Summary
Formazione del vaso sanguigno di nuovo e lo stimolo simpatico svolgono un ruolo fondamentale nel rimodellamento del tessuto adiposo. Tuttavia, permangono problemi tecnici nella visualizzazione e quantitativamente misurando il tessuto adiposo. Qui presentiamo un protocollo per etichettare correttamente e confrontare quantitativamente le densità dei vasi sanguigni e fibre nervose in diversi tessuti adiposi.
Abstract
Recenti studi hanno evidenziato il ruolo critico dell'angiogenesi e stimolo simpatico nel rimodellamento del tessuto adiposo durante lo sviluppo dell'obesità. Pertanto, lo sviluppo di un metodo semplice ed efficace per documentare i cambiamenti dinamici nel tessuto adiposo è necessario. Qui, descriviamo un metodo immunofluorescente modificato che efficacemente co-macchie vasi sanguigni e fibre nervose in tessuti adiposi. Rispetto ai metodi tradizionali e sviluppati di recente, il nostro approccio è relativamente facile da seguire e più efficiente in etichettatura i vasi sanguigni e fibre nervose con densità più elevate e meno lo sfondo. Inoltre, la maggiore risoluzione delle immagini ulteriormente permette di misurare con precisione la zona dei vasi, la quantità di ramificazione e dalla lunghezza delle fibre di software open source. Come una dimostrazione con il nostro metodo, vi indichiamo che il tessuto adiposo marrone (pipistrello) contiene una maggiore quantità di vasi sanguigni e fibre nervose rispetto al tessuto adiposo bianco (WAT). Inoltre trovare che tra i Wat, WAT sottocutaneo (sWAT) ha più vasi sanguigni e fibre nervose rispetto al WAT epididimaria (eWAT). Il nostro metodo fornisce pertanto uno strumento utile per indagare il rimodellamento del tessuto adiposo.
Introduction
Tessuto adiposo ha chiave metabolica ed endocrina funzioni1. Si espande o si contrae in risposta a differenti dinamicamente nutriente sottolinea2. Il tessuto attivo processo di rimodellamento è costituito da più percorsi/passaggi fisiologici tra cui l'angiogenesi, la fibrosi e la modellatura di microambienti infiammatoria locale2,3,4. Alcuni stimoli fisici, quali esposizione al freddo e l'esercizio, possono innescare l'attivazione simpatica, che infine conduce alla formazione del vaso sanguigno di nuovo e lo stimolo simpatico in tessuti adiposi5,6. Questi processi di rimodellamento sono collegati strettamente ai risultati metabolici sistemici compreso la sensibilità dell'insulina, il segno distintivo di tipo 2 il diabete2. Così, la visualizzazione di queste mutazioni patologiche è molto importante per comprendere lo stato integro di interi tessuti adiposi.
L'angiogenesi è il processo di formazione del vaso sanguigno di nuovo. Poiché i vasi sanguigni fornire ossigeno, nutrienti, ormoni e fattori di crescita del tessuto, l'angiogenesi è stata considerata un passo fondamentale nel rimodellamento del tessuto adiposo, che è stato documentato con tecniche differenti6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. Tuttavia, persistono dubbi la risoluzione delle immagini, efficienza di immunostaining e metodi per la quantificazione della densità della nave. Rispetto alla formazione del vaso sanguigno di nuovo, lo stimolo nel tessuto adiposo è stato sottovalutato per lungo tempo. Recentemente, Zeng et al.. 14 usato avanzata videomicroscopia microscopia del due-fotone e dimostrato che adipocytes sono circondati da strati di fibre nervose14. Da allora, i ricercatori hanno iniziato ad apprezzare il ruolo fondamentale di stimolo simpatico nel regolamento della fisiologia del tessuto adiposo. È quindi importante sviluppare un approccio facile e pratico per lo stimolo del nervo adiposa documento.
Qui, segnaliamo un metodo ottimizzato per la co-colorazione dei vasi sanguigni e fibre nervose basate sui nostri protocolli precedenti. Con questo metodo, possiamo ottenere immagini chiare dei vasi sanguigni e fibre nervose senza sfondo rumoroso. Inoltre, otteniamo una risoluzione che è sufficientemente elevata per eseguire la misurazione quantitativa della densità con software open source. Utilizzando questo nuovo approccio, possiamo confrontare correttamente le strutture e la densità dei vasi sanguigni e fibre nervose in diversi depositi adiposi.
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Protocol
Tutte le procedure contenenti animali soggetti sono state approvate da Animal Welfare Comitato della University of Texas Health Science Center a Houston (numero di protocollo animale: AWC-18-0057).
1. preparazione dei reagenti
- 1x tampone fosfato salino (PBS, pH 7.4): per rendere 1 L di PBS 1X, sciogliere 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na2HPO4e 0,24 g di KH2PO4 in 800 mL di acqua distillata. Regolare il pH a 7,4 e riempire con acqua distillata per ottenere un volume finale di 1 L.
- paraformaldeide 1% in PBS 1X (1% PFA, wt/vol): per ottenere un volume finale di 50 mL, aggiungere mL 3,125 del 16% PFA (Vedi Tabella materiali) a 46,875 mL di PBS 1X. Mescolare bene e conservare a 4 ° C per un uso successivo.
Attenzione: Paraformaldeide è tossico. Tutte le procedure devono essere eseguite sotto cappa aspirante per evitare l'inalazione e contatto con la pelle. - 0,1% polisorbato 20 (Vedi tabella materiali) in PBS 1X (1 x PBST, pH 7.4, vol/vol): per ottenere un volume finale di 50 mL, aggiungere 0,05 mL di polisorbato 20 a 49.95 mL di PBS 1X. Vortice e conservare a 4 ° C per 1 mese.
- 1% octoxynol-9 (Vedi Tabella materiali) in PBS 1X (1x PBS-TX, pH 7.4, vol/vol): per ottenere un volume finale di 10 mL, aggiungere 0,1 mL di octoxynol-9 a 9,9 mL di PBS 1X. Vortice e conservare a 4 ° C per 1 mese.
- 2% di sodio azide (wt/vol): per produrre 10 mL di 2% di sodio azide, aggiungere 10 mL di PBS 1x 0,2 g di sodio azide. Mescolare bene e conservare a 4 ° C per un uso successivo.
- glicerolo 90% in PBS 1X (vol/vol): per ottenere un volume finale di 10 mL, aggiungere 1 mL di PBS 1X a 9 mL di glicerolo. Vortice e conservare a temperatura ambiente (RT) per un uso successivo.
2. animale Ddissection e tessuto adiposo collezione
- Utilizzare topi maschii di C57BL/6J week-old 6. Anestetizzare i topi con isoflurano (4 – 5% per induzione poi 1-2% per la manutenzione). Una volta anestetizzato, eseguire un riflesso di punta-pizzico per determinare la profondità anestetica, a giudicare dalla mancanza di riflessi pedale. Una volta che i topi sono anestetizzati, sezionare i topi seguendo il protocollo come precedentemente pubblicato il15.
- Sterilizzare le forbici smussate e area chirurgica del torace (non c'è bisogno di radersi i capelli). Aprite la cassa tagliando il diaframma e costole lungo la superficie laterale con una dimensione di ~ 2 cm utilizzando forbici smussate. Bloccare la bandiera di petto con pinza emostatica e rifletterlo mettendo il laccio emostatico sopra la testa.
- Praticare una piccola incisione nel ventricolo sinistro (~0.5 cm) con forbici iris. Inserire un ago con punta oliva perfusione attraverso il sito di incisione e bloccare la punta dell'ago sul posto con la pinza emostatica. Inserire l'ago di una siringa da 50 mL contenente soluzione di fissazione del paraformaldeide (1% PFA, pH 7.4).
- Aprire l'atrio di destra taglio sezione con forbici iris come la presa di aspersione. Iniziare la perfusione di dolcemente e continuamente spingendo la siringa ad un tasso di aspersione vicino a 10 mL/min non spingere quando il fluido in uscita alla presa è chiaro di sangue. L'intero processo dovrebbe richiedere ~ 5 min.
Attenzione: Eseguire la procedura sotto cappa aspirante per impedire la tossicità da PFA. - Sezionare il tessuto adiposo bianco e marrone dai topi. Usare le forbici per rompere i campioni di tessuto in piccoli pezzi di pezzi circa 5 x 5 x 3 mm3. Trasferire i piccoli pezzi con la pinzetta sterilizzata nel tessuto incorporamento cassette con etichettatura corretta dei campioni di tessuto sulle cassette.
- Immergere l'incorporamento cassette contenenti i campioni di tessuto nella soluzione di fissazione (1% PFA in 1X PBS, pH 7.4) a 4 ° C per 24 – 48 h.
Nota: La soluzione di fissazione e l'ora di fissazione variano in base alle dimensioni dei tessuti16,17,18. - Lavare i campioni con fresco 1x tampone PBS tre volte (0,5 mL/lavaggio).
Attenzione: Eseguire questo passaggio sotto cappa aspirante. I rifiuti di paraformaldeide devono essere correttamente smaltiti secondo le procedure di smaltimento di rifiuti pericolosi.
Nota: I tessuti possono essere memorizzati in 1X PBS a 4 ° C per un'ulteriore elaborazione.
3. anticorpo incubazione
- Tagliate i campioni di tessuto fisso3 cubetti di circa 2 mm con le forbici sterilizzate. Per la permeabilizzazione, trasferire i campioni in una provetta da 1,5 mL contenente 1 mL di 1 x PBS-TX (1% octoxynol-9 in PBS 1X, Vedi tabella per i materiali, pH 7.4) e ruotare delicatamente le provette a RT per 1 h a 18 giri/min.
- Rimuovere con cautela la 1 x PBS-TX dall'aspirazione. Lavare i campioni 3 x aggiungendo il PBS 1X direttamente nelle provette stesse (nessuna necessità di cambiare i tubi). Durante ogni lavaggio, invertire i tubi più volte.
- Per bloccare, aggiungere 0,5 mL di tampone bloccante (Tabella materiali) ai campioni e incubare a RT per 2 h con leggera rotazione.
- Per preparare 0,4 mL di soluzione di anticorpo primario, diluire 2 μL di anti - endomucin (l'indicatore dei vasi sanguigni) 5 (1: 200) e 2 μL di anti — anticorpi di tirosina idrossilasi (TH, l'indicatore delle fibre nervose) 5 (1: 200, 1 µ g/mL) (tabella materiali per informazioni sugli anticorpi) in 396 μL di tampone bloccante. Vortice e spin giù per recuperare il volume.
- Per la prima incubazione dell'anticorpo, rimuovere con cautela il tampone bloccante dai blocchi del tessuto. Aggiungere 100 μL di soluzione di anticorpo primario preparata al punto 3.4 nelle provette e incubare a 4 ° C durante la notte.
Nota: Il tempo di diluizione e incubazione anticorpo può variare tra diversi anticorpi. Si consiglia di aggiungere alla soluzione di anticorpo a impediscono la crescita microbica 0,02% di sodio azide. Per preparare 0,4 mL di soluzione di anticorpo primario con sodio azide, aggiungere 4 μL di anticorpi (1 μL di ciascuno) e 4 μL di 2% sodio azide in 392 μL di tampone bloccante. - Raccogliere con cura la soluzione di anticorpo primario per il riutilizzo, se lo si desidera. Lavare i campioni con 1 x PBST (pH 7.4, 100 µ l/lavaggio) tre volte (ogni 30 min.) con leggera rotazione a 18 giri/min.
- Per la preparazione della soluzione di anticorpo secondario, diluire 2 μL di fluoroforo (onda lunghezza 495 nm) coniugato IgG di anti-capra (1: 200) e 2 μL di fluoroforo (onda lunghezza 650 nm) coniugato di anti-coniglio IgG (1: 200) (Vedi Tabella materiali) in 396 μL di tampone di bloccaggio. Vortex e centrifugare brevemente per raccogliere tutto il liquido.
Nota: Proteggere i campioni dalla luce durante le procedure seguenti. - Per la seconda incubazione dell'anticorpo, è necessario rimuovere il tampone di lavaggio ultimo da campioni. Aggiungere 100 μL di soluzione di anticorpo secondario nelle provette e incubare a RT per 2 h con delicata rotazione a 18 giri/min.
- Rimuovere con attenzione la soluzione di anticorpo secondario. Lavare i campioni 3 x con 1 x PBST (pH 7.4, 30 min. ciascuno) con leggera rotazione a 18 giri/min.
Nota: Non riutilizzare questa soluzione di anticorpo secondario, come possono essere contaminato con le tracce di anticorpi primari portati dai tessuti. - Per lo sdoganamento ottico, immergere i campioni in 1 mL di glicerolo al 90% e mantenere i campioni a 4 ° C al buio fino a quando non diventano trasparenti.
Nota: La durata di immersione dipende dal tipo di tessuto e le dimensioni. In genere, un cubo di3 2 mm di tessuto adiposo bianco ha bisogno di incubazione durante la notte, mentre gli stessi bisogni di campione del tessuto adiposo di marrone dimensione più lunghi. - Rispettare un isolatore di silicone alla diapositiva per creare un pozzo per l'imaging con volumi. In alternativa, allegare diversi strati di nastro trasparente per le diapositive e tagliato un quadrato di mezzo per creare un pozzo (Figura 2).
Nota: Regolare la profondità di ben per adattarsi alla dimensione del campione. In questo protocollo, una profondità di ben 1 mm viene utilizzata. - Attentamente i campioni di trasferimento nel pozzo e riempirlo con il mezzo di montaggio (Vedi Tabella materiali). Porre un coprivetrino sulla superficie e sigillare gli angoli di vetrini coprioggetto con media viscosità alta (Vedi Tabella materiali). Lasciate che la cura di medie di montaggio per 24 h a RT nel buio.
Nota: Assicurarsi che non vi è spazio tra il campione ed il vetrino coprioggetto. Evitare le bolle sotto il vetrino coprioggetto. Evitare di applicare pressione eccessiva sui campioni.
4. acquisizione immagini
- Acquisire immagini dello stack Z (fare riferimento ai punti 4.2-4.7) con l'obiettivo di 20 x di un microscopio confocale/software.
- Avviare il sistema. Fare clic sulla scheda <Configuration> e attivare il laser ad argon e il laser HeNe 633. Fare clic sulla scheda <Acquire>. Nel pannello di linee laser <Visible>, spostare i cursori di intensità corrispondente a scegliere le linee laser di 488 nm e 633 nm. Inizialmente, l'intensità può essere impostata a 20 – 30%. Selezionare il mirror dichoric triple 488/561/633. Attivare il PMTs cliccando sulle caselle <attivo>, scegliendo PMT1 per l'emissione eccitato di 488 nm laser e PMT3 per quello del laser 633 nm. Impostare l'intervallo di lunghezza d'onda a 500 – 550 nm per PMT1 e 650-750nm per PMT3. Selezionare il psudocolor da utilizzare per la visualizzazione dell'immagine facendo doppio clic il rettangolo colorato accanto a ogni rata e scegliere un colore dal menu a comparsa.
- Fare clic su <Live> per verificare l'immagine dei campioni. Usare la manopola di posizione z per selezionare un piano di messa a fuoco all'interno della regione XY di interesse. Regolare la luminosità delle immagini regolando l'intensità del laser, smart guadagno e offset. Per ogni canale di fluorescenza, eseguire questa regolazione sotto la modalità di visualizzazione di <QLUT> (Quick Look Up Table). Fare clic sul pulsante <QLUT> per accedere alla modalità QLUT, in cui saturi pixel vengono visualizzati in blu per facilitare l'impostazione del livello di luminosità appropriata. Fare clic due volte sul pulsante <QLUT> per tornare alla modalità di visualizzazione pseudocolor.
Nota: I valori numerici dell'impostazione può variare tra ogni esperimento. - Durante la scansione, ruotare la manopola di Z-posizione in senso antiorario per spostare il piano di messa a fuoco ad una estremità del volume di interesse e quindi fare clic sulla punta della freccia <fine> per impostare la posizione di fine scansione. Quindi ruotare la manopola di Z-posizione in senso orario per spostare il piano di messa a fuoco attraverso il campione per l'altra estremità del volume di interesse e quindi fare clic sulla punta della freccia <Begin> per impostare la posizione di inizio scansione.
Nota: Per il confronto tra diversi campioni, definire lo stesso Z-volume per diversi campioni. - Regolare la dimensione z-passo a 3 µm. cambia la qualità di immagine selezionando un formato di 1024 x 1024, velocità di 100 Hz e la linea media di 2.
- Selezionare <Start > per avviare l'acquisizione di immagini di z-stack.
- Per proiezione massima dello stack immagine acquisita, fare clic sulla scheda <processo> e <strumento>, selezionare <proiezione 3D> quindi immettere <massima> nell'elenco metodo senza modifiche a X, Y e Z. Set <Soglia> 0. Fare clic su <applicare>. L'intensità massima del Z-volume sarà sistemata in un'immagine 2D che verrà mostrata (Figura 4A).
5. analisi dei vasi sanguigni e fibre nervose reti
-
Analisi 2D immagini tramite software open source (Vedi tabella materiali)19
- Aprire le immagini impilate nel software. Regolare l'intensità e il diametro del vaso fino a tutte le strutture della nave possono essere correttamente selezionata (Figura 4B).
- Selezionare Esegui analisi ed esportare i dati seguendo la guida del software.
-
Analisi di 3D immagini tramite il software concesso in licenza (Vedi tabella materiali)
- Aprire i dati grezzi delle immagini con il software. Regolare la soglia e altri parametri, fino a quando le strutture della nave in ogni strato del z-volume siano selezionate correttamente (consultare la Guida utente per ulteriori informazioni sul software) (Figura 4).
- Analizzare i caratteri di segmenti selezionati ed esportare i dati seguendo la guida del software.
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Representative Results
La regione distale del tessuto adiposo bianco dell'epididimo (eWAT), regione mediale di dorsolumbar bianco tessuto adiposo sottocutaneo (sWAT) e mediale regione interscapolare tessuto adiposo marrone (pipistrello) sono stati raccolti. Le posizioni per la raccolta di questi tessuti sono indicate nella Figura 1.
Figura 1: anatomia del tessuto adiposo bianco sottocutaneo (sWAT), dell'epididimo tessuto adiposo bianco (eWAT) e tessuto adiposo marrone (pipistrello) indica aree utilizzate per la raccolta dei campioni. (A) le regioni delineato da linee bianche tratteggiate rappresentano sWAT, e la posizione di asterisco bianco evidenziato è il sito per la raccolta di sWAT. Le regioni delineate da linee nere tratteggiate sono eWAT, e la posizione di asterisco nero evidenziato è il sito per la raccolta eWAT. (B) le regioni delineate da linee nere tratteggiate sono BAT, e l'area di raccolta del tessuto è evidenziata dall'asterisco. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Dopo la colorazione intero-monta, i pezzi di tessuto sono stati montati in un pozzo di profondità di 1 mm (Figura 2)
e imaged con il microscopio confocale. In primo luogo abbiamo verificato l'effetto del passaggio di schiarimento con incubazione glicerolo 90% sulla qualità delle immagini. Abbiamo trovato che più vasi sanguigni sono stati macchiati positivamente con l'anticorpo di α-endomucin nella sWAT glicerolo-incubate, suggerendo che il passo di schiarimento è fondamentale per la macchiatura completa dei vasi sanguigni (Figura 3, confrontare pannelli A e B).
Figura 2: diagrammi dei pozzetti per imaging con volumi. (A) diagramma di una diapositiva con un isolatore di silicone. (B) diagramma di un pozzo con più strati di nastro fatto dal nostro laboratorio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: confronto di se immagini di vasi sanguigni acquiredwith o senza compensazione ottica passo con glicerolo 90%. (A) intero-monta immunofluorescenza (IF) che macchia con l'anticorpo anti-endomucin (verde) nella valle di sWAT. Il campione non è stato sottoposto alla fase di schiarimento ottico (punto 3.10). (B) intero-monta se macchiatura con l'anticorpo anti-endomucin nella valle di sWAT. Il campione è stato sottoposto alla fase di schiarimento ottico (punto 3.10) prima le operazioni di montaggio (passaggi 3.11 e 3.12). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tuttavia, il passo di schiarimento con glicerolo non ha influenzato l'integrità o la forma dei vasi sanguigni (Figura 3). Dato questi effetti benefici, nei seguenti esperimenti, è stato effettuato il passaggio di schiarimento.
Abbiamo inoltre confrontato i risultati delle analisi 2D e 3D utilizzando diversi software (Vedi Tabella materiali). Abbiamo trovato che, mentre le immagini 3D fornito apparentemente più dettagliate informazioni strutturali, i due metodi analitici alla fine non hanno mostrato differenze significative in termini di lunghezza e ramo numero dei vasi (Figura 4).
Figura 4: confronto tra analisi 2D e 3D su struttura del vaso. (A) l'effetto di proiezione massima sulle immagini. (B) i risultati analitici dal software 2D (Vedi Tabella materiali). In particolare, le linee rosse indicano scheletro selezionato, mentre i punti blu indicano punti di branding. (C) l'analitica risultati dal software 3D (Vedi Tabella materiali). La zona grigia è la regione selezionata per l'analisi. La linea verde indica i segmenti misurati e i punti verdi indicano i nodi misurati. (D), il confronto di lunghezza del vaso, numeri di segmento, ramificazione numeri di nodo e nodo terminale numeri analizzati con i metodi 2D o 3D. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Precedenti pubblicazioni hanno dimostrato che diversi depositi adiposi possiedono proprietà eterogenee1,18. Qui abbiamo cercato di determinare se i vasi sanguigni e fibre nervose presentano diversi modelli tra i depositi utilizzando il nostro metodo di recente sviluppato. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo effettuato co-se macchiatura con α-endomucin (per i vasi sanguigni) e α-TH (per fibre nervose) anticorpi nel tessuto adiposo. Interessante, risultati ha mostrato che c'erano significativamente più vasi sanguigni e fibre nervose in BAT rispetto al WATs (Figura 5, confronta fondo corsie a corsie superiore e media)
Figura 5: confronto dei vasi sanguigni e fibre nervose acquisite da diversi depositi adiposi. Intero-monta se macchiando con anti-endomucin (verde) e anti-tirosina idrossilasi (TH) (rosso) anticorpi in eWAT (A, B, fuse in C), sWAT (D, E, si fuse nel F) e BAT (G, H, fuse nel io). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tra i Wat, la sWAT esposti più alta densità di vaso sanguigno che il eWAT (Figura 5, confrontare la metà a corsia superiore). Di nota, mentre le fibre nervose ampliato in parallelo con i vasi sanguigni, non hanno mostrato significativi co-localizzazione (Figura 5, unite corsie). Abbiamo ulteriormente misurato quantitativamente l'area del vaso, numero di giunzioni e lunghezza del tubo con il metodo 2D e risultati trovati simili come descritto sopra (Figura 6).
Figura 6: analisi quantitativa di vascolare e le reti di fibre nervose. (A) la percentuale di area di vaso sanguigno nei campioni di eWAT, sWAT e BAT. (B) il numero di giunzioni del vascolare reti in eWAT, sWAT e BAT. (C) la nave totale lunghezza di reti vascolari in eWAT, sWAT e BAT. Area della fibra (D) la percentuale della neve nei campioni di eWAT, sWAT e BAT. (E) il numero di giunzioni delle fibre nervose in eWAT, sWAT e BAT. Lunghezza (F), il totale delle fibre nervose in eWAT, sWAT e BAT. Le analisi sono state eseguite con software 2D. I risultati sono stati raggiunti dalle immagini presentate nella Figura 5. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
In sintesi, questo approccio con successo co-macchiato i vasi sanguigni e fibre nervose in diversi tessuti adiposi.
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Discussion
Rimodellamento del tessuto adiposo è direttamente collegato al dysregulation metabolico durante lo sviluppo dell'obesità1,2. Angiogenesi e stimolo simpatico sono entrambi essenziali per il rimodellamento dinamico processo2,12. Di conseguenza, lo sviluppo di un approccio applicabile per visualizzare i nuovi vasi sanguigni così come le fibre nervose sono di grande importanza. Metodi precedenti sono stati segnalati per documentare l'angiogenesi nel tessuto adiposo. Tuttavia, rimangono alcuni problemi con questi approcci, tra cui bassa efficienza, risoluzione esigente e sfondo rumoroso. Nel frattempo, lo stimolo simpatico è stato riconosciuto solo recentemente come un passo fondamentale nel tessuto adiposo patologia14. Anche se i relativi risultati sono interessanti, metodi applicati richiedono strumenti di microscopia avanzata e sono che richiede tempo. Qui, segnaliamo un approccio facile da seguire per l'ultima volta dal nostro precedente protocollo per la co-macchiatura vasi sanguigni e fibre nervose simpatiche. Interessante, abbiamo macchiato con successo i vasi sanguigni e fibre nervose con alta risoluzione, e la colorazione ha qualità paragonabili a immagini precedentemente segnalati18.
In precedenza abbiamo macchiato i vasi sanguigni nel tessuto adiposo di immunohistochemistry o immunofluorescenza con l'anticorpo di α-CD31, un marcatore delle cellule endoteliali, paraffina diapositive8,13,20. Mentre il metodo permette di distinguere la densità del vaso sanguigno tra i diversi gruppi, i vasi microvascolari che sono stati macchiati positivamente non erano completi. Qui, abbiamo scelto un metodo di intero-monta ed eseguita se la colorazione con un anticorpo di α-endomucin, un altro marcatore per i vasi sanguigni. Con questo approccio ottimizzato, siamo stati in grado di raggiungere la colorazione con altri vasi sanguigni, soprattutto le navi microblood. Inoltre, in questo metodo, poiché abbiamo evitato passi come fissazione di incorporamento e formalina di paraffina, che hanno il potenziale di compromettere l'integrità dei vasi sanguigni, abbiamo ottenuto immagini con risoluzione più alta e più vasi intatti. La perfetta struttura dei vasi ulteriormente ci ha permesso di misurare e confrontare le loro lunghezze, rami e aree. Di nota, abbiamo aggiunto un passaggio di schiarimento con glicerolo, quindi i pezzi di tessuto potrebbero diventare più trasparenti, e questo passaggio semplice ma fondamentale ha migliorato significativamente l'efficienza della colorazione18,21.
A causa di alti livelli di contenuto di lipidi nel tessuto adiposo, che potrebbe limitare l'accessibilità di anticorpi verso le regioni interne del tessuto, abbiamo tagliato i depositi in piccoli pezzi per assicurare l'associazione di anticorpi adeguati di proteine bersaglio. Pertanto, il nostro metodo con successo le macchie più vasi sanguigni e fibre nervose di colorazione sui tessuti tutta. Tuttavia, esso può perdere informazioni spaziali e quindi compromettere l'integrità delle fibre nervose. Per risolvere il problema apparente e assicurare che le immagini sono confrontabili tra topi individuali, si consiglia di raccogliere i piccoli pezzi dalle stesse regioni nei depositi adiposi. Se ulteriormente sono necessarie maggiori informazioni spaziali, è necessario ottenere blocchi di dimensioni maggiori per la macchiatura. Per i più grandi campioni, fissazione più volte con dosi più elevate di FPA, concentrazioni più elevate di detergenti per la permeabilizzazione, e lunghi periodi di incubazione dell'anticorpo possono essere necessaria.
Innervazione del tessuto adiposo è stato studiato recentemente. Più avanzate tecniche sono state applicate per visualizzare fibre nervose14,17. Questi metodi sono costosi o che richiede tempo. Qui, abbiamo semplicemente eseguito una macchia se con α-TH (un indicatore del nervo simpatico) e con successo macchiato le fibre del nervo simpatiche ad un alta qualità. Ancora più importante, abbiamo effettuato la co-colorazione con α-endomucin e α-TH di indagare come i vasi sanguigni interazione con fibre nervose simpatiche durante il rimodellamento del tessuto adiposo.
Di nota, abbiamo confrontato i risultati dalle analisi 2D e 3D utilizzando diversi software. Si è constatato che, mentre le immagini 3D fornito dettagliate informazioni strutturali, i due metodi analitici non hanno mostrato una differenza significativa in termini di lunghezza e ramificazione dei vasi. Alla fine, quando l'analisi con il metodo 3D, il software stesso potrebbe rilevare alcuni falsi segnali che devono essere regolati manualmente. Dato che il software 2D è studiato appositamente per analisi di nave, così è preferibile per utilizzare questo metodo per misurare quantitativamente la struttura dei vasi.
Con questo metodo, vasi sanguigni e fibre nervose nel tessuto adiposo differente erano co-macchiate, e loro densità, rami e lunghezze erano rispetto19. È stato trovato che sia i vasi sanguigni e fibre nervose sono molto più spessore in BAT rispetto al WAT, suggerendo che il pipistrello è un deposito adiposo più metabolicamente attivo. Inoltre, il vaso sanguigno e del nervo densità nello sWAT erano superiori a eWAT, indicando che diversi WATs hanno differenti profili che ritocco.
In conclusione, questo metodo efficiente co-macchie vasi sanguigni e fibre nervose nel tessuto adiposo5. Inoltre, serve come uno strumento utile per studiare i cambiamenti dinamici nel tessuto adiposo durante lo sviluppo dell'obesità.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dall'Istituto nazionale di sovvenzione di salute (NIH) R01DK109001 (a K.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 805-545-180 | Lot: 116969 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Lot: 121944 |
| Amira 6.0 | Thermo Fisher Scientific | Licensed software | |
| Angio tool | National Institutes of Health | Open source software https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home |
|
| Anti-mouse endomucin antibody | R&D research system | AF4666 | Lot: CAAS0115101 |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | Pel Freez Biologicals | P40101-150 | Lot: aj01215y |
| Cover glasses high performance, D = 0.17 mm | Zeiss | 474030-9020-000 | |
| Cytoseal 280 | Thermo Fisher Scientific | 8311-4 | High-viscosity medium |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | |
| Paraformaldehyde,16% | TED PELLA | 170215 | |
| Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep | INVITROGEN | P24744 | Silicone isolator |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| SEA BLOCK Blocking Buffer | Thermo Fisher Scientific | 37527X3 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | |
| Tissue Path IV Tissue Cassettes | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Triton Χ-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Generic term: octoxynol-9 |
| Tube rotator and rotisseries | VWR | 10136-084 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Generic term: Polysorbate 20 |
References
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