Summary
Denna metod ger ett sätt att par optogenetik och genetiskt kodade kalcium sensorer till bild baslinje cytosoliska kalciumnivåer och förändringar i framkallade kalcium transienter i kroppen väggen musklerna i modellorganismen C. elegans.
Abstract
Modellorganismen C. elegans ger ett utmärkt system för att utföra in vivo kalcium avbildning. Dess transparenta kropp och genetiska manipulabilitet möjliggör riktat uttryck för genetiskt kodade kalcium sensorer. Detta protokoll beskriver användningen av dessa sensorer för in vivo avbildning av kalciumdynamik i riktade celler, särskilt kroppen vägg musklerna i maskar. Genom att utnyttja Co-uttrycket av presynaptiska channelrhodopsin, stimulering av acetylkolin frisättning från excitatoriska motoriska nervceller kan induceras med hjälp av blått ljuspulser, vilket resulterar i muskel depolarisering och reproducerbara förändringar i cytoplasmiska kalcium Nivåer. Två mask immobilisering tekniker diskuteras med varierande svårighetsgrader. Jämförelse av dessa tekniker visar att båda metoderna bevara fysiologi den neuromuskulära korsningen och möjliggöra reproducerbara kvantifiering av kalcium transienter. Genom att para ihop optogenetik och funktionell kalcium avbildning kan förändringar i postsynaptisk kalcium hantering och homeostas utvärderas i olika mutantbakgrunder. Data som presenteras validerar både immobilisering tekniker och specifikt undersöker rollerna för C. elegans Sarco (endo) plasmatiska retikulär kalcium ATPas och kalcium-aktiverad BK kalium kanal i kroppen vägg muskel kalcium reglering.
Introduction
Denna uppsats presenterar metoder för in vivo kalcium avbildning av C. elegans kropps vägg muskler med hjälp av optogenetisk neuronala stimulering. Para ihop en muskel uttryckt genetiskt kodade kalcium indikator (GECI) med blått ljus utlöses neuronala depolarisering och ger ett system för att tydligt Observera den framkallade postsynaptiska kalcium transienter. Detta undviker användning av elektrisk stimulering, vilket möjliggör en icke-invasiv analys av mutanter som påverkar postsynaptiska kalciumdynamiken.
Single-fluorophore GECIs, såsom GCaMP, använder en enda fluorescerande proteinmolekyl smält till M13 domän myosin ljus kedjans Kinas vid dess N-terminalen slutet och calmodulin (CaM) vid C-Terminus. Vid kalcium bindning genomgår CaM-domänen, som har en hög affinitet för kalcium, en konformationsförändring som inducerar en efterföljande konformationsförändring i det fluorescerande proteinet som leder till en ökning av fluorescensintensiteten1. Gcamp fluorescens är upphetsad på 488 nm, vilket gör det olämpligt att användas tillsammans med channelrhodopsin, som har en liknande excitation våglängd på 473 nm. Således, för att par kalcium mätningar med channelrhodopsin stimulering, den gröna fluorescerande protein av GCaMP måste ersättas med ett rött fluorescerande protein, mRuby (RCaMP). Med hjälp av muskeln uttryckte RCaMP, i kombination med den kolinerga motoriska neuron uttrycket av channelrhodopsin, tillstånd studier vid masken neuromuskulära korsningen (NMJ) med samtidig användning av optogenetik och funktionell avbildning inom samma djur 2.
Användningen av channelrhodopsin kringgår behovet av elektrisk stimulering för att depolarisera de neuromuskulära korsningar av C. elegans, som endast kan uppnås i dissekerade preparat, vilket gör denna teknik både lättare att anställa och mer exakt När du riktar in dig på specifika vävnader. Till exempel har channelrhodopsin tidigare använts i C. elegans för att reversibelt aktivera specifika nervceller, vilket leder till antingen robust aktivering av excitatoriska eller hämmande neuroner3,4. Användningen av ljusstimulerad depolarisering kringtar också frågan om neuronala skador på grund av den direkta elektriska stimulering. Detta ger en möjlighet att undersöka effekterna av många olika stimulans protokoll, inklusive ihållande och upprepade stimuleringar, på postsynaptisk kalcium dynamik4.
