Summary
Этот метод обеспечивает способ для пары оптогенетики и генетически закодированных датчиков кальция для изображения базовых уровней цитосолика кальция и изменения в вызванных переходных кальция в мышцах стенки тела модельного организма C. elegans.
Abstract
Модель организма C. elegans обеспечивает отличную систему для выполнения виво-изображения кальция. Его прозрачное тело и генетическая манипулируемость позволяют целенаправленно выражать генетически закодированные датчики кальция. Этот протокол описывает использование этих датчиков для in vivo изображения динамики кальция в целевых клетках, в частности, мышцы стенки тела червей. Используя совместное выражение пресинаптического каналародопсина, стимуляция ацетилхолина от возбуждающих моторных нейронов может быть индуцирована с помощью импульсов синего света, что приводит к деполяризации мышц и воспроизводимым изменениям цитоплазмического кальция Уровней. Два червя иммобилизации методы обсуждаются с различными уровнями сложности. Сравнение этих методов показывает, что оба подхода сохраняют физиологию нервно-мышечного соединения и позволяют воспроизводимую количественную оценку переходных кальция. При сопряжении оптогенетики и функциональной визуализации кальция, изменения в постсинаптической обработки кальция и гомеостаза могут быть оценены в различных мутантных фонов. Представленные данные подтверждают как методы иммобилизации, так и конкретно рассматривают сяосматривает роли C. elegans sarco (endo)plasmic reticular calcium ATPase и кальциевый канал BK калия в регуляции кальция мышцы стенки тела.
Introduction
В этой статье представлены методы для in vivo изображения кальция C. elegans мышцстены тела с использованием оптогенетической стимуляции нейронов. Сопряжение мышцы, выраженной генетически закодированным индикатором кальция (GECI) с синим светом, спровоцировав нейрональную деполяризацию и обеспечивает систему для четкого наблюдения вызываемых постсинаптических переходных кальций. Это позволяет избежать использования электрической стимуляции, что позволяет неинвазивный анализ мутантов, влияющих на динамику постсинаптического кальция.
Однофторофорные ГКИ, такие как GCaMP, используют одну флуоресцентную молекулу белка, сливную с доменом M13 миозиновой легкой цепи киназы в конце N-терминала и стодулина (CAM) в C-терминине. После связывания кальция, домен CaM, который имеет высокое сродство к кальцию, подвергается конформационным изменениям, вызывая последующее конформационное изменение флуоресцентного белка, что приводит к увеличению интенсивности флуоресценции1. GCaMP флуоресценция возбужденных на 488 нм, что делает его непригодным для использования в сочетании с channelrhodopsin, который имеет аналогичную длину волн возбуждения 473 нм. Таким образом, для того, чтобы соединить измерения кальция со стимуляцией channelrhodopsin, зеленый флуоресцентный белок GCAMP должен быть заменен красным флуоресцентным белком, мруби (RCaMP). Использование мышцы выразилRCaMP, в сочетании с холинергической двигательной нейронной экспрессии channelrhodopsin, позволяет исследования на червя нервно-мышечного соединения (NMJ) с одновременным использованием оптогенетики и функциональной визуализации в рамках одного и того же животного 2.
Использование channelrhodopsin обходит необходимость электрической стимуляции для деполяризации нервно-мышечных соединений C. elegans, которые могут быть достигнуты только в расчлененных препаратов, что делает этот метод как легче использовать и более точным при ориентации на конкретные ткани. Например, channelrhodopsin ранее был использован в C. elegans для обратимой активации конкретных нейронов, что приводит либо к надежной активации возбуждательных или ингибирующих нейронов3,4. Использование светостимулируемой деполяризации также обходит вопрос о повреждении нейронов из-за прямой электрической стимуляции. Это дает возможность изучить влияние многих различных протоколов стимуляции, в том числе устойчивых и повторяющихся стимуляций, на постсинаптической динамике кальция4.
Прозрачный характер C. elegans делает его идеальным для флуоресцентного изображения функционального анализа. Однако, при стимулировании возбуждающих ацетилхолина нейронов на NMJ, животные, как ожидается, реагировать с немедленной сокращения мышц4, что делает иммобилизацию червей решающее значение в визуализации дискретных изменений кальция. Традиционно, фармакологические агенты были использованы, чтобы парализовать животных. Одним из таких препаратов используется левамизол, холинергический ацетилхолин рецептор агониста5,6,7. Так как левамизол приводит к постоянной активации подтипа возбуждающих мышечных рецепторов, этот реагент не подходит для изучения динамики мышечного кальция. Действие левамизола вызывает постинаптическую деполяризацию, повышение цитозолического кальция и окклюзионные наблюдения после пресинаптической стимуляции. Чтобы избежать применения парализующих препаратов, мы рассмотрели два альтернативных метода обездвиживания C. elegans. Звери были либо склеены, а затем расчленены открытыми, чтобы разоблачить мышцы стенки тела, похожие на существующие C. elegans NMJ электрофизиологии метод8, или нанобусы были использованы для обездвиживания нетронутых животных9. Обе процедуры позволили для воспроизводимых измерений отдыха и вызвали мышечного кальция переходных, которые были легко поддаются количественной оценке.
