Summary
新的血管形成和交感神经支配在脂肪组织重塑中起着举足轻重的作用。然而, 在对脂肪组织进行可视化和定量测量方面仍然存在技术问题。在这里, 我们提出了一个协议, 以成功地标记和定量比较血管和神经纤维在不同的脂肪组织的密度。
Abstract
最近的研究强调了血管生成和交感神经支配在肥胖发展过程中脂肪组织重塑的关键作用。因此, 开发一种简单有效的方法来记录脂肪组织的动态变化是必要的。在这里, 我们描述了一种改进的免疫荧光方法, 有效地共同染色血管和神经纤维在脂肪组织。与传统和最近开发的方法相比, 我们的方法相对容易遵循, 更有效地标记密度较高、背景较少的血管和神经纤维。此外, 图像的高分辨率进一步使我们能够通过开源软件准确地测量容器的面积、分枝量和纤维长度。作为使用我们的方法的演示, 我们表明棕色脂肪组织 (bat) 含有更高的血管和神经纤维相比, 白色脂肪组织 (wat)。我们进一步发现, 在 wats 中, 皮下 wat (swat) 与附睾 (ewat) 相比, 血管和神经纤维更多。因此, 我们的方法为研究脂肪组织重构提供了一个有用的工具。
Introduction
脂肪组织具有关键的代谢和内分泌功能1。它动态膨胀或收缩, 以响应不同的养分胁迫2。活性组织重塑过程包括多种生理路径, 包括血管生成、纤维化和局部炎症微环境的形成 2,3,4。一些物理刺激, 如冷暴露和运动, 可能会触发交感神经激活, 最终导致新的血管形成和脂肪组织5,6的交感神经支配。这些重塑过程与全身代谢结果密切相关, 包括胰岛素敏感性, 2 型糖尿病的标志.因此, 这些病理改变的可视化是非常重要的了解整个脂肪组织的健康状态。
血管生成是新血管形成的过程。由于血管为组织提供氧气、营养物质、激素和生长因子, 血管生成被认为是脂肪组织重塑的关键一步, 这已被记录与不同的技术6,7,8,9,10,11,12,13. 然而, 在图像的分辨率、免疫染色的效率以及血管密度的量化方法方面仍然存在问题。与新的血管形成相比, 脂肪组织的神经支配被长期低估。最近, 曾等人.14使用先进的免疫管内双光子显微镜, 并证明脂肪细胞周围有一层神经纤维 14.从那时起, 研究人员开始认识到交感神经支配在脂肪组织生理调节中的关键作用。因此, 开发一种简单实用的方法来记录脂肪神经神经支配是非常重要的。
在这里, 我们报告了一种优化的方法, 血管和神经纤维的共染色基于我们以前的协议。通过这种方法, 我们可以在没有嘈杂背景的情况下实现血管和神经纤维的清晰图像。此外, 我们获得的分辨率足够高, 可以使用开源软件对密度进行定量测量。通过使用这种新方法, 我们可以成功地比较不同脂肪库的血管和神经纤维的结构和密度。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有含有动物科目的程序都已得到休斯敦德克萨斯大学健康科学中心动物福利委员会的批准 (动物协议编号: awc-18-0057)。
1. 试剂制备
- 1x 磷酸盐缓冲盐水 (pbs, ph 7.4): 使1x 的 1x pbs, 溶解8克的氯化钠, 0.2 克的 kcl, 1.44 克的 na 2 hpo4 , 0.24 克的 kh2po 4 在800毫升的蒸馏水中。将 ph 值调整到 7.4, 并加入蒸馏水, 以达到1升的最终体积。
- 1 x pbs 中的1% 甲醛 (1% pfa, wt/vol): 要达到50毫升的最终体积, 请将 3.125 ml 的 16% pfa (见材料表) 添加到 1x pbs 的 46.875 ml 中。混合好, 存放在 4°c, 供以后使用。
注意事项:对甲醛是有毒的。所有程序都应在通风罩下进行, 以避免吸入和皮肤接触。 - 0.1% 聚山梨酸酯 20 (见材料表) 在 1x pbs (1x pbst, ph 7.4, 伏体积): 以达到50毫升的最终体积, 添加 0.05 ml 的聚山梨酸酯20至 49.95 ml 的 1x pbs。涡流, 并在4°c 下存储长达1个月。
- 1% 八氯醇-9 (见材料表) 在 1x pbs (1x pbs-tx, ph 7.4, vol/vol): 以实现最终体积为 10 ml, 添加 0.1 ml 的八氯醇-9 至 9.9 ml 的 1x pbs。涡流, 并在4°c 下存储长达1个月。
- 2% 氮化钠 (wt/vol): 生产10毫升的2% 氮化钠, 将0.2 克氮化钠添加到 1x pbs 的10毫升。混合好, 存放在 4°c, 供以后使用。
- 90% 甘油在 1x pbs (vol/vol): 以达到10毫升的最终体积, 添加1毫升的 1x pbs 到9毫升的甘油。涡流和存储在室温 (rt), 供以后使用。
2. 动物解剖和脂肪组织采集
- 使用6周大的 c57bl/6j 雄性小鼠。用异氟醚对小鼠进行麻醉 (诱导为 4%-5%, 维护为 1%-2%)。一旦麻醉, 执行脚趾捏反射, 以确定麻醉深度, 判断缺乏踏板反射。一旦老鼠被深度麻醉, 按照之前公布的协议对小鼠进行解剖.
- 消毒钝剪刀和胸部的手术部位 (不需要剃光头发)。用钝剪刀切割横隔膜和肋骨沿侧向表面, 大小约2厘米, 打开胸部。用止血器夹住胸旗, 并将止血器放在头上反射。
- 用虹膜剪刀将小切口插入左心室 (约0.5 厘米)。将橄榄尖灌注针插入切口部位, 并用止血器将针尖固定在适当的位置。将针头连接到含有甲醛固定溶液的50毫升注射器上 (1% pfa, ph 7.4)。
- 用虹膜剪刀作为灌注出口, 通过切片切割打开右心房。以接近 10 mlmin 的灌注速率轻轻地连续推动注射器, 开始灌注, 当流出出口的液体没有任何血液时, 停止推动。整个过程需要 ~ 5分钟。
注意事项:在烟罩下执行这些步骤, 以防止来自 pfa 的毒性。 - 解剖小鼠的白色和棕色脂肪组织。使用剪刀将组织样本分解成小块块约 5 x 5 x 3 毫米 3.用消毒过的推子将小块转移到组织中, 将盒式磁带贴上适当的标签, 在盒式磁带上贴上组织样本的标签。
- 将含有组织样本的埋带盒在4°c 下, 将其浸入固定溶液中 (1x pbs 中的 1% pfa, ph 7.4), 在24–48小时内。
请注意:固定溶液和固定时间根据组织的大小变化 16,17,18。 - 用新鲜的 1x pbs 缓冲液清洗样品 3次 (0.5 ml/清洗)。
注意事项:在通风罩下执行此步骤。对甲醛废物应按照危险废物处置程序妥善处理。
请注意:组织可以在4°c 下存储在 1x pbs 中进行进一步处理。
3. 抗体培养
- 用消毒剪刀将固定的组织样本切割成大约2毫米3立方体。为了进行渗透性, 将样品转移到含有 1x pbs-tx 1 ml 的 1.5 ml 管中 (1x pbs 中的1% 八氯醇-9, 见材料表, ph 7.4), 并在18rpm 时在 rpm 处轻轻旋转1小时。
- 小心地取出 1x pbs-tx 的抽吸。将样品清洗 3倍, 将 1x pbs 直接添加到同一管中 (无需更换管)。每次清洗时, 将管道倒置几次。
- 对于阻塞, 在样品中添加 0.5 ml 的阻滞剂 (材料表), 并在 rt 孵育 2小时, 轻轻旋转。
- 制备 0.4 ml 的原代抗体溶液, 稀释2μl 的抗内膜素 (血管标记) 5 (1: 200) 和2μl 抗酪氨酸羟化酶 (th, 神经纤维标记) 5 (1:200, 1μg/ml) (抗体材料表)抗体信息) 转化为396μl 的阻滞缓冲液。涡旋和旋转下来, 以恢复音量。
- 对于第一次抗体培养, 请小心地从组织块中取出阻滞缓冲液。将步骤3.4 中制备的100μl 原代抗体溶液放入试管中, 并在4°c 下孵育过夜。
请注意:抗体稀释和培养时间可能因抗体而异。建议在抗体溶液中添加0.02% 的氮化钠, 以防止微生物生长。用氮化钠制备0.4 毫升的原代抗体溶液, 在392μl 的阻断缓冲液中加入4μl 抗体 (各 1μl) 和 4μl 2% 氮化钠。 - 如果需要, 请仔细收集主要抗体溶液以供重复使用。用 1x pbst (ph 7.4, 100μl 清洗) 清洗样品 3次 (每次 30分钟), 在 18 rpm 时轻轻旋转。
- 对于二次抗体溶液的制备, 将2μl 荧光体 (波长 495 nm) 共轭反山羊 igg (1:200) 和2μl 荧光体 (波长 650 nm) 共轭反兔子 igg (1:200) (见材料表) 稀释为396微米阻塞缓冲区。涡旋和旋转短暂地收集所有的液体。
请注意:在以下过程中保护样品不受光线影响。 - 对于第二个抗体培养, 从样本中取出最后一个洗涤缓冲液。将100μl 的二级抗体溶液加入试管中, 在 rpm 孵育 2小时, 在18转/分轻轻旋转。
- 小心去除二级抗体溶液。用 1x pbst (每个 ph 7.4, 30分钟) 清洗样品 3x, 在 18 rpm 时轻轻旋转。
请注意:不要重复使用这种二级抗体溶液, 因为它可能被组织带来的微量原代抗体污染。 - 为了进行光学清除, 将样品浸入90% 甘油的1毫升中, 并将样品保持在4°c 的黑暗中, 直到它们变得透明。
请注意:浸入时间取决于组织类型和大小。通常情况下, 2 毫米3立方体的白色脂肪组织需要隔夜孵化, 而相同大小的棕色脂肪组织样本需要更长的时间。 - 在幻灯片上加入有机硅隔离器, 为体积成像创造良好的效果。或者, 将几层透明胶带连接到幻灯片上, 并从中间剪下一个正方形以创建油井(图 2).
请注意:调整井深以适应样品尺寸。在该协议中, 使用1毫米井深。 - 小心地将样品转移到井中, 并将其填充到安装介质中 (参见材料表)。在表面放置盖板, 并用高粘度介质密封盖板滑移的角 (参见材料表)。让安装介质在黑暗中在 rt 固化24小时。
请注意:确保样品和盖板之间没有留下任何空间。避免在盖板下起泡。避免对样品施加过多的压力。
4. 图像采集
- 获取 z 堆栈图像 (请参阅步骤 4.2–4.7), 实现共聚焦显微镜软件的20x 目标。
- 启动系统。单击 "< 配置>" 选项卡, 激活氩激光器和 hene 633 激光器。单击 "获取 >"选项卡 <。在"可见 >激光线面板 <, 向上移动相应的强度滑块, 以选择 488 nm 和 633 nm 的激光线。最初, 强度可以设置为 20%--30%。选择488/56533个三重二分形镜。通过单击 <有源 > 复选框激活 pmt, 选择 pmt1 表示 488 nm 激光激发的发射, 选择 pmt3 作为 633 nm 激光激发的发射。将 pmt1 的波长范围设置为500–550纳米, 将 pmt3 的波长范围设置为650-750nm。通过双击每个 pmt 旁边的彩色矩形并从弹出菜单中选择一种颜色, 选择要用于图像显示的 psudocolor。
- 点击 <实时> 查看样本的图像。使用 z 位置旋钮选择感兴趣的 xy 区域内的焦点平面。通过调整激光强度、智能增益和偏移来调整图像的亮度。对于每个荧光通道, 请在 <qlut> (快速查找表) 显示模式下执行此调整。单击 <qlut> 按钮进入 qlut 模式, 在该模式中, 饱和像素以蓝色显示, 以帮助设置适当的亮度级别。在 <qlut> 按钮上单击两次, 返回到伪彩色显示模式。
请注意:设置的数值可能因每个实验而异。 - 扫描时, 逆时针旋转 z-位置旋钮将焦点计划移动到兴趣量的一端, 然后单击 <结束> 箭头以设置扫描结束位置。然后顺时针转动 z 位置旋钮, 将焦点平面通过样品移动到感兴趣体积的另一端, 然后单击 <开始> 箭头来设置扫描开始位置。
请注意:对于不同样本之间的比较, 请为不同的样本定义相同的 z 体积。 - 将 z 步长调整为 3μm. 通过选择 1024 x 1024 的格式、100 hz 的速度和2的线平均值来更改图像质量。
- 选择 <"开始 >" 以启动 z 堆栈图像采集。
- 要获得的图像堆栈的最大投影, 请单击 "处理 >" 选项卡, 然后单击 "工具><" < 选择 "3d投影 >, 然后在方法列表中输入 < 最大 >, 而无需更改 x、y 和 z.<阈值> 为0。单击 <应用>。z 卷的最大强度将堆叠到一个2d 图像中, 该图像将显示 (图 4a)。
5. 血管和神经光纤网络分析
-
通过开源软件分析二维图像 (见材料表)19
- 打开软件中堆叠的图像。调整容器直径和强度, 直到可以正确选择所有容器结构 (图 4b)。
- 选择 "运行分析" 并按照软件的指导导出数据。
-
通过许可软件分析3d 图像 (见材料表)
- 使用软件打开图像的原始数据。调整阈值和其他参数, 直到正确选择 z 卷每一层中的容器结构 (有关软件中的详细信息, 请参阅用户指南) (图 4c)。
- 分析选定的段字符, 并按照软件的指导导出数据。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
采集了附属性白色脂肪组织 (ewat) 的远端区域、腰腰椎皮下白色脂肪组织 (swat) 的内侧区域和肩周间棕色脂肪组织 (bat) 的内侧区域。收集这些组织的位置如图 1所示。
图 1: 皮下白色脂肪组织 (swat)、附睾状白色脂肪组织 (ewat) 和棕色脂肪组织 (bat) 的解剖显示用于采集样本的区域.(a) 白色虚线所概述的区域表示 swat, 白色星号突出显示的位置是用于收集 swat 的位置。黑色虚线所显示的区域是 ewat, 黑色星号突出显示的位置是用于收集 ewat 的站点。(b) 黑色虚线所概述的区域为 bat, 组织收集区域用星号突出显示。请点击这里查看此图的较大版本.
全装染色后, 组织块被安装在1毫米深的井中 (图 2)
用共聚焦显微镜成像。我们首先测试了90% 甘油培养的清除步骤对图像质量的影响。我们发现, 更多的血管被阳性染色α-内毒素抗体在甘油孵育 swat, 这表明清除步骤是至关重要的完全染色的血管 (图 3, 比较面板 a 和 b)。
图 2: 用于体积成像的井图.(a)带有有机硅隔离器的幻灯片示意图。(b)由我们的实验室制作的多层胶带井的示意图。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 与90% 甘油获得或不进行光学清除步骤的血管 if 图像的比较。(a)用抗内皮素抗体 (绿色) 在 swat 中进行全安装免疫荧光染色。样品未经过光学清除步骤 (步骤 3.10)。(b)用抗内皮素抗体全贴性 if 染色。在安装步骤 (步骤3.10 和 3.10) 之前, 样品经过光学清除步骤 (步骤 3.10)。请点击这里查看此图的较大版本.
然而, 甘油的清除步骤并不影响血管的完整性或形状(图 3)。鉴于这些有益的效果, 在下面的实验中, 执行了清除步骤。
我们使用不同的软件进一步比较了2d 和3d 分析的结果 (见材料表)。我们发现, 虽然三维图像显然提供了更详细的结构信息, 但这两种分析方法最终在容器的长度和分支数量方面没有显示出显著的差异 (图 4)。
图 4: 船舶结构二维和三维分析的比较。(a)最大投影对图像的影响。(b)二维软件的分析结果 (见材料表)。特别是, 红线表示选定的骨架, 而蓝色圆点表示品牌点。(c) 3d 软件的分析结果 (见材料表)。灰色区域是要分析的选定区域。绿线表示测量的段, 绿点表示测量的节点。(d) 用二维或三维方法分析的容器长度、段数、分支节点数和端子节点数的比较。请点击这里查看此图的较大版本.
以前的出版物表明, 不同的脂肪仓库具有异质特性1,18。在这里, 我们试图使用我们新开发的方法来确定血管和神经纤维是否在仓库之间表现出不同的模式。为了实现这一目标, 我们在脂肪组织中使用α-内毒素 (用于血管) 和α-th (神经纤维) 抗体进行了联合 if 染色。有趣的是, 结果显示, 与 wats 相比, bat 中的血管和神经纤维明显增多 (图 5, 将底部车道与顶部和中层通道进行比较)
图 5: 从不同脂肪库获得的血管和神经纤维的比较.在 ewat (a, b, 合并为 c)、swat (d, e, 合并为f) 和 bat (g, h, 合并于 i).请点击这里查看此图的较大版本.
在 wats 中, swat 的血管密度高于 ewat (图 5, 比较中间车道和顶部车道)。值得注意的是, 虽然神经纤维与血管平行扩张, 但并没有显示出明显的共同定位 (图 5, 合并车道)。我们进一步定量测量血管面积, 连接点的数量, 管长度与二维方法, 并发现类似的结果, 如上所述 (图 6)。
图 6: 血管和神经纤维网络的定量分析.(a) ewat、swat 和 bat 样本中血管面积的百分比。(b) ewat、swat 和 bat 中血管网络的连接数。(c) ewat、swat 和 bat 中血管网络的总血管长度。(d) ewat、swat 和 bat 样品中纤维面积的百分比。(e) ewat、swat 和 bat 中神经纤维的连接数。(f) ewat、swat 和 bat 中神经纤维的总长度。利用2d 软件进行了分析。结果是从图 5中显示的图像中获得的。请点击这里查看此图的较大版本.
总之, 该方法成功地同时染色血管和神经纤维在不同的脂肪组织。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
脂肪组织重塑与肥胖发展过程中的代谢失调直接相关 1,2。血管生成和交感神经支配对动态重塑过程2,12都是必不可少的。因此, 开发一种适用的方法来可视化新的血管以及神经纤维是非常重要的。以前的方法已经报告记录血管生成在脂肪组织。然而, 这些方法仍然存在一些问题, 包括效率低、分辨率低和背景嘈杂。同时, 交感神经支配最近才被认为是脂肪组织病理学的关键一步.尽管相关的发现很有趣, 但应用的方法需要先进的显微镜工具, 而且非常耗时。在这里, 我们报告一种易于遵循的方法, 从我们以前的协议修改为共染色血管和交感神经纤维。有趣的是, 我们成功地染色血管和神经纤维的高分辨率, 和染色具有类似于以前报告的图像18的性质。
此前, 我们用免疫组织化学或免疫荧光技术在石蜡嵌入的滑块 8、13、20上用α-cd31 抗体 (内皮细胞标记) 对脂肪组织中的血管进行了染色。虽然该方法使我们能够区分不同组的血管密度, 但被阳性染色的微血管血管并不完整。在这里, 我们选择了全贴入法, 并与α-内毒素抗体进行 if 染色, 这是血管的另一个标记。通过这种优化的方法, 我们能够用更多的血管, 特别是微血管进行染色。此外, 在这种方法中, 由于我们避免了石蜡嵌入和福尔拉林固定等步骤, 这些步骤有可能损害血管的完整性, 因此我们获得了分辨率较高、血管更完整的图像。血管的未受损结构进一步使我们能够测量和比较它们的长度、分枝和区域。值得注意的是, 我们增加了一个用甘油清理的步骤, 这样组织块就可以变得更加透明, 这个简单但关键的步骤显著提高了染色18,21的效率。
由于脂肪组织中的脂质含量很高, 这可能会限制抗体对组织内部区域的获取, 因此我们将仓库切割成小块, 以确保与目标蛋白有足够的抗体结合。因此, 我们的方法成功地染色更多的血管和神经纤维比染色整个组织。然而, 它可能会丢失空间信息, 从而影响神经纤维的完整性。为了解决这一明显问题, 并确保图像在单个小鼠之间是可比的, 建议从脂肪库中相同的区域收集小块。如果进一步需要更多的空间信息, 应获得更大的块进行染色。对于较大的样品, 使用较高剂量的 fpa 更长的固定时间、较高浓度的渗透性洗涤剂以及更长的抗体培养周期可能需要更长的时间。
脂肪组织神经支配最近得到了研究。多种先进技术已被应用于神经纤维的可视化 14,17。这些方法要么昂贵, 要么耗时。在这里, 我们只是用α-th (交感神经标记) 进行 if 染色, 并成功地染色了高质量的交感神经纤维。更重要的是, 我们与α-内毒素和α-th 进行了共染色, 以研究脂肪组织重构过程中血管如何与交感神经纤维相互作用。
值得注意的是, 我们使用不同的软件对2d 和3d 分析的结果进行了比较。研究发现, 虽然三维图像提供了更详细的结构信息, 但两种分析方法在容器长度和分支方面没有明显差异。最终, 在使用3d 方法进行分析时, 软件本身可能会检测到一些需要手动调整的错误信号。鉴于二维软件是专门为船舶分析而设计的, 因此建议使用这种方法定量测量船舶的结构。
采用该方法对不同脂肪组织中的血管和神经纤维进行了共染, 并对其密度、分枝和长度进行了比较.研究发现, 与 wat 相比, bat 中的血管和神经纤维都要厚得多, 这表明 bat 是一个代谢活跃程度更高的脂肪库。此外, swat 的血管和神经密度高于 ewat, 这表明不同的 wats 具有不同的重塑特征。
总之, 该方法有效地共同染色脂肪组织中的血管和神经纤维5。此外, 它还可作为研究肥胖发育过程中脂肪组织动态变化的有用工具。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
提交人声明, 他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项研究得到了国家卫生研究所授予 r01dk109001 (向 k. s.) 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 805-545-180 | Lot: 116969 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Lot: 121944 |
| Amira 6.0 | Thermo Fisher Scientific | Licensed software | |
| Angio tool | National Institutes of Health | Open source software https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home |
|
| Anti-mouse endomucin antibody | R&D research system | AF4666 | Lot: CAAS0115101 |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | Pel Freez Biologicals | P40101-150 | Lot: aj01215y |
| Cover glasses high performance, D = 0.17 mm | Zeiss | 474030-9020-000 | |
| Cytoseal 280 | Thermo Fisher Scientific | 8311-4 | High-viscosity medium |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | |
| Paraformaldehyde,16% | TED PELLA | 170215 | |
| Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep | INVITROGEN | P24744 | Silicone isolator |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| SEA BLOCK Blocking Buffer | Thermo Fisher Scientific | 37527X3 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | |
| Tissue Path IV Tissue Cassettes | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Triton Χ-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Generic term: octoxynol-9 |
| Tube rotator and rotisseries | VWR | 10136-084 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Generic term: Polysorbate 20 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. Adipose tissue remodeling and obesity. Journal of Clinical Investigations. 121 (6), 2094-2101 (2011).
- Sun, K., et al. Endotrophin triggers adipose tissue fibrosis and metabolic dysfunction. Nature Communication. 5, 3485 (2014).
- Zhao, Y., et al. Divergent functions of endotrophin on different cell populations in adipose tissue. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 311 (6), E952-E963 (2016).
- Zhao, Y., et al. Transient Overexpression of VEGF-A in Adipose Tissue Promotes Energy Expenditure via Activation of the Sympathetic Nervous System. Molecular and Cellular Biology. , (2018).
- Xue, Y., et al. Hypoxia-independent angiogenesis in adipose tissues during cold acclimation. Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).
- Chen, S., et al. LncRNA TDRG1 enhances tumorigenicity in endometrial carcinoma by binding and targeting VEGF-A protein. BBA Molecular Basis of Disease. 1864 (9 Pt B), 3013-3021 (2018).
- Sun, K., et al. Dichotomous effects of VEGF-A on adipose tissue dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (15), 5874-5879 (2012).
- During, M. J., et al. Adipose VEGF Links the White-to-Brown Fat Switch With Environmental, Genetic, and Pharmacological Stimuli in Male Mice. Endocrinology. 156 (6), 2059-2073 (2015).
- Elias, I., et al. Adipose tissue overexpression of vascular endothelial growth factor protects against diet-induced obesity and insulin resistance. Diabetes. 61 (7), 1801-1813 (2012).
- Sung, H. K., et al. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17 (1), 61-72 (2013).
- Cao, Y. Angiogenesis and vascular functions in modulation of obesity, adipose metabolism, and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 18 (4), 478-489 (2013).
- Sun, K., et al. Brown adipose tissue derived VEGF-A modulates cold tolerance and energy expenditure. Molecular Metabolism. 3 (4), 474-483 (2014).
- Zeng, W., et al. Sympathetic neuro-adipose connections mediate leptin-driven lipolysis. Cell. 163 (1), 84-94 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Berry, R., et al.
- Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
- An, Y. A., et al. Angiopoietin-2 in white adipose tissue improves metabolic homeostasis through enhanced angiogenesis. eLife. 6, (2017).
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
