Summary
Questo protocollo descrive metodi sia in vivo che ex vivo per visualizzare e caratterizzare completamente i vasi ialoidi, un modello di regressione vascolare negli occhi del topo, utilizzando la tomografia a coerenza ottica e l'angiografia fundus fluorescein per l'imaging dal vivo e l'ex vivo isolamento e successivo montaggio piatto di iauide per l'analisi quantitativa.
Abstract
Nell'occhio, i vasi ialidi embrionali nutrono la lente e la retina in via di sviluppo e regrediscono quando i vasi retinici si sviluppano. La regressione persistente o fallita dei vasi ialidi può essere osservata in malattie come il vitreo primario iperplastico persistente (PHPV), che porta a un percorso luminoso ostruito e a una compromissione della funzione visiva. Comprendere i meccanismi alla base della regressione dei vasi ialoidi può portare a nuove intuizioni molecolari sul processo di regressione vascolare e a potenziali nuovi modi per gestire le malattie con vasi ialidi persistenti. Qui descriviamo le procedure per l'imaging dello ialoide nei topi vivi con tomografia a coerenza ottica (OCT) e fundus fluorescein angiografia (FFA) e un protocollo tecnico dettagliato di isolamento e ialoide flat-mount ex vivo per l'analisi quantitativa. I topi da knockout 5 (LRP5) correlati al recettore della lipoproteina a bassa densità sono stati utilizzati come modello sperimentale di vasi ialidi persistenti, per illustrare le tecniche. Insieme, queste tecniche possono facilitare una valutazione approfondita dei vasi ialoidi come modello sperimentale di regressione vascolare e studi sul meccanismo dei vasi ialoidi persistenti.
Introduction
L'afflusso di sangue nell'occhio è essenziale per garantire il normale sviluppo della retina e dei tessuti oculari circostanti e per dotare una corretta funzione visiva. Ci sono tre letti vascolari nell'occhio: la vascolatura retinica, la choroide e una rete circolatoria embrionale transitoria di vasi ialoidi. Lo sviluppo della vascolatura oculare richiede una coordinazione spaziale e temporale durante l'embriogenesi e la maturazione dei tessuti. Tra i tre letti vascolari, la vascolatura ialoide è il primo sistema funzionale di approvvigionamento del sangue a fornire nutrizione e ossigeno alla lente embrionale appena formata e alla retina in via di sviluppo. I vasi ialoidi regrediscono nello stesso momento in cui le vaslazioni della retina si sviluppano e maturano1. La regressione della vascolatura iatalide è fondamentale per consentire un chiaro percorso visivo per lo sviluppo della funzione visiva; quindi, questo processo di regressione vascolare è importante quanto la crescita della vascolatura retinica. La regressione ialidea alterata può portare a malattie oculari. Inoltre, la regressione dei vasi ialoidi fornisce un sistema modello per studiare i meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nella regolazione della regressione vascolare, che possono avere implicazioni per la regolazione angiogenica anche in altri organi.
La vascolatura ialoide, derivata dall'arteria iataloide (HA), è composta da vasa hyaloidea (VHP), tunica vasculosa lentis (TVL) e membrana pupillare (PM). Fornisce nutrimento alla retina in via di sviluppo, alla vitrea primaria e alla lente durante lo sviluppo embrionale2. A sorgere dall'HA, VHP si dirama anteriormente attraverso la vetrezia fino alla lente. La TVL coppa la superficie posteriore della capsula lente, e anastomosi al PM, che si collega alle arterie ciliari anteriori, coprendo la superficie anteriore della lente2,3, con conseguente formazione di una rete di vasi nel PM 3 (COM del nome , 4 DEL psu' , 5. È interessante notare che non ci sono vene nella vascolatura iatilla, e il sistema fa uso di vene conoidali per realizzare il drenaggio venoso.
Nell'embrione umano, la vascolatura ialoide è quasi completa alla nona settimana di gestazione e inizia a regredire quando compaiono i primi vasi retinici, durante il quarto mese di gestazione2. A partire dall'atrofia del VHP, regressione delle reti capillari del TVL, il PM, e, infine, l'HA avviene successivamente2,3. Nel frattempo, iniziano a formarsi le ritrazioni vitree primarie e il vitreoso secondario, composto dai componenti della matrice extracellulare, comprese le fibre di collagene. Entro il sesto mese di gestazione, il vitreoprimario primario è ridotto a un piccolo canale trasparente che si estende dal disco nervoso ottico all'obiettivo, chiamato canale o canale ialio del Cloquet, e il vitreo secondario diventa il componente principale del segmento posteriore 2 Il nome del sistema , 3. La circolazione ialidea svanisce per lo più a 35-36 settimane di gestazione, poco prima della nascita3.
