuticle genererer en cuticle klaff. Denne klaffen har blitt limt ned for å avdekke intakt NMJs dannet mellom synapser av ventrale nerve ledningen i grønt (channelrhodopsin) og RCaMP uttrykker musklene i rødt. (B) denne grafikken demonstrerer nanobead immobilisering teknikk. Den intakte ormen er omgitt av en representasjon av nanobeads i løsningen, at når komprimert av overliggende dekkglass, nakkens ormen. På grunn av gjennomsiktigheten til C. elegans, den ventrale nerve ledningen kan bli visualisere i grønt (channelrhodopsin) og RCaMP uttrykker musklene kan bli visualisere i rødt. Den ovale i midten av ormen representerer den snappe, som er et landemerke identifisere ventrale kroppen veggen muskler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representative spor av kalsium transienter. (A) single Trace representasjon av en kalsium transient fremkalt av et tog på 5, 2 MS blått lyspulser på 50 MS interpulse intervaller, innspilt i et dyr med begrenset kroppsbevegelse (-bevegelse) dyrket i nærvær av all-trans retinal (+ alt- trans retinal). Pigg gjenstandene er de blå lys stimulering pulser, som begge LED er co-belyst samtidig. (B) single Trace representasjon som viser fraværet av en kalsium transient som svar på et tog på 5, 2 MS blått lyspulser med 50 MS interpulse intervaller i et dyr som ikke har vært utsatt for alle-trans retinal (-all-trans retinal ,-bevegelse). (C) single Trace representasjon av en kalsium transient som har blitt fremkalt av et tog på 5, 2 MS blått lyspulser med 50 MS interpulse intervaller, innspilt i et dyr som hadde betydelig muskel sammentrekning fører til bevegelse gjenstander (+ bevegelse, + all-trans retinal). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Baseline kalsium nivåer og fremkalt kalsium transienter fra kontroll og SCA-1 (tm5339) prøver utarbeidet ved hjelp av disseksjon teknikk. (A) representative bilder av Baseline RCaMP fluorescens i SCA-1 (tm5339) mutanter og kontroller. Skala bar = 50 μm. (B) Baseline fluorescens nivåer kvantifisering i SCA-1 (tm5339) mutanter (n = 13) og kontroll (n = 9). (C) ensemble gjennomsnittlig spor av fremkalt kalsium transienter for SCA-1 (tm5339) mutanter og kontroll dyr. (D) kvantifisering av peak RCaMP fluorescens fra channelrhodopsin fremkalt kalsium respons i SCA-1 (tm5339) mutanter (n = 12) og kontroller (n = 9). (E) kvantifisering av økningen til peak tid for channelrhodopsin fremkalt kalsium transienter i SCA-1 (tm5339) mutanter (n = 12) og kontroller (n = 8). (F) Half Decay tid kvantifisering av channelrhodopsin fremkalt kalsium transienter i SCA-1 (tm5339) mutanter (n = 12) og kontroller (n = 7). Statistisk signifikante verdier var: ikke signifikant p > 0,05, * p ≤ 0,05, * * p ≤ 0.01, * * * p ≤ 0.001. Feilfelt representerer gjennomsnittlig ± SEM. data ble normalisert ved bruk av Shapiro-Wilk-tester og betydning ble bestemt med en mann-Whitney-test for ikke-normale distribusjoner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Baseline kalsium nivåer og fremkalt kalsium transienter fra kontroll og SCA-1 (tm5339) prøver tilberedt ved hjelp av nanobead immobilisering. (A) representative bilder av Baseline fluorescens i SCA-1 (tm5339) mutanter og kontroller, skala bar 50 μm. (B) kvantifisering av Baseline RCaMP fluorescens nivåer