Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

In vivo היישום של מערכת שליטה מרחוק עבור הביטוי מניפולציה של ג'ין אנדוגני

Published: March 29, 2019 doi: 10.3791/59235
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1
1Center for Epigenetics, Van Andel Research Institute, 2Amgen

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הדרושים כדי ליצור מערכת מודל שבו שעתוק של גנים אנדוגני עניין יכול להיות מותנה נשלט בעלי חיים או תאים באמצעות מדכא. שבולם משופרת lac ו/או מערכות activator ט .

Abstract

כאן נתאר פרוטוקול להטמעת מערכת שליטה מרחוק (Reversible Manipulation of Transcription- Endogenous לוקוסים), אשר מאפשר ביטוי הפיך, tunable שליטה ג'ין אנדוגני עניין בחיים מודל מערכות. מערכת שלט מעסיקה משופרת לאק דיכוי ו ט הפעלת מערכות להשיג למטה - או קולטנים upregulation של גנים היעד בתוך מערכת ביולוגית יחידה. דיכוי חזק יכולה להיות מושגת מ מדכא. שבולם מחייב אתרים בגמישות הממוקמים רחוק במורד הזרם של אתר התחלת שעתוק על ידי עיכוב התארכות שעתוק. קולטנים upregulation חזקים בר השגה על ידי שיפור שעתוק של גנים אנדוגני על ידי מיקוד ט מפעילים תעתיק את האמרגן cognate. פקד זה הפיך והביטוי tunable יכול להיות מיושם, מסוגר שוב ושוב אורגניזמים. האונות ואת צדדיות של המערכת, כפי שמתואר עבור אנדוגני Dnmt1 כאן, יאפשר ניתוחים פונקציונליים ויוו מדויקת יותר על-ידי הפיכת החקירה של ג'ין תפקוד ברמות שונות של ביטוי ועל -ידי בדיקות של הפיכות של פנוטיפ.

Introduction

נוקאאוט גנטי או גישות הטרנסגניים היו אמצעי יעיל ללמוד ג'ין פונקציה במודלים של בעלי חיים. עם זאת, הביטוי רגולציה על ידי גישות אלה דיכוטומי (פועל/לא פועל), שאינם-טמפורלית, ולכן הוא לא מסוגל לחשוף את מלוא הספקטרום פונקציונלי של גנים. מותנה Cre/LoxP טכנולוגיות אפשרו איון-עתיים או הפעלה של תפקוד הגן, אך טבעם דיכוטומי ממשיכה לדגמן מגבלות, כגון תא קטלני, irreversibility1,2 , 3. על מנת למלא את החלל הזה, מותנה גישות תמונות ציפורים אלו פותחו ט-מוסדר shRNA או miRNA4. עם זאת, אפקטים את המטרה להישאר דאגה RNAi5 , יש כבר מאתגר כדי לשלוט ויוו. לאחרונה, יש טכנולוגיות בקרת גנים ברמת השעתוק CRISPR/Cas-מתווכת ' הציג גישה תכליתיות להשגת הן. ואת downregulation של ביטוי גנים אנדוגני והפגינו שלהם כלי עזר6,7 . עם זאת, האפקטיביות של הבקרה תעתיק CRISPR/Cas-מתווכת ברור עדיין אין ויוו, ו הפיכות של דיכוי מבוסס-קראב נותר דיכוי שיראו אותו, חזקה על ידי קראב, שלה חלבון שמעצבת KAP1 הוכח לגרום גן קבוע להשתיק8,9.

על מנת לטפל מגבלות אלה, פיתחנו הרומן גנים ברמת השעתוק מערכת היכולים לשלוט באופן מותנה ביטוי גנים אנדוגני של זאזא ומתוכננים בצורה tunable בעכברים באמצעות גנים ברמת השעתוק prokaryotic בינארי מערכות רגולטוריות10. Prokaryotic מערכות רגולטוריות בינארי תעתיק עם ליגנדים רגולטוריות, lac ו ט, אפשרו כזה הפיך ולשלוט ביטוי tunable11,12,13, 14. עם זאת, העוצמה דיכוי לקוי של מערכות בינאריות הנוכחי יש המניע שלהם אימוץ רחב לשליטה על ביטוי גנים אנדוגני ביונקים. אנו פיתחה מערכת הדיכוי לאק משופרת מספיק חזק בשביל הדיכוי של גנים אנדוגני, המועסקים אסטרטגיה הרומן של פילוח ט מפעילים תעתיק ישירות אל cognate האמרגן של ג'ין אנדוגני כדי להשיג קולטנים upregulation חזקים (איור 1)10. באמצעות טכנולוגיה זו, השגנו כמעט שני סדרי גודל בקרת ביטוי של הגן Dnmt1 אנדוגני באופן tunable, inducible ו הפיך10. כאן אנו מספקים הוראות שלב אחר שלב את תחולת ויוו אחרות הגנים ואורגניזמים שימוש בעכברים כמין מודל.

Figure 1
איור 1 : סקירה כללית של מערכת שלט. שעתוק של גנים היעד אנדוגני יכול להיות מוסדר באמצעות הנדסה לאק מדכא. שבולם ומערכות activator ט . היעד ג'ין יזם או אינטרון והוא מתוכנן להכיל אופרטורים של איגוד חזק LacIGY מדכא. שבולם ו/או את rtactivator TA-M2. R מציין Repron (נציגression intrעל), אשר מכיל לאק סימטרי 12 אופרטורים (S) ובנוסף אינטרון בטא-גלובין ארנב חלקית. T מציין ט למפעיל. מדכא. שבולם את ו/או מפעיל/באים לידי ביטוי של מקדם רקמות ספציפיות. הביטוי של הגן היעד ניתן לאחר מכן הפיכה לכוונן אותו רמת הביטוי הרצוי על-ידי מינהל IPTG (איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside, אנטגוניסט של מדכא. שבולם LacIGY) או דוקסיציקלין (Dox). איור זה השתנה לי ואח10אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

לפני תחילת פרוטוקול זה, עיין טבלה 1 כדי לזהות את השלבים הרלוונטיים עבור הפקד הרצוי של ביטוי גנים. לדוגמה, כדי להנדס עכבר המאפשרת downregulation הפיך של ג'ין אקס, להשלים את סעיפים 1, 3 ו- 4 של להלן פרוטוקול. טבלה 1 מסכמת גם את הרכיבים הדרושים של מערכת שליטה מרחוק.

שינוי הביטוי הרצוי דיכוי בלבד הפעלה בלבד דיכוי והפעלה
החלקים הרלוונטיים של פרוטוקול 1, 3-4 2-4 1-4
שלט רצף הצורך בהיעד ג'ין Repron ("דיכוי אינטרון"; 12 לאק סימטרי מפעילי בתוספת אינטרון בטא-גלובין ארנב חלקית) ט operator(s) Operator(s) Repron וט
שלט רצף מיקום אינטרון יזם אינטרון & יזם
Activator/מדכא. שבולם הדרושים עבור הפקד הרצוי LacIGY מדכא. שבולם rtTA-M2 Activator מדכא. שבולם LacIGY ו- rtTA-M2 Activator
ליגנדים רגולטוריות IPTG דוקסילין IPTG ו/או דוקסיציקלין

טבלה 1: סקירה של רכיבים שלט.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים נערכו עם האישור של טיפול בעלי חיים מוסדיים ושל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת דרום קליפורניה, את ואן אנדל מכון ובציות המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה מ המכונים הלאומיים לבריאות15.

