Method Article

Assaying בוויסות מעגל ספציפי של היפוקמאל מבוגרים תאים מקודמן עצבי

DOI:

10.3791/59237

⸱

July 24th, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of North Carolina Chapel Hill, 2Neuroscience Center, University of North Carolina Chapel Hill, 3Neuroscience Curriculum, University of North Carolina Chapel Hill

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר גישה לניתוח התנהגות של מבוגרים בתאי גזע/מחולל קדמון בתגובה לטיפול כימוגנטי של מעגל מקומי ספציפי עצביים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוירוגנזה למבוגרים הוא תהליך דינמי שבו הופעל לאחרונה תאי גזע עצביים (NSCs) באזור תת-החוליות (sgz) של פיתול כישור מבית (DG) ליצור נוירונים חדשים, אשר משתלבים לתוך המעגל העצבי הקיים ולתרום פונקציות היפוקאמאל ספציפיים . חשוב מכך, נוירוגנזה מבוגרת היא רגישה מאוד לגירויים סביבתיים, המאפשרת רגולציה תלוית הפעילות של פונקציות קוגניטיביות שונות. מגוון רחב של מעגלים עצביים מאזורי מוח שונים מתזמרים פונקציות קוגניטיביות מורכבות אלה. לכן חשוב להבין כיצד מעגלים עצביים ספציפיים לווסת נוירוגנזה למבוגרים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לתמרן פעילות המעגל העצבי באמצעות קולטן מעצב מופעל באופן בלעדי על ידי תרופות מעצב (ראסטות) טכנולוגיה המסדיר NSCs ו צאצאי היילוד במכרסמים. פרוטוקול מקיף זה כולל הזרקת סטריאוטקאית של חלקיקים ויראליים, גירוי גנטי כימוע של מעגלים עצביים ספציפיים, מינהל אנלוגי של תימידין, עיבוד רקמות, מimmunofluorescence תיוג, הדמיה מיקוד, והדמיה ניתוח של בשלבים שונים של תאים מקודמי העצבי. פרוטוקול זה מספק הוראות מפורטות על טכניקות אחזור אנטיגן המשמש להמחיש NSCs וצאצהם ומתאר פשוט, דרך יעילה עדיין לווסת את מעגלי המוח באמצעות קלוזאפין N-תחמוצת (cno) או cno-המכיל מי שתייה ו וירוסים בהבעת הדרדים. החוזק של פרוטוקול זה טמון ביכולת הסתגלות שלה ללמוד מגוון רחב של מעגלים עצביים המשפיעים על נוירוגנזה מבוגרת נגזר מ NSCs.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוירוגנזה למבוגרים הוא תהליך ביולוגי שדרכו הנוירונים החדשים נולדים במבוגר ומשולבים לתוך הרשתות העצביות הקיימות1. בבני אדם, תהליך זה מתרחש בפיתול הדנאט (DG) של ההיפוקמפוס, שם כ-1,400 תאים חדשים נולדים כל יום2. תאים אלה נמצאים בחלק הפנימי של ה-DG, אשר הנמלים נישה נוירוגניים, כינה את האזור התת בגרגרים (SGZ). כאן, תאי גזע עצביים מבוגרים (NSCs) עוברים תהליך התפתחותי מורכב כדי להפוך נוירונים תפקודית לחלוטין כי לתרום לוויסות של פונקציות המוח ספציפיים, כולל למידה וזיכרון, רגולציה מצב הרוח, ואת תגובת הלחץ3 ,4,5,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים כולל נושאי בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) באוניברסיטת צפון קרוליינה היל.

1. הזרקת סטריאוטקאית של חלקיקים ויראליים

  1. . קבע את המעגלים העצביים האלה זה יקבע את הווירוס ואת קו העכבר מנוצל עבור ההליך הבא.
    הערה: בדוגמה זו, התחזיות תא מוסי צלעות מושלכות לנתח את השפעותיו על נוירוגנזה למבוגרים. ויראלי חלקיקים קידוד AAV5-hSyn-דיו-hM3Dq-mCherry מועברים DG של 5ht2A-יצור עכברים15.
  2. מנהל מלוקסיאם (5 מ"ג/ק"ג, תת-עורי) לפחות 30 דקות מראש כדי לספק משככי כאבים מראש לזכר בן 8 שבועות heterozygous בעכבר 5ht2A.
  3. הניחו את העכבר בתערובת חמצן באורך 4% ע....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעקבות ההליכים הניסיוניים שתוארו לעיל (איור 1A,B), הצלחנו לקבוע את ההשפעות של עירור התחזיות תא מוסי הצלעות על הנישה הנוירוגניים בתוך ההיפוקמפוס. על-ידי ניצול של היצורים התלויים ביצור-מצמידים וירוס המגרה בשילוב עם מכשיר הקשר של תא מוסי 5-HT2A-קו, היינו מסוגלים באופן סלקטיבי הפעלה של התחזיות הגירוי מתאי מוסי על ה-DG הצלעות וקבע כי תא מוסי חזק גירוי תא גזע הקודם השקט (איור 1C). אנו מאומתים משלוח נגיפי מדויק לפני ניתוח רקמות (אי.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה של פרוטוקול זה היא להעריך כיצד מניפולציה מעגלים עצביים ספציפיים מסדיר נוירוגנזה היפוקאמאל למבוגרים בvivo באמצעות סדרה של טכניקות אימונוהיסטוכימיה. שיטה התלויה בוויסות הפעילות של בוגרים נוירוגנזה באמצעות מעגלים עצביים ספציפיים היא טכניקה רבת ערך עם פוטנציאל רב לשינויים לחקר מגוון רחב של מעגלים עצביים. ההצלחה של סוגים אלה של ניסויים תלוי בגורמים מרובים כולל משלוח נגיפי מדויק, הבחירה הנגיפית הנכונה עבור המניפולציה הרצויה, המסירה הנכונה של אנמיטין אנלוגי, בעלי חיים גיל, היעילות חיסוני, מוצלח וכימות בלתי משוחדת של תמונו.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L.J.Q. היה נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות הנפש של המוסדות הלאומיים לבריאות תחת התוספת גיוון R01MH111773, כמו גם מענק הכשרה T32 T32NS007431-20. פרויקט זה נתמך ממענקים הוענק ל-י. ס. י. מ-NIH (MH111773, AG058160, ו NS104530).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
24 צלחתבאר תרמו פישר סיינטיפיק07-200-84
48 צלחתבאר דנוויל סיינטיפיקT1049
5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין (אדו)קרבוסינת'NE08701
אלכוהול 70% איזופרופילתרמו פישר סיינטיפיק64-17-5
רפידות הכנה לאלכוהולתרמו פישר סיינטיפיק13-680-63
Alexa-488 AzideThermo Fisher ScientificA10266
Anti-Chicken NestinAvesNES; RRID: AB_2314882
נגד עזים DCXסנטה קרוזחתול# SC_8066; RRID: AB_2088494
נגד עכבר Tbr2Thermo Fisher Scientific14-4875-82; RRID: תמיסת
(פובידון-יוד)
[0.1M] חומצת לימון (21 גרם/ליטר חומצת לימון)סיגמא-אולדריץ'251275
קלוזפין N- תחמוצתסיגמא-אולדריץ'C08352-5MG
תוכנה קונפוקלית (Zen Black)Zeiss MicroscopyZen 2.3 SP1 FP1 (שחור)
נחושת (II) סולפט PentahydrateThermo Fisher ScientificAC197722500
Cotton SwabsAmazon
CoverslipDenville ScientificM1100-02
עדין משימה לנגב KimwipesKimtech Science7557
מקדחה 0.5 מ"מFine ScienceTools 19007-05
אתילן גליקולתרמו פישר סיינטיפיקE178-1
מחט המילטון 2 אינץ'חברת Hmailton7803-05
מזרק המילטון 5 μ L דגם 75 RNHmailton מספר חברה: 87931
מקדחה במהירות גבוההForedom1474
משאבת עירוימכשיר הרווארד70-4511
תמיסת מלח להזרקהMountainside Health CareNDC 0409-4888-20
מזרק אינסוליןBD מזרקי
IsofluraneHenry Schein29405
Stereotax לבעלי חיים קטניםמכשירי KOPFדגם 942
Leica M80Leica
Leica MicrotomeLeicaSM2010 R
LSM 780Zeiss Microscopy
Nair (מוצר להסרת שיער)Nair
Paraformaldahyde 4%Sigma-Aldrich
פלוס טעון שקופיותדנוויל סיינטיפיקM1021
תמיסה מאגר פוספט (PBS)תרמו פישר מדעי10010031
Puralube וטרינר משחהPuralube
מתלה שקופיות 20 יחידת שקופיותמיקרוסקופיה מדע70312-24
מחזיק מתלה שקופיותאלקטרונים מיקרוסקופיה מדע70312-25
כרית חימום לבעלי חיים קטניםK&
SucroseSigma-AldrichS0389
Super PAP Pen 4 מ"מ קצהPolySciences24230
אזמל כירורגיMedPride47121
Tris Buffered Solution (TBS)Sigma-AldrichT5912
טרי-סודיום ציטראט מלאי [0.1 M] טרי-נתרן ציטראט (29.4 גרם/ליטר טרי-נתרן ציטראט)סיגמא-אולדריץ'C8532
Triton X-100Sigma-Aldrich93443
פינצטהאמזון
וטרינר בונד3M1469SB
בטדין AB_11042577 מלאי חומצה ציטירית אמזון אינסולין עדינים במיוחד158127 אלקטרונים H דבק רקמות

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132 (4), 645-660 (2008).
  2. Spalding, K. L., et al. Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans. Cell. 153 (6), 1219-1227 (2013).
  3. Hill, A. S., Sahay, A., Hen, R.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Adult NeurogenesisNeural Stem CellsDREADDs TechnologyStereotaxic InjectionChemogenetic StimulationThymidine AnalogImmunofluorescence LabelingConfocal ImagingAntigen RetrievalMossy Cells

Related Articles