i SCA-1 (tm5339) mutanter (n = 14) og kontroll (n = 13) . (C) gjennomsnitt av fremkalt kalsium transienter for SCA-1 (tm5339) mutanter og kontroller. (D) kvantifisering av peak RCaMP fluorescens følgende fremkalt kalsium respons i SCA-1 (tm5339) mutanter (n = 14) og kontroller (n = 13). (E) kvantifisering av opphav til peak tid for fremkalt kalsium transienter i SCA-1 (tm5339) mutanter (n = 14) og kontroller (n = 12). (F) kvantifisering av halv Forfallstid for fremkalt kalsium transienter i SCA-1 (tm5339) mutanter (n = 14) og kontroll (n = 13). Figuren er tilpasset fra19. Statistisk signifikante verdier var: ikke signifikant p > 0,05, * p ≤ 0,05, * * p ≤ 0,01, * * * p ≤ 0,001. Feil barer viser bety ± SEM. data normalitet ble vurdert ved hjelp av Shapiro-Wilk-tester og betydning ble bestemt med en mann-Whitney-test for ikke-normale distribusjoner. Dette tallet er endret med tillatelse fra19. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Baseline kalsium nivåer og fremkalt kalsium transienter fra kontroll og slo-1 (eg142) prøver tilberedt ved hjelp av nanobeads immobilisering. (A) representative bilder av Baseline fluorescens i slo-1 (eg142) mutanter og kontroller, skala bar 50 μm. (B) kvantifisering av Baseline RCaMP fluorescens nivåer i slo-1 (eg142) mutanter (n = 29) og kontroll (n = 13). (C) gjennomsnitt av fremkalt kalsium transienter for slo-1 (eg142) mutanter og kontroller. (D) kvantifisering av peak RCaMP fluorescens følgende fremkalt kalsium respons i slo-1 (eg142) mutanter (n = 29) og kontroller (n = 13). (E) kvantifisering av opphav til peak tid for fremkalt kalsium transienter i slo-1 (eg142) mutanter (n = 29) og kontroller (n = 13). (F) kvantifisering av halv forråtnelse tid av fremkalt kalsium transienter i slo-1 (eg142) mutanter (n = 11) og kontroller (n = 13). Figuren er tilpasset fra19. Statistisk signifikante verdier var: ikke signifikant p > 0,05, * p ≤ 0,05, * * p ≤ 0,01, * * * p ≤ 0,001. Feil barer viser bety ± SEM. data normalitet ble vurdert ved hjelp av Shapiro-Wilk-tester og betydning ble bestemt med en mann-Whitney-test for ikke-normale distribusjoner. Dette tallet er endret med tillatelse fra19. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GECIs er et kraftig verktøy i C. elegans nevrobiologi. Tidligere arbeid har benyttet kalsium Imaging teknikker for å undersøke en rekke funksjoner i både neurons og muskelceller, inkludert sensoriske og atferdsmessige responser, med varierte metoder for stimulering. Noen studier har brukt kjemiske stimuli for å utløse kalsium transienter i Sensorisk aske neurons22,23 eller for å indusere kalsium bølger i pharyngeal muskler24. En annen gruppe benyttet mekanisk stimulering mens ormer ble holdt i mikrovæskebasert sjetonger for å undersøke kalsium responser i kontakt reseptor neurons25. Likevel, andre har ansatt elektrisk stimulering for å visualisere kalsium endringer i begge neurons26 og Body Wall musklene27. Hva er felles mellom disse studiene er kravet om ytre stimuli, for eksempel løsninger eller utstyr, for å utløse kalsium transienter. Protokollen skissert her stor bokstav på kontrollen fikk fra optogenetic stimulering, som gir neuronal spesifisitet, kombinert med funksjonell analyse av muskel uttrykt GECIs2 i samme eksperimentelle paradigmet.