1. לשנות את הגן עניין עבור דיכוי על ידי שליטה מרחוק

  1. בעזרת ההנחיות הבאות, לזהות אינטרון transcriptionally אינרטי לקראת סיום 5' של הגן עניין להכנסה של הרצף Repron ("intr ressionנציגעל"; 12 מפעילי לאק סימטרית פלוס אינטרון בטא-גלובין ארנב חלקית). להיות מודע היזמים חלופי עבור הגן עניין, ובחרו של אינטרון בהתאם transcript(s) כדי להיות נשלט (קרי אינטרון משותפים על ידי כל התמלילים או אחד ספציפי תעתיק הרצוי).
    הערה: עבור גנים בלי אינטרון או עם אלה לקראת הסוף 3', הכנס את רצף Repron לתוך האמרגן (ראה לי, et al.10 לניתוח נתונים היסטוריים).
    1. להשיג את רצף גנומית עבור הגן עניין.
      1. נווט אל UCSC הגנום דפדפן ה-16,17, ובחר את הטיוטה האחרונה של הגנום העכבר (העכבר GRCm38/mm10 בזמן הפרסום), אשר נמצא כעת תחת הלשונית הגנום .
      2. הזן את השם או את סמל הגן עניין למנוע החיפוש כדי להציג את התמלילים של הגן. לחץ על בצע.
      3. בחר את הווריאציה הרצויה התעתיק עבור הגן עניין.
      4. לחץ על סמל הגן ליד הווריאציה תעתיק של הריבית (סמל בתמליל שנבחרו קודם לכן יהיה בתוך קופסה כהה).
      5. תחת הכותרת רצף וקישורים כלים, מסדי נתונים , לחץ על הקישור רצף גנומית .
      6. עבור אפשרויות אזור אחזור רצף, בחר רק Exons (5' UTR, תקליטורים, ו 3' UTR), אינטרונים, וברירת המחדל FASTA אחת רשומה לכל הגנים. רצף אפשרויות עיצוב, בחר Exons במקרה העליונה, כל דבר אחר באותיות ואת המסכה חוזרת על N (להסתיר רצפים חוזרים). לאחר מכן לחץ על שלח.
      7. שמירת הרצף הזה, שמירה על העליונה - ואותיות עיצוב, במסמך או תוכנית אשר יכול להיות מבואר.
    2. למנוע הפרעה של CpG איים, אשר עשוי להצביע על אזורים עם פונקציית רגולציה ג'ין.
      הערה: למרות 5' אינטרון עדיפה על ההכנסה של רצף Repron, אינטרון הראשון עשוי להכיל תעתיק רגולטוריות רכיבים כגון איי CpG, (שנבדקו בשלב זה) או משפר אלמנטים (שנבדקו בשלב 1.1.4), אשר יש להימנע עבור Repron ההכנסה.
      1. תחת הדגל ביטוי ורגולציה של הדפדפן הגנום UCSC, בחר להראות למסלול CpG האיים ולאחר לחץ על רענון.
      2. התקרבות אינטרונים 5', לחץ על כל אי CpG (מוצג בצבע ירוק בזמנו של הפרסום אם קיים) ובחר תצוגה DNA עבור תכונה זו.
      3. לאחר בחירת מסיכה חוזר ל N, בחר לקבל את ה-DNA כדי לקבל את רצף האי CpG.
      4. כיסוי רצפי אלה עם הקובץ המקורי רצף, ביאורים אלה כמו אזורים intronic כדי למנוע בשל פונקציות רגולטוריות גנטי אפשרי.
    3. למנוע הפרעה ללא קידוד RNAs, למקרה שיש להם פונקציה רגולטוריות.
      1. תחת הבאנר גנים, גנים תחזיות של הדפדפן הגנום UCSC, בחר להציג על המסלול GENCODE (Ensembl) , ולאחר לחץ על רענון.
      2. התקרבות אינטרונים 5', לחץ על כל ללא קידוד RNA (מוצג בצבע ירוק בזמנו של הפרסום אם קיימים), להשיג רצף הדנ א לכל על ידי לחיצה על נקודות הציון כרומוזומלית שלה.
      3. בתפריט הנפתח ' תצוגה ', בחר DNAולחץ מסכת חוזר ל N. לאחר מכן לחץ לקבל את ה-DNA.
      4. כיסוי רצפי אלה עם הקובץ המקורי רצף, ביאורים אלה כמו אזורים intronic כדי למנוע בשל פונקציות רגולטוריות גנטי אפשרי.
    4. להימנע אזורים intronic עם חתימות משפר tissue(s) של עניין, כגון H3K4me1, H3K27ac ו- DNase אני רגישות יתר18,19,20,21, כמו גם איגוד CTCF . אתרים, המסדירה משפר לולאה22,23.
      1. נווט אל קידוד מסד הנתונים24,25, בחר בסמל ניסויים .
      2. עבור סוג assay, בחר שבב-seq או DNase-seq, אכלוס יתר הקטגוריות (אורגניזם, סוג Biosample, וכו ') על פי לתאים. ניתן לתכנן.
      3. לאחר בחירת תכונות, רחף מעל יצוגיים בכחול, בחר עבורו הצג תוצאות ברשימה מופיעה (השמאלי ביותר pictogram בזמן הפרסום).
      4. בחר את קבצי הנתונים עבור המטרות של H3K4me1, H3K27ac, DNase ואני CTCF המתאימים ביותר לתאים. ניתן לתכנן.