Методы в этой работе могут быть использованы для измерения базовых уровней цитосолика кальция и переходных в постсинаптических клеток мышц стенки тела в C. elegans. Приводятся примеры данных, использующих два различных метода иммобилизации. Оба метода воспользоваться оптогенетики деполяризации мышечных клеток без использования электрической стимуляции. Эти примеры демонстрируют осуществимость этого метода при оценке мутаций, которые влияют на постсинаптическую обработку кальция у червей, и указывают на плюсы и минусы двух иммобилизационных подходов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Установка микроскопа
- Используйте сложный микроскоп с возможностями флуоресценции. Для этого исследования были собраны данные по вертикальному микроскопу(Таблица материалов),оснащенному светодиодами для возбуждения.
- Для того, чтобы правильно визуализировать изменения флуоресценции в мышцах стенки тела, используйте цель высокого увеличения.
- Для вскрытия препаратов используйте цель погружения воды 60x NA 1.0(Таблица материалов).
- Для приготовления с использованием нанобий, используйте 60x NA 1.4 цель погружения масла(Таблица материалов). Это увеличение обеспечивает достаточное разрешение мышц на датчик камеры.
- Используйте камеру высокой чувствительности, прикрепленную к микроскопу, для захвата изображений с высокой частотой кадров, чтобы отслеживать быстрые изменения в уровнях кальция. Для этого исследования, изображение с системой sCMOS (Таблица материалов), способный полный кадр изображения на 100 Гц, как время подъема для сигналов Ca2 "может быть столь же быстрым, как десятки миллисекунд.
- Управление приобретением камеры и светодиодной флуоресценцией с помощью программного обеспечения микро-менеджера, работая в ImageJ10 в соответствии с инструкциями производителя(Таблица материалов).
- Используйте электронный плагин с открытым исходным кодом, который соединяет внешнюю доску микроконтроллера с открытым исходным кодом(Таблица материалов),чтобы управлять внешними импульсами синхронизации для управления возбуждением флуоресценции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Цифровые выходы доступны из цифровых контактов от 8 до 13, обеспечивая выходные биты от 0 до 5. Они могут быть рассмотрены в качестве базовых 2 значений 1, 10, 100 и т.д. Параметры серийных портов указаны в таблице 1 и доступны на веб-сайте микроменеджера(Таблица материалов). Прошивка для микроконтроллерной платы также доступна на этом веб-сайте. - Чтобы контролировать логику синхронизации, активируйте протокол приобретения микроменеджера в программном обеспечении в соответствии с инструкциями производителя(Таблица материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Это одновременно инициирует заданные кадры камеры продолжительность и количество кадров, которые будут активированы, а также логический затвор и предустановленный светодиод янтаря для флуоресценции возбуждения. В этом случае янтарный светодиодный твердотельный переключатель управляется микроконтроллером, отбиваемым 1 выходом через контактный 9. Камера кадры из TTL (задняя пластина из 3 разъема) вызывает стимулятор. Это точно раз активации синего света светодиоддля активации channelrhodopsin в установленное время после активации последовательности изображений. - Для стимуляции канала с синим светом и записи Изменений RCaMP, используйте два светодиода. Активировать каналродопсин со светодиодом с пиковой длиной волны выбросов 470 нм и фильтром полосы (455 до 490 нм) и возбудить RCaMP со светодиодом с пиковой длиной волны выбросов 594 нм и фильтром bandpass (570 до 600 нм).
- Для того, чтобы одновременно активировать каналродопсин и захватить изменения в rCaMP флуоресцентных уровней, совместно освещать оба светодиода и передать свет на тот же оптический путь с помощью дихроического пучка комбайна.
- Контролируйте время светодиодной подсветки с помощью твердотельных выключателей(Таблица материалов),управляемых сигналами TTL (максимально рассчитанное время включения, 1 мс, время выключения 0,3 мс: от 0 до 90% включения и выключение времени lt; 100 s).
- Установите интенсивность светодиодов с текущим контролируемым низким уровнем шума линейных источников питания(Таблица материалов).