To former for ormen immobilisering er beskrevet, og mens hver metode bør vurderes når adressering eksperimentelle behov, både dissekert og fysiologisk intakt preparater produsere komplementære resultater slik at etterforskere til å bruke enten tilnærming i forskningen sin. Det er en forhøyet teknisk angripe å benytter det disseksjon teknikk, med det bruker tilværelse krevde å kontroll begge to akkurat bruk av det inngrep lim og microdissection uten skadelige det nerve ledningen eller muskelen. I tillegg, på grunn av vanskelighetsgraden av disseksjon, bør bare gravid voksne brukes, noe som kan begrense den eksperimentelle tiden poeng. Videre er disseksjon teknikken også mye vanskeligere å utføre på mutanter som produserer små, tynne eller sykelig dyr, igjen muligens begrense eksperimentelle parametre. Fordelen med denne teknikken er at det begrenser kroppen bevegelse gjenstand som følge av depolarization, liming hindrer overflødig bevegelse av ormen kropp, og gir også tilgang til NMJ for løsnings endringer og narkotika applikasjoner. I tillegg utsetter hver forberedelse det samme området av ormen, som garanterer kroppen veggen musklene vil være konsekvent i fokus. Den andre teknikken, bruker nanobeads å nakkens ormene, er mindre involvert og kan raskt læres. Likeledes, alle alderen dyrene kan brukes med dette metoden, tillater for endre inne kalsium handling igjennom utviklingen å bli kontrollert. Care trenger å bli tatt når plassere ormer i nanobead løsning, som for mye manipulasjon av dyrene kan føre dem til å sprekke. Dessuten må dekkglass ikke flyttes en gang plassert på toppen av dyrene, da dette kan føre til at dyrene til å rulle eller vri på seg selv, igjen fører til skaden. Til tross for benytter det nanobeads kanne skaffe en høy-produksjon analysen i hvilket dyrene kunne muligheter være kommet til hektene, det er nei standardisering av dyrene ' kropp holdning, således enhver dyr kanskje ikke ha kropp mur muskelen inne en helt fokal plan. Hvis eksperimentet krever et stort antall dyr, ulike metoder for immobilisering kan være nødvendig, slik som agar-baserte mikro-brønner, som tillater bulk kalsium fluorescens Imaging28. Uavhengig av begrensningene i disse to teknikkene, enten kan utnyttes for å få pålitelig, lett målbare kalsium transienter innen C. elegans Body Wall musklene.
C. elegans gir mange fordeler som et in vivo-system for de funksjonelle bildebehandlings studiene. Dyrene er gjennomsiktige, slik at sammenkoblingen av optogenetic neuronal depolarization gjennom bruk av channelrhodopsin med GECI RCaMP å måle den resulterende postsynaptic kalsium transienter i muskelen. Pre-stimulering nivåer av RCaMP fluorescens kan også brukes til å vurdere Baseline cytosolic kalsium nivåer. Den genetiske føyelighet av C. elegans gjør studiet av romanen mutasjoner som kan påvirke kalsium homeostase eller håndtering lett å forfølge, ofte med lett tilgjengelig mutant alleler. Ved hjelp av teknikkene skissert i denne protokollen, postsynaptic kalsium-Imaging data kan oppnås effektivt og til en relativt lav kostnad, noe som gjør dette til et attraktivt system for en rekke Imaging eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Alexander Gottschalk for ZX1659, den RCaMP og channelrhodopsin inneholder ormen belastning, Dr. Hongkyun Kim for slo-1 (eg142) ormen belastning, og National Bioresource Project for SCA-1 (tm5339) ormen belastning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| all-trans retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | Necessary for excitation of channel rhodopsin |
| Amber LED | RCaMP illumination | ||
| Arduino UNO | Mouser | 782-A000066 | Controls fluorescence illumination |
| Blue LED | channelrhodopsin illumination | ||
| BX51WI microscope | Olympus | Fixed state compound microscope | |
| Current controlled low noise linear power supply | Ametek | Sorenson | Controls LED intensity |
| Igor Pro | Wavemetrics | Wavemetrics.com | Graphing software |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov | Image processing software |
| LUMFLN 60x water NA 1.4 | Olympus | Water immersion objective for dissected preparation | |
| Master-8 Stimulator | A.M.P.I | Master timer for image acquisition and LED illumination | |
| Micro-Manager | micro-manager.org | Controls camera acquisition and LED excitiation | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| pco.edge 4.2 CMOS camera | pco. | 4.2 | High-speed camera |
| PlanApo N 60x oil NA 1.4 | Olympus | Oil immersion objective for nanobead preparation | |
| Polybead microspheres | Polysciences, Inc. | 00876-15 | For worm immobilization |
| solid state switches | Sensata Technologies | Crydom CMX100D6 | Controls timing of LED illumination |
| Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | SY1627 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele |
| Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele | |
| Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Gottschalk Lab | ZX1659 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line |
References
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).