      5. בתוך כל ערכת נתונים רלוונטיים, גלול למקטע קבצים , ודא mm10 הזה (או את הגירסה העדכנית ביותר של גנום), UCSC שנבחרו, לחץ על לחצן Visualize .
      6. עכשיו הדפדפן הגנום UCSC התקרבות אינטרונים 5' עבור הגן עניין, לחץ על כל H3K4me1, H3K27ac, DNase ואני CTCF שיא במסלולם שיא המבואר בהתאמה.
      7. להשיג רצף הדנ א לכל אזור שיא על ידי לחיצה על נקודות הציון כרומוזומלית שלה.
      8. בתפריט הנפתח ' תצוגה ', בחר DNAולחץ מסכת חוזר ל N. לאחר מכן לחץ לקבל את ה-DNA.
      9. כיסוי רצפי אלה עם הקובץ המקורי רצף, ביאורים אלה כמו אזורים intronic כדי למנוע בשל פונקציות רגולטוריות גנטי אפשרי.
    5. למנוע שיבוש קונצנזוס החדרת רצפים, כדי לא להפריע שחבור המתאים של exons.
      הערה: למרות רצפים הדרושות שחבור מוגבלים בעיקר הבסיסים בערך שש בקצה 5' של אינטרון26 וכ-60 בסיסים ב 3' סוף27, מומלץ לבחור אינטרון גדולים, מתן אפשרות עבור שוליים רחבים יותר במידה ניכרת מאלה קונצנזוס אזורי כדי לצמצם את הסבירות של להשפיע שחבור. שימוש בכלים לניתוח אינטרון, כגון מכונת וקטורים תומכים-BPfinder28, מומלץ ניתוח מעמיק יותר של רצפי splice פוטנציאליים.
  2. לאחר זיהוי אזור intronic פוגש הקריטריונים הנ ל (כמו למשל, עבור Dnmt1 הנתונים משלים), מסך הרצף באמצעות sgRNA באינטרנט עיצוב כלי לזיהוי של sgRNA באזור עם ירידה לפרטים גבוה, חזה תוצאות יעילות.
    1. נווט אל כלי עיצוב sgRNA מקוון של בחירה, כמו CRISPOR29.
    2. הזן את הרצף של האזור intronic עניין, ציין הגנום הפניה הרלוונטית ובחר את הרצוי Protospacer סמוכים מוטיב (פאם). לחץ על שלח.
    3. למיין את sgRNAs החזוי על ידי ציון ירידה לפרטים, ובחר sgRNAs אחד או יותר, שגם ככה יש יעילות החזוי גבוהה ציון29.
      1. אופציונלי: כדי להגדיל את הסבירות של שימוש של sgRNA יעיל, תחילה לבחון את היעילות המחשוף של מספר בעל ניקוד העליון sgRNAs assay במבחנה30ולהמשיך sgRNA היעילה ויוו.
  3. עיצוב של תבנית ה-DNA המכיל פיט (מבוססת על הזרקת Pronuclear Transgenesis ממוקד) נחיתה רצף pad, למשל, ב- איור משלים 1A, B, ולצדו שני הצדדים נשק 60-בסיס הומולוגיה התואמים sgRNA לחתוך באתר31 .
    הערה: המנחת מכיל שני אתרים heterotypic loxP (JT15 ו- Lox2272) ומאפשרת יישוב החדרת רצפים גדול דרך גישה דו-שלבית; ודא כי צמתי ונקודה זו אינם יוצרים אתרים splice נסתר. לחלופין, ניתן להשתמש בתאי גזע עובריים (ESC) - טוק מבוסס - באסטרטגיה כדי להוסיף את רצף Repron ישירות.
  4. להכין את sgRNA, חלבון Cas9 וכן את תבנית ה-DNA (ssDNA) חד-גדילי המנחת, microinject לתוך הביצים (מ B6C3F1/J עכברים או אחרים למתח הרצוי) על פי פרוטוקולים הוקמה32,33.
  5. מסך עבור עכברים עם ה נחיתה pad טוק-in.
    1. עיצוב ה-PCR תחל משלימים את לוקוס גנומי אלא מחוץ האזורים ממוקד על-ידי הזרועות הומולוגיה, כפי שמתואר עבור Dnmt1 של 1C איור משלים. הימנע שחוזר על עצמו רצף גנומית בעת עיצוב של צבעי יסוד.
    2. תמצית ה-DNA מתפסי הזנב של העכברים על פי פרוטוקולים הוקמה34.
    3. השתמש PCR, ג'ל אלקטרופורזה לזהות עכברים עם ההכנסה משטח הנחיתה.
    4. ודא כי ה-טוק-in הצליחה על-ידי קביעת רצף את המוצרים ה-PCR.
      הערה: מחיקות גדולות לא רצויות ו rearrangements יכול להיות הציג על-ידי CRISPR/Cas935, זהיר ההקרנה לעריכה חופש-יעד מומלץ לפני שתמשיך35,36,37.
  6. באמצעות הביצים מן העכברים משטח הנחיתה, microinject iCre mRNA38 ו של פלסמיד מהונדס המכיל את רצף Repron ולצדו JTZ17 ו- Lox2272 רקומבינציה אתרי31,39,40, 41 על פי הקים שיטות-38,-42,-43.
  7. מסך עבור עכברים עם הכניסה Repron.
    1. עיצוב ה-PCR תחל משלים לוקוס גנומית, מחוץ Repron הכנס. הימנע שחוזר על עצמו רצף גנומית בעת עיצוב של צבעי יסוד.
    2. תמצית ה-DNA מתפסי הזנב של העכברים על פי פרוטוקולים הוקמה34.
    3. השתמש PCR, ג'ל אלקטרופורזה לזהות עכברים עם הכניסה Repron.
    4. לאשר שטוק-in הצליחה על-ידי קביעת רצף את המוצרים ה-PCR.