- Для обеспечения точного времени светодиода синего света активируйте его непосредственно импульсом TTL в твердотельную ретранслятор от стимулятора. Программа синий протокол стимуляции света в стимулятор(Таблица материалов), который выступает в качестве точного таймер с начала приобретения изображения до синего светодиодного освещения. В этом эксперименте, включите синего света стимуляции после 2 с захвата RCaMP флуоресценции только и использовать поезд 5, 2 мс синий свет импульсов с 50 мс межпульсовых интервалов для активации channelrhodopsin.
ПРИМЕЧАНИЕ: Задержка перед импульсами синего света, продолжительность импульсов синего света, время между импульсами, и количество импульсов в поезде все могут быть установлены в этой точке и должны отражать конкретные параметры экспериментального интереса.
2. C. elegans подготовка образца и получение данных
- Чтобы оптически стимулировать пресинаптических нейронов, получить животных, выражающих channelrhodopsin в возбуждающих холинергических нейронов, управляемых с unc-17 промоутер области, и RCaMP выражается во всех мышц стенки тела приводом с мио-3 промоутер регион2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать только животных со встроенными трансгенами и устойчивыми уровнями флуоресценции, поскольку переменное выражение в соответствующих типах клеток может повлиять на надежность получения данных. - Сделать рабочий запасвсе-транс жетины путем разбавления порошок женеливой(Таблица материалов) в этанол, чтобы создать окончательную концентрацию 100 мм и хранить при -20 градусов по Цельсию. Этот рабочий запас будет стабильным в течение примерно одного года.
- Создайте запас OP50 E. coli,выращенный в LB-медиа, дополненный все-транс-жеренной из рабочего запаса, сделанного в шаге 2.2, при конечной концентрации 80 мкм. Объем, используемый для ОП50-ретинального запаса, будет зависеть от количества пластин, необходимых для эксперимента.
- Семена нематод роста средств (NGM) пластины с примерно 300 л из OP50 "ретинального запаса и позволяют пластины высохнуть на ночь при комнатной температуре в темноте.
- Выращивайте C. elegans штаммов до желаемого возраста в темноте на OP50'retinal NGM пластин при 20 градусах Цельсия. Для этого эксперимента используйте взрослых червей.
- Для эксперимента с использованием вскрытых подготовки, только использовать gravid взрослых червей, как выполнение вскрытия на молодых, мелких животных является чрезвычайно сложной задачей. Оставьте животных на OP50-ретинальных пластин на не менее 3 дней для эффективной активации канала.
- При использовании расчлененный препарат8,11 (Рисунок 1А),выполнять вскрытия в низкой освещенности.
- Поместите животных в рассекающее блюдо с силиконовым покрытием крышкой базы, которая заполнена 1 мМ Ca 2 "внеклеточное решение состоит из 150 мМ NaCl, 5 мм KCl, 1 мМ CaCl2, 4 мМ MgCl2, 10 мм глюкозы, 5 мм сахарозы, и 15 мМ HEPES (pH 7.3 , -340 Осм).
- Клей вниз животных, используя жидкость актуальные кожи клей с голубой окраской вдоль содвождения стороне червя и сделать боковой разрез кутикулы вдоль клея / червя интерфейс с помощью стеклянных игл.
- Используйте пипетку для очистки внутренней внутренности от полости червя.
- Клей вниз кутикулы лоскут животного подвергать брюшной медиальной мышцы стенки тела для визуализации.
- При использовании препарата нанобивок(рисунок 1B)
- Сделайте расплавленный 5% агарозный раствор с помощью ddH2O до конечного объема 100 мл.
- Используя пипетку Pasteur, поместите каплю расплавленного раствора агарозы на стеклянную горку и немедленно поместите вторую стеклянную горку поверх, перпендикулярно первому, используя нежное давление, чтобы создать ровную агарозную площадку. Удалите верхний слайд перед использованием.
- Добавьте примерно 4 злитрона нанобусов полистирола(Таблица материалов)к середине агарозной площадки.
- При слабом освещении выберите 4-6 C. elegans в раствор нанобищ, убедившись, что животные не лежат друг на друге, и аккуратно поместите крышку сверху.
- Поместите подготовленную горку или блюдо вскрытия на микроскоп, и найти и сосредоточиться на червя с помощью 10x увеличение и тусклый яркое освещение поля.
- Переключитесь на 60-кратное увеличение и возбуждение флуоресценции RCaMP для определения вентромедиаальной мышцы стенки тела, которая является передней к вульве и в правильной координационной плоскости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышцы передвульвиной выбраны, поскольку они отражают мышцы обычно стимулируются в экспериментах электрофизиологии. - Измените путь изображения от окуляра к камере, потянув за переключатель и нажав Live в рамках программного обеспечения для сбора данных (Таблица материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что синий свет стимуляции путь выключен в этой точке, чтобы убедиться, что channelrhodopsin не активируется перед захватом изображений. - Сосредоточьте изображение в программном обеспечении для сбора данных с помощью тонкого фокуса микроскопа.