- Nagel, G., et al. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Current Biology. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Liewald, J. F., et al.
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L.
- Lewis, J. A., et al. Cholinergic Receptor Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).
- Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature Neuroscience. 9, 791-798 (1999).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization. PLoS ONE. 8 (1), 1-6 (2013).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using umanager. Current Protocols in Molecular Biology. (Suppl 92), 1-17 (2010).
- Richmond, J. Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction. Journal of Visualized Experiments. (24), 1-4 (2009).
- Hoon Cho, J., Bandyopadhyay, J., Lee, J., Park, C. S., Ahnn, J. Two isoforms of sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) are essential in Caenorhabditis elegans. Gene. 261, 211-219 (2000).
- Zwaal, R. R., et al. The Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase Is Required for Development and Muscle Function in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (47), 43557-43563 (2001).
- Stammers, A. N., et al. The regulation of sarco(endo)plasmic reticulum calcium-ATPases (SERCA). Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93, 1-12 (2015).
- Clapham, D. E.
- Hovnanian, A. Serca pumps and human diseases. Calcium Signalling and Disease: Molecular Pathology of Calcium. , 337-363 (2007).
- Periasamy, M., Kalyanasundaram, A. SERCA pump isoforms: Their role in calcium transport and disease. Muscle and Nerve. 35 (4), 430-442 (2007).
- Gehlert, S., Bloch, W., Suhr, F. Ca2+-Dependent Regulations and Signaling in Skeletal Muscle: From Electro-Mechanical Coupling to Adaptation. International Journal of Molecular Sciences. 16, 1066-1095 (2015).
- Martin, A. A., Richmond, J. E. The sarco(endo)plasmic reticulum calcium ATPase SCA-1 regulates the Caenorhabditis elegans nicotinic acetylcholine receptor ACR-16. Cell Calcium. 72, 104-115 (2018).
- Wang, Z., Saifee, O., Nonet, M. L., Salkoff, L. SLO-1 Potassium Channels Control Quantal Content of Neurotransmitter Release at the C. elegans Neuromuscular Junction. Neuron. 32, 867-881 (2001).
- Abraham, L. S., Oh, H. J., Sancar, F., Richmond, J. E., Kim, H. An Alpha-Catulin Homologue Controls Neuromuscular Function through Localization of the Dystrophin Complex and BK Channels in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 6 (8), 1-13 (2010).
- Gourgou, E., Chronis, N. Chemically induced oxidative stress affects ASH neuronal function and behavior in C. elegans. Scientific Reports. 6, 1-9 (2016).
- Zahratka, J. A., Williams, P. D. E., Summers, P. J., Komuniecki, R. W., Bamber, B. A. Serotonin differentially modulates Ca2+ transients and depolarization in a C. elegans nociceptor. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1041-1050 (2015).
- Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26 (3), 583-594 (2000).
- Nekimken, A. L., et al. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. 17 (6), 1116-1127 (2017).
- Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (74), 1-9 (2013).
- Jospin, M., Jacquemond, V., Mariol, M. C., Ségalat, L., Allard, B. The L-type voltage-dependent Ca2+channel EGL-19 controls body wall muscle function in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 159 (2), 337-347 (2002).
- Wabnig, S., Liewald, J. F., Yu, S., Gottschalk, A. High-Throughput All-Optical Analysis of Synaptic Transmission and Synaptic Vesicle Recycling in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. , 1-26 (2015).