Den genomskinliga karaktären hos C. elegans gör den idealisk för den fluorescerande Imaging funktionella analysen. Emellertid, när stimulera excitatoriska acetylkolin neuroner vid NMJ, djur förväntas svara med en omedelbar muskelkontraktion4, att göra immobilisering av maskar kritisk i visualisera diskreta kalcium förändringar. Traditionellt har farmakologiska medel använts för att paralysera djuren. En sådan drog som används är levamisole, en kolinerg acetylkolinreceptoragonist5,6,7. Eftersom Levamisol leder till ihållande aktivering av en subtyp av excitatoriska muskel receptorer, denna reagens är olämplig för studiet av muskeln kalcium dynamik. Effekten av Levamisol inducerar postsynaptisk depolarisering, upplyser cytosoliska kalcium, och ockluderande observationer efter presynaptisk stimulering. För att undvika användning av paralyserande läkemedel undersökte vi två alternativa metoder för att immobilisera C. elegans. Djuren var antingen limmade ner och sedan dissekeras öppna för att exponera kroppen väggen muskler, liknande den befintliga C. elegans NMJ elektrofysiologi metod8, eller nanobeads användes för att immobilisera intakt djur9. Båda förfarandena tillåts för reproducerbara mätningar av vilande och framkallade muskel kalcium transienter som var lätt kvantifierbara.
Metoderna i detta papper kan användas för att mäta baslinjen cytosoliska kalciumnivåer och transienter i postsynaptiska kroppen väggen muskelceller i C. elegans. Exempel på data som sysselsätter de två olika immobiliseringsteknikerna ges. Båda teknikerna utnyttjar optogenetik för att depolarisera muskelcellerna utan användning av elektrisk stimulering. Dessa exempel visar genomförbarheten av denna metod för att utvärdera mutationer som påverkar postsynaptiska kalcium hantering i maskar och påpeka för-och nackdelar med de två immobilisering metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. inställning av Mikroskop
- Använd ett sammansatt Mikroskop med fluorescensförmåga. För denna studie, data samlades in på ett upprätt Mikroskop (tabell över material) försedd med lysdioder för excitation.
- För att korrekt visualisera fluorescens förändringar i kroppen väggen muskler, använda en hög förstoring mål.
- För dissekerade preparat, Använd en 60x NA 1,0 vatten nedsänkning mål (tabell över material).
- För preparat med nanobeads, Använd en 60x NA 1,4 Oil Immersion mål (tabell över material). Denna förstoring ger tillräcklig upplösning av musklerna på kamerasensorn.
- Använd en kamera med hög känslighet ansluten till mikroskopet för att fånga bilder med hög bildhastighet för att spåra snabba förändringar i kalciumnivåer. För denna studie, bild med en sCMOS system (tabell över material) kan full frame imaging på 100 Hz, som Stig gånger för ca2 + signaler kan vara så snabbt som tiotals millisekunder.
- Kontroll kamera förvärv och LED fluorescens excitation med en Micro-Manager programvara som körs i imagej10 enligt tillverkarens anvisningar (tabell över material).
- Använda en öppen källkod elektronisk plattform plugin, som ansluter en extern öppen källkod mikrokontroller Board (tabell över material), för att hantera den externa timing pulser för att styra fluorescens excitation.
Digital outs är tillgängliga från digitala stift 8 till 13 som ger utgångs bitar 0 till 5. Dessa kan adresseras som bas 2-värden på 1, 10, 100 osv. Inställningar för seriell port anges i tabell 1 och är tillgängliga från webbplatsen för Micro-Manager (tabell över material). Firmware för mikrokontroller Board är på samma sätt tillgänglig på denna webbplats. - För att styra timing logik, aktivera Micromanager Acquisition Protocol i programvaran enligt tillverkarens anvisningar (tabell över material).
Obs: detta initierar samtidigt en förinställd kamera ramens varaktighet och antalet bildrutor som ska aktiveras, samt den logiska slutaren och den förinställda gula lysdioden för fluorescensexcitation. I detta fall, den gula led-Solid State switch styrs av mikrokontroller bit 1 utdata genom stift 9. Kameran ramar ut TTL (tillbaka plattan ut 3 kontakt) utlöser en stimulator. Detta exakt gånger aktiveringen av det blå ljuset LED för aktivering av channelrhodopsin vid en inställd tid efter aktiveringen av bildsekvensen. - Använd två lysdioder för att stimulera channelrhodopsin med blått ljus och registrera RCaMP-förändringar. Aktivera channelrhodopsin med en lysdiod med en topp emission våglängd på 470 nm och ett bandpass filter (455 till 490 nm) och excitera RCaMP med en lysdiod med en topp emission våglängd på 594 nm och ett bandpass filter (570 till 600 Nm).
- För att samtidigt aktivera channelrhodopsin och fånga förändringar i RCaMP fluorescerande nivåer, Co-belysa båda lysdioderna och överföra ljuset till samma optiska vägen med hjälp av en Dichroic beam Combiner.
- Kontrollera timing av LED-belysning med solid state switchar (tabell över material) styrs av TTL-signaler (maximal nominell Turn-on tid, 1 MS, turn-off tid 0,3 MS: 0 till 90% Turn-on och stänga av tiden för < 100 μs).
- Ställ in LED-intensitet med dagens kontrollerade låg brus linjära nätaggregat (tabell över material).
- För att säkerställa den exakta tidpunkten för det blå ljuset LED, aktivera den direkt av TTL puls till solid-state Relay från en stimulator. Program mera blått ljus stimulering protokollet till en stimulator (tabell över material), som fungerar som en exakt timer från början av bilden förvärvet till blå LED-belysning. I detta experiment, slå på blått ljus stimulering efter 2 s av fånga RCaMP fluorescens och använda ett tåg av 5, 2 MS blått ljuspulser med 50 ms interpulse intervaller för att aktivera channelrhodopsin.
Obs: förseningen innan blått ljuspulser, varaktigheten av det blå ljuset pulser, tiden mellan pulser, och antalet pulser i tåget kan alla ställas in på denna punkt och bör återspegla de specifika parametrarna för experimentellt intresse.
2. C. elegans provberedning och datainsamling
- För att optiskt stimulera presynaptiska neuroner, få djur som uttrycker channelrhodopsin i excitatoriska kolinerga nervceller, driven med UNC-17 promotor regionen, och rcamp uttrycks i alla kroppens vägg muskler drivs med MYO-3 promotor region2.
Observera: endast användning av djur med integrerade transgener och robusta nivåer av fluorescens rekommenderas eftersom variabel uttrycket i motsvarande celltyper kan påverka tillförlitligheten i datainhämtningen. - Gör en arbets lager av all-trans retinal genom att späda näthinnans pulver (tabell över material) i etanol för att skapa en slutlig koncentration av 100 mm och lagra vid-20 ° c. Detta arbets bestånd kommer att vara stabilt i cirka ett år.
- Skapa ett bestånd av OP50 E. coli, odlas i lb media, kompletterat med all-trans retinal från arbets beståndet som gjorts i steg 2,2, vid en slutlig koncentration av 80 μm. Den volym som används för OP50 + retinal lager kommer att vara beroende av antalet plattor som behövs för experimentet.
- Utsäde Nematoden Growth media (NGM) plattor med cirka 300 μL av OP50 + retinal lager och låt plattorna torka över natten vid rumstemperatur i mörker.
- Odla C. elegans stammar till önskad ålder i mörkret på OP50 + retinal NGM plattor vid 20 ° c. Använd vuxna maskar för det här experimentet.
- För experimentet med dissekerade preparatet, endast använda gravid vuxen maskar som utför dissektion på yngre, mindre djur är oerhört utmanande. Lämna djuren på OP50-retinal plattor i minst 3 dagar för en effektiv channelrhodopsin aktivering.
- Om du använder dissekerade preparatet8,11 (figur 1A), utför du dissektioner i svagt ljus.
- Placera djuren i en dissekeringsskål med en silikon belagd täckplatta som är fylld med en 1 mM ca2 + extracellulär lösning som består av 150 mm NaCl, 5 mm KCL, 1 mm CaCl2, 4 mm mgcl2, 10 mm glukos, 5 mm sackaros och 15 mm Heper (pH 7,3 ,-340 OSM).
- Lim ner djur med hjälp av vätskan aktuell hudlim med blå färg längs ryggsidan av masken och göra en lateral nagelband snitt längs lim/Worm gränssnitt med hjälp av glasnålar.
- Använd en pipett för att rensa den inre inälvans från masken hålighet.
- Lim ner nagelbanden flik av djuret för att exponera den ventrala mediala kroppen väggen muskler för avbildning.
- Om du använder nanobead-preparatet (figur 1B)
- Gör en smält 5% aguppstod lösning med DDH2O till en slutlig volym av 100 ml.
- Använd en Pastinpipett och placera en droppe smält aganlösning på en glasskiva och placera omedelbart en andra glas bild över ovansidan, vinkelrät mot den första, med ett milt tryck för att skapa en jämn aganplatta. Ta bort den övre bilden före användning.
- Tillsätt ca 4 μL polystyren nanobeads (tabell över material) till mitten av Agam pad.
- I svagt ljus, plocka 4-6 C. elegans i nanobead lösning, att se till att djuren inte låg ovanpå varandra, och försiktigt placera en täckslip på toppen.
- Placera den förberedda bilden eller dissektion skålen på mikroskopet, och hitta och fokusera på en mask med 10X förstoring och svagt ljus fält belysning.
- Byt till 60x förstoring och rcamp fluorescens excitation att identifiera en ventromediala kropp vägg muskel som är Anterior till vulva och i rätt fokalplan.
Obs: muskler Anterior till vulva väljs som de reflekterar muskler vanligen stimuleras i elektrofysiologi experiment. - Ändra bildens väg från okularet till kameran genom att dra ut växlingsknappen och klicka på Live i datainsamlingsprogrammet (tabell över material).
Se till att den blå ljus stimuleringen är avstängd på denna punkt för att säkerställa att channelrhodopsin inte aktiveras innan du fångar bilder. - Fokusera bilden inom datainsamlingsprogrammet med hjälp av mikroskopet fin fokus.
- När muskeln är klart i fokus, stänga av Live-bilden genom att avmarkera Live -knappen.
- Klicka på ROI -knappen i datainsamlingsprogrammet och skapa en ruta runt muskeln som fokuserar på.
- På stimulatorn, slå på den blå ljus stimulering väg som tidigare har programmerats i steg 1,10.
- Klicka på Skaffa i bildhanteringsprogrammet för att avbilda bilden genom CMOS-kameran. För att göra detta, ställa in exponeringstiden till 10 s med 1 000 ramar och 2x Binning.
3. analys av data
- Öppna datafilen i bildhanteringsprogrammet (tabell över material) och Använd polygonverktygetför att beskriva intresse muskeln. Detta är ROI.
- Gå till bild | Stackar | Rita Z-axelprofil och exportera de resulterande datapunkterna till kalkylbladsprogram varan (tabell över material). Den här funktionen plottar ROI-markeringen medelvärde kontra tidspunkten.
- Flytta muskeln ROI skapas med polygonverktyget utanför djuret för att få en bakgrund fluorescens mätning med hjälp av de steg som beskrivs i 3,2. Exportera resulterande data till kalkylblads arbetsboken.
- Subtrahera bakgrundfluorescensvärdena från muskelfluorescensvärdena vid varje tidpunkt i kalkylblads arbetsboken. Detta ger bakgrunden subtrageras fluorescerande signal.
- Genomsnittlig bakgrund subtraaleras fluorescens för de första 2 s datapunkter. Detta kommer att ge baslinjefluorescensmätningen, F.
- Använd baslinjefluorescensmätningen för att beräkna den normaliserade fluorescensnivån vid varje tidpunkt. Använd ekvationen (ΔF/F) + 1 för att göra detta. ΔF representerar (F (t)-F), där F (t) är fluorescensmätningen vid en given tidpunkt och F är utgångsvärde. + 1 läggs till som en y-axelförskjutning.
- Upprepa steg 3.2-3.6 för varje muskel bild som samlas in. Med hjälp av en eller flera muskelceller per bild är efter bedömning av forskaren. N av experimentet kan bestämmas genom att utföra en effektanalys.
- Använd bearbetade data från steg 3.2-3.6 för att göra ett spår av fluorescerande värden i grafräknare Software enligt tillverkarens anvisningar (tabell över material).
- Från denna spår, mäta kinetik av kalcium övergående, såsom upphov till topptid och halv sönderfallstid, med hjälp av de verktyg som tillhandahålls i grafratt programvaran enligt tillverkarens instruktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna teknik utvärderade förändringar i mutanter tros påverka kalcium hantering eller muskel depolarisering. Baslinjefluorescensnivåer och fluorescerande transienter visualiserades och vilande cytosoliskt kalcium och kalciumkinetik i muskeln utvärderades. Det är viktigt att djuren odlades på all-trans retinal i minst tre dagar för att säkerställa en lyckad inkorporering av retinal, och därmed därefter Aktivera channelrhodopsin (figur 2A). Om djuren inte utsätts för all-trans retinal, utlöses ingen muskel kalcium övergående (figur 2B). Även om dessa djur fortfarande kan användas för att utvärdera baseline cytosoliska kalciumnivåer, alla dynamiska förändringar i kalcium kommer inte att fångas. Dessutom, som en intern kontroll för djur eller dissektion hälsa, djuret kommer att kontraktet efter blått ljus stimulering. En inspelning med en muskelkontraktion som orsakar minimal brutto förflyttning av masken kropp valdes för datainsamling när du använder nanobeads för immobilisering. Om muskeln används för att samla in rå fluorescensvärden kontrakt kraftigt, vilket gör att hela kroppen av masken att flytta, den övergående spårningen kommer att återspegla denna rörelse artefakt (figur 2C) och bör kasseras från kvantifiering.
En mutation mappning till SCA-1 genen Locus isolerades från en skärm för mutationer som påverkar C. elegans muskel nikotinreceptorn lokalisering. C. elegans SCA-1 genen kodar den enda homolog av Sarco (endo) plasmatiska retikulära kalcium ATPas (SERCA) i masken och är den enda SERCA pumpen närvarande i kroppen väggen muskler12,13. Förlust av funktion SCA-1 mutanter förutspåddes uppvisa förändringar i muskel kalcium hantering baserat på den viktiga roll SERCA spelar för att bibehålla kalcium homeostas i däggdjurs musklerna14,15,16 ,17,18. Den GECI RCaMP uttrycktes i kroppen väggen muskler och den blå ljus-aktiverade channelrhodopsin uttrycktes i excitatoriska kolinerga neuroner att utvärdera både intracellulära baslinjen kalcium och kalcium dynamik i SCA-1 mutanter. Med den dissekerade berednings tekniken observerades ökningar av baslinjens nivåer av fluorescens i RCaMP i SCA-1 Mutant jämfört med kontrollen (figur 3A, B), vilket tyder på att förlust av SERCA-funktionen leder till förhöjda nivåer av vilande cytoplasmiska kalcium. När kalciumdynamiken undersöktes, efter presynaptisk stimulering utlöst med ett tåg av 5, 2 MS blå ljuspulser (figur 3C), det fanns en signifikant minskning av topp kalciumnivåer i SCA-1 (tm5339) mutanter som jämfört med kontrollen (figur 3D), som kan återspegla reducerade kalcium lager i SR. Emellertid sågs ingen ändring i löneförhöjningen till rusningstid eller den halva förfalla tiden (figurera 3E, F). Detta tyder på att framkallade förändringar i cytosoliska kalcium från antingen extern källa såsom kalcium inträde genom acetylkolinreceptorer och/eller spännings-gated kalciumkanaler samt från interna butiker påverkas inte i SCA-1 (tm5339) mutanter . Liknande resultat kan observeras med hjälp av nanobead preparat, som visas i figur 419. Denna rekapitulation av data ger belägg för att båda dessa tekniker är fysiologiska för att mäta kroppen vägg muskel vilande cytoplasmiska kalciumnivåer samt Observera stimulerade kalcium transienter. Detta visar också att dissektion av masken inte orsakar skador på djuret som förändrar dess kalcium hantering eller förmågan att depolarisera postsynaptiska muskler.
Detta protokoll kan också användas för att undersöka mutanter som indirekt påverkar kalcium hanteringen i C. elegans. Förlust av funktion SLO-1 (eg142) mutanter utvärderades för att demonstrera detta. Den SLO-1 genen kodar en kalcium-aktiverad BK kalium kanal, som uttrycks i både nervceller och muskler20,21. Studier har tidigare beskrivit en roll för SLO-1 i kroppen vägg muskler, visar att förlust av funktion mutanter har en defekt i postsynaptiska repolarisering efter muskelactionpotentialer20,21. Möjliga förändringar i baslinjen kalciumnivåer och kalcium övergående dynamik på grund av denna hyperexcitabilitet undersöktes med hjälp av nanobead immobilisering. När baslinjenivåerna av RCaMP mättes, visade SLO-1 (eg142) mutanter öka fluorescensen jämfört med kontrollerna (figur 5A, B)19. Detta tyder på att BK-kanalerna också kan reglera basnivåerna av cytosoliskt kalcium. Inga förändringar i topp kalciumnivåer sågs jämfört med kontrollen (figur 5C, D) vid utvärdering av kinetiken hos det framkallat kalcium övergående. Den SLO-1 (eg142) mutanter uppvisade dock en signifikant ökad ökning till topptid jämfört med kontrollen (figur 5E). Detta kan återspegla en tidigare rapporterad ökning av presynaptisk retbarhet20,21. Det fanns dock ingen signifikant förändring i halva sönderfallstiden i SLO-1 (eg142) mutanter jämfört med kontroll (figur 5F). Tillsammans, dessa data visar att denna metod kan användas för att utvärdera effekterna av pre-och postsynaptiska mutationer på både vila och stimuleras kropp vägg muskel kalcium.
| Seriell inställning | Värde |
| Svars-timeout | 500 |
| Baudhastighet | 57600 |
| DelayBetweenCharsMs | 0 |
| Handskakning | Av |
| Paritet | Ingen |
| StopBits | 1 |
| Utförlig | 0 |
Tabell 1: seriella portinställningar för mikrokontroller plugin, som styr en extern mikrokontroller styrelse. Detta används för att programmera externa timing pulser för att styra fluorescens excitation.
Bild 1: grafisk representation av olika immobiliseringstekniker. (A) denna bild visar dissekering teknik för immobilisering. Kroppen av masken limmas ner (blå) runt ryggsidan av djuret. En dorsala snitt längs nagelbanden genererar en nagelband flik. Denna flik har limmats ner för att exponera intakt NMJs bildas mellan synapser i den ventrala nerv sladden i grönt (channelrhodopsin) och RCaMP uttrycker muskler i rött. (B) denna grafik visar nanobead immobilisering teknik. Den intakt masken är omgiven av en representation av nanobeads i lösning, att när komprimeras av den överliggande täckslip, immobilisera masken. På grund av insynen i C. eleganskan den ventrala nerv sladden visualiseras i grönt (channelrhodopsin) och rcamp uttrycker musklerna kan visualiseras i rött. Den äggformade i mitten av masken representerar vulva, vilket är ett landmärke som identifierar den ventrala kroppen väggen muskler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa spår av kalcium transienter. A) en enda spår representation av en kalcium övergående frammanade av ett tåg på 5, 2 MS blått ljuspulser vid 50 ms interpulse intervall, registreras i ett djur med begränsad kroppsrörelse (-rörelse) som odlas i närvaro av all-trans retinal (+ all- transretinal ). Den Spike artefakter är den blå ljus stimulering pulser, eftersom båda lysdioderna är co-belysta samtidigt. B) en enda spår representation som visar frånvaron av ett kalcium övergående som svar på ett tåg av 5, 2 MS blått ljuspulser med 50 ms interpulse intervall hos ett djur som inte har exponerats för all-trans retinal (-all-trans retinal ,-rörelse). C) en enda spår representation av en kalcium övergående som har framkallat av ett tåg på 5, 2 MS blått ljuspulser med 50 ms interpulse intervaller, registreras i ett djur som hade betydande muskelsammandragning leder till rörelse artefakter (+ rörelse, + all-trans retinal). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: kalciumnivåer Vidbaslinjen och framkallade kalcium transienter från kontroll och SCA-1 (tm5339) prover som bereds med dissektionsteknik. A) representativa bilder av rcamp-fluorescens vid baseline i SCA-1 (tm5339) mutanter och kontroller. Skalstapel = 50 μm. (B) kvantifiering av fluorescensnivå i SCA-1 (tm5339) mutanter (n = 13) och kontroll (n = 9). (C) Ensemble genomsnittliga spår av framkallade kalcium transienter för SCA-1 (tm5339) mutanter och kontrolldjur. (D) kvantifiering av Peak rcamp fluorescens från channelrhodopsin framkallade kalcium svar i SCA-1 (tm5339) mutanter (n = 12) och kontroller (n = 9). (E) kvantifiering av ökningen till topptid för channelrhodopsin framkallade kalcium transienter i SCA-1 (tm5339) mutanter (n = 12) och kontroller (n = 8). F) halveringstid vid beräkning av channelrhodopsin framkallade kalcium transienter i SCA-1 (tm5339) mutanter (n = 12) och kontroller (n = 7). Statistiskt signifikanta värden var: inte signifikant p > 0,05, * p ≤ 0,05, * * p ≤ 0,01, * * * p ≤ 0,001. Felstaplar representerar medelvärdet ± SEM. data normaliserades med hjälp av Shapiro-Wilk tester och signifikans bestämdes med ett Mann-Whitney-test för icke-normala distributioner. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: kalciumnivåer Vidbaslinjen och framkallade kalcium transienter från kontroll och SCA-1 (tm5339) prover som förberetts med nanobead immobilisering. A) representativa bilder av fluorescensen vid baseline i SCA-1 (tm5339) mutanter och reglage, skal stång 50 μm.Bkvantifiering av rcamp-fluorescensnivåer i SCA-1 (tm5339) mutanter (n = 14) och kontrollen (n = 13) . C) genomsnittet av framkallat kalciumtransienter för SCA-1 (tm5339) mutanter och kontroller. (D) kvantifiering av Peak rcamp fluorescens efter framkallat kalcium svar i SCA-1 (tm5339) mutanter (n = 14) och kontroller (n = 13). (E) kvantifiering av ökningen till topptid av framkallade kalcium transienter i SCA-1 (tm5339) mutanter (n = 14) och kontroller (n = 12). Fkvantifiering av halva sönderfallstiden för framkallade kalcium transienter i SCA-1 (tm5339) mutanter (n = 14) och kontroll (n = 13). Figurera anpassas från19. Statistiskt signifikanta värden var: inte signifikant p > 0,05, * p ≤ 0,05, * * p ≤ 0,01, * * * p ≤ 0,001. Felstaplar visar medelvärdet ± SEM. data normaliteten bedömdes med hjälp av Shapiro-Wilk tester och signifikans bestämdes med ett Mann-Whitney-test för icke-normala distributioner. Denna siffra har modifierats med tillstånd från19. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: kalciumnivåer Vidbaslinjen och framkallade kalcium transienter från kontroll och SLO-1 (eg142) prover tillagade med nanobeads immobilisering. A) representativa bilder av fluorescensen vid baseline i SLO-1 (eg142) mutanter och reglage, skalstapel 50 μm.Bkvantifiering av rcamp-fluorescensnivåer i SLO-1 (eg142)- mutanter (n = 29) och kontrollen (n = 13). C) medelvärdet av framkallade kalcium transienter för SLO-1 (eg142) mutanter och kontroller. (D) kvantifiering av Peak rcamp fluorescens efter framkallat kalcium svar i SLO-1 (eg142) mutanter (n = 29) och kontroller (n = 13). (E) kvantifiering av ökningen till topptid av framkallade kalcium transienter i SLO-1 (eg142) mutanter (n = 29) och kontroller (n = 13). (F) kvantifiering av halva sönderfallstiden för framkallade kalcium transienter i SLO-1 (eg142) mutanter (n = 11) och kontroller (n = 13). Figurera anpassas från19. Statistiskt signifikanta värden var: inte signifikant p > 0,05, * p ≤ 0,05, * * p ≤ 0,01, * * * p ≤ 0,001. Felstaplar visar medelvärdet ± SEM. data normaliteten bedömdes med hjälp av Shapiro-Wilk tester och signifikans bestämdes med ett Mann-Whitney-test för icke-normala distributioner. Denna siffra har modifierats med tillstånd från19. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GECIs är ett kraftfullt verktyg i C. elegans neurobiologi. Tidigare arbete har utnyttjat kalcium avbildning tekniker för att undersöka en mängd olika funktioner i både nervceller och muskelceller, inklusive sensoriska och beteendemässiga svar, med olika metoder för stimulering. Vissa studier har använt kemiska stimuli för att utlösa kalcium transienter i sensoriska aska nervceller22,23 eller inducera kalcium vågor i faryngeal muskler24. En annan grupp utnyttjas mekanisk stimulering medan maskar hölls i mikroflödessystem chips att undersöka kalcium svar i beröring receptor nervceller25. Fortfarande, andra har använt elektrisk stimulering för att visualisera kalcium förändringar i både nervceller26 och kropps Väggs musklerna27. Vad som är vanligt mellan dessa studier är kravet på yttre stimuli, såsom lösningar eller utrustning, för att utlösa kalcium transienter. Det protokoll som beskrivs här kapitaliserar på den kontroll som erhållits från optogenetisk stimulering, som ger neuronala specificitet, tillsammans med funktionell analys av muskler uttryckte GECIs2 i samma experimentella paradigm.
Två former av mask immobilisering beskrivs och, medan varje metod bör utvärderas vid hantering av experimentella behov, både dissekerade och fysiologiskt intakt preparat ger kompletterande resultat som gör det möjligt för utredare att använda antingen tillvägagångssätt i sin forskning. Det finns en ökad teknisk utmaning att använda dissektion teknik, med användaren som krävs för att behärska både exakt användning av kirurgisk lim och microdissection utan att skada nerv sladden eller muskler. Dessutom, på grund av svårighetsgraden av dissektion, endast dräktiga vuxna bör användas, vilket skulle kunna begränsa den experimentella tid punkter. Dessutom är dissektion tekniken också mycket svårare att utföra på mutanter som producerar små, tunna eller sjukliga djur, återigen möjligen begränsa experimentella parametrar. Fördelen med denna teknik är att det begränsar kroppen rörelse artefakt till följd av depolarisering, limning förhindrar överflödig förflyttning av masken kropp, och ger även tillgång till NMJ för lösning förändringar och läkemedelsapplikationer. Dessutom, varje beredning exponerar samma område av masken, som garanterar kroppens vägg muskler kommer att vara konsekvent i fokus. Den andra tekniken, med nanobeads att immobilisera maskar, är mindre inblandade och kan snabbt lära sig. Dessutom kan alla ålders djur användas med denna metod, vilket möjliggör förändringar i kalcium hantering genom utveckling som skall övervakas. Försiktighet måste iakttas när du placerar maskar i nanobead lösning, som för mycket manipulation av djuren kan orsaka dem att brista. Dessutom får täckglådet inte flyttas en gång placeras ovanpå djuren, eftersom detta kan orsaka djuren att rulla eller vrida på sig själva, återigen leder till skadan. Även med hjälp av nanobeads kan ge en hög genomströmning assay där djuren potentiellt skulle kunna återvinnas, det finns ingen standardisering av djurets kroppsställning, vilket varje djur kanske inte har kroppen vägg muskler i ett tydligt fokalplan. Om experimentet kräver ett stort antal djur, kan olika metoder för immobilisering vara nödvändiga, såsom agar-baserade mikro-brunnar, som gör det möjligt för bulk kalcium fluorescens Imaging28. Oavsett begränsningarna av dessa två tekniker, antingen kan utnyttjas för att få tillförlitlig, lätt kvantifierbara kalcium transienter inom C. elegans kropps vägg muskler.
C. elegans ger många fördelar som ett in vivo-system för funktionella avbildnings studier. Djuren är transparenta, vilket gör att para ihop av optogenetiska neuronala depolarisering genom användning av channelrhodopsin med GECI RCaMP att mäta resulterande postsynaptiska kalcium transienter i muskeln. Pre-stimulering nivåer av rcamp fluorescens kan också användas för att bedöma baseline cytosoliska kalciumnivåer. Den genetiska tractabilitet av C. elegans gör studiet av nya mutationer som kan påverka kalcium homeostas eller hantering lätt att fullfölja, ofta med lätt tillgängliga Mutant alleler. Med hjälp av de tekniker som beskrivs i detta protokoll, postsynaptiska kalcium-avbildning data kan erhållas effektivt och till relativt låg kostnad, vilket gör detta till ett attraktivt system för ett brett spektrum av Imaging experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Dr Alexander Gottschalk för ZX1659, den RCaMP och channelrhodopsin innehåller masken stam, Dr Hongkyun Kim för SLO-1 (eg142) Worm stam, och den nationella Bioresource projektet för SCA-1 (tm5339) Worm stam.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| all-trans retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | Necessary for excitation of channel rhodopsin |
| Amber LED | RCaMP illumination | ||
| Arduino UNO | Mouser | 782-A000066 | Controls fluorescence illumination |
| Blue LED | channelrhodopsin illumination | ||
| BX51WI microscope | Olympus | Fixed state compound microscope | |
| Current controlled low noise linear power supply | Ametek | Sorenson | Controls LED intensity |
| Igor Pro | Wavemetrics | Wavemetrics.com | Graphing software |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov | Image processing software |
| LUMFLN 60x water NA 1.4 | Olympus | Water immersion objective for dissected preparation | |
| Master-8 Stimulator | A.M.P.I | Master timer for image acquisition and LED illumination | |
| Micro-Manager | micro-manager.org | Controls camera acquisition and LED excitiation | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| pco.edge 4.2 CMOS camera | pco. | 4.2 | High-speed camera |
| PlanApo N 60x oil NA 1.4 | Olympus | Oil immersion objective for nanobead preparation | |
| Polybead microspheres | Polysciences, Inc. | 00876-15 | For worm immobilization |
| solid state switches | Sensata Technologies | Crydom CMX100D6 | Controls timing of LED illumination |
| Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | SY1627 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele |
| Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele | |
| Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Gottschalk Lab | ZX1659 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line |
References
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).
- Nagel, G., et al. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Current Biology. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Liewald, J. F., et al.
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L.
- Lewis, J. A., et al. Cholinergic Receptor Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).
- Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature Neuroscience. 9, 791-798 (1999).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization. PLoS ONE. 8 (1), 1-6 (2013).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using umanager. Current Protocols in Molecular Biology. (Suppl 92), 1-17 (2010).
- Richmond, J. Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction. Journal of Visualized Experiments. (24), 1-4 (2009).
- Hoon Cho, J., Bandyopadhyay, J., Lee, J., Park, C. S., Ahnn, J. Two isoforms of sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) are essential in Caenorhabditis elegans. Gene. 261, 211-219 (2000).
- Zwaal, R. R., et al. The Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase Is Required for Development and Muscle Function in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (47), 43557-43563 (2001).
- Stammers, A. N., et al. The regulation of sarco(endo)plasmic reticulum calcium-ATPases (SERCA). Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93, 1-12 (2015).
- Clapham, D. E.
- Hovnanian, A. Serca pumps and human diseases. Calcium Signalling and Disease: Molecular Pathology of Calcium. , 337-363 (2007).
- Periasamy, M., Kalyanasundaram, A. SERCA pump isoforms: Their role in calcium transport and disease. Muscle and Nerve. 35 (4), 430-442 (2007).
- Gehlert, S., Bloch, W., Suhr, F. Ca2+-Dependent Regulations and Signaling in Skeletal Muscle: From Electro-Mechanical Coupling to Adaptation. International Journal of Molecular Sciences. 16, 1066-1095 (2015).
- Martin, A. A., Richmond, J. E. The sarco(endo)plasmic reticulum calcium ATPase SCA-1 regulates the Caenorhabditis elegans nicotinic acetylcholine receptor ACR-16. Cell Calcium. 72, 104-115 (2018).
- Wang, Z., Saifee, O., Nonet, M. L., Salkoff, L. SLO-1 Potassium Channels Control Quantal Content of Neurotransmitter Release at the C. elegans Neuromuscular Junction. Neuron. 32, 867-881 (2001).
- Abraham, L. S., Oh, H. J., Sancar, F., Richmond, J. E., Kim, H. An Alpha-Catulin Homologue Controls Neuromuscular Function through Localization of the Dystrophin Complex and BK Channels in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 6 (8), 1-13 (2010).
- Gourgou, E., Chronis, N. Chemically induced oxidative stress affects ASH neuronal function and behavior in C. elegans. Scientific Reports. 6, 1-9 (2016).
- Zahratka, J. A., Williams, P. D. E., Summers, P. J., Komuniecki, R. W., Bamber, B. A. Serotonin differentially modulates Ca2+ transients and depolarization in a C. elegans nociceptor. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1041-1050 (2015).
- Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26 (3), 583-594 (2000).
- Nekimken, A. L., et al. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. 17 (6), 1116-1127 (2017).
- Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (74), 1-9 (2013).
- Jospin, M., Jacquemond, V., Mariol, M. C., Ségalat, L., Allard, B. The L-type voltage-dependent Ca2+channel EGL-19 controls body wall muscle function in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 159 (2), 337-347 (2002).
- Wabnig, S., Liewald, J. F., Yu, S., Gottschalk, A. High-Throughput All-Optical Analysis of Synaptic Transmission and Synaptic Vesicle Recycling in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. , 1-26 (2015).
