Ce protocole présente une méthode pour la décellularisation et la formation suivante d'hydrogel des garnitures de graisse mammaire murine suivant l'irradiation ex vivo.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Étudier les effets normaux du rayonnement tissulaire à l'aide d'hydrogels de matrice extracellulaire
Dans cet article
Résumé
Résumé
La radiothérapie est une thérapie pour les patients atteints d'un cancer du sein triple négatif. L'effet du rayonnement sur la matrice extracellulaire (ECM) du tissu sain de sein et son rôle dans la répétition locale au site primaire de tumeur sont inconnus. Ici nous présentons une méthode pour la décellularisation, la lyophilisation, et la fabrication des hydrogels d'ECM dérivés des garnitures de graisse mammaire murine. Les résultats sont présentés sur l'efficacité du processus de décellularisation, et des paramètres rhéologiques ont été évalués. Les cellules de cancer du sein GFP- et luciferase-étiquetées encapsulées dans les hydrogels ont démontré une augmentation de la prolifération des hydrogels irradiés. Enfin, la coloration conjuguée de phalloidin a été employée pour visualiser l'organisation de cytosquelette des cellules encapsulées de tumeur. Notre objectif est de présenter une méthode de fabrication d'hydrogels pour l'étude in vitro qui imitent l'environnement in vivo des tissus mammaires et sa réponse au rayonnement afin d'étudier le comportement des cellules tumorales.
Introduction
Le cancer se caractérise par une prolifération excessive de cellules qui peuvent échapper à l'apoptose et métastasent également des sites éloignés1. Le cancer du sein est l'une des formes les plus courantes chez les femmes aux États-Unis, avec environ 266 000 nouveaux cas et 40 000 décès en 20182. Un sous-type particulièrement agressif et difficile à traiter est le cancer du sein triple négatif (TNBC), qui manque de récepteur d'oestrogène (ER), de récepteur de progestérone (PR), et de facteur de croissance épidermique humain (HER2). La radiothérapie est couramment utilisée dans le cancer du sein pour éliminer les cellule....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Les études sur les animaux ont été réalisées conformément aux lignes directrices et protocoles institutionnels approuvés par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université Vanderbilt.
1. Préparation et irradiation ex vivo des MFP
- Sacrifier les souris nu/Nu athymiques (8 à 10 semaines) en utilisant l'asphyxie au CO2 suivie d'une luxation cervicale.
- Nettoyer la peau à l'aide de 70 % d'éthanol.
- Recueillir des coussinets de graisse mammaire (MPF) à l'aide de souris sacrifiées à l'aide de ciseaux et de forceps pré-stérilisés dans un tube conique de 15 ml contenant des milie....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Les MFP ont été décellularisés à la suite de l'irradiation à l'aide de la procédure indiquée à la figure 1A. Les MPF pré-décellularisation (figure 1B) et post-décellularisation (figure 1C) sont montrés. La décellularisation a été confirmée à l'aide de l'hématoxylin et de l'éosine (H et E) tainingent, et 1-[4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol coloration a été utilisé pour évaluer la teneur en lipides (Figure 2). Les propriét.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Cette méthode de formation d'hydrogel dépend en grande partie de la quantité de tissu de départ. Les MPF murines sont petits, et le processus de décellularisation entraîne une réduction significative du matériel (tableau 1). Le processus peut être répété avec plus de MFP pour augmenter le rendement final. Le fraisage est une autre étape importante qui peut entraîner la perte de matériel. D'autres ont montré le succès avec un moulin cryogénique, mais ce protocole est basé sur le fraisage par l'intermédiai.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Les auteurs remercient la Dre Laura L. Bronsart d'avoir fourni les cellules GFP- et luciferase-4T1, le Dr Edward L. LaGory pour ses conseils sur 1-([Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol, le Dr Craig L. Duvall pour l'utilisation de l'IVIS et du lyophiliseur, et le Dr Scott A. Guelcher pour le rhéomètre utiliser. Cette recherche a été financée par les subventions des NIH #R00CA201304.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Formol tamponné neutre à 10 %, cube avec embout | VWR | 16004-128-2-méthylbutane | |
| Alfa Aesar | 19387-AR | ||
| 2000ex Rhéomètre | TA Instruments | 10D4335 | rhéomètre |
| Albumine sérique bovine Sigma-Aldrich | A1933-25G-acécéine | ||
| acétoxyméthyle (calcéine AM) | Molecular Probes, Inc. | C1430-D-Luciferin | |
| Lucifly, sel de potassium | Biosynth Chimie & Biologie | L-8820 | (S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylique sel de potassium |
| DPX Mountant for Histology | Sigma-Aldrich | 06522-500ML-Solution | |
| saline tamponnée au phosphate de Dulbecco | Gibco | 14040133-Eosin-Y | |
| avec phloxine | Richard-Allan Scientific | 71304 | eosine |
| ethidium homodimère | Sondes moléculaires, Inc. | E1169 | ethidium homodimère-1 (EthD-1) |
| Sérum de bovin fœtal | Sigma-Aldrich | F0926-500ML-Fisher | |
| Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | Milieu d’enrobage cryostat |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | milieu d’enrobage aqueux |
| FreeZone 4.5 | Labconco | 7751020 | lyophilisateur |
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Scientific | 62249 | colorant fluorescent bleu |
| Acide chlorhydrique | Sigma-Aldrich | 258148-500ML-IVIS | |
| Lumina III | PerkinElmer | CLS136334 | système d’imagerie par bioluminescence |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark | lingettes | |
| délicatesn-Propanol (sans peroxyde/séquençage), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1130-500-Oil | |
| Red O | Sigma-Aldrich | O0625-25G | 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphtol |
| OPS Diagnostics CryoGrinder | OPS Diagnostics, LLC | CG-08-02-PBS | |
| (10X), pH 7.4 | Quality Biological, Inc. | 119-069-151 | Solution saline tamponnée au phosphate |
| Pénicilline-Streptomycine | Gibco | 15140-122-Pepsine | |
| de muqueuse gastrique porcine | Sigma-Aldrich | P6887-5G | Pepsine |
| Acide peracétique | Sigma-Aldrich | 77240-100ML-Réactif | |
| Phalloidin-iFluor 594 (ab176757) | abcam | ab176757 | Conjugué |
| de la phalloïdinePropylène glycol | Sigma-Aldrich | W294004-1KG-K-Richard-Allan | |
| Scientific Signature Series Réactif de bleuissement | Richard-Allan Scientific | 7301L | Agent bleuissant |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Hématoxyline 7211 | Richard-Allan Scientific | 7211-RPMI | |
| Medium 1640 | Gibco | 11875-093-Désoxycholate | |
| de sodium, 98 % | Frontier Scientific | JK559522 | acide désoxycholique |
| Saccharose | Sigma-Aldrich | S5016-Triton | |
| x-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | em>t-Octylphénoxypolyéthoxyéthanol |
| Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénol | Gibco | 25200-056-Whatman | |
| papier filtre qualitatif, Grade 4 | Whatman | 1004-110 | Papier filtre qualitatif de grade 4 |
| Xylènes (certifié ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X5-4 | - |
Références
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. J.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