A differenza degli esseri umani, in cui la vascolatura ialoide è completamente regredita alla nascita, il sistema vascolare ialoide del topo inizia a regredire dopo la nascita. Poiché la retina del topo nasce vasi avascolari e retinici si sviluppano postnatmente, i vasi ialoidi regrediscono contemporaneamente dal giorno postnatale (P) 4 e sono per lo più completamente regrediti da P216 (Figura 1). Il PM scompare prima tra P10 e P12, e il VHP scompare tra P12 e P16, mentre un piccolo numero di cellule TVL e HA rimangono anche a P16, e da P21 il sistema di regressione vascolare ialoide è quasi completo6. Nel frattempo, la vascolatura della retina inizia a svilupparsi dopo la nascita. Lo strato superficiale del plesso vascolare si estende completamente alla retina periferica a P7–P8, lo strato profondo (situato nello strato plexiforme esterno) si sviluppa da P7-P12 e, infine, il plesso intermedio nello strato plexiforme interno si sviluppa tra P12 e P157 . Man mano che la vascolatura retinica si sviluppa, sostituisce gradualmente la funzione di regredire concomitante i vasi ialoidi, fornendo nutrizione e ossigeno all'occhio in via di sviluppo. L'occorrenza postnatale della regressione dei vasi ialoidi nei topi fornisce un modello sperimentale facilmente accessibile per osservare e studiare la vascolatura ialoide, nonché la base molecolare che regola i processi di regressione vascolare sia fisiologici che patologiche8.
Il fallimento della regressione ialoide può essere visto in malattie come il PHPV, che è una rara anomalia congenita dello sviluppo dell'occhio risultante da una regressione non riuscita o incompleta della vascolatura embrionale, vitreos primaria e ialoide9. I meccanismi che regolano il processo di regressione della vascolatura ialoide sono complicati e ampiamente studiati. Una delle principali vie molecolari essenziali per la normale regressione dei vasi ialidi è la via di segnalazione Wnt10, poiché le mutazioni genetiche in questa via che interessano sia il ligando Wnt che i recettori sono state collegate con PHPV nell'uomo9. Studi sperimentali hanno identificato un ligando Wnt, Wnt7b, che è prodotto dai macrofagi intorno ai vasi ialoidi nell'occhio in via di sviluppo per mediare questo processo di regressione. Wnt7b attiva la segnalazione wnt legandosi con i recettori frizzled4 (F-D4)/LRP5 nelle cellule endoteliali adiacenti per avviare l'apoptosi cellulare, portando alla regressione dei vasi ialoidi10. Di conseguenza, i topi carenti di Wnt7bmostrano una persistenza di vasi ischemidi10. Allo stesso modo, un ligando Wnt non convenzionale, Norrin (codificato dal gene Ndp), si lega anche all'F-D4/LRP5 per indurre la regressione del vaso iadilido durante lo sviluppo. Ndpy/-, Lrp5-/-e Fzd4-/- visualizzano tutti la regressione della nave ialoide posticipata, sostenendo un ruolo normativo critico della segnalazione Wnt11,12, 13,14,15,16. Inoltre, un altro corecettore Wnt LRP6 si sovrappone a LRP5 nella loro funzione di modulazione del percorso di segnalazione Wnt nelle cellule endoteliali vascolari ialoidi17. Altri fattori che possono anche contribuire alla regressione ialoide includono il fattore ipossia-inducibile18,19, fattore di crescita endoteliale vascolare20,21, collagene-1822, 23, Arf24, angiopoietin-225e proteina morfogenetica ossea-426. In questo articolo, utilizziamo i topi Lrp5-/- come modello di vasi ialidi persistenti per dimostrare le tecniche di valutazione e caratterizzazione della vascolatura ialidea attraverso metodi sia in vivo che ex vivo.
La visualizzazione della vascolatura iatloide in vivo ed ex vivo è essenziale per studiare i meccanismi di regressione della nave ialoide. Gli attuali metodi per osservare la vascolatura iataide si concentrano principalmente sulla visualizzazione e l'analisi di VHP e HA, attraverso immagini dello OCT e FFA, sezioni trasversali oculari e il supporto piatto ialoide. Oct e FFA sono potenti strumenti di imaging in vivo, consentendo l'osservazione longitudinale negli animali vivi dopo che hanno aperto gli occhi. Inoltre, il supporto piatto ialoide isolato fornisce la visualizzazione dell'intera vascolatura ialoide e un mezzo per ottenere una quantificazione accurata del numero di navi. Eppure la natura delicata e fragile delle navi ialoidi e le conseguenti difficoltà tecniche del suo isolamento possono averne limitato l'uso nella ricerca oculistica un po'10,17,27. In questo articolo, forniamo un protocollo dettagliato della visualizzazione dei vasi ialidi, combinando sia l'imaging della retina viva in vivo che il supporto piatto ialoide isolato ex vivo per migliorare la fattibilità di queste tecniche. Questo protocollo è stato adattato con la modifica e l'espansione da pubblicazioni precedenti sul metodo in vivo di imaging live fundus e OCT28 e sul metodo ex vivo del supporto piatto ialoide isolato11.