2. לשנות את הגן עניין על קולטנים upregulation על ידי שליטה מרחוק

  1. בעזרת ההנחיות הבאות, לזהות אזור האמרגן של הגן עניין זה סביר ש perturb יזם פונקציה על החדרת רצפים אופרטור ט . להיות מודע היזמים חלופי עבור הגן עניין, ובחרו מקדם מכירות לפי transcript(s) כדי להיות נשלט (קרי מקדם משותפים על ידי כל התמלילים או אחד ספציפי תעתיק הרצוי).
    1. להשיג את רצף גנומית ייצוג המקדם של עניין.
      1. נווט אל UCSC הגנום דפדפן ה-16,17, ובחר את הטיוטה האחרונה של הגנום העכבר (העכבר GRCm38/mm10 בזמן הפרסום), אשר נמצא כעת תחת הלשונית הגנום .
      2. הזן את השם או את סמל הגן עניין למנוע החיפוש כדי להציג את התמלילים של הגן. לחץ על בצע.
      3. בחר את הווריאציה הרצויה התעתיק עבור הגן עניין.
      4. לחץ על סמל הגן ליד הווריאציה תעתיק של הריבית (סמל הגן בתמליל שנבחרו קודם לכן יהיה בתוך קופסה כהה).
      5. תחת הכותרת רצף וקישורים כלים, מסדי נתונים , לחץ על הקישור רצף גנומית .
      6. עבור אפשרויות אזור אחזור רצף, בחר רק יזם/Upstream פי 1000 בסיסים. רצף אפשרויות עיצוב, בחר מסיכת חוזר ל N (להסתיר רצפים חוזרים). לאחר מכן לחץ על שלח.
      7. שמירת רצף יזם זה במסמך או תוכנית אשר יכול להיות מבואר.
    2. בחר אזורים חופשיים של אתרי קישור פקטור שעתוק בשם, כמו לקטוע רצפים אלה עשוי לשנות ביטוי גנים אנדוגני.
      1. נווט אל הדפדפן הגנום UCSC ופתח את הגירסה האחרונה של הגנום העכבר.
      2. מעל הבאנר מיפוי של רצף , בחר לעקוב אחר רכזות.
      3. לחץ על mm10 לצד שם רכזת JASPAR 2018 TFBS (או את הגירסה האחרונה של JASPAR).
      4. הזן את השם או את סמל הגן עניין למנוע החיפוש כדי להציג את התמלילים של הגן. לחץ על בצע.
      5. בחר את הווריאציה הרצויה התעתיק עבור הגן עניין.
      6. גלול מטה אל הדגל JASPAR 2018 TFBS , לחץ על החץ הנפתח כדי לבחור את אפשרות הצפייה הרצויה עבור המסלול, כגון ימחץ. לחץ על רענן.
      7. זום לתוך האזור המקדם של הגן עניין וזהה אזורים חופשיים (או יחסית חופשית) של אתרי קישור של פקטור שעתוק לפי המסלול JASPAR. להקליט את הקואורדינטות כרומוזומליות של אזורים אלה.
      8. לקבל את רצף גנומית של הקואורדינטות כרומוזומלית על-ידי הקלדתן לחיפוש ולחיצה על ללכת. בתפריט הנפתח ' תצוגה ', בחר DNAולחץ מסכת חוזר ל N. לאחר מכן לחץ לקבל את ה-DNA.
      9. כיסוי רצפי אלה עם הקובץ המקורי רצף, ביאורים אלה כמו אזורים יזם אידיאלי למטרה עקב חוסר פקטור שעתוק מחייב.
    3. בתוך רצפים אלה, בחר אזור יזם perturbable במעלה הזרם, אבל ליד אתר התחלת שעתוק של הגן עניין.
      הערה: ההכנסה זה יותר מדי. אתר התחלת שעתוק עשויים להגדיל את הסיכוי של ופוגע יזם פעילות, אבל ההכנסה זה רחוק מדי עשויה להקטין את רמת קולטנים upregulation. החדרת רצפים אופרטור ט כ-200 basepairs במעלה הזרם של אתר התחלת שעתוק הביא קולטנים upregulation חזקה של היזמים שני בדקה (ראה דיון)10.
  2. מסך האזור שנבחר יזם באמצעות כלי עיצוב באינטרנט sgRNA לזיהוי של sgRNA באזור עם ירידה לפרטים גבוה ותוצאות יעילות החזוי.
    1. נווט אל כלי עיצוב sgRNA מקוון של בחירה, כמו CRISPOR29.
    2. הזן את הרצף של האזור בעל עניין, לציין הגנום הפניה הרלוונטית ובחר את הרצוי Protospacer סמוכים מוטיב (פאם). לחץ על שלח.
    3. למיין את sgRNAs החזוי על ידי ציון ירידה לפרטים, ובחר sgRNAs אחד או יותר, שגם ככה יש יעילות החזוי גבוהה ציון29.
      1. אופציונלי: כדי להגדיל את הסבירות של שימוש של sgRNA יעיל, תחילה לבחון את היעילות המחשוף של מספר sgRNAs assay במבחנה30ולהמשיך sgRNA היעילה ויוו.
  3. לעצב תבנית ה-DNA המכיל מפעילי ט ומשני על-ידי הזרועות 60-בסיס הומולוגיה התואמים sgRNA לחתוך באתר31,33.
    הערה: המספר של מפעילי ט הוא להתאמה אישית; ההכנסה של שניים עד ארבעה ט למפעיל רצפי במשולב בעבר הוכח להיות יעיל, אבל באופן עקרוני אופרטורים נוספים הם רצויים נהיגה ביטוי גבוה יותר. לחלופין, המבוסס על ESC טוק-אין אסטרטגיית יכול לשמש להוספת האופרטורים ט .
    1. אופציונלי: עבור ראיות כי השינויים המוצעת סביר לא ישבש את הפעילות תעתיק אנדוגני של הגן עניין, לשכפל את רצף יזם מהונדסים לתוך גחלילית לוציפראז וקטור (כגון pGL3-Basic), ו השווה יעילותה כדי ייצוג המקדם המקורי שימוש assay לוציפראז.
  4. להכין את sgRNA, חלבון Cas9 וכן את תבנית ssDNA המכיל את רצפי אופרטור ט , microinject לתוך הביצים (מ B6C3F1/J עכברים או אחרים למתח הרצוי) על פי פרוטוקולים הוקמה32,33.
    הערה: בשל המורכבות של סינתזה רצף החוזרות על עצמן, גישה מבוססת-תמלול שעתוק במבחנה/הפוכה מומלץ לסנתז תבנית ssDNA בין שני גדילי ה-DNA (dsDNA) פלסמיד44. לחלופין, תבנית dsDNA עשוי לשמש microinjection, אך היעילות טוק-אין יכול להיות מופחת45.
  5. מסך עבור עכברים עם טוק-אין של האופרטורים ט .
    1. עיצוב ה-PCR תחל משלים לוקוס גנומית, מחוץ האזורים ממוקד על-ידי הזרועות הומולוגיה. הימנע שחוזר על עצמו רצף גנומית בעת עיצוב של צבעי יסוד.
    2. תמצית ה-DNA מתפסי הזנב של העכברים על פי פרוטוקולים הוקמה34.
    3. השתמש PCR, ג'ל אלקטרופורזה לזהות עכברים עם הכניסה של האופרטורים ט .
    4. ודא כי ה-טוק-in הצליחה על-ידי קביעת רצף את המוצרים ה-PCR.
      הערה: מחיקות גדולות לא רצויות ו rearrangements יכול להיות הציג על-ידי CRISPR/Cas935, זהיר ההקרנה לעריכה חופש-יעד מומלץ לפני שתמשיך35,36,37.

3. לפתח activator - ו/או הבעת מדכא. שבולם עכברים

  1. לזהות מקדם robustly לביטוי עבור סוגי ריבית tissue(s) או תא.
    הערה: חיפוש ספרות של רקמות ספציפיות יזם מסד46 עשוי להיות מועיל באיתור שכזה מקדם.
  2. למקם את מדכא. שבולם משופרת שסופקו לאק או ט activator רצף במורד הזרם של האמרגן הרצוי כדי ליצור מבנה מהונדס.
  3. לייצר את קווי הטרנסגניים העכבר באמצעות נהלי הטרנסגניים-42,-43,-47. לחלופין, ניתן להשתמש בגישה transgenesis בייעודי לאתר כדי למנוע תופעות מיקום וכדי לאפשר עותק יחיד transgene ההכנסה31,48.
  4. הפץ המייסדים, לקבוע את תבנית הביטוי ואת רמת transgene של הצאצאים של כל מייסד. בחר שורות עם ביטוי חזקים לסוגי אמצעי רקמות המיועד עבור רבייה נוסף.
    1. גזע המייסדים wildtype עכברים.
    2. עיצוב תחל PCR כי יאתר את ההוספה activator ו/או מדכא. שבולם.
    3. תמצית ה-DNA מתפסי הזנב של הצאצאים על פי פרוטוקולים הוקמה34.
    4. השתמש PCR, ג'ל אלקטרופורזה לזהות עכברים עם ההוספה.
    5. לאשר את הכניסה transgene על ידי רצף של מוצרי ה-PCR.
    6. Propogate הקווים מהונדס.
    7. להקריב כמה גורים מכל שורה, ולאסוף את הרקמות עניין לרביעיית-PCR, אימונוהיסטוכימיה, ו/או סופג המערבי כדי לנתח את הביטוי של החלבון/ג'ין עניין בלסוגי אמצעי רקמת המטרה.
    8. בחר את השורות עם הביטוי החזק ביותר ברקמות של עניין לשימוש בסעיף 4.

4. לתמרן ביטוי גנים אין ויוו

  1. גזע העכברים עם הגן ששונה עניין (סעיף 1 או 2) עם העכברים הטרנסגניים מהסעיף 3 לפי שיטות רבייה הוקמה49. עבור בקרת ביטוי מכסימלי, גזע עכברים homozygosity עבור אלל ששונה.
  2. השחזור או התאמה של דיכוי של הגן היעד, לנהל IPTG במי השתייה.
    1. השפעול לקבוע את המינון של IPTG לשימוש, מתייחסים עכברים גנוטיפ המתאים והפקדים עם אחד מתוך מגוון של מנות (מומלץ החל טווח: 0 – 400 מ IPTG) עבור שבוע אחד לפחות50,51. לכלול לפחות שלושה עכברים לכל טיפול קבוצה ובחר את הגיל, המין של עכברים הרלוונטיים ביותר הניסויים העתידי המתוכנן. הערה: זוגות של עכברים יכולים להיות מטופלים עם מים IPTG לספק התפתחותית חשיפת IPTG אופספרינג במידת הצורך13, או עכברים יכולים להתחיל טיפול בכל עת לאחר הלידה.
      1. להמיס את המסה הרצוי של IPTG במים מזוקקים סטריליים ביום של המינהל, ומערבבים עם בר-מערבבים במשך 5 דקות, או עד התפרקה לחלוטין.
      2. לעטוף את הבקבוק עם רדיד, ולפקח על המים IPTG בקבוק המוגן על-ידי אור. להחליף פעמיים בשבוע. לספק אותו מקור מים עכברים שקיבלו 0 מ"מ IPTG.
      3. לאחר שבוע אחד לפחות, להקריב את העכברים, ולנתח את הביטוי של הגן עניין ב- tissue(s) היעד באמצעות לרביעיית-PCR, אימונוהיסטוכימיה, ו/או סופג המערבי.
      4. לזהות את מינון זה משחזר את הביטוי של הגן עניין לזה של פקדים wildtype, והשתמש מינון זה כדי להשיג ביטוי הרגיל הגן בניסויים בעתיד.
  3. עבור אינדוקציה של קולטנים upregulation ג'ין, לנהל דוקסיציקלין (Dox) בתזונה.
    1. השפעול לקבוע ריכוז Dox לנהל, מתייחסים עכברים גנוטיפ המתאים והפקדים עם אחד של ריכוזים טווח של Dox (מומלץ החל טווח: 0 – 5000 מ ג/ק ג Hyclate דוקסיציקלין) עבור שבוע אחד לפחות52 ,53, כולל לפחות שלושה עכברים לכל קבוצה לטיפול. לרכוש המכילות Dox עכבר אוכל מכל ספק מסחרי.
      הערה: זוגות של עכברים יכולים להיות מטופלים עם מזון Dox לספק התפתחותית חשיפת Dox אופספרינג במידת הצורך54,55, או עכברים יכולים להתחיל טיפול בכל עת לאחר הלידה.
    2. להחליף דיאטה אחת לשבוע. לספק את הדיאטה באותו בסיס עכברים שקיבלו מזון נטול Dox.
    3. לאחר שבוע אחד לפחות, להקריב את העכברים, ולנתח את הביטוי של הגן עניין ב- tissue(s) היעד באמצעות לרביעיית-PCR, אימונוהיסטוכימיה, ו/או סופג המערבי.
    4. לזהות את המינון שמגביה את הביטוי של הגן עניין לרמה הרצויה, והשתמש מינון זה כדי להשיג ביטוי של הגן בניסויים בעתיד.

Representative Results

יכולת דיכוי של מערכת שלט הוכח בשתי גישות שונות עד כה. בגישה הראשונה, אתרי קישור מדכא. שבולם לאק הוכנסו את האמרגן אנדוגני של הגן Dnmt1 . בגישה השנייה, אשר מומלץ על ידי פרוטוקול זה, האתרים מחייב מדכא. שבולם הוכנסו לתוך אינטרון במורד הזרם כדי למנוע את הסיכון הפוטנציאלי של להשפיע על יזם פונקציה על-ידי ההוספה, ובכך לפשט את היישום של השלט- מערכת. שתי הגישות הביא הדחקה מוצלחת (איור 2A, B ו- 3A איור-C)10. Dnmt1 הביטוי היה מדוכא. 15% של רמות ללא פיקוח באמצעות גישה מבוססת-יזם (איור 2א). דיכוי חזק זה פעלה באופן תלוי מינון על ידי טיפול עכברים עם כמויות משתנות של IPTG (איור 2א). הדיכוי Dnmt1 נצפתה שהוכח ברמת החלבון על ידי immunostaining (איור 2B). לא נתבונן כל הבדל ניכר בביטוי Dnmt1 בין Dnmt1+ + Dnmt1LO/LO בעכברים, המאשר כי ההכנסה אופרטור לאק שלנו היה לא שיבשו יזם רגיל הפונקציה10. הגישה מבוססת-אינטרון מושגת יותר 90% הדיכוי של מפעילי ממוקם מספר kilobases במורד הזרם של אתר התחלת שעתוק attenuating שעתוק התארכות (איור 3A, B)10. גישה זו מבוססת-אינטרון אומתה נוסף על היזמים חזקים נוספים שבעה (איור 3ג'). דיכוי תמיד חזק הושג מכל היזמים נבדק. אין קורלציה בין רמות ביטוי שיורית החוזק של היזמים נצפתה, רומז כי הקיבולת דיכוי של המערכת שלנו מבוססת-אינטרון דיכוי חורגת את העוצמה תעתיק של כל היזמים חזקים בדקנו ( איור 3 C).

היכולת קולטנים upregulation ויוו של מערכת שלט הודגם גם על הגן Dnmt1 . הצגנו שני עותקים של האופרטור ט לתוך Dnmt1 המקדם, יחד עם לאק אופרטור רצפים, כדי לאפשר קולטנים upregulation או downregulation תלוי איזה אפקטור חלבון קיים. קולטנים upregulation חזקים, downregulation של הביטוי Dnmt1 , קרוב בשני סדרי גודל (10% עד 650%), הושגו ב ESCs המכיל אלל Dnmt1 אנדוגני ששונתה (Dnmt1LGT) (איור 4א)10 . תקנות הן היו הפיך באופן מלא inducible מאת IPTG Dox טיפולים, בהתאמה (איור 4א). לאחר מכן הצגנו את השינוי Dnmt1LGT לתוך germline העכבר כדי לבחון את יכולת קולטנים upregulation ויוו של מערכת שליטה מרחוק. קולטנים upregulation חזקה של Dnmt1 נצפתה מן הכבד, הטחול, הכליות, ואילו אין קולטנים upregulation לזיהוי בלב נצפתה (איור 4B)7. הדפוס תלויי-מחזור התא הביטוי של Dnmt1 ואת המחסור בתאי proliferative בלב עשויה ביסוד הזה10,תצפית56. זה נותר לראות אם מגבלה זו ניתן להתגבר על ידי הגדלת רמת ביטוי activator או מספר אתרי קישור שלה.

Figure 2
איור 2 : אין ויוו דיכוי של Dnmt1 על ידי מדכא. שבולם LacIGY. (א) עכברים עם מפעילי לאק (LO) מוכנס לתוך מקדם Dnmt1 , עם או בלי ביטוי של LacIGY, טופלו במינונים שונים של IPTG. ניתוח לרביעיית-PCR של הביטוי Dnmt1 מציגה היפוך למינון של דיכוי Dnmt1 ויוו באמצעות טיפול IPTG. כל עמודה מייצגת נתונים מעכבר שונים. נתונים מייצגים זאת אומרת ± SEM (n = 3). Immunostaining (B) של חלבון Dnmt1 באולמות חוקן של עכברים מסופקים מי שתייה עם או בלי 160 ממ IPTG למשך 3 שבועות. איור זה השתנה לי ואח10אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : אין ויוו ודיכוי במבחנה של היזמים השונים על ידי מערכת שלט. (א) גרסה מוקדמת של הרצף Repron (R *) הוכנס לתוך אינטרון במורד הזרם של האמרגן Villin ב Villin-mKate2 עכבר (VilmKate2). ניתוח לרביעיית-PCR של הביטוי mKate2 במעי הדק של עכברים עם או בלי מדכא. שבולם את LacIGY מוצג. כל עמודה מייצגת נתונים מעכבר שונים. (B) תמונות mKate2 קונאפוקלית של המעי הדק עם ובלי LacIGY הביטוי. (ג) 6 לאק סימטרי אופרטורים (S) הוכנסו בין היזמים השונים כתב לוציפראז. כתבים (50 ng/טוב בצלחת 96-ובכן), מדכא. שבולם פלסמידים הוצגו transiently לתאי NIH/3T3 ביחס 1:1 שן טוחנת. לוציפראז הערכים היו המוערך 24 שעות לאחר תרביות תאים. אלה נתונים במבחנה לייצג את אחוז לוציפראז ביטוי LacIGY-ביטוי תאים ביחס לאלה לבטא פונקציונלי לצי (NFlacI). T-בדיקות שימשו כדי לקבוע מובהקות סטטיסטית. נתונים מייצגים זאת אומרת ± SEM (n = 3). P ≤ 0.05, * *P ≤ 0.01. איור זה השתנה לי ואח10אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : למטה - ו/או קולטנים upregulation Dnmt1 הביטוי במבחנה, ויוו. (א) מערכת שליטה מרחוק שלמה היה מהונדסים ב ESCs בתרבית על ידי ג'ין מיקוד אלקטרופורציה גישות. דיכוי מקסימלי של ביטוי Dnmt1 הושגה עם שום טיפול בזמן הפעלה מקסימלי הושג על ידי טיפול IPTG והן Dox. נתונים מייצגים זאת אומרת ± SEM (n = 3). P ≤ 0.05, * *P ≤ 0.01 (של וולש t-בדיקות). (B) In vivo הפעלה של Dnmt1 על ידי מערכת שליטה מרחוק, כפי שמגלה immunostaining Dnmt1 החלבון ברקמות השונות של עכברים בשלט רחוק. אלל LGT מייצג מקדם שינוי של Dnmt1 להכיל אתרי קישור activator המפעיל לבין ט lac . עכברים טופלו בדיאטה רגילה או המכילים Dox (5000 מ"ג/ק"ג Hyclate דוקסיציקלין) למשך חודש אחד. איור זה השתנה לי ואח10אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Supplementary Figure 1
משלים איור 1 : דוגמה של נחיתה pad הכניסה לתוך Dnmt1 מאתר אינטרון 1. תיאור סכמטי של תבנית ה-DNA הנחיתה ההכנסה pad, משנת הקואדרוס et al. (2015)31(א). אתרים heterotypic loxP , JT15, Lox2272, המופרדים באמצעות רצף מרווח קצר (sp), ולצדו בכל צד 60-bp של ה-DNA זה הומולוגי לאזור היעד גנומית. (B) דגימת DNA תבנית הנחיתה pad הכניסה לתוך אינטרון Dnmt1 באמצעות את sgRNA הבאים: CTAGTACCACTCCTGTACCG (אשר מטרות סטרנד הפוכה). האזור intronic שנבחר היה bioinformatically הודיע על ידי צעד 1.1, sgRNA היה מזוהה באמצעות CRISPOR29. (ג) דוגמה PCR עיצוב תחל להערכת ההכנסה של המנחת. PCR תחל תוכננו מחוץ לזרועות הומולוגיה של התבנית כדי לאשר שילוב אנדוגני Dnmt1. אמפליקון PCR wildtype הוא 213 bp; בעת הכניסה, הוא הופך להיות 291 bp. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

שלב קריטי והגבלת פוטנציאל מערכת שליטה מרחוק הוא האתגר המשויך ההוספה מדכא. שבולם ו/או אתרי קישור activator מבלי להשפיע על ביטוי גנים היעד. הגישה דיכוי המקורי שלנו, כפי שהוא מיושם הגן Dnmt1 , מעורב ההכנסה של אתרי קישור מדכא. שבולם לאק בתוך אזורים transcriptionally קריטיים של מקדם מכירות. על מנת להפחית את הסיכון המשפיעים על תפקוד יזם ובכך כדי לשפר את תחולתה הכללית של מערכת שליטה מרחוק, פיתחנו גישה מבוססת-אינטרון הדיכוי. העוצמה של מערכת משופרת לאק שלנו מאפשרת לנו להדחיק בחוזקה שעתוק של כל היזמים חזקה. בדקנו-מפעילי הממוקם מאות מספר kilobases במורד הזרם של שעתוק להתחיל אתרים (איור 3A-C) 10. חשוב, הרמות של דיכוי היו עצמאיים. היתרונות תעתיק של היזמים (איור 3A-C)10. הדבר מצביע על כי הקיבולת דיכוי של המערכת שלנו מבוססת-אינטרון דיכוי חורגת הכוח תעתיק של היזמים שנבדקו. בגישה זו מבוססת-אינטרון, סביר כי הדיכוי מתווך דרך הפרעה פיזית בין שני מרכיבים, המכונות התארכות שעתוק של lac repressors57. מנגנון דיכוי פשוט זה ואת החוסן והפגינו של השיטה מבוססת-אינטרון עלול להפוך גישה זו חלים באופן כללי על גנים שונים, רקמות, ואת היצורים.

קולטנים upregulation על ידי מערכת שליטה מרחוק מחייבת את רצפי איגוד transactivator כדי להיות קרוב מקדם ג'ין היעד, אשר כרוך סיכון של להשפיע על תפקוד יזם. עם זאת, מצאנו כי העמדה של איגוד רצפים יכול להיות מחוץ לאזור transcriptionally קריטי. היזמים הן Dnmt1 והן EF1α היו robustly upregulated מ ט מפעילי ממוקם כמה מאות בסיסים במעלה הזרם של שעתוק התחלה אתרים10. אילוץ זה רגוע מקטינה באופן משמעותי את הסיכוי להשפיע על יזם פונקציה של גנים היעד בהיעדר transactivator. הגדלת מספר איגוד רצף ו/או השימוש transactivators חזק יותר יכול לעזור לצמצם עוד יותר את הסיכון על-ידי הפעלת קולטנים upregulation מכל אתרי יותר רחוק מן האתר התחלה שעתוק.

מערכת שליטה מרחוק שלנו מספק שליטה אלגנטי של רמה, תזמון, המיקום של ביטוי גנים אנדוגני, המאפשר בדיקה של הפיכות של הפנוטיפ ואת ההשלכות של רמות ביטוי שונה, אשר אינם ניתנים להשגה בקלות על ידי טכנולוגיות בקרת ביטוי גנים ויוו הנוכחי. חשוב לציין כי רוב בניתוח ביטוי גנים, כולל שלנו, ביטוי ערכים מייצגים את הממוצע של אוכלוסיית תאים וביניהם ניתן למצוא מגוון. הטרוגניות זו עשויים להשפיע הסלולר בתהליכי קבלת החלטות, כגון בידול או אפופטוזיס58. למרות הדיוק של בקרת ביטוי גנים יכולים סביר עוד יותר להשתפר על ידי הנדסה נוספים במעגל גנטי59, נצפתה עוצמת המערכת הנוכחית שלנו יאפשר שימושי חקירת פונקציה ג'ין בהקשרים ביולוגיים רבים. בנוסף, רמה גבוהה של ירידה לפרטים היעד צפוי בגלל המורכבות של הרצפים המפעיל, כמו גם המרחק אבולוציונית גדולה בין היונקים מינים שמקורם של רכיבים רגולטוריות60. יתר על כן, קווים העכבר הטרנסגניים של repressors, מפעילים יכולים להיות פיתח, מועסק בכל גן אנדוגני. לדוגמה, ניתן להתאים המודלים הקיימים של העכבר transactivator ט לבצע קולטנים upregulation של גנים היעד ברקמות העכבר הרצויה. לאחרונה פיתחנו קו הטרנסגניים יכול לנהוג רקמות ספציפיות חזקים, הבעת מדכא. שבולם שלנו לאק משופרת של מספר סוגי רקמות בשילוב עם שורות Cre קיימות על ידי החדרת הגן lacIGY לתוך מיקומה Hipp11 48 תחת השליטה של רכיב סלומון-עצור-לקס (לא פורסם). קו זה להקל באופן משמעותי היישום רקמות ספציפיות של מערכת שליטה מרחוק.

קולטנים upregulation הגן על ידי מערכת שלט מספקת מספר יתרונות בהשוואה לגישות הטרנסגניים inducible. . זה לא דורש דור של שורות מרובות הטרנסגניים כדי לבדוק את מיקום השפעת ההוספה, כאשר הוא מנצל את לוקוס אנדוגני. בנוסף, גישה זו הוא מתאים היטב קולטנים upregulation של גנים עם ביטוי בסיסית חזקה כי היא מגבירה ביטוי מ מקדם כבר חזקים, ואילו מודלים מהונדס קונבנציונאלי להסתמך על היזמים ויראלי מינימלי. לבסוף, הרקמה ירידה לפרטים, בקרה מחזור התא, החדרת וריאציות של גן היעד עשויות להישמר על קולטנים upregulation על ידי הגישה שלנו, כפי שומרת על אלמנטים של תקנה טבעיים כגון מולדת cis-אלמנטים רגולטוריות. כניסתו של CRISPR/Cas-מתווכת טכנולוגיה פילוח ג'ין יקל מאוד היישום של טכנולוגיה זו במערכות דגם מגוונות.

Disclosures

PWL מגישה על לוחות המייעצת המדעית של AnchorDx ו Progenity, inc.

Acknowledgments

אנו מודים Scrable היידי מאוחר את ד ר שלה מתנה נדיבה של הבונה ג'ין לצי יונקים (Mayo Clinic, רוצ'סטר, MN), ד ר דניאל Louvard (ובמכון קירי, פריז, צרפת) על מתן ייצוג המקדם Villin, ד ר לורי ג'קסון-Grusby (בית החולים לילדים, בוסטון, MA) תרומתו שלה בשלבים המוקדמים של התפתחות טכנולוגיה זו. אנחנו אסירי תודה על ד ר ננסי Wu וד ר רוברט מקסון לסיוע שלהם ביצירת העכברים הטרנסגניים ו נוקאאוט אנו מודים חברי המעבדה ליירד לדיונים מועיל ותמיכה. עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים [R01 CA75090 R01 DA030325, R01 CA157918, R01 CA212374 כדי P.W.L., 1F31CA213897-01A1 כדי N.A.V.S].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B6C3F1/J The Jackson Laboratory 100010 https://www.jax.org/strain/100010
Cas9 Protein PNA Bio CP04 http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE
CRISPOR Haeussler et al. 2016 http://crispor.tefor.net/
Doxycycline-Containing Mouse Diet Envigo Varies by concentration https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/
ENCODE Database Stanford University https://www.encodeproject.org/
iCre mRNA synthesis plasmid (pBBI) Addgene 65795 https://www.addgene.org/65795/
IPTG GoldBio I2481C https://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&q=iptg
pGL3-Basic Promega E1751 https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751
SVM-BPfinder Regulatory Genomics, Pompeu Fabra University http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/
TiProD: Tissue specific promoter Database Department of Bioinformatics, UMG, University of Göttingen  http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de
UCSC Genome Browser University of California Santa Cruz https://genome.ucsc.edu/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jackson-Grusby, L., et al. Loss of genomic methylation causes p53-dependent apoptosis and epigenetic deregulation. Nature Genetics. 27 (1), 31-39 (2001).
  2. David, G., Turner, G. M., Yao, Y., Protopopov, A., DePinho, R. A. mSin3-associated protein, mSds3, is essential for pericentric heterochromatin formation and chromosome segregation in mammalian cells. Genes & Development. 17 (19), 2396-2405 (2003).
  3. Sumi-Ichinose, C., Ichinose, H., Metzger, D., Chambon, P. SNF2beta-BRG1 is essential for the viability of F9 murine embryonal carcinoma cells. Molecular and Cellular Biology. 17 (10), 5976-5986 (1997).
  4. Premsrirut, P. K., et al. A rapid and scalable system for studying gene function in mice using conditional RNA interference. Cell. 145 (1), 145-158 (2011).
  5. Qiu, S., Adema, C. M., Lane, T. A computational study of off-target effects of RNA interference. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1834-1847 (2005).
  6. Gilbert, L. A., et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  7. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
  8. Peng, H., Ivanov, A. V., Oh, H. J., Lau, Y. F., Rauscher, F. J. Epigenetic gene silencing by the SRY protein is mediated by a KRAB-O protein that recruits the KAP1 co-repressor machinery. The Journal of Biological Chemistry. 284 (51), 35670-35680 (2009).
  9. Groner, A. C., et al. KRAB-zinc finger proteins and KAP1 can mediate long-range transcriptional repression through heterochromatin spreading. PLOS Genetics. 6 (3), 1000869 (2010).
  10. Lee, K. H., Oghamian, S., Park, J. A., Kang, L., Laird, P. W. The REMOTE-control system: a system for reversible and tunable control of endogenous gene expression in mice. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12256-12269 (2017).
  11. Gossen, M., Bonin, A. L., Bujard, H. Control of gene activity in higher eukaryotic cells by prokaryotic regulatory elements. Trends in Biochemical Sciences. 18 (12), 471-475 (1993).
  12. Hu, M. C., Davidson, N. The inducible lac operator-repressor system is functional in mammalian cells. Cell. 48 (4), 555-566 (1987).
  13. Cronin, C. A., Gluba, W., Scrable, H. The lac operator-repressor system is functional in the mouse. Genes & Development. 15 (12), 1506-1517 (2001).
  14. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  15. Council, N. R. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition. , The National Academies Press. (2011).
  16. Casper, J., et al. The UCSC Genome Browser database: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46 (1), 762-769 (2018).
  17. Church, D. M., et al. Lineage-specific biology revealed by a finished genome assembly of the mouse. PLOS Biology. 7 (5), 1000112 (2009).
  18. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  19. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  20. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nature Genetics. 39 (3), 311-318 (2007).
  21. Rada-Iglesias, A., et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
  22. Handoko, L., et al. CTCF-mediated functional chromatin interactome in pluripotent cells. Nature Genetics. 43 (7), 630-638 (2011).
  23. Splinter, E., et al. CTCF mediates long-range chromatin looping and local histone modification in the beta-globin locus. Genes & Development. 20 (17), 2349-2354 (2006).
  24. The ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  25. Rosenbloom, K. R., et al. ENCODE data in the UCSC Genome Browser: year 5 update. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 56-63 (2013).
  26. Murray, J. I., Voelker, R. B., Henscheid, K. L., Warf, M. B., Berglund, J. A. Identification of motifs that function in the splicing of non-canonical introns. Genome Biology. 9 (6), 97 (2008).
  27. Taggart, A. J., et al. Large-scale analysis of branchpoint usage across species and cell lines. Genome Research. 27 (4), 639-649 (2017).
  28. Corvelo, A., Hallegger, M., Smith, C. W., Eyras, E. Genome-wide association between branch point properties and alternative splicing. PLOS Computational Biology. 6 (11), 1001016 (2010).
  29. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  30. Grainger, S., et al. CRISPR Guide RNA Validation In Vitro. Zebrafish. 14 (4), 383-386 (2017).
  31. Quadros, R. M., Harms, D. W., Ohtsuka, M., Gurumurthy, C. B. Insertion of sequences at the original provirus integration site of mouse ROSA26 locus using the CRISPR/Cas9 system. FEBS Open Bio. 5, 191-197 (2015).
  32. Harms, D. W., et al. Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System. Current Protocols in Human Genetics. 83, (2014).
  33. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13 (1), 195-215 (2018).
  34. Laird, P. W., et al. Simplified mammalian DNA isolation procedure. Nucleic Acids Research. 19 (15), 4293 (1991).
  35. Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology. 36 (8), 765-771 (2018).
  36. Akcakaya, P., et al. In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations. Nature. 561 (7723), 416-419 (2018).
  37. Lazzarotto, C. R., et al. Defining CRISPR-Cas9 genome-wide nuclease activities with CIRCLE-seq. Nature Protocols. 13 (11), 2615-2642 (2018).
  38. Ohtsuka, M., et al. Improvement of pronuclear injection-based targeted transgenesis (PITT) by iCre mRNA-mediated site-specific recombination. Transgenic Research. 22 (4), 873-875 (2013).
  39. Ohtsuka, M., et al. Pronuclear injection-based mouse targeted transgenesis for reproducible and highly efficient transgene expression. Nucleic Acids Research. 38 (22), 198 (2010).
  40. Lee, G., Saito, I. Role of nucleotide sequences of loxP spacer region in Cre-mediated recombination. Gene. 216 (1), 55-65 (1998).
  41. Thomson, J. G., Rucker, E. B., Piedrahita, J. A. Mutational analysis of loxP sites for efficient Cre-mediated insertion into genomic DNA. Genesis. 36 (3), 162-167 (2003).
  42. Cho, A., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. Generation of Transgenic Mice. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter Unit-19.11 (2009).
  43. Pu, X. A., Young, A. P., Kubisch, H. M. Production of Transgenic Mice by Pronuclear Microinjection. Methods in Molecular Biology. 1874, 17-41 (2019).
  44. Murgha, Y., et al. Combined in vitro transcription and reverse transcription to amplify and label complex synthetic oligonucleotide probe libraries. Biotechniques. 58 (6), 301-307 (2015).
  45. Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18 (1), 92 (2017).
  46. Chen, X., Wu, J. M., Hornischer, K., Kel, A., Wingender, E. TiProD: the Tissue-specific Promoter Database. Nucleic Acids Research. 34, Database issue 104-107 (2006).
  47. Haruyama, N., Cho, A., Kulkarni, A. B. Overview: Engineering transgenic constructs and mice. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter Unit-19.10 (2009).
  48. Tasic, B., et al. Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7902-7907 (2011).
  49. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
  50. Wyborski, D. L., DuCoeur, L. C., Short, J. M. Parameters affecting the use of the lac repressor system in eukaryotic cells and transgenic animals. Environmental and Molecular Mutagenesis. 28 (4), 447-458 (1996).
  51. Wyborski, D. L., Short, J. M. Analysis of inducers of the E.coli lac repressor system in mammalian cells and whole animals. Nucleic Acids Research. 19 (17), 4647-4653 (1991).
  52. Traykova-Brauch, M., et al. An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice. Nature Medicine. 14 (9), 979-984 (2008).
  53. Michel, G., Mosser, J., Fauran, F. Serum kinetics of doxycycline polyphosphate in dogs. European Journal of Drug Metabolism and Pharmacokinetics. 4 (1), 43-48 (1979).
  54. Bertocchi, I., et al. Regulatory functions of limbic Y1 receptors in body weight and anxiety uncovered by conditional knockout and maternal care. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19395-19400 (2011).
  55. Plageman, T. F., Lang, R. A. Generation of an Rx-tTA: TetOp-Cre knock-in mouse line for doxycycline regulated Cre activity in the Rx expression domain. PLOS One. 7 (11), 50426 (2012).
  56. Mollova, M., et al. Cardiomyocyte proliferation contributes to heart growth in young humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1446-1451 (2013).
  57. Ptashne, M. Principles of a switch. Nature Chemical Biology. 7 (8), 484-487 (2011).
  58. Balazsi, G., van Oudenaarden, A., Collins, J. J. Cellular decision making and biological noise: from microbes to mammals. Cell. 144 (6), 910-925 (2011).
  59. Nevozhay, D., Zal, T., Balazsi, G. Transferring a synthetic gene circuit from yeast to mammalian cells. Nature Communications. 4, 1451 (2013).
  60. Labow, M. A., Baim, S. B., Shenk, T., Levine, A. J. Conversion of the lac repressor into an allosterically regulated transcriptional activator for mammalian cells. Molecular and Cellular Biology. 10 (7), 3343-3356 (1990).

Tags

גנטיקה גיליון 145 שעתוק ביטוי זאזא מדכא. שבולם לאק ט activator Dnmt1 דיכוי הכונה inducible
In vivo היישום של מערכת שליטה מרחוק עבור הביטוי מניפולציה של ג'ין אנדוגני
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vander Schaaf, N. A., Oghamian, S.,… More

Vander Schaaf, N. A., Oghamian, S., Park, J. A., Kang, L., Laird, P. W., Lee, K. H. In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression. J. Vis. Exp. (145), e59235, doi:10.3791/59235 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter