Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Isolatie, vermeerdering en Prion eiwituitdrukking tijdens neuronale differentiatie van stamcellen van menselijke tandmerg

Published: March 18, 2019 doi: 10.3791/59282
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 1,2, 3, 3, 2, 2, 1,2
1Laboratory of Experimental Medicine and Environmental Pathology, Sabina Universitas - Rieti University Hub, 2Department of Experimental Medicine, Sapienza University of Rome, 3Department of Science Dentistry and Maxillofacial, Sapienza University of Rome

Summary

Hier presenteren we een protocol voor menselijke tandheelkundige Pulp stamcellen isolatie en vermeerdering teneinde het prion-eiwit expressie tijdens neuronale differentiatie.

Abstract

Bio-ethische kwesties in verband met de manipulatie van embryonale stamcellen hebben belemmerd vooruitgang op het gebied van medisch onderzoek. Om deze reden is het zeer belangrijk voor het verkrijgen van volwassen stamcellen uit verschillende weefsels zoals adipeus, bloed, navelstrengbloed en beenmerg. Onder de mogelijke bronnen is tandmerg bijzonder interessant omdat het is gemakkelijk te verkrijgen met betrekking tot bio-ethische overwegingen. Inderdaad, menselijke tandheelkundige Pulp stamcellen (hDPSCs) zijn een soort van volwassen stamcellen kunnen onderscheiden in neuronale-achtige cellen en kan worden verkregen bij de derde Kies voor gezonde patiënten (13-19 leeftijden). In het bijzonder werd het tandmerg verwijderd met een graafmachine, snijd in kleine plakjes, behandeld met collagenase IV en gekweekt in een maatkolf. Om de neuronale differentiatie, werden hDPSCs gestimuleerd met EGF/bFGF voor 2 weken. Eerder, hebben wij aangetoond dat tijdens de differentiatie wordt de inhoud van cellulaire prion eiwit (PrPC) in hDPSCs verhoogd. De cytofluorimetric-analyse toonde een vroege uiting van PrPC dat na het proces van de neuronale differentiatie is toegenomen. Ablatie van PrPC door siRNA PrP voorkomen neuronale differentiatie geïnduceerd door EGF/bFGF. In deze paper illustreren we dat als we het isolement, de scheiding en de in vitro cultivatie-methoden van hDPSCs met verschillende eenvoudige procedures versterkt, efficiënter cel klonen verkregen en grootschalige uitbreiding van de mesenchymale stamcellen (MSCs werden) werd waargenomen. Ook laten we zien hoe de hDPSCs, verkregen met methoden die zijn beschreven in het protocol, zijn een uitstekend experimenteel model om het proces van de neuronale differentiatie van MSCs en latere cellulaire en moleculaire processen te studeren.

Introduction

Mesenchymale stamcellen zijn geïsoleerd uit verschillende weefsels, met inbegrip van het beenmerg, navelstrengbloed, menselijke tandmerg, adipeus weefsel en bloed1,2,3,4,5 , 6. zoals gemeld door verschillende auteurs, hDPSCs kunststof hechting, een typische morfologie van de fibroblast-achtige Toon. Deze vertegenwoordigen een zeer heterogene populatie met verschillende klonen en verschillen in proliferatieve en onderscheidende capaciteit7,8. hDPSCs express specifieke markers voor mesenchymale stamcellen (d.w.z. CD44 CD90, CD73, CD105, STRO-1), ze zijn negatief voor sommige hematopoietische gegevensmarkeringen (bijvoorbeeld in CD14 en CD19) en zijn geschikt voor in-vitro differentiatie van de multilineage9, 10,11.

Verschillende auteurs hebben aangetoond dat deze cellen zijn bekwaam om te onderscheiden in neuron-achtige cellen met behulp van verschillende protocollen, waaronder de toevoeging van de NGF, bFGF, EGF in combinatie met de specifieke media en supplementen7,12. Ook veel eiwitten zijn betrokken neuronale differentiatie tijdens, en daaronder verscheidene papers Toon een relevante rol en aanzienlijke expressie van cellulaire prion-eiwit PrP (C), beide in embryonale en volwassen stamcellen13, 14. PrPC vertegenwoordigt een pleiotropic molecuul staat van het uitvoeren van verschillende functies binnen cellen als koper metabolisme, apoptosis, en weerstand tegen oxidatieve stress15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22.

We onderzochten in onze eerdere papier23, de rol van PrPC in het proces van de neuronale differentiatie hDPSCs. In feite, hDPSCs express precociously PrPC en, na de neuronale differentiatie, was het mogelijk om een extra verhoging van observeren. Andere auteurs hypothetische een mogelijke rol van PrPC in processen van de neuronale differentiatie van stamcellen. Inderdaad, PrPC drijft de differentiatie van menselijke embryonale stamcellen in neuronen, oligodendrocyten en de astrocyten24. Het doel van deze studie was om te benadrukken de methodologie voor het verkrijgen van stamcellen van tandmerg, zijn differentiatie-proces en de rol van PrPC tijdens neuronale differentiatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Derde kiezen gebruikt in de studie werden weggesneden uit patiënten (13-19 jaar) met geen voorafgaande geschiedenis van drugs- of alcoholgebruik, alle niet-rokers en passende mondhygiëne. Op de dag van de uitleg, bij het departement wetenschap tandheelkunde en Maxillofacial van "Sapienza" Universiteit van Rome, was geïnformeerde toestemming verkregen van de patiënt of de ouders. Geïnformeerde toestemming werd verkregen op basis van ethische overwegingen en goedkeuring van de ethische commissie.

1. tand en tandmerg extractie

  1. Voorbereiding van geschikte voedingsbodem voor de instandhouding of het vervoer.
    1. Bereiden van Dulbecco bewerkt Eagle's medium lage concentratie van glucose (DMEM-L) met L-glutamine (494.5 mL).
    2. Voeg 5 mL penicilline/streptomycine (1%) en 0,5 mL amfotericine (0,1%).
  2. De derde Kies extract van de patiënt, snel spoelen met PBS, zet in een tube van 15 mL test met het medium en overbrengen naar het laboratorium in minder dan 2 h.
  3. Onder de motorkap van een biohazard, open de tand met een kotter bij coronale snijden doorgang parallel en tangent door het dak van de pulp kamer.
  4. Zachtjes Verwijder het vruchtvlees met een kleine graafmachine en plaats deze in een reageerbuis.
  5. Wassen met PBS driemaal samen en centrifugeer bij 2.500 x g gedurende 10 minuten op RT.

2. de verwerking van het tandmerg en de introductie van de cel van de stam

  1. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in Hank's oplossing plaatst u deze in een petrischaal. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C in 5% CO2.
  2. Typ IV collagenase oplossing voorbereiding.
    1. Bereiden van 0,8 mL van DMEM-L.
    2. Smelten van 1 mg van type IV collagenase in 0,8 mL DMEM-L en vortex gedurende enkele minuten.
    3. Toevoegen van DMEM-L hebben een eindconcentratie tot 1 mL 1 mg/mL.
    4. Filtreer de oplossing met een 0,22 µM filter.
  3. Verwijderen van Henks oplossing door centrifugatie bij 2.500 x g gedurende 10 minuten bij RT en verdelen van de pulp in kleine plakjes ongeveer 1 mm van elkaar met een disposable scalpel.
  4. Plaats van de segmenten van de pulp in een petrischaal en incubeer met 1 mL van type IV collagenase gedurende 15 minuten bij 37 ° C in 5% CO2.
  5. Middellange cultuur voorbereiding (500 mL).
    1. 445 ml DMEM-L met L-glutamine.
    2. Voeg 50 mL van foetale runderserum (FBS) (10%).
    3. Voeg 5 mL penicilline/streptomycine (1%).
  6. Centrifugeer het monster bij 2.500 x g gedurende 10 minuten op RT, verwijder de bovendrijvende substantie, resuspendeer de pellet in het medium (stap 2.5) en cultuur in T25 kolf specifiek voor stamcel bij 37 ° C in 5% CO2.

3. de cel van de stam cultuur en vermeerdering

  1. Elke dag Controleer de cultuur en na 3 dagen van de groei, het observeren van verschillende klonen van Adherente cellen binnen de kolf.
  2. Om de 3 dagen wijzigen het kweekmedium.
  3. Tussen 7 en 12 dagen, eenmaal de Adherente cellen bereik samenvloeiing, loskoppelen hen door de behandeling van de cellen met 1 mL trypsine-EDTA gedurende 3 minuten bij 37 ° C of voorzichtig met behulp van een cel schraper.
  4. Voeg 4 ml (verhouding 1:5) van het kweekmedium (stap 2.5) om trypsine actie te stoppen.
  5. Centrifugeren van de celsuspensie voor 6 min bij 259 x g, verwijder het supernatant en plaats van de cellen in een maatkolf van T25 doorgeven.
    Opmerking: Om de 3 dagen de cellen bereiken samenvloeiing.
  6. Het propageren van de cellen tot 21 of 28 dagen (ongeveer 6-8 passages) de aanwezigheid van niet-stam als cellen in de cultuur te voorkomen.
  7. Loskoppelen van de cellen met 1 mL trypsine-EDTA gedurende 3 minuten bij 37 ° C of voorzichtig afschrapen. De celsuspensie voor 6 min bij 259 x gcentrifugeren.
  8. Verwijder het supernatant en testen van de cellen voor cytofluorimetric analyse (stap 6).

4. Pre-steady PrPC Silencing door siRNA

  1. Cultuur van de hDPSCsin 6-Wells-platen (2 x 105 cellen/mL) met 2 mL gestolde voedingsbodem (stap 2.5) gedurende 24 uur.
  2. Overmorgen, bereiden siRNA PrP medium (400 µL).
    1. Voeg aan een steriele reageerbuis, 384 µL DMEM-L.
    2. Voeg 1 µL voor elk type van siRNA PrP naar DMEM-L om een eindconcentratie van 5 nM (4 siRNA PrP werden gebruikt en geverifieerd door de leverancier te waarborgen van een vechtpartij efficiëntie ≥70%).
    3. Voeg 12 µL van transfectionreagent naar DMEM-L.
    4. Vortex het mengsel en incubeer gedurende 10 min op RT dat de vorming van transfectie complexen.
  3. 400 μL van siRNA PrP medium toevoegen aan elk monster en incubeer gedurende 6 uur bij 37 ° C.
  4. Voeg zonder teruggooi siRNA PrP medium, 1.6 mL (verhouding van 1 tot en met 5) kweekmedium (stap 2.5).
  5. Laat de cellen gedurende 72 uur bij 37 ° C.
  6. Verwijder het supernatant en was 3 keer met 2 mL PBS op RT.
  7. Voeg 2 mL neuronale kweekmedium voor 7 en/of 14 dagen (stap 5.1).
  8. De neuronale kweekmedium elke 3 dagen wijzigen.
    Opmerking: Vervang de siRNA PrP oplossing elke keer vervangen de neuronale kweekmedium.
  9. Aan het einde van de tijd, was 3 keer met 2 mL PBS op RT en test voor neuronale oppervlakte antigenen door analyse van de Western Blot.

5. de neuronale inductie proces van hDPSCs

  1. Neuronale kweekmedium voorbereiding (500 mL).
    1. Voorbereiden 444.7 mL van basale media geformuleerd naar neuronale cellen.
    2. Voeg 50 mL van serumvrij supplement gebruikt ter ondersteuning van de levensvatbaarheid op lange termijn van embryonale en volwassen neuronale stamcellen (10%) op het medium.
    3. 200 µL van fundamentele Fibroblast Growth Factor (bFGF) (eindconcentratie 40 ng/mL) en 100 µL van de epidermale groeifactor (EGF) toevoegen aan het medium (eindconcentratie 20 ng/mL).
    4. Voeg 5 mL penicilline/streptomycine (1%) aan het medium.
  2. Cultuur hDPSCs in 6-Wells-platen (2 x 105 cellen/mL) tot 28 dagen van de scheiding van de pulp en hen te stimuleren met 2 mL neuronale kweekmedium.
  3. Om de 3 dagen Verwijder het supernatant, was 3 keer met 2 mL PBS op RT en vervangen van 2 mL van de neuronale voedingsbodem.
  4. Na 7 en/of 14 dagen, loskoppelen de cellen met 1 mL trypsine-EDTA gedurende 3 minuten bij 37 ° C of zachtjes met een schraper.
  5. Voeg 4 mL (verhouding 1:5) van kweekmedium (stap 2.5) om trypsine actie te stoppen.
  6. Testen op de aanwezigheid van neuronale oppervlakte antigenen (stap 6) of het prion-eiwit expressie (stap 7) door stroom cytometry analyse.

6. karakterisering van hDPSCs door Stroom Cytometry

  1. Selecteer mesenchymale stromale (MSC)-specifieke of neuronale oppervlakte antigenen.
  2. Cultuur van de hDPSCs in 6-Wells-platen (2 x 105 cellen/mL) met 2 mL gestolde voedingsbodem (stap 2.5).
  3. Loskoppelen hDPSCs na 28 dagen vanuit tandmerg scheiding of na 14 dagen van neuronale kweekmedium (stap 5.1) met 1 mL trypsine-EDTA gedurende 3 minuten bij 37 ° C of zachtjes schraper.
  4. Voeg 4 ml (verhouding 1:5) van kweekmedium (stap 2.5) om trypsine actie te stoppen en centrifugate op 259 x g voor 6 min op RT. wassen andere 2 keer met 2 mL PBS op RT.
  5. Herstellen van de hDPSCs onbehandeld of behandeld met 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
  6. Permeabilize hDPSCS met 0,1% (v/v) niet-ionogene oppervlakteactieve stof in PBS voor extra 10 min op RT.
  7. Uitvoeren van de afscherming met 5% nonfat melkpoeder in 1 mL PBS voor 1 h op RT.
  8. Was 3 keer met 1 mL PBS en Incubeer de cellen met anti-CD105 (1:100 / 5 x 105 cellen), anti-CD44 (1:100 / 5 x 105 cellen), anti-STRO-1 (1:100 / 5 x 105 cellen), anti-CD90 (1:100 / 5 x 105 cellen), anti-CD73 (1:100 / 5 x 105 cellen), anti β3-tubuline (1:100 / 5 x 105 cellen), anti-NFH (1:100 / 5 x 105 cellen) en anti-GAP43 (1:100 / 5 x 105 cellen) mAb gedurende 1 uur op RT.
  9. Spoel de cellen 3 keer met 1 mL PBS en incubeer met anti-muis PE (1:50 / 5 x 105 cellen) of anti-konijn CY5 (1:50 / 5 x 105 cellen) mAb voor extra 1 h op RT.
  10. Gebruiken van de secundaire antilichamen voor de cellen van de immunopositive (anti-muis PE of anti-konijn CY5 mAb) gating en analyseren van alle monsters met een stroom cytometer en verwerven van minstens 20.000 gebeurtenissen.

7. evaluatie van PrPC expressie in hDPSCs door Stroom Cytometry analyse

  1. Cultuur van de hDPSCsin 6-Wells-platen (2 x 105 cellen/mL) met 2 mL gestolde voedingsbodem (stap 2.5).
  2. Ontkoppelen van hDPSCs op 21 en 28 dagen van tandmerg scheiding en na 7 en/of 14 dagen met neuronale kweekmedium (stap 5.1) met 1 mL trypsine-EDTA en stoppen van de trypsine actie, zoals beschreven in stap 6.4. Herstellen van de specimens met 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
  3. Permeabilize met 0,1% (v/v) niet-ionogene surfactantin PBS voor 10 min op RT. Verwijder het supernatant en vlekken van de cellen met konijn anti-PrP mAb EP1802Y (1:50 / 5 x 105 cellen) mAb gedurende 1 uur op RT. Incubate met anti-konijn CY5 (1:50 / 5 x 105 cellen) mAb voor extra 1 h op RT.
  4. Analyseren van alle monsters met een stroom-cytometer en het verwerven van minstens 20.000 gebeurtenissen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De procedures voor isolatie en afscheiding van de hDPSCs van tandmerg, verkregen uit de derde kies, zijn complexe processen waarin kleine veranderingen een ruïneuze resultaat kan leiden. In dit document gebruiken we het protocol van Arthur et al.. 12 met verschillende verbeteringen. Een representatieve stelsel van procedures is afgebeeld in Figuur 1.

hDPSCs vertegenwoordigt een heterogene populatie van cellen met verschillende klonen en verschillen in proliferatieve en onderscheidende capaciteit7,8. Na de scheiding van de pulp en zaaien van kleine fragmenten van pulp, nageleefd wij clusters van cellen uit te breiden in de periferie. Figuur 2 toont een kleine cluster van cellen op 1 dag (linker paneel), 4 (centrale paneel) en 7 dagen (rechtervenster) van tandmerg scheiding. In het algemeen, deze clusters van cellen groeien tot de samenvloeiing ongeveer tussen 7 en 12 dagen.

Deze cellen, na neuronale differentiatie geïnduceerd door EGF/bFGF, verminderen hun groei en, na twee weken was het mogelijk om aanzienlijke veranderingen in de cel morfologie en neurites uitgroei (Figuur 3).

In Figuur 4tonen we dat onbehandeld hDPSCs express multipotente mesenchymale stromale specifieke oppervlakte antigenen zoals CD44, CD90, CD105, CD73 en STRO-15,9. Anders, na passende neuronale inductie stimuli, hDPSCs express specifieke neuronale markers zoals β3-tubuline NFH en GAP43. hDPSCs, onbehandeld of behandeld met neuronale inductie stimuli, doen niet express hematopoietische markeringen zoals CD14 en CD19.

In Figuur 5tonen we dat hDPSCs express precociously PrPC (21 en 28 dagen) en, na de neuronale differentiatie proces geïnduceerd door EGF/bFGF voor extra 7 en 14 dagen, het wachtwoordreplicatiebeleidC inhoud toegenomen (Figuur 5A). Aangezien verschillende auteurs gerapporteerd dat PrPC is betrokken bij de neuronale celdifferentiatie, we de rol van endogene PrPC in dit proces geëvalueerd. Daarom was een klein Mengend RNA (siRNA PrP) toegepast lasertherapie PrPC en de functie daarvan. Voorbehandeling met siRNA gedurende 72 uur vóór het EGF/bFGF stimuli voor 14 dagen voorkomt u dat de expressie van neuronale markers B3-tubuline en NHS (Figuur 5B). Uit de gegevens blijkt dat het proces van de neuronale differentiatie van hDPSCs, geïnduceerd door EGF/bFGF na 2 weken zwijgen van PrPC door siRNA beïnvloed.

Figure 1
Figuur 1 : Stelsel van scheiding van het tandmerg uit de derde kies. De tand is geopend met een kotter bij coronale snijden doorgang parallel en tangent door het dak van de kamer van de pulp en het vruchtvlees werd voorzichtig verwijderd onder steriele omstandigheden met een kleine graafmachine en geplaatst in een reageerbuis. De pulp, na Henks oplossing behandeling, werd gesneden in plakjes en behandeld met collagenase IV gedurende 15 minuten en doorgegeven in een maatkolf van T25. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : hDPSCs morfologie op verschillende dagen van tandmerg scheiding door fasecontrastmicroscoop. Morfologie van hDPSCs van tandmerg op verschillende dagen (1, 4, 7) van tandmerg scheiding. Schaal bars = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Neurite uitvloeisel van hDPSCs door fasecontrastmicroscoop. Morfologie van hDPSCs van tandheelkundige pulp onbehandeld of behandeld met EGF/bFGF voor 14 dagen. Schaal bars = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

Figure 4
Figuur 4 : hDPSCs karakterisering. Stroom cytometry analyse van CD44, CD90, CD105, CD73, STRO-1, CD14, CD19, β3-tubuline, NFH en GAP43 expressie in hDPSCs onbehandeld of behandeld met EGF/bFGF voor 14 dagen. Histogrammen vertegenwoordigen log fluorescentie vs celaantal, omheinde op van een kant vooruit en scatter scatter-celpopulatie (SS/FS) histogram. Elk paneel werd vergeleken met de bijbehorende secundaire antilichamen als negatieve controle. Een representatieve experiment onder 3 wordt weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 : Rol van PrPC tijdens neuronale differentiatie van hDSPCs. (A) Cytofluorimetric analyse van PrPC expressie onbehandeld (21 en 28 dagen na de scheiding van het tandmerg) en na extra 7 en 14 dagen met neuronale inductie media EGF/bFGF. Elk paneel werd vergeleken met de bijbehorende IgG negatief isotype besturingselement. Een representatieve experiment onder 3 wordt weergegeven. (B) westelijke vlekkenanalyse van neuronale markeringen β3-tubuline en NFH expressie (28 dagen vanaf tandmerg scheiding) en na extra 14 dagen met neuronale inductie media EGF/bFGF in de aanwezigheid of afwezigheid van siRNA PrP. Dit cijfer 5 (A, B) is gewijzigd van "Rol van het Prion-eiwit-EGFR multimolecular complex tijdens neuronale differentiatie van menselijke tandheelkundige pulp afkomstige stamcellen" 23. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit werk, we gericht op methodologie voor isolatie en neuronale differentiatie van hDPSCs; we geëvalueerd bovendien de rol van PrPC in dit proces. Er zijn verschillende methoden om te isoleren en hDPSCs in neuron-achtige cellen en kritische stappen onderscheiden tijdens het proces. hDPSCs zijn bekwaam om te onderscheiden in verschillende geslachten zoals chondroblasts, adipocytes, botcellen en neuronen. In onze papier onderzochten we de mechanismen voor Neuronale Differentiatie en de aanwezigheid van PrPC. Zoals hierboven is besproken, express deze cellen typische mesenchymale stromale-specifieke oppervlakte antigenen zoals CD44, CD90, CD105, CD73 en STRO-110,25,26.

In het protocol, verschillende kritische stappen kunnen leiden tot het falen van de procedure van de scheiding. De eerste kritieke stap wordt vertegenwoordigd door de keuze van patiënten27. In onze ervaring, vonden we dat vergrijzing van donoren (> 20) geleidelijk vermindert het vermogen van de proliferatie en differentiatie van stamcellen. In onze experimenten gebruikten we derde kiezen van patiënten 13-19 jaar oud en met geen voorafgaande geschiedenis van drugs- of alcoholgebruik, alle niet-rokers en passende mondhygiëne weggesneden.

De tweede cruciale stap wordt vertegenwoordigd door de keuze van het enzym te scheiden van de cellen van de pulp weefsel, dat de belangrijkste hete stap van stamcellen scheiding procedure vertegenwoordigen zou. In feite, realiseerden we ons dat een breed gebruik van collagenase I en II enzymen die te agressief worden kunnen, beschadigen de cellen aanwezig in de pulp weefsel tijdens het scheidingsproces. Om deze reden besloten hebben we collagenase IV te gebruiken, omdat dit soort collagenase als lagere al activiteit dan collagenase type I en II. Na precies de procedure is het mogelijk om het verkrijgen van stamcellen in 90% van de behandelde tanden.

Na de scheiding, is de oplossing met hDPSCs gekweekt in passende kolven tot de 6° passage (ongeveer 21-28 dagen) de aanwezigheid van de niet-stamcellen in de cultuur te voorkomen. Na 28 dagen, werden ze getest op de aanwezigheid van typische mesenchymale antigenen (als waarnaar wordt verwezen boven) en gebruikt voor experimenten alleen wanneer zij positief waren. In feite, ondanks de geboekte vooruitgang in de gehele jaar op hDPSCs, zijn er nog steeds belangrijke beperkingen vertegenwoordigd door de extreme heterogeniteit van de bevolking.

Zoals blijkt uit verschillende schrijvers wonen, zijn er verschillende celtypes van de bevolking in het tandmerg en, tot op heden, is het onbekend wat is de beste fenotypen bekwaam om te onderscheiden in elke mesenchymale afkomst (chondroblasts, adipoblasts, botcellen of neuronen). Om te voorkomen dat de huidige beperkingen van onze en andere procedures, zal de volgende stap zijn om te selecteren van cellulaire bevolking met specifieke fenotypen met specifieke monoklonale antilichamen.

In vorige werk toonden we dat PrPC van hDPSCs wordt uitgedrukt. In feite, is het mogelijk om een zwakke positiviteit bij 21 dagen en een stijging van PrPC inhoud na 28 dagen worden nageleefd. Bovendien, we hebben vastgesteld dat tijdens het EGF/bFGF-gemedieerde neuronale inductie, PrPC inhoud verder verhoogd werd. We onderzochten bovendien de rol van endogene PrPC in neuronale inductie proces van hDPSCs. Het proces van de differentiatie van hDPSCs die zijn geïnduceerd door EGF/bFGF23voorkomen de voorbijgaande zwijgen van PrPC .

We verfijnd en verbeterd de methoden van afzondering, separatie en in vitro kweek van hDPSCs met eenvoudige en veelzijdige procedures. Deze innovaties kunnen verkrijgen van een efficiëntere cel klonen en de grootschalige uitbreiding van de mesenchymale stamcellen. Wij stellen ook voor dat de hDPSCs zijn een uitstekend experimenteel model om te studeren van cellulaire en moleculaire mechanismen van MSCs neuronale differentiatie proces.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de "Fondazione Varrone" en Rieti Universiteit Hub "Sabina Universitas" aan Vincenzo Mattei.

Figuur 5 (A, B) herdrukt met toestemming van de uitgever, Taylor & Francis Ltd uit: rol van Prion-eiwit-EGFR multimolecular complex tijdens neuronale differentiatie van menselijke tandheelkundige pulp-afgeleide cellen van de stam. Martellucci, S., Manganelli V., Santacroce C. Santilli F. Piccoli L., Sorice M., Mattei V. Prion. 2018 Mar 4. Taylor & Francis Ltd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin B solution Sigma-Aldrich A2942 It is use to supplement cell culture media, it is a polyene antifungal antibiotic from Streptomyce
Anti-B3tubulin Cell Signaling Technology  #4466 One of six B-tubulin isoform, it is expressed highly during fetal and postnatal development, remaining high in the peripheral nervous system
Anti-CD105  BD Biosciences 611314 Endoglin (CD105), a major glycoprotein of human vascular endothelium, is a type I integral membrane protein with a large extracellular region, a hydrophobic transmembrane region, and a short cytoplasmic tail
Anti-CD44 Millipore CBL154-20ul Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells
Anti-CD73  Cell Signaling Technology  13160 CD73 is a 70 kDa glycosyl phosphatidylinositol-anchored, membrane-bound glycoprotein that catalyzes the hydrolysis of extracellular nucleoside monophosphates into bioactive nucleosides
Anti-CD90 Millipore CBL415-20ul Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells
Anti-GAP43  Cell Signaling Technology  #8945 Is a nervous system specific, growth-associated protein in growth cones and areas of high plasticity
Anti-mouse PE  Abcam ab7003 Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis
Anti-NFH  Cell Signaling Technology  #2836 Is an antibody that detects endogenous levels of total Neurofilament-H protein
Anti-PrP mAb EP1802Y  Abcam ab52604 Rabbit monoclonal [EP 1802Y] to Prion protein PrP
Anti-rabbit CY5  Abcam ab6564 Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis
Anti-STRO 1 Millipore MAB4315-20ul Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells
B27 Supp XF CTS Gibco by life technologies A14867-01 B-27  can be used to support induction of human neural stem cells (hNSCs) from pluripotent stem cells (PSCs), expansion of hNSCs, differentiation of hNSCs, and maintenance of mature differentiated neurons in culture
BD Accuri C6 flow cytometer  BD Biosciences AC6531180187 Flow cytometer equipped with a blue laser (488 nm) and a red laser (640 nm)
BD Accuri C6 Software  BD Biosciences Controls the BD Accuri C6 flow cytometer system in order to acquire data, generate statistics, and analyze results
bFGF PeproThec, DBA 100-18B basic Fibroblast Growth Factor 
Centrifuge CL30R Termo fisher Scientific 11210908 it is a device that is used for the separation of fluids,gas or liquid, based on density
CO2 Incubator 3541 Termo fisher Scientific 317527-185 it ensures optimal and reproducible growth conditions for cell cultures
Collagenase, type IV  Life Technologies 17104019 Collagenase is a protease that cleaves the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-X-Glyc-Pro, which is found with high frequency in collagen
Disposable scalpel  Swann-Morton 501 It is use to cut tissues
DMEM-L Euroclone ECM0060L Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose with L-Glutamine with Sodium Pyruvate
EGF PeproThec, DBA AF-100-15 Epidermal Growth Factor 
Fetal Bovine Serum Gibco by life technologies 10270-106 FBS is a popular media supplement because it provides a wide array of functions in cell culture. FBS delivers nutrients, growth and attachment factors and protects cells from oxidative damage and apoptosis by mechanisms that are difficult to reproduce in serum-free media (SFM) systems
Filtropur BT50 0.2,500 mL Bottle top filter Sarstedt 831,823,101 it is a device that is used for filtration of solutions
Flexitube GeneSolution for PRNP Qiagen GS5621 4 siRNAs for Entrez gene 5621. Target sequence N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA  N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA  N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA  N.4  CAGTGACTATGAGGACCGTTA
Hank's solution 1x Gibco by life technologies 240200083 The essential function of Hanks′ Balanced Salt solution is to maintain pH as well as osmotic balance. It also provides water and essential inorganic ions to cells
HiPerFect Transfection Reagent  Qiagen 301705 HiPerFect Transfection Reagent is a unique blend of cationic and neutral lipids that enables effective siRNA uptake and efficient release of siRNA inside cells, resulting in high gene knockdown even when using low siRNA concentrations
Neurobasal A  Gibco by life technologies 10888022 Neurobasal-A Medium is a basal medium designed for long-term maintenance and maturation of pure post-natal and adult brain neurons 
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 30525-89-4 Paraformaldehyde has been used for fixing of cells and tissue sections during staining procedures
penicillin/streptomycin  Euroclone ECB3001D  It is use to supplement cell culture media to control bacterial contamination
Phosphate buffered saline  (PBS) Euroclone ECB4004LX10  PBS is a balanced salt solution used for the handling and culturing of mammalian cells. PBS is used to to irrigate, wash, and dilute mammalian cells. Phosphate buffering maintains the pH in the physiological range
TC-Platte 6 well, Cell+,F Sarstedt 833,920,300 It is a growth surface for adherent cells
Tissue culture flask T-25,Cell+,Vented Cap Sarstedt 833,910,302 Tissue culture flask T-25, polystyrene, Cell+ growth surface for sensitive adherent cells, e.g. primary cells, canted neck, ventilation cap, yellow, sterile, Pyrogen-free, non-cytotoxic, 10 pcs./bag
Triton X-100  Sigma-Aldrich 9002-93-1 Widely used non-ionic surfactant for recovery of membrane components under mild non-denaturing conditions
Trypsin-EDTA  Euroclone ECB3052D  Trypsin will cleave peptides on the C-terminal side of lysine and arginine amino acid residues. Trypsin is used to remove adherent cells from a culture surface
Tube Sarstedt 62,554,502 Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP
VBH 36 C2 Compact Steril ST-003009000 Offers totally protection for the enviroment and worker
ZEISS Axio Vert.A1 – Inverted Microscope Zeiss 3849000962 ZEISS Axio Vert.A1 provides a unique entry level price and can provide all contrasting techniques, including brightfield, phase contrast, PlasDIC, VAREL, improved Hoffman Modulation Contrast (iHMC), DIC and fluorescence. Incorporate LED illumination for gentle imaging for fluorescently-labeled cells. Axio Vert.A1 is ergonomically designed for routine work and compact enough to sit inside tissue culture hoods.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Robey, P. G., Kuznetsov, S. A., Riminucci, M., Bianco, P. Bone marrow stromal cell assays: in vitro and in vivo. Methods in Molecular Biology. 1130, 279-293 (2014).
  2. Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418, 1-49 (2002).
  3. Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24, 1294-1301 (2006).
  4. Zannettino, A. C. W., et al. Multi-potential Human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. Journal of Cellular Physiology. 214, 413-421 (2008).
  5. Mattei, V., et al. Role of lipid rafts in neuronal differentiation of dental pulp-derived stem cells. Experimental Cell Research. 339, 231-240 (2015).
  6. Jansen, J., Hanks, S., Thompson, J. M., Dugan, M. J., Akard, L. P. Transplantation of hematopoietic stem cells from the peripheral blood. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 9 (1), 37-50 (2005).
  7. Young, F. I., et al. Clonal heterogeneity in the neuronal and glial differentiation of dental pulp stem/progenitor cells. Stem Cells International. 2016, 1290561 (2016).
  8. Pisciotta, A., et al. Human dental pulp stem cells (hDPSCs): isolation, enrichment and comparative differentiation of two sub-populations. BMC Developmental Biology. 15, 14 (2015).
  9. Atari, M., et al. Dental pulp of the third molar: a new source of pluripotent-like stem cells. Journal of Cell Science. 125, 3343-3356 (2012).
  10. Koyama, N., Okubo, Y., Nakao, K., Bessho, K. Evaluation of pluripotency in human dental pulp cells. Journal of oral and maxillofacial surgery: official journal of the American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 67, 501-506 (2009).
  11. Gronthos, S., et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. Journal of Dental Research. 81, 531-535 (2002).
  12. Arthur, A., Rychkov, G., Shi, S., Koblar, S. A., Gronthos, S. Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues. Stem Cells. 7, 1787-1795 (2008).
  13. Lee, Y. J., Baskakov, I. V. The cellular form of the prion protein is involved in controlling cell cycle dynamics, self-renewal, and the fate of human embryonic stem cell differentiation. Journal of Neurochemistry. 124, 310-322 (2013).
  14. Steele, A. D., Emsley, J. G., Ozdinler, P. H., Lindquist, S., Macklis, J. D. Prion protein (PrPc) positively regulates neural precursor proliferation during developmental and adult mammalian neurogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 3416-3421 (2006).
  15. Wulf, M. A., Senatore, A., Aguzzi, A. The biological function of the cellular prion protein: an update. BMC Biology. 15, 34 (2017).
  16. Mattei, V., et al. Recruitment of cellular prion protein to mitochondrial raft-like microdomains contributes to apoptosis execution. Molecular Biology of the Cell. 22, 4842-4853 (2011).
  17. Linden, R. The Biological Function of the Prion Protein: A Cell Surface Scaffold of Signaling Modules. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 77 (2017).
  18. Garofalo, T., et al. Role of mitochondrial raft-like microdomains in the regulation of cell apoptosis. Apoptosis. , 621-634 (2015).
  19. Watt, N. T., et al. Reactive oxygen species-mediated beta-cleavage of the prion protein in the cellular response to oxidative stress. The Journal of Biological Chemistry. 280, 35914-35921 (2005).
  20. Mattei, V., et al. Morphine Withdrawal Modifies Prion Protein Expression in Rat Hippocampus. PLoS One. 12, 0169571 (2017).
  21. Hu, W., et al. Prion proteins: physiological functions and role in neurological disorders. Journal of the Neurological Sciences. 264, 1-8 (2008).
  22. Sorice, M., et al. Trafficking of PrPC to mitochondrial raft-like microdomains during cell apoptosis. Prion. 6, 354-358 (2012).
  23. Martellucci, S., et al. Role of Prion protein-EGFR multimolecular complex during neuronal differentiation of human dental pulp-derived stem cells. Prion. 12 (2), 117-126 (2018).
  24. Lee, Y. J., Baskokov, I. V. The cellular form of the prion protein guides the differentiation of human embryonic stem cell into neuron-, oligodendrocyte- and astrocyte-committed lineages. Prion. 8, 266-275 (2014).
  25. Huang, G. T., Sonoyama, W., Chen, J., Park, S. H. In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments. Cell and Tissue Research. 324, 225-236 (2006).
  26. Suchanek, J., et al. Dental pulp stem cells and their characterization. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacký. 153, Olomouc, Czechoslovakia. 31-35 (2009).
  27. Bressan, E., et al. Donor age-related biological properties of human dental pulp stem cells change in nanostructured scaffolds. PLoS One. 7 (11), 49146 (2012).

Tags

Ontwikkelingsbiologie kwestie 145 tandmerg adulte stamcellen mesenchymale stamcellen differentiatie proces prion-eiwit prionen.
Isolatie, vermeerdering en Prion eiwituitdrukking tijdens neuronale differentiatie van stamcellen van menselijke tandmerg
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martellucci, S., Santacroce, C.,… More

Martellucci, S., Santacroce, C., Manganelli, V., Santilli, F., Piccoli, L., Cassetta, M., Misasi, R., Sorice, M., Mattei, V. Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells. J. Vis. Exp. (145), e59282, doi:10.3791/59282 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter