Summary
وهنا، فإننا نقدم مجموعة موحدة من البروتوكولات لمراقبة ناصف العين متفوقة، بنية حددت مؤخرا، وحفظت تقحم في عين الفقاريات. استخدام اليرقات الزرد، علينا أن نظهر التقنيات اللازمة لتحديد العوامل التي تسهم في تشكيل وإغلاق ناصف العين متفوقة.
Abstract
الثلامه العين الخلقية هو اضطراب وراثي هو عادة ما يحتفل فيه المشقوق في الجانب السفلي العين الناجمة عن الإغلاق الشق شرويد غير مكتملة. مؤخرا، تحديد هوية الأفراد مع الثلامه في الجانب متفوقة القزحية والشبكية، والعدسة التي أدت إلى اكتشاف بنية الرواية، يشار إلى الشق متفوقة أو متفوقة ناصف العين (SOS)، موجود عابر على الظهرية جانب كأس البصرية أثناء تطوير عين الفقاريات. على الرغم من أن هذا الهيكل هو حفظت عبر نيوت والأسماك، الفئران والفرخ، يقتصر فهمنا الحالي للاستغاثة. من أجل توضيح العوامل التي تسهم في تشكيل والإغلاق، يتحتم أن تكون قادرة على الاحتفال به وتحديد شذوذ، مثل التأخير في إقفال SOS. هنا، نحن المبينة لإنشاء مجموعة موحدة من البروتوكولات التي يمكن استخدامها بكفاءة عن طريق الجمع بين تقنيات الفحص المجهري متاحة على نطاق واسع مع تقنيات البيولوجيا الجزيئية المشتركة مثل تلطيخ إيمونوفلوريسسينت ومرناً تصور SOS أوفيريكسبريشن. بينما يركز هذا المجموعة من البروتوكولات على القدرة على مراقبة تأخير إغلاق SOS، هو يتكيف مع احتياجات المجرب ويمكن تعديلها بسهولة. وعموما، نأمل أن إنشاء أسلوب ودود من خلالها يمكن المتقدم فهمنا للاستغاثة توسيع المعارف الراهنة للتنمية عين الفقاريات.
Introduction
تشكيل العين الفقاريات هي عملية عالية مصانة التي تحدد أنواع الأنسجة مدبرة بعناية من مسارات الإشارات بين الخلايا وتحديد الهوية الإقليمية1. الاضطرابات إلى أوائل العين morphogenesis ينتج عيوب عميقة على بنية العين، وهي التي كثيرا ما تسبب العمى2. واحد مثل هذا المرض نتيجة لعدم إغلاق الشق العين تشورويد في الجانب البطني من كأس البصرية3. ويقدر هذا الاضطراب، المعروفة باسم الثلامه العين، تحدث في 1 من أصل 4-5000 مولود والسبب 3-11% من العمى طب الأطفال، يظهر عادة كبنية مثل ثقب المفتاح الذي يبرز إينفيريورلي من التلميذ في مركز العين4، 5،6. وظيفة الشق شرويد توفير نقطة انطلاق للمفرج المبكر المتزايد في كأس البصرية، بعد ذلك سوف الصمامات على جانبي الشق أن أرفق سفن7.
بينما كان معروفا الثلامه العين منذ العصور القديمة، لقد حددنا مجموعة فرعية جديدة من المرضى الثلامه مؤخرا مع فقدان الأنسجة التي تؤثر على الجانب الأعلى/الظهرية للعين. عمل مؤخرا في مختبر لدينا أدت إلى اكتشاف بنية العين بالعين الظهرية الزرد، والتي نشير إلى أنها متفوقة ناصف العين (SOS) أو شرخ متفوقة8. من المهم أن نلاحظ أن البنية خصائص ناصف والشق. شبيه ناصف، أنها طبقة نسيج مستمر الذي يمتد من الآنف أن الشبكية الزمانية. وباﻹضافة إلى ذلك، إغلاق الهيكل هو عدم توسط مزيجاً من اثنين يعارضان الغشاء، ويبدو أنها تتطلب عملية مورفوجينيتيك التي يسكنها الهيكل الخلايا. ومع ذلك، شبيه الشق، وأنها تشكل هيكل الذي يفصل بين جانبي الآنف والزمانية العين الظهرية مع الغشاء الطابق السفلي. للاتساق، سنشير إليها كاستغاثة في هذا النص.
SOS هو يحافظ تقحم عبر الفقاريات، يجري مرئية أثناء morphogenesis العين في الأسماك، والفرخ، نيوت، والماوس8. خلافا للشق شرويد، الذي موجود من 20-60 ساعة بعد الإخصاب (hpf) في الزرد، الغاية عابرة، يجري مرئية بسهولة من 20-23 هبف SOS وغائبة من 26 هبف8. قد وجدت البحوث التي أجريت مؤخرا في مختبر لدينا، مماثلة للشق choroid, SOS يلعب دوراً في توجيه الأوعية الدموية خلال العين morphogenesis8. على الرغم من أن العوامل التي تتحكم في تشكيل وإغلاق SOS لا يفهم تماما بعد من، سلطت الضوء على البيانات المتوفرة لدينا أدوار للعين الظهرية البطني الزخرفة الجينات8.
الزرد كائن حي نموذجا ممتازا لدراسة SOS. كنظام نموذجي، ويوفر عددا من المزايا في دراسة التنمية العين: نموذج فقاريات؛ كل جيل يسلك خصوبة عالية (~ 200 الأجنة)؛ أن الجينوم قد تم تماما متتابعة، مما يسهل التلاعب بالجينات؛ وحوالي 70% جينات البشرية أورثولوجوي الزرد واحد على الأقل، مما يجعل من نموذج مثالي المستندة إلى علم الوراثة من الأمراض البشرية9،10. الأهم من ذلك، تنميته تأخذ مكان خارجياً للأم، ولها يرقات تتسم بالشفافية، مما يسمح لتصور العين النامية بسهولة نسبية11.
في هذه المجموعة من البروتوكولات، يصف لنا التقنيات التي من خلالها يمكن تصور SOS في الزرد اليرقات. تسمح مجموعة متنوعة تقنيات التصوير المستخدمة في هذا التقرير الملاحظة واضحة للاستغاثة أثناء تطوير العين العادية، وكذلك القدرة على اكتشاف العيوب الإغلاق SOS. لدينا بروتوكولات المثال سوف تتميز بتحقيقات Gdf6، بمب المترجمة إلى الظهرية العين ومنظم المعروفة للإغلاق SOS. علاوة على ذلك، يمكن الجمع بين هذه التقنيات مع المعالجات التجريبية لتحديد العوامل الوراثية أو وكلاء الدوائية التي تؤثر على تشكيل SOS السليم والإغلاق. وباﻹضافة إلى ذلك، أدرجنا بروتوكول الممكن من خلالها التصوير الفلورسنت جميع أغشية الخلايا، السماح المجرب لمراقبة التغيرات المورفولوجية للخلايا المحيطة الاستغاثة. أن هدفنا هو إنشاء مجموعة من بروتوكولات موحدة يمكن استخدامها في جميع أنحاء المجتمع العلمي لتقديم رؤى جديدة في هذا الهيكل رواية العين النامية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الأساليب الموصوفة هنا أقرتها جامعة ألبرتا رعاية الحيوان واستخدام اللجنة.
1-البروتوكول 1: التصور للاستغاثة باستخدام ستيريوميكروسكوبي وتصوير التباين (DIC) التدخل التفاضلية
- جمع الجنين
- في خزان مياه الكلور، إعداد الصلبان من gdf6a+/- الزرد في المساء بالاقتران من الزرد ذكور مع الزرد الإناث. يجب التأكد من فصل الذكور عن الإناث باستخدام مقسم إلى ضمان أن الأجنة يولدون داخل مجموعة صغيرة من الوقت.
- في صباح اليوم التالي، سحب الفاصل وتسمح الزرد إلى تولد للم يعد من 30 دقيقة جمع الأجنة في أطباق بتري مع وسائل الإعلام E3، الموصوفة في12من كتاب الزرد، ووضعها في حاضنة 28.5 درجة مئوية.
- قم بإزالة أي البيض المخصبة أو أجنة ميتة، التي سوف تظهر بيضاء وغير شفاف.
- إعداد وتصوير يعيش الأجنة الزرد
- في 20 هبف، استبدال E3 وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام E3 تتضمن 0.004% 1-فينيل-2 ال (PTU) لمنع إنتاج الصباغ.
ملاحظة: إضافة PTU في تيميبوينت لاحق قليلاً، مثل هبف 22-24، من غير المحتمل أن تتداخل مع هذه التجربة بسبب السن المبكرة للأجنة في وقت التصوير. ومع ذلك، من المستحسن لعلاج الأجنة المبكر لمنع تصبغ تماما كما أن هناك عصابة من التصبغ الذي يظهر في العين الظهرية، والتي يمكن أن تتداخل مع تصوير SOS. - ضمان أن جميع الأجنة في المراحل التنموية الصحيحة في مختلف النقاط المؤدية إلى الوقت للمراقبة. من المستحسن أن يتم ذلك على المراحل في سوميتي الذي رقم مرئية بوضوح كما حددها كيميل et al.13. قم بإزالة تلك التي غير ناضجة تنمويا.
- وضع الأجنة تحت مجهر تشريح، وديتشوريوناتي الأجنة عن طريق سحب بلطف إلى جانب المشيمة استخدام الملقط غرامة. تصور SOS في العين الظهرية. قد تظهر SOS المسافة بادئة في الحافة الظهرية للعين، وينبغي أن يكون خط مرئي عبر العين الظهرية. لإغلاق SOS، العادية ومراقبة الأجنة في جميع أنحاء هبف 20-23. لفحص SOS تأخر الإغلاق تعمل، مراقبة الأجنة في 28 هبف أو في وقت لاحق.
- فرز الأجنة تظهر تأخير إغلاق استغاثة من تلك التي لم تفعل ذلك.
- لتصوير هذه الأجنة باستخدام مجهر تشريح، تحضير طبق بتري يحتوي على 1% [اغروس] في E3. وخز وسط [اغروس] لخلق ثقب ضحلة التي يمكن الجلوس صفار البيض للجنين عندما يتم وضع الجنين على [اغروس] إصابات طفيفة. وهذا سيضمن أن الجنين ليس بزاوية مائلة عندما يجري تصويرها.
- تخدير الأجنة مع تريكايني 0.003% في E3 وأفقيا على [اغروس].
- الصورة في الأجنة استخدام مجهر مركب أو [كنفوكل]، نقل الجنين إلى 35 ملم طبق بتري يحتوي على بولس صغيرة لعدم تبلور 1% ذوبان منخفضة نقطة [اغروس] في E3 (w/v). بسرعة وضع الجنين أفقياً باستخدام خط صيد غرامة أو جفن وانتظر [اغروس] لتبرد. مرة واحدة [اغروس] الراسخ، صب ما يكفي E3 في الطبق لتغطية [اغروس]. للحصول على مزيد من التفاصيل، انظر ديستيل و Köster14.
ملاحظة: إذا كان استخدام مجهر مقلوب، الجنين يمكن وضعها ضد الزجاج صحن زجاج-ساترة-أسفل وتصويرها مع 20 قياسية X عدسة موضوعية. - استخدام عدسة هدف 20 x غمر مياه لتصور SOS مع مجهر المركب. بعد التصور، سحب [اغروس] من الأجنة بلطف وإصلاح في بارافورمالدهيد 4% (PFA) أو السماح بمواصلة تنميتها.
- في 20 هبف، استبدال E3 وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام E3 تتضمن 0.004% 1-فينيل-2 ال (PTU) لمنع إنتاج الصباغ.
2-البروتوكول 2: الجامع-جبل تلطيخ إيممونوفلوريسسينت من لامينين
- الجامعة-جبل تلطيخ إيممونوفلوريسسينت من لامينين: 1 يوم
- ديتشوريوناتي الأجنة كما هو موضح في الخطوة 1.2.3، إذا لم تكن قد فعلت. إصلاح الأجنة في أنبوب ميكروسينتريفوجي في تيميبوينت المرجوة في تقدم طازجة 4% منهاج عمل بيجين ح 2 على شاكر درجة حرارة الغرفة (22-25 درجة مئوية). أغسل في 1 x PBST لمدة 5 دقائق، أربع مرات.
ملاحظة: بعد جاستروليشن، الأجنة قد حل أفضل بعد ديتشوريونيشن. - بيرميبيليزي الأجنة في بروتيناز 10 ملغ/مل ك في درجة حرارة الغرفة لوقت الحضانة 5 دقيقة سيتوقف على مرحلة النمو التي يتم إصلاحها في الأجنة (انظر ثيسي وثيسي15).
- أغسل في 1 x PBST لمدة 5 دقائق، أربع مرات.
- كتلة الأجنة في حل من 5% الماعز 2 مغ/مل والمصل البقري ألبومين المصل (BSA) في 1xPBST ح 1-2 على شاكر درجة حرارة الغرفة.
- إعداد حل جسم الأولية بإذابة جسم الأرنب laminin المضادة في كتلة الحل في إضعاف 1: 200.
- تبني الأجنة في جسم laminin مكافحة الأولية بين عشية وضحاها في شاكر 4 درجات مئوية.
- ديتشوريوناتي الأجنة كما هو موضح في الخطوة 1.2.3، إذا لم تكن قد فعلت. إصلاح الأجنة في أنبوب ميكروسينتريفوجي في تيميبوينت المرجوة في تقدم طازجة 4% منهاج عمل بيجين ح 2 على شاكر درجة حرارة الغرفة (22-25 درجة مئوية). أغسل في 1 x PBST لمدة 5 دقائق، أربع مرات.
- الجامعة-جبل تلطيخ إيممونوفلوريسسينت من لامينين: 2 يوم
- أغسل في 1 x PBST لمدة 15 دقيقة، خمس مرات.
- إعداد حل جسم الثانوية بتمييع الماعز الأرنب المضادة الأجسام المضادة أليكسا فلور 488 في 1 x PBST إلى إضعاف 1: 1000.
ملاحظة: من الممكن للتكيف مع هذه الخطوة التي تتناسب مع الموارد المتاحة المجرب باستخدام جسم ثانوية مختلفة. - تبني الأجنة في جسم الثانوي بين عشية وضحاها في شاكر 4 درجات مئوية. درع من الضوء قدر الإمكان من هذه الخطوة فصاعدا.
- أغسل في 1 x PBST لمدة 15 دقيقة، أربع مرات. ويمكن تخزين الأجنة عند 4 درجة مئوية لتصل إلى أسبوع، إذا لزم الأمر.
- تشريح وتركيب عيون الجنينية
- إذا رغبت في ذلك، بوضع الأجنة في طبق بتري صغيرة وديلك الأجنة في 1 x PBST. القيام بذلك بتعطيل الصفار مع الملقط غرامة بلطف وإزالة الخلايا صفار البيض من خلال إلغاء معتدل من كيس ألمح.
- تحضير التركيزات التالية من برنامج تلفزيوني والغليسيرول سلسلة الحلول في أنابيب ميكروسينتريفوجي: والغليسيرول 30%، 50% و 70% في برنامج تلفزيوني. نقل الأجنة إلى 30% والغليسيرول/برنامج تلفزيوني، مع التأكد من وضع الأجنة على رأس الحل ونقل القليل من الحل السابق قدر الإمكان. الانتظار للأجنة تنزل إلى الجزء السفلي من الأنبوب.
- عند الأجنة قد غرقت إلى الأسفل، نقلها إلى 50% والغليسيرول/برنامج تلفزيوني. تكرار ونقل إلى 70% والغليسيرول/برنامج تلفزيوني.
- وبمجرد الأجنة قد غرقت في 70% والغليسيرول/برنامج تلفزيوني، نقلها إلى طبق بلاستيكية صغيرة لتشريح.
- قطع الجنين الخلفي إلى هيندبرين، واستخدام الأنسجة الخلفي للتنميط، إذا لزم الأمر.
- نقل الرأس إلى شريحة زجاجية، نقل والغليسيرول قليلة قدر الإمكان. استخدام الملقط أو غيرها من أدوات تشريح غرامة للتمسك بالنهاية الخلفية لإبقاء رأسه ثابتة. استخدام pin مينوتين غرامة أو أدوات تشريح غرامة أخرى لإدراج في البطين فوريبراين من الأمامية برفق ودفع إلى الأسفل لفصل النصفين الأيمن والأيسر من الرأس من بعضها البعض. كرر هذا الإجراء أثناء نقل جيدة من خلال midbrain وفي البطين هيندبرين، أساسا فيليتينج الرأس إلى أسفل خط الوسط. وهذا يقلل من التلاعب اليدوي للعين والأنسجة المحيطة بها، مما يترك SOS غير التالفة.
- يتصاعد كل من جانبي خط الوسط الرأس إلى أسفل العين. موقف أربعة وظائف للشحوم فراغ في الزوايا (مناسبة مسافة وبصرف النظر عن ساترة المستخدمة) وتغطية مع ساترة زجاجية، دفع أسفل التسلسل في كل وظيفة حتى ساترة يجعل الاتصال مع العينات. "الماصة؛" والغليسيرول 70% على حافة ساترة حيث أن يتم سحبها في والغليسيرول تحتها، ملء الفضاء بين ساترة والشريحة.
- الصور عينات خلال يوم واحد، أو ختم حول ساترة مع طلاء الأظافر وعينات صورة إلا بعد طلاء الأظافر قد جفت. تخزين في الظلام في 4 درجات مئوية.
3-بروتوكول 3: التصور استخدام SOS اجفب كا مرناً
- توليف مرناً اجفب-كاكس
- لينيريزي 1 ملغ من pCS2-اجفب-كا بلازميد16 مع نوتي في حجم رد فعل من 40 مل لمدة 4 ساعات في 37 درجة مئوية.
- للتوقف عن رد فعل خلاصة القيد، إضافة 10 مل رناسي خالية من الماء، 2.5 مل 10% الحزب الديمقراطي الصربي ومل 2.0 10 ملغ/مل بروتيناز ك.
- احتضان 1 ساعة في 50 درجة مئوية.
- يضاف ما يلي إلى رد فعل (إجمالي حجم 200 مل) والمضي قدما إلى الخطوة التالية: 50 مل رناسي خالية من الماء، 20 مل م 3 الصوديوم خلات pH 5.2 و 75.5 مل رناسي خالية من الماء
ملاحظة: يتم إضافة المياه خالية من رناسي في مناسبتين منفصلتين للحيلولة دون إضعاف المفرط من خلات الصوديوم.
- تنقية الحمض النووي من خلال هطول الأمطار، واستخراج الإيثانول الفينول/كلوروفورم
- إضافة 200 مل الفينول: كلوروفورم: إيسواميل الكحول ودوامه لفصل س. 20 في مراحل مائي والعضوية عن طريق استخدام الطرد المركزي في س 18,000 ز لمدة 5 دقائق.
- نقل الطبقة المائية العليا لأنبوب ميكروسينتريفوجي جديدة، مع التأكد من تجنب نقل الطبقة السفلي العضوية. إضافة وحدة تخزين متساوية من كلوروفورم للأنبوب الجديد.
ملاحظة: إضافة كلوروفورم اختياري، ولكن من المستحسن لضمان الإزالة الكاملة للفينول من العينة. - دوامة لفصل س. 20 في مراحل مائي والعضوية عن طريق استخدام الطرد المركزي في 18,000 س ز لمدة 5 دقائق.
- كما كان من قبل، نقل الطبقة المائية العليا لأنبوب ميكروسينتريفوجي جديدة، مع التأكد من تجنب نقل الطبقة السفلي العضوية.
- إضافة حجم 1/10 م 3 خلات الصوديوم pH 5.2.
- يعجل بالحمض النووي بإضافة 3 مجلدات من الإيثانول رناسي خالية 100 ٪ والبرد في-20 درجة مئوية ل 15 دقيقة للطرد المركزي في 18,000 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. بيليه يجب أن تكون مرئية. صب المادة طافية.
- أغسل بيليه مع 100 مل ماء البارد خالية من الإيثانول/رناسي 70%. وبعد الاختلاط برفق كسر بيليه فضفاضة، الطرد المركزي في س 18,000 ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. بيليه يجب أن تكون مرئية. صب المادة طافية.
- أيردري بيليه لمدة 5 دقائق وريسوسبيند في الحمض النووي في 7 مل من الماء.
ملاحظة: قد يلزم بيليه أن تجفف لمدة أطول من 5 دقائق اعتماداً على تدفق الهواء المتوفرة.
- النسخ وتنقية مرناً اجفب كا
- بطريقة خالية من رناسي، إعداد فعل نسخ في المختبر مع مجموعة بوليميراز الرنا Sp6 متاحة تجارياً، استخدام حوالي 1 ملغ بلازميد خطية تنقية الحمض النووي التي تم الحصول عليها في "الخطوة 3-2". احتضانها ح 2 في 37 درجة مئوية.
ملاحظة: يجب استخدام Sp6 بوليميريز الحمض النووي الريبي لإنتاج توج مرناً. - أضف 1 مل الدناز (يو 2/مل؛ رناسي الحرة) واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- تنقية مرناً مع أي مواد تنقية الحمض النووي الريبي المتاحة تجارياً. قاسمة مرناً لتجنب تجميد أذاب المتكررة، وتخزينها في-80 درجة مئوية.
- بطريقة خالية من رناسي، إعداد فعل نسخ في المختبر مع مجموعة بوليميراز الرنا Sp6 متاحة تجارياً، استخدام حوالي 1 ملغ بلازميد خطية تنقية الحمض النووي التي تم الحصول عليها في "الخطوة 3-2". احتضانها ح 2 في 37 درجة مئوية.
- حقن والتصور
- الحصول على الأجنة كما ورد في "البروتوكول 1-1".
- استخدام جهاز microinjection، حقن 300 خريج من اجفب كا مرناً في المرحلة 1-الخلية.
- الشاشة للأجنة مع تعبير مشرق من اجفب في أعين استخدام ستيريوسكوبي الأسفار.
- صورة الأجنة كما هو موضح في 1.2 بروتوكول.
- وبدلاً من ذلك، ديتشوريوناتي وإصلاح الأجنة في تيميبوينت المرجوة في 4% منهاج العمل لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. تغسل الأجنة في 1 × ببست لمدة 5 دقائق، أربع مرات، وديتشوريوناتي، إذا لم تكن قد فعلت. تشريح العيون وجبل لهم على الشرائح كما هو موضح في 2.3 البروتوكول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يظهر الزرد SOS في 20 هبف في الشبكية الظهرية الظني8. طريق التحولات هبف SOS 23 من بنيتها الضيقة الأولى إلى المسافة بادئة واسعة و 26 هبف أنها لم تعد مرئية8. ولذلك، يجب دراسة SOS أثناء تطوير العين الزرد العادية، التقيد بالأجنة بين 20-23 هبف. وخلال هذه الفترة، هو SOS يمكن ملاحظتها من خلال مجهر تشريح وعن طريق تصوير DIC كخط رفيع في العين الظهرية الذي يفصل بين شطري الآنف والزمانية الشبكية النامية (الشكل 1). وبالإضافة إلى ذلك، قد تكون المسافة بادئة خفية مرئية في الحدود الظهرية العين (الشكل 1). على أثر تلطيخ إيمونوفلوريسسينت من لامينين، يمكن تأكيد خط رفيع أن الغشاء الطابق السفلي (الشكل 1).
دراسة مسارات جزيئية أسفر عن تأخر SOS الإغلاق، اخترنا لمراقبة الأجنة في 28 هبف كهذا هو تيميبوينت الذي تتم إزالته بما فيه الكفاية من الوقت العادي SOS الإغلاق وهو، لذلك، علامة موثوق بها من تأخير إغلاق استغاثة بسبب تجريبي التلاعب. من خلال التصور مباشرة من 28 هبف الزرد تحت مجهر تشريح، فمن الممكن لتقييم SOS تأخير الإغلاق بسبب التلاعب التجريبية. عندما يتم تأخير إغلاق SOS، يمكن اعتبار وجودها فترة طويلة شق وضوحاً في الجهة الظهرية من العين تحت مجهر تشريح (الشكل 2). عندما لاحظ تحت المجهر المركب باستخدام البصريات DIC أو نومارسكي، هذه الميزة أكثر بروزا، وجانبي الآنف والزمانية العين مفصولة الاستغاثة، وواضحة للعيان كخط في العين الظهرية (الشكل 3).
وقد اصطف SOS مع مكونات الصفيحة القاعدية، بما في ذلك لامينين. ولذلك، تلطيخ إيمونوفلوريسسينت يوفر طريقة تكميلية لتقييم الإغلاق SOS في الأجنة ثابتة. عند تصوير العين الجنينية من وجهة نظر أفقي، الصفيحة القاعدية فىالوقت الهامش الخارجي للعين، وشقوق العين، والحدود بين العدسة والشبكية (الشكل 4). SOS التوجه مباشرة مقابل الشق شرويد في الجانب الظهرية للعين. يمكن تركيبة الأجنة كله أفقياً، مع نوعا ما أفضل البصرية الوضوح يتحقق إذا كانت العينان سابقا ميكروديسيكتيد. قبل 28 هبف، في wildtype الزرد، تلطيخ laminin يبين بوضوح أن SOS مغلقة تماما، مما يجعل هذا المسرح المثالي لرصد حالات التأخير في إغلاق الشق.
حقن اجفب كا مرناً يسمح التصور أغشية الخلايا من الأجنة الحية أو الثابتة (الشكل 5). الحقن بنجاح المرحلة خلية واحدة كافية لإنتاج أجنة بالأسفار غشاء الخلية كاملة. في طريقة العرض الأفقي، يجب أن تتسم جميع الحدود الخلوية بالأسفار التجارة والنقل، وعلى هذا النحو، مورفولوجيا الخلايا يحتفل أيضا بوضوح. يسمح هذا تصور التغيرات المورفولوجية للخلايا التي تؤدي إلى إغلاق SOS.
رقم 1: مراقبة SOS أثناء تطوير العين الزرد العادية- وجمعت الأجنة الزرد وتصويرها في 22 هبف. ألف-باء. العرض الأفقي 22 الأجنة هبف العيش-تصويرها بالمجهر تشريح (A) وعبر DIC التصوير (ب)، على التوالي. SOS هو موضوع عليها علامة نجمية حمراء. جيم لامينين إيمونوفلوريسسينت تلطيخ جنين هبف 22. الأجنة كانت ثابتة في 4% منهاج عمل بيجين، والتي تم الحصول عليها لتلطيخ الجامع-جبل إيمونوفلوريسسينت من لامينين. وكانت فيليتيد الأجنة وشنت في 70% والغليسيرول/برنامج تلفزيوني. تم الحصول على صور شريحة واحدة عن طريق التصوير [كنفوكل] مع برمجيات. SOS هو موضوع عليها علامة نجمية بيضاء. جميع الأرقام كانت المشروح وتجميعها باستخدام برنامج Adobe Illustrator. تمثل أشرطة مقياس 50 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تشريح صور المجهر لتأخير إغلاق SOS في اليرقات الزرد. كانت الأجنة Wildtype و gdf6a-/- 28 التي تم جمعها وتصويرها ويعيش في هبف. العرض الجانبي ألف جنين wildtype مع SOS مغلقة. باء الأفقي عرض جنين gdf6a-/- مع حدوث تأخير إغلاق SOS (العلامة النجمية). اكتئاب حاد يمكن ملاحظتها في الجانب الظهرية للعين بسبب فشل SOS لإغلاق على نحو ملائم. تمثل أشرطة مقياس 50 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: صور الممثل DIC SOS في العين الجنينية الزرد. الأجنة-/- Wildtype و gdf6aجمع، وتخديره، ويوضع أفقياً في 1% عالي النقاوة ذوبان منخفضة نقطة [اغروس] في E3 على 35 مم طبق بيتري. الطبق مليئة E3، وتم استخدام مجهر المركب مع 20 × الهدف غمس المياه لتصوير DIC. العرض الجانبي ألف جنين wildtype مع SOS مغلقة. باء الأفقي عرض جنين gdf6a-/- مع حدوث تأخير إغلاق SOS (العلامة النجمية). SOS يمكن ملاحظتها كخط رفيع في الجانب الظهرية للعين. تمثل أشرطة مقياس 50 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: صور الممثل من لامينين إيممونوفلوريسسينت تلطيخ في العين الزرد الجنينية. وجمعت الأجنة-/- Wildtype و gdf6aوثابتة في 4% منهاج عمل بيجين في 28 هبف. الصفيحة القاعدية إيمونوستينيد، وكانت فيليتيد الأجنة وشنت في 70% من الجلسرين/برنامج تلفزيوني لتصوير [كنفوكل]. تم الحصول على صور شريحة واحدة باستخدام البرمجيات زن. العرض الجانبي ألف جنين wildtype مع SOS مغلقة. باء الأفقي عرض جنين gdf6a-/- مع حدوث تأخير إغلاق SOS (العلامة النجمية). ويرد الصفيحة القاعدية تحدد العين باللون الأخضر، مع استغاثة مرئية في الجزء الظهري من العين في الأجنة-/- gdf6a. تمثل أشرطة مقياس 50 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: تصوير العين الجنينية الزرد عقب حقن مرناً كا اجفب. تم حقن الأجنة Wildtype 300 خريج من اجفب كا مرناً في المرحلة 1-الخلية. في 22 هبف و 28 هبف، على التوالي، تم تخديره من الأجنة وشنت أفقياً في 1% عالي النقاوة ذوبان منخفضة نقطة [اغروس] في E3 على 35 مم طبق بيتري. مجهر [كنفوكل] مع 20 × الهدف غمس المياه استخدمت لتصوير، وتم الحصول على صور شريحة واحدة باستخدام برمجيات. ألف الأفقي عرض جنين gdf6a-/- في 22 هبف مع SOS مفتوحة مرئية (العلامة النجمية). ب توسيع لوحات جنين gdf6a-/- في 22 هبف. جيم العرض الجانبي جنين gdf6a-/- في 28 هبف مع إغلاق SOS تأخير. د توسيع لوحات جنين gdf6a-/- في 28 هبف. تمثل أشرطة مقياس 50 و 10 ملم في لوحات ألف وجيم، وب ود، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وهنا، نقدم مجموعة موحدة من البروتوكولات لمراقبة SOS في الجنين النامي الزرد. لتحديد تعمل تأخير الإغلاق، ولدينا بروتوكولات ركزت على القدرة على التمييز بين فصل الفصوص منفصلة اثنين من الجانبين الظهرية الآنف والظهريه الزمانية العين، مماثلة للتقنيات المستخدمة لتصور تأخير إغلاق الشق شرويد تعمل في العين البطني.
يمكن استخدام هذه التقنيات التصور بالتزامن مع مجموعة متنوعة من تقنيات التحوير الوراثي لدراسة آثار إعاقة أو حمل التعبير عن بعض الجينات لدراسة أدوارهم في إغلاق SOS. لقد اخترنا إثبات هذه البروتوكولات باستخدام أجنة gdf6a-/- كما أثبتنا سابقا أن الخسارة يمكن أن تؤثر على الإغلاق السليم ل SOS، ولكن يمكن استخدام البروتوكولات لدراسة آثار التلاعب بالتعبير عن أي الجينات مطلوب. من المستحسن أن تدرس أي التغييرات الشكلية للعين الظهرية مبدئياً مع الملاحظات باستخدام مجهر تشريح. وينبغي استخدام تقنيات أخرى بمجرد تأسيس ارتباط أولى نهائياً، كما أنها أكثر استهلاكاً للوقت وانخفاض الإنتاجية.
بينما يمكن بسهولة تعديل البروتوكولات لتناسب احتياجات المجرب، هناك العديد من الجوانب التي يجب أن تتبع بدقة. بسبب طبيعة عابرة لهذا الهيكل، من الضروري ضمان أن الجميع لاحظ الأجنة نفس المرحلة الإنمائية. لعملنا، نجد أنه من المهم السماح فقط نافذة صغيرة لتربية الوقت وفرز دورياً الأجنة في جميع أنحاء التنمية في وقت مبكر. أهم خطوة لمعادلة المراحل في 20 هبف، عندما يمكنك لا يزال دقة حساب سميتس (24)17، ونجد هذا كثير أكثر موثوقية من بصمات التدريج التي تحدد وقت 28 هبف. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن تحول دون تصبغ أو إزالتها لضمان نجاح التصور للهيكل. أننا لاحظنا التصبغ في العين يبدأ بتشغيل حوالي 22 هبف، وهناك نمط من تصبغ في العين الظهرية التي يمكن أن تتداخل مع التصور السليم للاستغاثة. ولذلك، فإنه ينصح بشدة لعلاج الأجنة مع PTU قبل تصبغ لضمان نجاح التصور. بالإضافة إلى ذلك، يتطلب تشريح العين الجنينية قبل تركيب الشرائح دون التسبب في أضرار بعض الممارسة. من الضروري أيضا أفقياً جبل العيون الموازية قدر الإمكان إلى الشريحة. من المستحسن أن المجرب ممارسات هذه التقنيات مع الأجنة الزائدة قبل التجربة.
وباستثناء تلطيخ إيمونوفلوريسسينت الصفيحة القاعدية، كافة البروتوكولات المذكورة هنا يمكن أن تكتمل باستخدام أجنة حية. يسمح هذا التصور المستمر من SOS في جميع أنحاء امبريوجينيسيس المبكر، يسمح المجرب لإجراء دراسات الوقت الفاصل بين التغيرات المورفولوجية المتورطين في إغلاق SOS. في الماضي، وقد استخدمنا المتسلسلات شبكية محددة، مثل Tg(rx3:eGFP)، الذي يمثل الشبكية العصبية خلال النمو المبكر. على الرغم من أنه يفتقر إلى القدرة على تصور أغشية الخلية، استخدام Tg(rx3:eGFP) له ميزة لا تتطلب ميكروينجيكتيونس وقد كان لدينا الأسلوب الأساسي لتصور إجمالي التغييرات الشكلية للعمارة SOS في الوقت الحقيقي. أن البروتوكول لم تدرج هنا، كما قد سبق أساليب مماثلة في هذه المجلة18،19. ومع ذلك، سيتطلب التحقيق في الخلية الأساس البيولوجي لتشكيل SOS وإغلاق غشاء بروتينات الفلورسنت. على وجه التحديد، حقن اجفب كا مرناً يسمح التصور أغشية الخلايا حول الاستغاثة كما يتضح في الشكل 5، مما يسمح لنا بدراسة ديناميات التغيرات الشكل الخلية في العين الظهرية مطلوبة للمناسبة SOS الإغلاق. بينما كا اجفب يمكن أن يكون مفيداً لأداء العيش-التصوير للإغلاق SOS، جعلت صعبة بوجود طبقة تغليف في الزرد. وبالإضافة إلى ذلك، يجب توخي الحذر عند تحليل النتائج من حقن مرناً لأنه يمكن أن يؤدي في mosaicism، مما يجعل من الصعب مقارنة مباشرة الأجنة استناداً إلى التحديد الكمي لقوة التعبير اجفب. هذا يمكن أن تحسن من خلال استخدام خطوط الزرد المعدلة وراثيا التي فلوريسسينتلي تسمية أغشية الخلية على وجه التحديد في الشبكية النامية، مثل Tg(vsx2.2:GFP-caax).
واحدة من التحديات التي لدينا بروتوكولات تقع على عاتق أي معاملة غير الاختراق تماما. وقد لاحظنا سابقا أن يتبين تأخر استغاثة في حوالي 10% أجنة التحكم في 28 هبف8، وهذا الوجود الأساسي للأجنة باستغاثة داخل أي فريق تجريبي يمكن أن تجعل من الصعب على مراقبة آثار خفية من التجريبية التلاعب. ويمكن معالجة ذلك بالعمى المجرب للحد من التحيز المجرب وزيادة عدد الأجنة المستخدمة داخل كل مجموعة تجريبية لزيادة القوة للتجربة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تحول مرحلة التحليل إلى هبف 29-30.
مع هذه المجموعة من البروتوكولات، نسعى إلى توحيد الطريقة التي من خلالها يتم تصور SOS الإغلاق التأخير. التقنيات الموضحة أعلاه قد ثبت أنه يمكن التعويل عليها في كشف وتصور SOS الإغلاق التأخيرات في مجموعة متنوعة من الإعدادات التجريبية وتكييفه مع الاحتياجات المجرب. في حين أننا استخدمنا تقنيات مثل المسح الضوئي المجهر الإلكتروني أو التصوير الوقت الفاصل بين الأجنة وراثيا لتصور SOS بمزيد من التفصيل، أن هدفنا هنا هو إنشاء مجموعة موحدة من البروتوكولات التي قابلة للفائق التجريبية تصاميم لتصور عدد كبير من الأجنة في يوم واحد مع التركيز على القدرة على نقاط الإغلاق تعمل من التأخير. بالإضافة إلى استخدامها مع الأجنة-/- gdf6a، قد تمكنا من مراقبة SOS الإغلاق تأخير تعمل باستخدام هذه التقنيات التصور جنبا إلى جنب مع العلاجات الدوائية والحقن morpholino، والجيش الملكي النيبالي overexpression الدراسات. كما يتم توضيح دور SOS في التنمية العين كذلك من خلال وسائل مختلفة، ونأمل أن توفر هذه مجموعة موحدة من البروتوكولات المجتمع العلمي لغة مشتركة التي من خلالها يتم دراسة هذا الهيكل الرواية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا المصالح المتضاربة تعلن.
Acknowledgments
كان يدعمها هذا العمل في المعاهد الكندية للبحوث الصحية (استوفوا)، والعلوم الطبيعية ومجلس البحوث الهندسية (مقدمة) والبرتا يبتكر التكنولوجيا المستقبلية، والمرأة ومعهد أبحاث صحة (وتشري الطفل).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl 2-thiourea | Sigma Aldrich | P7629-10G | |
| 100 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 35 mm Petri dish | Corning | CLS430588 | |
| Agarose | BioShop Canada Inc. | AGA001.1 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| DIC/Fluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z1 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZX12 | |
| Dissection microscope camera | Qimaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Dow Corning High-vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma Aldrich | A5040-25G | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150077 | |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Image capture software | Zeiss | ZEN | |
| Incubator | VWR | Model 1545 | |
| Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Minutien pin | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148-500G | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2 | Fisher Scientific | BP1752-100 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P4850 | |
| Rabbit anti-laminin antibody | Millipore Sigma | L9393 | |
| TURBO Dnase (2 U/µL) | Invitrogen | AM2238 | |
| Ultrapure low-melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Invitrogen | 15525017 |
References
- Chow, R. L., Lang, R. A.
- Slavotinek, A. M. Eye development genes and known syndromes. Molecular Genetics and Metabolism. 104 (448-456), (2011).
- Gregory-Evans, C. Y., Williams, M. J., Halford, S., Gregory-Evans, K. Ocular coloboma: a reassessment in the age of molecular neuroscience. Journal of Medical Genetics. 41 (12), (2004).
- Onwochei, B. C., Simon, J. W., Bateman, J. B., Couture, K. C., Mir, E.
- Williamson, K. A., FitzPatrick, D. R. The genetic architecture of microphthalmia, anophthalmia and coloboma. European Journal of Medical Genetics. 57, 369-380 (2014).
- Chang, L., Blain, D., Bertuzzi, S., Brooks, B. P. Uveal coloboma: clinical and basic science update. Current Opinion in Ophthalmology. 17, 447-470 (2006).
- Kaufman, R., et al. Development and origins of Zebrafish ocular vasculature. BMC Developmental Biology. 15 (18), (2015).
- Hocking, J. C., et al. Morphogenetic defects underlie Superior Coloboma, a newly identified closure disorder of the dorsal eye. PLOS Genetics. 14 (3), (2018).
- Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Developmental Cell. 21 (1), (2011).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. International Journal of Developmental Neuroscience. 19, 621-629 (2001).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edition, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Distel, M., Köster, R. W. In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
- Kwan, K. M., Otsuna, H., Kidokoro, H., Carney, K. R., Saijoh, Y., Chien, C. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139, 359-372 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F.
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (79), e50525 (2013).
- Percival, S. M., Parant, J. M. Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (113), e54218 (2016).