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Protocol
Tutti gli animali sono stati trattati in conformità con la dichiarazione dell'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) per l'uso degli animali in Oftalmic e Vision Research per esperimenti sugli animali, seguendo le Linee guida degli Istituti Nazionali di Salute ( NIH) per quanto riguarda la cura e l'uso degli animali per le procedure sperimentali e le norme stabilite dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Boston Children's Hospital. Lrp5-/- topi (stock n. 005823; Jackson Laboratory) e il suo controllo wild-type (WT) Topi C57BL/6J (stock n. 000664; Jackson Laboratory) sono stati utilizzati per questo studio.
1. Parte I: Immagini in vivo di vasi ialoidi utilizzando un sistema di imaging della retina dei roditori
- Preparazione dell'anestesia dei topi e dilatazione della pupilla
- Selezionare i mouse.
- Utilizzare topi più vecchi di P12 (dopo aver aperto gli occhi) per l'imaging della retina; entrambi i sessi sono adatti.
- Come desiderato, topi mutanti di immagine con regressione ialoide ritardata (e loro controlli WT) durante l'età adulta. I topi WT di età superiore a 3 settimane potrebbero non presentare vasi ialoridi rimanenti molto rilevabili, quindi P12–P21 è ideale per l'imaging rimanente visibile WT hyaloid.
- Preparare una miscela di chetamina/xilazina per l'anestesia.
- Prendere 2,3 mL di soluzione di stock di ketamina (100 mg/mL) e 0,7 mL di soluzione di stock di xilosina (20 mg/mL) e aggiungere 20 mL di salina sterile (20 mg/mL di salina sterile (20 mg/mL) 0,9% di cloruro di sodio) per fare una soluzione di lavoro di una miscela di ketamina/xilanina (10 mg/mL di ketamina e 0,6 mg/mL di xilana).
- Anestesizzare i topi iniettando intraperitonealmente la miscela di ketamina/xilonica in un volume di 8 volte il peso corporeo del topo (ad esempio, un topo da 20 g ha bisogno di 160 L di miscela di soluzione di lavoro di ketamina/xilonica per ottenere una dose di ketamina [80 mg/kg di peso corporeo] e xylazina [4.8 mg/kg peso corporeo]miscela).
- Applicare una goccia di soluzione farmacologica per la dilatazione delle pupille (vedi Tabella deimateriali) ad ogni occhio per dilatare le pupille del topo immediatamente dopo l'anestesia.
- Valutare il livello di anestesia mediante riflesso pedale (pizzico dell'aglione dell'arto posteriore. Attendere che il topo sia sufficientemente anetizzato (nessun riflesso del pedale) e le sue pupille siano ampiamente dilatate.
- Selezionare i mouse.
- Imaging tomografia a coerenza ottica di vasi ialoidi
- Idratare le cornee del topo con lacrime artificiali, e quindi, posizionare il mouse sul palco di posizionamento.
- Contattare delicatamente la cornea del mouse con la lente della sonda OCT. Regolare il mouse e la sonda in modo che la testa del nervo ottico si trova al centro del campo visivo nell'immagine del fondo, per guidare l'imaging dello Strumento di personalizzazione di Office.
NOTA: Per ulteriori dettagli sulla configurazione generale di un sistema di imaging retinico del roditore (vedere Tabella dei materiali) e sulla regolazione della posizione del mouse, fare riferimento a Gong et al.28. - Regolare la messa a fuoco per ottenere le immagini ottimali dello Strumento di personalizzazione di Office.
- Regolare l'angolo della linea indicata nel software di imaging dello Strumento di personalizzazione di Office (vedere Tabella dei materiali) per rivelare i vasi ialoidi persistenti e, quindi, scattare immagini.
- F (in questo modo undus f (in questo stato luoresceina un ngiografia imaging di vasi ialidi
- Preparare una soluzione di fluoresceina: aggiungere 9 mL di salina sterile con buffer di fosfato (PBS) a 1 mL di soluzione di fluoresceina (concentrazione di scorte: 100 mg/mL). La concentrazione della soluzione di lavoro finale è di 10 mg/mL.
- Intraperitonemente iniettare la soluzione di lavoro della fluoresceina (5 l/g di peso corporeo).
- Idratare la cornea del topo con lacrime artificiali, e quindi, posizionare il mouse sul palco di posizionamento.
- Posizionare la lente del microscopio di imaging retinico Micron IV per creare un contatto diretto con la cornea di topo. Regolare leggermente l'allineamento per posizionare la testa del nervo ottico al centro del campo di visualizzazione.
- Modificare il filtro del microscopio in un canale fluorescente verde.
- Concentrarsi sui vasi ialoidi persistenti per scattare immagini.
- Scattare più immagini dopo 1 min, 3 min, 5 min e 10 min (non più di 10 min) post-iniezione per determinare il miglior punto di tempo (rapporto segnale-sfondo) per osservare i vasi ialoidi. Completare la procedura FFA entro 10 minuti, dopo di che la fluoresceina può diventare troppo diffusa e rendere invisibili i vasi.
- Recupero dei topi dall'anestesia
- Dopo le procedure, tenere i topi su una piastra di riscaldamento calda.
- Attendere che i topi siano di nuovo mobili per riportarli alla gabbia del topo.
2. Parte II: Visualizzazione ex vivo di vasi ialoidi
- Preparazione di occhi fissi del mouse
- Seleziona i topi dell'età giusta.
NOTA: i topi neooatali vengono in genere sacrificati al P8 per la dissezione degli iauloidi. Entrambi i sessi sono adatti. I topi mutanti con regressione ialidea ritardata (e i rispettivi controlli WT) possono essere sezionati e analizzati durante l'età adulta. - Eutanasia i topi per esposizione a CO2.
- Enucleate gli occhi del topo per dissezione smussata.
- Aprire le palpebre larghe con pinze di microchirurgia per consentire l'accesso al bulbo oculare. Posizionare le pinze di microchirurgia curva sotto il globo in orbita per afferrare il nervo ottico senza spremere il bulbo oculare. Tirare delicatamente e rimuovere il bulbo oculare con le pinze.
- In alternativa, sezionare il bulbo oculare utilizzando forbici microchirurgiche per tagliare con attenzione parallelamente al globo dai quattro lati verso la parte posteriore dell'orbita e separando il globo dai tessuti connettivi circostanti.
- Immergere gli occhi nel 4% di paraformaldeide nel buffer PBS per 30 min a temperatura ambiente per la fissazione.
- Trasferire i bulbi oculari fissi nel tampone PBS ghiacciato.
NOTA: I bulbi oculari possono essere conservati in PBS a 4 gradi centigradi per un massimo di 1 settimana.
- Seleziona i topi dell'età giusta.
- Incorporamento di vasi ialidi con iniezione di gelatina
- Preparare una soluzione di gelatina del 5%.
- Pesare 50 mg di gelatina.
- Sciogliere la gelatina in 1 mL di acqua distillata.
- Incubare la soluzione di gelatina in un bagno d'acqua a 37 gradi fino a completa dissoluzione. Mantenere la soluzione in acqua a 37 gradi centigradi fino all'uso.
NOTA: Un lotto di soluzione più grande può essere preparato e conservato a 4 gradi centigradi. Ogni volta prima dell'uso, la soluzione deve essere riscaldata in bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per ottenere una consistenza chiara.
- Al microscopio a dissezione, iniettare 50 -L di soluzione di gelatina nel corpo vitreo al limbo; ripetere l'iniezione 3x in diversi siti per effettuare un totale di quattro iniezioni, distanziate uniformemente intorno al limbo (Figura 2A).
- Incubare i bulbi oculari in un frigorifero a 4 gradi centigradi o sul ghiaccio per 30 min per solidificare la gelatina iniettata nello spazio vitreo.
- Preparare una soluzione di gelatina del 5%.
- Dissezione e isolamento dei vasi ialidi
NOTA: vedere la figura 2B-E.- Collocare i bulbi oculari in una teglia Petri contenente PBS per evitare che il tessuto si asciughi. Fare un'incisione con forbici microchirurgiche al limbo e rimuovere la cornea.
- Snip e rimuovere il nervo ottico.
- Sotto un microscopio di dissezione, utilizzare due coppie di pinze per staccare e scartare gli strati di sclera, choroide e pigmento retitico (RPE) e rimuovere l'iride.
- Con il lato ottico-nervoso della retina rivolto verso l'alto e il lato dell'obiettivo verso il basso, iniettare 50 - L di PBS appena sotto la coppa della retina per consentire l'accumulo del buffer PBS tra il corpo vitreo sovrincone gelatinizzato e la retina.
- Staccare delicatamente e rimuovere la coppa della retina e il corpo ciliario dal corpo vitreo con pinze di microchirurgia.
- Utilizzando una pipetta di trasferimento, trasferire la tazza di gelatina contenente il tessuto ialoide immerso in PBS in un vetrino al microscopio
- Capovolgere il resto del tessuto (obiettivo/ialoide) sopra, in modo che il lato dell'obiettivo sia rivolto verso l'alto.
- Sollevare l'obiettivo e allentare delicatamente il collegamento tra l'obiettivo / TVL e VHP, quindi tagliare l'HA con forbici microchirurgiche per rimuovere l'obiettivo-TVL. Mantenere la parte VHP della coppa ialoide per il supporto piatto.
- Montaggio piatto e colorazione dei vasi ialoidi
- Sciacquare delicatamente la tazza ialidea con PBS sul vetrino per rimuovere tutti i detriti di dissezione.
- Assicurarsi che la coppa ialata galleggia sulla diapositiva in una soluzione PBS adeguata.
- Disporre delicatamente e regolare la posizione della coppa ialidea gelatinizzata con pinze microchirurgiche, con il bordo della tazza rivolto verso il basso sul vetrino, per ottenere un aspetto ottimale dopo la fusione.
- Posizionare il vetrino con la tazza ialidea immersa in PBS su uno scaldavezzo a 37 gradi centigradi, attendere che la gelatina si sciolga e lo ialoide si appiattisce e rimuovere il vetrino quando è appena asciutto (non asciugarlo troppo).
- (Facoltativo) Immunostain i vasi ialoidi
- Creare buffer di blocco e penetrazione (ad esempio, 5% di albumin del siero bovino [BSA] e 0,1% Triton X-100 nel buffer PBS). Aggiungere 50 ll l di buffer di blocco su un isolamento ialoide a pallone piatto e incubarlo a temperatura ambiente per 30 min.
- Applicare 50 l di anticorpo primario (ad esempio, CD31) (1:100 diluizione nel buffer di blocco) su un supporto piatto di isolamento ialoide, quindi incubarlo in una scatola bagnata a 4 gradi durante la notte.
- Risciacquare delicatamente 3x, per 5 min ogni volta, con PBS.
- Applicare 50 - L di anticorpo secondario (ad esempio, anticorpo secondario anti-coniglio-Alexa 488, 1:100 diluizione) sul supporto piatto ialidea e incubarlo a temperatura ambiente per 1 h.
- Risciacquare delicatamente 3x, per 5 min ogni volta, con PBS.
- Aggiungere una goccia di mezzo di montaggio anti-dissolvenza con DAPI (4', 6-diamidino-2-fenylindole) per macchiare i nuclei nei vasi ialoidi.
- Posizionare delicatamente un coperchio sullo ialoide per completare il supporto piatto.
- Imaging e quantificazione di recipienti ialidi a prua
- Immagina la colorazione DAPI dei vasi ialidi con un microscopio fluorescente e assicurati che l'HA centrale sia visibile (escludere i campioni senza l'HA).
- Identificare i rami dei vascelli direttamente derivati dall'HA e contare manualmente il numero di rami dei vascelli per la quantificazione.
- Visualizzazione dei vasi ialidi nella sezione trasversale degli occhi
- Incorporare bulbi oculari fissi in un composto ottimale di temperatura di taglio in uno stampo di tessuto adatto, quindi congelare gli occhi incorporati sul ghiaccio secco o conservarli in un congelatore a -20 gradi centigradi.
- Utilizzare un microtoma criostato per creare una sezione trasversale degli occhi incorporati in sezioni di spessore di 12 m a -20 gradi centigradi.
- Raccogliere le sezioni trasversali oculari su una temperatura ambiente scorrevole microscopio toccando delicatamente le sezioni di tessuto, che aderiscono al vetrino.
- Asciugare all'aria per disidratare le sezioni di tessuto per 30 min, che possono essere conservati in un congelatore -20 gradi fino a quando non sono pronti per la colorazione.
- Risciacquare la diapositiva 1x con PBS per rimuovere il composto di temperatura di taglio ottimale rimanente sul vetrino.
- (Facoltativo) Immergere lo scivolo in un buffer di fissaggio appropriato (ad esempio, 4% paraformaldeide in PBS) per 15 min a temperatura ambiente per una fissazione aggiuntiva, se necessario.
- Permeabilizzare il tessuto con 0,1% Triton X-100 in PBS per 30 min a temperatura ambiente.
- Preparare il tampone di colorazione isoletina-IB4 per la colorazione dei vasi sanguigni.
- Sciogliere e ricostituire la polvere di isoletto-IB4 (500 g) con 50 mL di PBS in un tubo di centrifugazione da 50 mL.
- Aggiungere lentamente 50 -L di 1 M soluzione CaCl 2, goccia dopo goccia, nella miscela 50 mL di PBS/isolectin-IB4. Questo passaggio deve essere eseguito lentamente per evitare precipitazioni. La concentrazione finale di CaCl2 è di 1 M. Per la colorazione isoletta-IB4 è richiesta la presenza di Ca 2o.
- Applicare 30 l di cuscinetto di colorazione isoletto-IB4 sulle sezioni trasversali dell'occhio sullo scivolo e incubarlo in una scatola bagnata a 4 gradi centigradi durante la notte.
- Risciacquare 3x, per 5 min ogni volta, con PBS.
- Aggiungere una goccia di supporto di montaggio anti-dissolvenza con DAPI per macchiare i nuclei nelle sezioni.
- Posizionare delicatamente un coperchio sulle sezioni del tessuto per completare il supporto piatto.
- Controllare il tessuto al microscopio per visualizzare la presenza di vasi ialoidi all'interno della coppa per gli occhi.
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Representative Results
Immagini in vivo di vasi ialidi in topi vivi
Figura 3 A rivela viste trasversali delle immagini dello OCT per i tessuti retina e ialoidi nei topi WT e Lrp5-/-di 3 mesi, un modello animale con ipoteride persistente. L'occhio WT mostra l'assenza di tessuto ialoide, mentre l'occhio Lrp5-/-mostra due vasi ialoidi persistenti derivati dalla testa del nervo ottico. Figura 3 B mostra le immagini FFA di vasi ialidi persistenti (verdi) nel campo fluorescente nei topi Lrp5-/- di 6 settimane. Il topo WT non mostra alcun residuo di vasi ialidi, e il topo Lrp5-/-mostra otto rami di vasi ialoidi nel corpo vitreo.
Esposizione ex vivo di vasi ialidi
Figura 4 A,B dimostra vasi ialidi isolati come visualizzati in supporti piatti, dove le cellule vascolari e i macrofagi associati sono stati macchiati dai loro nuclei con colorazione DAPI (blu). L'HA è al centro di ogni immagine, e vasi ialoidi sono rivelati dalle linee discontinue derivate da DAPI. Ogni linea rappresenta una nave di VHP. Nei topi Lrp5-/-,un numero più elevato di navi ialoidi rimanenti è stato osservato al P8 in supporti piatti (Figura 4A). I topi WT avevano una media di 12 rami di navi ialoidi al P8, mentre i cuccioli di Lrp5-/- corrispondevano all'età mostravano circa 25 rami di navi ialoidi, dimostrando una regressione significativamente compromessa della figura di vascolarità iatilide (4 B). Inoltre, lo sviluppo vascolare della retina ritardato e incompleto, un'altra caratteristica spesso associata a vasi ialidi persistenti, è stata osservata anche nei cuccioli Lrp5-/- (Figura 4C,D). La figura 5 mostra i restanti vasi ialidi in sezioni trasversali di gli occhi Lrp5-/-a P8, mentre gli occhi WT non mostrano vasi ialidi.
Figura 1 : Diagramma schematico che illustra la regressione dello sviluppo della vascolatura ialoide negli occhi del mouse. I vasi e i rami ialoidi, tra cui VHP, TVL e PM, derivano dall'HA e occupano gran parte dello spazio tra l'obiettivo e la retina immatura alla nascita (P0). L'involuzione ialoide nei topi inizia con la regressione dei capillari PM già dal P4. A P8, PM, VHP e TVL gli strati regrediscono continuamente, coincidendo con la formazione completa dello strato superficiale dei vasi retinici. Con P12, l'involuzione dello strato PM è completa, mentre l'atrofia di VHP e TVL è ancora in corso. Nel frattempo, uno strato profondo di vasi retinici inizia a formarsi durante P7-P12. Con P16, la regressione del sistema ialoide è parzialmente completata (con i restanti vasi TVL e HA a sinistra), e lo strato intermedio di plesso vascolare retiico continua a svilupparsi. La vascolatura retinica è completamente matura di P21 e assume il ruolo di tessuti retinici nutriti dai vasi ialoidi, che ora sono per lo più regrediti. A P21, il vitreo, in assenza di vasi ialidi, mostra un chiaro percorso visivo. Le linee rosse tratteggiate rappresentano i vasi regrediti. VHP - vasa hyaloidea propria; TVL - tunica vasculosa lentis; PM - membrana pupillare; HA - arteria ialoide. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Diagramma schematico che illustra la procedura sequenziale di isolamento della nave ialoide per l'ex vivo montaggio piatto visualizzazione. (A) Iniezione di gelatina nell'occhio enucleated attraverso quattro punti di iniezione (punti rossi) al limbo, per solidificare il corpo vitreo. (B) Rimozione della cornea e del nervo ottico, dissezione accurata dell'iride e staccare il complesso sclera-choroid-RPE. (C) Capovolgere la tazza retinica rimanente con la lente per rendere il lato della retina rivolto verso l'alto; quindi, iniettando PBS tra la retina e il corpo vitreo per separarli, seguito da staccare lo strato reticino. (D) Capovolgendo a testa in giù di nuovo il resto del tessuto, contenente la lente con l'iauide circostante. Sollevare leggermente l'obiettivo per allentare la connessione di TVL e VHP. (E) Taglio all'HA tra la TVL e il VHP, e la rimozione dell'obiettivo e TVL. Strato VHP di montaggio piatto. VHP - vasa hyaloidea propria; TVL - tunica vasculosa lentis; PM - membrana pupillare; HA - arteria ialoide. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : imaging in vivo di recipienti ialidi con tomografia a coerenza ottica (OCT) e e angiografia a fluorescenza (FFA). R: Immagini rappresentative dello OCT di topi WT e Lrp5-/-di 3 mesi che mostrano vasi ialidi persistenti nello spazio vitreoso negli occhi Lrp5-/-. B: Rappresentativo delle immagini FFA dei topi WT e Lrp5-/-a 6 settimane di età. I topi sono stati iniettati con sodio fluorescein o 0,1 ml di salina per topo dopo l'anestesia, e le immagini sono state scattate 5 min dopo l'iniezione, focalizzate su vasi ialidea in lrp5-/-topi o corpo vitreo in WT (in assenza di vasi ialoidi). I vasi ialoidi persistenti sono stati visualizzati negli occhi Lrp5-/-ma non WT. Le frecce rosse indicano i vasi ialoidi. Entrambe le barre della scala: 100 m (A). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : visualizzazione della regressione ritardata del vaso ialoide e sviluppo ritardato della vascolatura della retina nei topi Lrp5-/-. (A) Immagini rappresentative di vasi ialidi piatti macchiati con DAPI (blu) negli occhi WT e Lrp5-/-a P8. Le frecce (bianche) indicano l'arteria ialoide. (B) Quantificazione del numero di navi ialoidi che si diramano dall'arteria ialata negli occhi di WT e Lrp5-/.. (C) Rappresentante retine a montatura piatta macchiate con isolectina-IB4 (rosso) per la vascolatura negli occhi WT e Lrp5-/-a P8. Le linee tratteggiate bianche indicano il bordo della retina. Le linee gialle indicano il bordo dell'area vascolarizzata. (D) Quantificazione della copertura vascolare del plesso vascolare retile superficiale negli occhi WT e Lrp5-/-. n - 8–12/gruppo. Per l'analisi statistica sono state utilizzate le barre della scala nei pannelli A e C - 1 mm. I dati sono indicati come media: il test t -test di Studenta due code è stato utilizzato per l'analisi statistica. P < 0,01. Questa cifra viene modificata con ilpermesso di Wang et al. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : visualizzazione di recipienti ialidi in sezioni trasversali di occhi Lrp5-/-. Immagini rappresentative di sezioni trasversali di occhi isolati da topi WT e Lrp5-/-a P8. Gli occhi erano enucleati e incorporati nella temperatura di taglio ottimale, e le sezioni sono state tagliate usando il criostato. Le sezioni trasversali sono state macchiate di DAPI (blu) per mostrare i nuclei e isolectina-IB4 (rosso) per mostrare i vasi sanguigni. Le frecce bianche indicano i vasi ialoidi. La barra della scala è di 500 m. Questa cifra è adattata con ilpermesso di Chen et al. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Le tecniche per valutare e caratterizzare i vasi ialidi sono procedure intuitive e necessarie per osservare la regressione dei vasi ialidi nei modelli animali, per consentire studi sui meccanismi alla base della regressione vascolare durante lo sviluppo. Mentre l'imaging retinico in vivo consente l'osservazione longitudinale della regressione ialidea nello stesso animale, l'accesso a un sistema di imaging del reddito dei roditori per OCT e FFA può essere un fattore limitante. Inoltre, l'imaging in vivo nei topi vivi non è fattibile prima di aprire gli occhi. Pertanto, questa metodologia non è applicabile durante lo sviluppo oculare nella fase neooatale. D'altra parte, mentre l'imaging di sezioni trasversali di occhi isolati può essere utilizzato per qualsiasi età del mouse e ha una bassa barriera tecnica, non è quantitativo quando ci sono solo pochi vasi ialidi visibili, e la possibilità di ottenere un'immagine ideale dipende in gran parte dal angolo di sezionamento (Figura 5). In confronto, l'isolamento dei vasi ialidi per la visualizzazione del monte piatto consente l'imaging completo dell'intero recipiente ialoide e la quantificazione accurata, ma possono esistere sfide tecniche a causa della natura delicata e fragile dei vasi ialidi. Ci auguriamo che il protocollo descritto in questo documento aiuti a superare queste sfide.
Diversi passaggi critici nel protocollo di isolamento degli ialoidi includono l'iniezione della soluzione di gelatina, la rimozione della retina e il montaggio piatto finale. La difficoltà tecnica di maneggiare la vascolatura ialidea sta nella sua natura delicata, nello stato quasi liquido di vasi ialorali in cui risiedono i vasi ialoidi e nella sua stretta connessione con la lente adiacente e la retina. L'iniezione di soluzione di gelatina intravitveraè è la chiave per solidificare il corpo vitreo contenente vasi ialoidi e, quindi, rendere la loro consistenza più solidale per una più facile dissezione e manipolazione. La gelatina è un agente gelling che forma gel trasparenti termoreversibili elastici. Iniettando la forma liquida di gelatina (a temperatura ambiente o a 37 gradi centigradi) nello spazio vitreo e raffreddandola a una temperatura più bassa (4 gradi centigradi), il corpo vitreo si trasforma in una tazza di gel più solida. L'esecuzione di iniezioni multiple di gelatina nell'occhio consente la piena dispersione di una quantità sufficiente di gelatina nello spazio vitreo, per formare una tazza di tessuto ialoide gelatinizzata uniforme e rotonda. Un'altra difficoltà tecnica sta nel rimuovere la retina senza danneggiare il tessuto ialoide. A differenza della choroide, che è relativamente facile da sezionare a parte, il corpo vitreo gelatinizzato contenente vasi ialidi è difficile separarsi dalla retina vicina senza danneggiare lo ialoide. Abbiamo scoperto che l'iniezione di PBS nello spazio tra il corpo vitreo e la retina generava uno strato di buffer liquido, rendendo molto più facile separare questi due tessuti. Questo è in qualche modo simile alla tecnica di idrodissezione utilizzata nella chirurgia della cataratta per separare la capsula e la corteccia della cataratta. Il montaggio piatto finale è l'ultimo passo tecnicamente difficile del protocollo. Riscaldare il tessuto ialoide gelatinizzato in una goccia PBS su uno scaldavele lo riconverte in una forma più liquida per consentire un montaggio piatto più facile. Una corretta disposizione e orientamento della tazza gel ialoide è ancora essenziale per garantire il suo appiattimento uniforme dopo la fusione e l'essiccazione.
Il protocollo di isolamento delle navi ialoidi può essere ulteriormente modificato in diversi modi. La concentrazione di soluzione di gelatina che abbiamo usato è del 5%, ma possono funzionare anche concentrazioni superiori o inferiori, a seconda della preferenza del ricercatore per ottenere una consistenza più solida o più morbida per la manipolazione. La colorazione DAPI dei nuclei cellulari può anche essere modificata con isolectina-IB4 o altri marcatori di cellule endotiliali o macrofagi, per distinguere meglio le cellule endoteliali vascolari dai macrofagi. Una parola di cautela: i vasi ialoidi a piano sono molto delicati e solo vagamente aderenti allo scivolo; quindi, i vetrini ialidi devono essere maneggiati con molta delicatezza e attenzione se è necessario il risciacquo durante la colorazione. Questo protocollo di isolamento ha anche i suoi limiti, compresa la complessità dell'esecuzione della dissezione fine e la difficoltà della conservazione a lungo termine dei campioni a causa della natura del tessuto fragile. Tuttavia, i vasi ialidi isolanti e piatti è ancora il modo più completo e intuitivo per studiare la vascolideia ialidea, per promuovere gli studi di oculare e angiogenesi10,17,27, 29,30,31.
La vasculatura ialoide fornisce un eccellente modello sperimentale di studio della crescita e della regressione delle navi dello sviluppo, rilevanti per i campi di ricerca in oftalmologia, angiogenesi e morte cellulare programmata, con cui questo articolo mira ad assistere. Le future modifiche del protocollo di isolamento possono essere volte a migliorare la fattibilità di una procedura di dissezione tecnica. Nel complesso, l'imaging in vivo combinato e l'isolamento ex vivo dei vasi ialoidi sono un metodo vantaggioso per consentire la valutazione completa e la caratterizzazione dei vasi ischemidi nei topi come utile modello di regressione vascolare.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni del National Institutes of Health (NIH) (R01 EY024963 ed EY028100) a J.C. . La procedura di isolamento degli ialoidi descritta in questo studio è stata adattata con la modifica da protocolli generosamente condivisi dai dottori Richard Lang, Toshihide Kurihara e Lois Smith, di cui gli autori sono grati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AK-Fluor (fluorescein injection, USP) | Akorn | 17478-253-10 | |
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher | S2828 | |
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Artificial tear eyedrop | Systane | N/A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | Stock NO: 000664 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| Cyclopentolate hydrochloride and phenylephrine hydrochloride eyedrop | Cyclomydril | N/A | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9382 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Heating board | Lab-Line Instruments Inc. | N/A | |
| Isolectin GS-IB4, 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | I21413 | |
| Ketamine hydrochloride injection | KetaVed | NDC 50989-996-06 | |
| Lrp5-/- mice | The Jackson Laboratory | Stock NO. 005823 | Developed by Deltagen Inc., San Mateo, CA |
| Micron IV and OCT | Phoenix Research Labs | N/A | Imaging software: InSight |
| Microscope | Zeiss | discovery v8 | |
| Microsurgery forceps | Scanlan International | 4004-05 | |
| Microsurgery scissors | Scanlan International | 6006-44 | |
| Optimal cutting temperature compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Optimal cutting temperature compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Peel-A-Way disposable embedding molds (tissue molds) | Fisher Scientific | 12-20 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (10X) | Teknova | P0496 | |
| Slide cover glass | Premiere | 94-2222-10 | |
| Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn: AnaSed | NDC: 59399-110-20 |
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