- После того, как мышца явно в фокусе, выключите живое изображение, отключив кнопку Live.
- Нажмите кнопку рентабельности инвестиций в программном обеспечении для сбора данных и создайте окно вокруг мышц, на которых сосредоточено внимание.
- На стимуляторе включите путь стимуляции синего света, который ранее был запрограммирован в шаге 1.10.
- Нажмите Приобрести в изображении программного обеспечения для захвата изображения через камеру CMOS. Для этого установите время экспозиции до 10 с 1000 кадров и 2x binning.
3. Анализ данных
- Откройте файл данных в программном обеспечении для визуализации(Таблица материалов)и, используя инструмент Polygon, наметить мышцы интереса. Это рентабельность инвестиций.
- Перейти к изображению Стеки Участок профиля оси и экспортировать полученные точки данных в программное обеспечение электроннойтаблицы (Таблица материалов). Эта функция указывает на среднее значение выбора ROI по сравнению с точкой времени.
- Перемещение мышечной рентабельности, созданной с помощью инструмента Polygon за пределами животного, чтобы получить фон флуоресценции измерения с помощью шагов, изложенных в 3.2. Экспорт полученных данных в электронную таблицу.
- В таблице таблицы учебник, вычесть фоновых значений флуоресценции из значений флуоресценции мышц в каждой временной точке. Это обеспечивает фон вычитается люминесцентный сигнал.
- Среднее фон вычитается флуоресценции для первых 2 с точек данных. Это даст базовые измерения флуоресценции, F.
- Используйте базовые измерения флуоресценции для расчета нормализованного уровня флуоресценции в каждой временной точке. Для этого используйте уравнение (ЗФ/Ф)1. ЗФ представляет (F(t)-F), где F(t) является измерением флуоресценции в любой момент времени, а F является базовым значением. No 1 добавляется в качестве смещения y-оси.
- Повторите шаги 3.2-3.6 для каждого собранного мышечного изображения. Использование одиночных или множественных мышечных клеток на изображение находится на усмотрение исследователя. N эксперимента можно определить путем выполнения анализа мощности.
- Используйте обработанные данные из шагов 3.2-3.6, чтобы сделать след флуоресцентных значений в программном обеспечении для графиков в соответствии с инструкциями производителя(Таблица материалов).
- Из этого следа, измерить кинетику кальция переходных, таких как подъем к пиковому времени и половина времени распада, используя инструменты, представленные в программном обеспечении для графиков в соответствии с инструкциями производителя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот метод оценивал изменения в мутантах, как полагают, влияют на обработку кальция или деполяризацию мышц. Базовые уровни флуоресценции и флуоресцентные переходные были визуализированы и отдыхациозного кальция и кинетики кальция в мышцах были оценены. Важно, чтобы животные выращивались на всетрансрежной жене лежки в течение не менее трех дней, чтобы обеспечить успешное включение ретины, тем самым впоследствии активируя каналродопсин(рисунок 2А). Если животные не подвергаются воздействию все транс-ретинала, не мышечный кальций переходных срабатывает(Рисунок 2B). Хотя эти животные все еще могут быть использованы для оценки базовых уровней цитосолика кальция, любые динамические изменения в кальции не будут захвачены. Кроме того, в качестве внутреннего контроля для здоровья животных или вскрытия, животное будет сокращаться после синего света стимуляции. Запись с сокращением мышц, что вызывает минимальное валовое движение тела червя был выбран для сбора данных при использовании нанобий для иммобилизации. Если мышца, используемая для сбора необработанных значений флуоресценции, энергично сокращается, в результате чего все тело червя будет двигаться, переходный след будет отражать этот артефакт движения(рисунок 2C) и должны быть отброшены из количественной оценки.
Мутация отображение в локус гена sca-1 была выделена с экрана для мутаций, влияющих c. elegans мышечной никотиновой локализации рецепторов. C. elegans sca-1 ген кодирует только омолог сарко (эндо) плазменный ретикулярный кальций ATPase (SERCA) в червя и является единственным насосом SERCA присутствует в мышцах стенки тела12,13. Потеря функции sca-1 мутантов были предсказаны, чтобы проявлять изменения в обработке кальция мышц на основе важной роли SERCA играет в поддержании гомеостаза кальция в мышцах млекопитающих14,15,16 ,17,18. GECI RCaMP был выражен в мышцах стенки тела и синий свет активированный каналродопсин был выражен в возбуждающих холинергических нейронов для оценки как внутриклеточного базового кальция и кальция динамики в sca-1 мутантов. С расчлененный метод подготовки, увеличение базовых уровней RCaMP флуоресценции наблюдались в sca-1 мутант по сравнению с контролем(Рисунок 3A,B), предполагая, что потеря функции SERCA приводит к повышенный уровень покоя цитоплазмического кальция. Когда динамика кальция были изучены, после пресинаптической стимуляции, вызванной с поездом 5, 2 мс синий свет импульсов(Рисунок 3C), было значительное снижение пиковых уровней кальция в sca-1 (tm5339) мутантов, как по сравнению с контролем(рисунок 3D), который может отражать снижение запасов кальция в SR. Однако никаких изменений не было замечено в подъеме к пиковому времени или половине времени распада(рисунок 3E,F). Это говорит о том, что вызвали изменения в цитосолико кальция из любого внешнего источника, таких как ввод кальция через рецепторы ацетилхолина и / или напряжения-gated кальциевых каналов, а также из внутренних магазинов не затрагиваются в sca-1 (tm5339) мутантов . Аналогичные результаты можно наблюдать с помощью препарата нанобида, как показано на рисунке 419. Это повторение данных дает доказательства того, что оба эти методы являются физиологическими для измерения мышцы стенки тела отдыхациоплазмических уровней кальция, а также наблюдения стимулировали переходных кальция. Это также свидетельствует о том, что вскрытие червя не наносит ущерб животному, что изменяет его обработки кальция или способность деполяризовать postsynaptic мышц.
Этот протокол также может быть использован для изучения мутантов, которые косвенно влияют на обработку кальция в C. elegans. Потеря функции slo-1 (eg142) мутантов были оценены, чтобы продемонстрировать это. Ген slo-1 кодирует кальций активированный канал калия BK, который выражен в обоих нейронах и мышцах20,21. Исследования ранее описал роль Для SLO-1 в мышцах стенки тела, демонстрируя, что потеря функции мутантов имеют дефект в postsynaptic реполяризации после мышечного действия потенциалов20,21. Возможные изменения в базовых уровнях кальция и переходной динамике кальция из-за этой гипервозбудимости были рассмотрены с помощью иммобилизации нанобидов. Когда базовые уровни RCaMP были измерены, slo-1 (eg142) мутанты отображаются увеличение флуоресценции по сравнению с элементами управления (Рисунок 5A,B)19. Это говорит о том, что каналы БК могут также регулировать базовые уровни цитосолильного кальция. Никаких изменений в пиковых уровнях кальция не было замечено по сравнению с контролем(Рисунок 5C,D) при оценке кинетики вызываемого кальция преходящим. Slo-1 (eg142) мутантов, однако, выставлены значительно увеличилось рост до пикового времени по сравнению с контролем (Рисунок 5E). Это может отражать ранее сообщалось увеличение пресинаптической возбудимости20,21. Существовал, однако, никаких существенных изменений в половину времени распада в slo-1 (eg142) мутантов по сравнению с контролем (Рисунок 5F). В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что этот метод может быть использован для оценки влияния до- и постсинаптических мутаций как на отдых, так и на стимулированный кальций мышц стенки тела.
| Серийная настройка | Значение |
| Ответ тайм-аут | 500 |
| Скорость | 57600 |
| ЗадержкаМеждуЧарами | 0 |
| Квитирования | Выключено |
| Четности | Ни один |
| Стопбиты | 1 |
| Подробного | 0 |
Таблица 1: Серийные настройки порта для плагина микроконтроллера, который управляет внешней микроконтроллерной доской. Это используется для программирования внешних импульсов времени для контроля возбуждения флуоресценции.
Рисунок 1: Графическое представление различных методов иммобилизации. (A) Этот график демонстрирует технику вскрытия для иммобилизации. Тело червя приклеивается (синий) вокруг псной стороны животного. Вдоль кутикулы сонливок создает кутикулу. Этот лоскут был склеен вниз, чтобы разоблачить нетронутыми NMJs формируется между синапсами брюшного нервного шнура в зеленый (channelrhodopsin) и RCaMP выражения мышц в красном. (B) Этот график демонстрирует нанобицы иммобилизации техники. Нетронутый червь окружен представлением нанобусов в растворе, что при сжатии накладным покрытием, обездвижить червя. Благодаря прозрачности C. elegans,брюшной нервный шнур может быть визуализирован зеленым (channelrhodopsin) и RCaMP выражая мышцы могут быть визуализированы красным цветом. Яйцеклетка в середине червя представляет вульвы, которая является ориентиром выявления брюшной мышцы стенки тела. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Представительные следы переходных кальция. (A) Однократное представление следа кальция переходных вызванных поездом 5, 2 мс синий свет импульсов на 50 мс межпульсовых интервалов, записанных в животных с ограниченным движением тела (- движение), выращенных в присутствиивсе-транс женевой (я все- транс-ретина). Артефакты шипа являются импульсами стимуляции синего света, так как оба светодиода одновременно освещаются совместно. (B) Однократное представление трассировки, показывающее отсутствие переходного кальция в ответ на поезд 5, 2 мс синего света импульсов с 50 мс интерпульсовых интервалов в животном, которое не подвергалось воздействию всех транс-жертной (- все- транс-ретинал , - движение). (C) Однократное представление следов преходящего кальция, который был вызван поездом 5, 2 мс синий свет импульсов с 50 мс интерпульсинтервалов, записанных в животных, которые имели значительное сокращение мышц, ведущих к движению артефактов (я движения, все транс-жертовца). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Базовый уровень кальция и вызвал переходные кальция из контроля и sca-1 (tm5339) образцы, подготовленные с использованием техники вскрытия. (A) Представитель изображения базовых RCaMP флуоресценции в sca-1 (tm5339) мутантов и элементов управления. Шкала бар 50 мкм. (B) Базовые уровни флуоресценции количественнове произвмествующих в sca-1 (tm5339) мутантов (n'13) и контроля (n'9). (C) Ансамбль средний следы вызвал кальций переходных для sca-1 (tm5339) мутантов и контрольных животных. (D) Количественная оценка пиковой флуоресценции RCaMP от channelrhodopsin вызвала реакцию кальция у мутаций sca-1 (tm5339) (n'12) и контроля (n'9). (E) Количественная оценка подъема к пиковому времени channelrhodopsin вызвало переходные кальция в sca-1 (tm5339) мутантов (n'12) и контроля (n'8). (F) Половина времени распада количественной оценки channelrhodopsin вызвало кальция переходных в sca-1 (tm5339) мутантов (n'12) и контроля (n'7). Статистически значимые значения были: незначительные p'gt;0.05, p'0.05, p'0.01, p'01, p'001. Ошибки баров представляют собой среднее ЗНАЧЕНИЕ SEM. Данные были нормализованы с помощью тестов Shapiro-Wilk и значение было определено с манна-Уитни тест для ненормальных дистрибутивов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Базовый уровень кальция и вызвал переходные кальция из контроля и sca-1 (tm5339) образцы, подготовленные с использованием нанобиад иммобилизации. (A) Репрезентативные изображения базовых флуоресценции в sca-1 (tm5339) мутантов и элементов управления, шкала бар 50 мкм. (B) Количественная оценка базовых уровней флуоресценции RCaMP в sca-1 (tm5339) мутантов (n'14) и контроля (n'13) . (C) Средний вызванный кальций переходных для sca-1 (tm5339) мутантов и элементов управления. (D) Количественная оценка пиковой флуоресценции RCaMP после вызвала реакцию кальция у мутантов sca-1 (tm5339) (n'14) и контроля (n'13). (E) Количественная оценка подъема к пиковому времени вызываемого перекачанного кальция переходных веществ в мутантах sca-1 (tm5339) (n'14) и контролях (n'12). (F) Количественная количественная оценка половины времени распада вызываемого кальция переходных веществ в мутантах sca-1 (tm5339) (n'14) и контроль (n'13). Рисунок адаптирован от19. Статистически значимые значения были: не значительные р.г.; 0,05,. 0,05,. 0,01,. 0,01,. 0,001. Ошибки баров показывают, что означает SEM. Нормализация данных была оценена с помощью тестов Shapiro-Wilk и значение было определено с тестом Манн-Уитни для ненормальных дистрибутивов. Эта цифра была изменена с разрешенияот 19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Базовый уровень кальция и вызвал переходные кальция из контроля и slo-1 (eg142) образцы, подготовленные с использованием нанобебя иммобилизации. (A) Репрезентативные изображения базовых флуоресценции в slo-1 (например142) мутантов и элементов управления, шкала бар 50 мкм. (B) Количественная оценка базовых уровней флуоресценции RCaMP в slo-1 (например142) мутантов (n'29) и контроля (n'13). (C) Средний вызванный кальций переходных для slo-1 (eg142) мутантов и элементов управления. (D) Количественная оценка пиковой флуоресценции RCaMP после вызвала реакцию кальция в сло-1 (eg142) мутантов (n'29) и контроля (n'13). (E) Количественная оценка подъема к пиковому времени вызываемого перетавоченного кальция переходных веществ в мутантах slo-1 (eg142) (n'29) и контролях (n'13). (F) Количественная количественная оценка половины времени распада вызываемого кальция переходных веществ в мутантах slo-1 (eg142) (n'11) и контролях (n'13). Рисунок адаптирован от19. Статистически значимые значения были: не значительные р.г.; 0,05,. 0,05,. 0,01,. 0,01,. 0,001. Ошибки баров показывают, что означает SEM. Нормализация данных была оценена с помощью тестов Shapiro-Wilk и значение было определено с тестом Манн-Уитни для ненормальных дистрибутивов. Эта цифра была изменена с разрешенияот 19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GECIs являются мощным инструментом в C. elegans нейробиологии. Предыдущая работа использовала методы визуализации кальция для изучения широкого спектра функций в нейронах и мышечных клетках, включая сенсорные и поведенческие реакции, с различными методами стимуляции. Некоторые исследования использовали химические стимулы, чтобы вызвать переходные кальция в сенсорных нейронов ASH22,23 или вызвать кальциевые волны в мышцах фарингина24. Другая группа использовала механическую стимуляцию в то время как черви были проведены в микрофлюидных чипов для изучения реакции кальция в сенсорных рецепторов нейронов25. Тем не менее, другие использовали электрическую стимуляцию, чтобы визуализировать изменения кальция в обоих нейронов26 и мышцы стенки тела27. Что является общим между этими исследованиями является требование внешних стимулов, таких как решения или оборудование, чтобы вызвать переходных кальция. Протокол, изложенный здесь, капитализирует сяпч управления, полученный от оптогенетической стимуляции, которая обеспечивает нейрональную специфичность, в сочетании с функциональным анализом мышц, выраженных GECIs2 в той же экспериментальной парадигме.
Описаны две формы иммобилизации червей, и, хотя каждый метод должен быть оценен при удовлетворении экспериментальных потребностей, как вскрытые, так и физиологически нетронутые препараты дают дополнительные результаты, позволяющие следователям использовать любой подход в своих исследованиях. Существует повышенная техническая проблема с использованием техники вскрытия, с пользователем требуется освоить как точное использование хирургического клея и микродиссекции без повреждения нервного шнура или мышц. Кроме того, из-за уровня сложности вскрытия, только gravid взрослых должны быть использованы, которые могли бы ограничить экспериментальные точки времени. Кроме того, метод вскрытия также гораздо труднее выполнять на мутантов, которые производят малых, тонких или болезненных животных, опять же, возможно, ограничивая экспериментальные параметры. Преимущество этого метода является то, что он ограничивает тело движения артефакт в результате деполяризации, склеивание предотвращает избыточное движение тела червя, а также обеспечивает доступ к NMJ для решения изменений и применения наркотиков. Кроме того, каждый препарат подвергает той же области червя, который гарантирует мышцы стенки тела будет последовательно в центре внимания. Второй метод, используя нанобусы для обездвиживания червей, менее вовлечены и могут быть быстро изучены. Кроме того, любой возраст животных могут быть использованы с помощью этого метода, что позволяет изменения в обработке кальция через развитие, чтобы контролироваться. Необходимо принимать меры при размещении червей в раствор нанобища, так как слишком много манипуляций с животными может привести к их взрыву. Кроме того, coverslip не должны быть перемещены после размещения на верхней части животных, так как это может привести к животным ролл или поворот на себя, опять же приводит к повреждению. Хотя использование нанобий может обеспечить высокой пропускной результат, в котором животные потенциально могут быть восстановлены, нет стандартизации положения тела животного, таким образом, каждое животное не может иметь мышцы стенки тела в ясной координации плоскости. Если эксперимент требует большого количества животных, могут потребоваться различные методы иммобилизации, такие как микроколодцы на основе агара, которые позволяют навалом флуоресценции кальция28. Независимо от ограничений этих двух методов, либо могут быть использованы для получения надежных, легко количественно кальция переходных в C. elegans мышцы стенки тела.
C. elegans предоставляют много преимуществ в качестве системы in vivo для функциональных исследований изображений. Звери прозрачны, что позволяет спаривания оптогенетических нейронов деполяризации с помощью channelrhodopsin с GECI RCaMP для измерения в результате postsynaptic кальция переходных в мышцах. Уровни достимуляции флуоресценции RCaMP также могут быть использованы для оценки базовых уровней цитосолика кальция. Генетическая tractability C. elegans делает изучение новых мутаций, которые могут повлиять на гомеостаз кальция или обработки легко преследовать, часто с легко доступнымутномутмых аллелей мутантов. Используя методы, изложенные в этом протоколе, постсинаптические данные по визуализации кальция могут быть получены эффективно и при относительно низких затратах, что делает эту систему привлекательной для широкого спектра экспериментов в области визуализации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят д-ра Александра Готтшалька за «X1659», RCaMP и channelrhodopsin, содержащий штамм червей, доктора Hongkyun Кима за штамм червей slo-1 (eg142) и Национальный проект биоресурсов для штамма червя sca-1 (tm5339).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| all-trans retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | Necessary for excitation of channel rhodopsin |
| Amber LED | RCaMP illumination | ||
| Arduino UNO | Mouser | 782-A000066 | Controls fluorescence illumination |
| Blue LED | channelrhodopsin illumination | ||
| BX51WI microscope | Olympus | Fixed state compound microscope | |
| Current controlled low noise linear power supply | Ametek | Sorenson | Controls LED intensity |
| Igor Pro | Wavemetrics | Wavemetrics.com | Graphing software |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov | Image processing software |
| LUMFLN 60x water NA 1.4 | Olympus | Water immersion objective for dissected preparation | |
| Master-8 Stimulator | A.M.P.I | Master timer for image acquisition and LED illumination | |
| Micro-Manager | micro-manager.org | Controls camera acquisition and LED excitiation | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| pco.edge 4.2 CMOS camera | pco. | 4.2 | High-speed camera |
| PlanApo N 60x oil NA 1.4 | Olympus | Oil immersion objective for nanobead preparation | |
| Polybead microspheres | Polysciences, Inc. | 00876-15 | For worm immobilization |
| solid state switches | Sensata Technologies | Crydom CMX100D6 | Controls timing of LED illumination |
| Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | SY1627 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele |
| Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele | |
| Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Gottschalk Lab | ZX1659 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line |
References
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).
- Nagel, G., et al. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Current Biology. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Liewald, J. F., et al.
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L.
- Lewis, J. A., et al. Cholinergic Receptor Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).
- Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature Neuroscience. 9, 791-798 (1999).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization. PLoS ONE. 8 (1), 1-6 (2013).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using umanager. Current Protocols in Molecular Biology. (Suppl 92), 1-17 (2010).
- Richmond, J. Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction. Journal of Visualized Experiments. (24), 1-4 (2009).
- Hoon Cho, J., Bandyopadhyay, J., Lee, J., Park, C. S., Ahnn, J. Two isoforms of sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) are essential in Caenorhabditis elegans. Gene. 261, 211-219 (2000).
- Zwaal, R. R., et al. The Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase Is Required for Development and Muscle Function in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (47), 43557-43563 (2001).
- Stammers, A. N., et al. The regulation of sarco(endo)plasmic reticulum calcium-ATPases (SERCA). Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93, 1-12 (2015).
- Clapham, D. E.
- Hovnanian, A. Serca pumps and human diseases. Calcium Signalling and Disease: Molecular Pathology of Calcium. , 337-363 (2007).
- Periasamy, M., Kalyanasundaram, A. SERCA pump isoforms: Their role in calcium transport and disease. Muscle and Nerve. 35 (4), 430-442 (2007).
- Gehlert, S., Bloch, W., Suhr, F. Ca2+-Dependent Regulations and Signaling in Skeletal Muscle: From Electro-Mechanical Coupling to Adaptation. International Journal of Molecular Sciences. 16, 1066-1095 (2015).
- Martin, A. A., Richmond, J. E. The sarco(endo)plasmic reticulum calcium ATPase SCA-1 regulates the Caenorhabditis elegans nicotinic acetylcholine receptor ACR-16. Cell Calcium. 72, 104-115 (2018).
- Wang, Z., Saifee, O., Nonet, M. L., Salkoff, L. SLO-1 Potassium Channels Control Quantal Content of Neurotransmitter Release at the C. elegans Neuromuscular Junction. Neuron. 32, 867-881 (2001).
- Abraham, L. S., Oh, H. J., Sancar, F., Richmond, J. E., Kim, H. An Alpha-Catulin Homologue Controls Neuromuscular Function through Localization of the Dystrophin Complex and BK Channels in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 6 (8), 1-13 (2010).
- Gourgou, E., Chronis, N. Chemically induced oxidative stress affects ASH neuronal function and behavior in C. elegans. Scientific Reports. 6, 1-9 (2016).
- Zahratka, J. A., Williams, P. D. E., Summers, P. J., Komuniecki, R. W., Bamber, B. A. Serotonin differentially modulates Ca2+ transients and depolarization in a C. elegans nociceptor. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1041-1050 (2015).
- Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26 (3), 583-594 (2000).
- Nekimken, A. L., et al. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. 17 (6), 1116-1127 (2017).
- Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (74), 1-9 (2013).
- Jospin, M., Jacquemond, V., Mariol, M. C., Ségalat, L., Allard, B. The L-type voltage-dependent Ca2+channel EGL-19 controls body wall muscle function in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 159 (2), 337-347 (2002).
- Wabnig, S., Liewald, J. F., Yu, S., Gottschalk, A. High-Throughput All-Optical Analysis of Synaptic Transmission and Synaptic Vesicle Recycling in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. , 1-26 (2015).
